得自鼠尾草属的具有抗病毒活性的化合物
阅读：828发布：2021-07-18
专利汇可以提供得自鼠尾草属的具有抗病毒活性的化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供含有具有至少一个得自β－(3,4－二羟基苯基)乳酸和/或咖啡酸的部分的分子之组合物,这些分子见于鼠尾草属 植物 的提取物中,所述部分是式(Ⅰ),活性剂具有至少190道尔顿的分子量。一类优选的活性剂是含有上述部分的偶联成为二聚体、三聚体、四聚体和更大 聚合物 的那些。最优选 丹酚酸 二聚体、三聚体、四聚体和更大聚合物。所述化合物和组合物可以在可药用载体和赋形剂中全身或局部 给药 用于 治疗 病毒性感染。，下面是得自鼠尾草属的具有抗病毒活性的化合物专利的具体信息内容。
1．一种通过施用组合物治疗或预防病毒性感染的方法，所示组合物 含有抑制病毒有效量的至少一种具有至少一个下式部分的活性剂： 其中R1是-OH、-O-和一个键；R2是-H或一个键；R3是-OH或-O-；R4 是一个键或 其中R5是-OH或一个键；R6是-H或一个键；并且R7是-H或一个键；该 活性剂具有190道尔顿以上的分子量。
2．按照权利要求1的方法，其中所述活性剂具有至少一个下式的 部分： 和至少一个下式的部分：
3．按照权利要求1的方法，其中所述活性剂是所述部分的二聚体、 三聚体、四聚体或更大聚合物。
4．按照权利要求1的方法，其中所述活性剂选自D-(2,3-二羟基苯 基)乳酸，迷迭香酸，2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)咖啡酸、紫草酸B、 紫草酸镁B、2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)咖啡酸的二聚体，或
5．按照权利要求1的方法，其中所述病毒感染是由肝炎病毒、正 粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、多瘤病毒或逆转 录病毒引起。
6．按照权利要求5的方法，其中逆转录病毒是HIV或FIV。
7．按照权利要求5的方法，其中病毒感染是由产生整合酶或具有 整合酶活性的蛋白的病毒引起。
8．按照权利要求1的方法，其中所述组合物经鼻、经口、透皮、 非肠道、鞘内的或静脉内给药。
9．一种通过给治疗对象施用组合物来治疗或预防其病毒性感染的 方法，所述组合物含有病毒抑制有效量的两种或多种活性剂，且所述活 性剂至少两种含有至少下式之一： 其中R1是-OH、-O-或一个键；R2是-H或一个键；R3是-OH或-O-；R4 是一个键或 其中R5是-OH或一个键；R6是-H或一个键；并且R7是-H或一个键；所 述活性剂具有190道尔顿以上的分子量。
10．按照权利要求9的方法，其中所述活性剂是所述部分的二聚体、 三聚体、四聚体或更大聚合物。
11．按照权利要求9的方法，其中所述活性剂选自D-(2,3-二羟基 苯基)乳酸，迷迭香酸，2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)咖啡酸、紫草酸B、 紫草酸镁B、2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)咖啡酸的二聚体，或
12．按照权利要求9的方法，其中所述病毒感染是由肝炎病毒、正 粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、多瘤病毒或逆转 录病毒引起。
13．按照权利要求12的方法，其中逆转录病毒是HIV或FIV。
14．按照权利要求12的方法，其中病毒感染是由产生整合酶或具 有整合酶活性的蛋白的病毒引起。
15．按照权利要求9的方法，其中所述组合物经鼻、经口、透皮、 非肠道、鞘内的或静脉内给药。
16．一种含有两种或多种活性剂的抗病毒组合物，其中所述活性剂 含有至少一个下式部分： 其中R1是-OH、-O-或一个键；R2是-H或一个键；R3是-OH或-O-；R4 是一个键或 其中R5是-OH或一个键；R6是-H或一个键；并且R7是-H或一个键；所 述活性剂具有190道尔顿以上的分子量；其中该组合物在施用给需要它 的对象时能够抑制病毒性感染。
17．一种从鼠尾草属植物鉴定抗病毒剂的方法，该方法包括步骤：
(a)由含有下式部分之一或所述部分的偶联物的植物提取活性剂： 其中R1是-OH、-O-或一个键；R2是-H或一个键；R3是-OH或-O-；R4 是一个键或 其中R5是-OH或一个键；R6是-H或一个键；并且R7是-H或一个键；和
(b)将所述第一活性剂与含有与第一活性剂不同的部分或偶联物 的第二活性剂合并；和
(c)分析该第一活性剂和该第二活性剂的混合物的抗病毒活性。
18．一种偶联产物，其是丹酚酸和/或丹酚酸的脱氢形式的单体单 元的均聚物或杂聚物，所述偶联物具有等于或大于约492的分子量，或 其含乙酰基衍生物、其酯、或酸酐衍生物，或其可药用盐。
19．按照权利要求18的偶联产物，其具有约492至约986的分子 量。
20．按照权利要求19的偶联产物，其具有约492的分子量。
21．按照权利要求19的偶联产物，其具有约984的分子量。
22．按照权利要求19的偶联产物，其具有约986的分子量。
23．按照权利要求19的偶联产物，其是丹酚酸和/或丹酚酸的脱氢 形式Ⅱ或Ⅲ的单体单元的均聚物或杂聚物，所述丹酚酸具有结构 (Ⅰ)： 所述丹酚酸的脱氢形式具有如下结构： 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢或一个键，并且该均聚物和杂聚物的 单体单元彼此通过R1、R2、R3、R4、R5和R6键合。
24．权利要求23的偶联产物，其是均聚二聚体。
25．权利要求24的偶联产物，其中所述单体单元通过R1-R1、R2-R2、 R3-R3、R4-R4、R5-R5或R6-R6键键合在一起。
26．权利要求24的偶联产物，其中所述单体单元通过R1-R2、R1-R3、 R1-R4、R2-R3、R2-R4或R3-R4键键合在一起。
27．权利要求23的偶联产物，其是杂聚二聚体。
28．权利要求27的偶联产物，其中所述单体单元通过R1-R5、R2-R5、 R3-R5或R4-R5键键合在一起。
29．权利要求27的偶联产物，其中所述单体单元通过R1-R6、R2-R6、 R3-R6、R4-R6或R5-R6键键合在一起。
30．权利要求18的偶联产物，其是均聚三聚体。
31．权利要求18的偶联产物，其是杂聚三聚体。
32．权利要求18的偶联产物，其是4个或更多个单体单元的均聚 聚合物。
33．权利要求18的偶联产物，其是4个或更多个单体单元的杂聚 聚合物。
34．一种通过施用组合物治疗或预防病毒性感染的方法，所述组合 物含有抑制病毒有效量的如权利要求18所述的偶联产物。
35．按照权利要求34的方法，其中所述偶联产物是均聚二聚体、 杂聚二聚体、均聚三聚体或杂聚三聚体。
36．按照权利要求34的方法，其中所述病毒感染是由肝炎病毒、 正粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、多瘤病毒或逆 转录病毒引起。
37．按照权利要求36的方法，其中逆转录病毒是HIV或FIV。
38．按照权利要求36的方法，其中病毒感染是由产生整合酶或具 有整合酶活性的蛋白的病毒引起。
39．按照权利要求34的方法，其中所述偶联产物经鼻、经口、透 皮、非肠道、鞘内的或静脉内给药。
40．一种制备抗病毒剂的方法，该方法包括在碱性pH下保温丹酚 酸，由此形成均聚物或杂聚物，它们具有高于丹酚酸的抗病毒活性。
41．按照权利要求40的方法，其中所述均聚物或杂聚物具有等于 或大于约492的分子量。
42．按照权利要求40的方法，其中所述均聚物或杂聚物具有约492 至约986的分子量。
43．按照权利要求42的方法，其中所述均聚物或杂聚物具有约492 的分子量。
44．按照权利要求42的方法，其中均聚物或杂聚物具有约984的分 子量。
45．按照权利要求42的方法，其中所述均聚物或杂聚物具有约986 的分子量。
46．按照权利要求42的方法，其中所述均聚物或杂聚物含有丹酚 酸和/或丹酚酸的脱氢形式Ⅱ或Ⅱ的单体单元，该丹酚酸具有结构： 所述丹酚酸的脱氢形式具有如下结构： 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢或一个键，并且该均聚物和杂聚物的 单体单元彼此通过R1、R2、R3、R4、R5和R6键合。
47．按照权利要求46的方法，其中形成均聚二聚体。
48．按照权利要求47的方法，其中其中所述单体单元通过R1-R1、 R2-R2、R3-R3、R4-R4、R5-R5或R6-R6键键合在一起。
49．权利要求47的方法，其中所述单体单元通过R1-R2、R1-R3、 R1-R4、R2-R3、R2-R4或R3-R4键键合在一起。
50．权利要求46的方法，其中形成杂聚二聚体。
51．权利要求50的方法，其中所述单体单元通过R1-R5、R2-R5、R3-R5 或R4-R5键键合在一起。
52．权利要求40的方法，其中所述单体单元通过R1-R6、R2-R6、 R3-R6、R4-R6或R5-R6键键合在一起。
53．按照权利要求50的方法，其中形成均聚三聚体。
54．按照权利要求40的方法，其中形成杂聚三聚体。
55．按照权利要求40的方法，其中形成4个或更多个单体单元的 均聚物。
56．按照权利要求40的方法，其中形成4个或更多个单体单元的 杂聚物。
发明领域
本发明涉及得自植物鼠尾草属提取物的活性物质。所述活性成分包 括具有至少一个来自β-(3,4-二羟基苯基)乳酸和/或咖啡酸的部分的 分子偶联物。优选所述活性成分是丹酚酸、其二聚体、三聚体和四聚体。 不论单用或更优选在合用时，都可以施用所述活性剂用于治疗病毒性感 染或病毒介导的病症。
发明背景
丹参(salvia miltiorrhiza)：很久以来传统中医已采用丹参 (SM)治疗心血管和肝脏疾病。该植物的提取物在体外和体内皆产生有效 的保肝活性。见Hase等人的《植物医学》(P1anta Med.)63: 22-6(1997)。紫草酸镁(Magnesium lithospermate)B可能是SM中具 有保肝作用的主要活性成分之一(Liu等人，中国中西医结合杂志， 13:352-3,326(1993))。SM还含有抗氧剂，在治疗病毒性心肌炎时这 些抗氧剂看来有助于膜损伤的修复(Meng等人，中国中西医结合杂志， 12:345-4,324-5(1992))。患有慢性乙型肝炎的患者对SM和/或多孔 伞(Polyporus Umbellarus)多糖(PUP)的治疗产生反应(Xiong，中国 中西医结合杂志，13:33-5,516-7(1993))。另外证明SM的草药提取 物具有抗-HIV活性(美国专利号5178865)和抗肝炎作用(国际专利申 请98/24460；中国专利申请号1192922和1192918)。业已公开了抗 疱疹、脊髓灰质炎、麻疹、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、DNA病毒和RNA 病毒有效的抗病毒剂，其含有至少一种由丹参根部获得的生药(欧洲专 利号0568001)。还可以将鼠尾草提取物制备成抗疱疹病毒药(美国专利 号5411733)。
SM植物具有数种可提取的部位。根部首先用乙醇提取随后用冷水 提取(SM(I))或用热水(SM(I))提取。两种用水提取的部分都显示出抗 病毒活性。
目前开发了以病毒生命周期中不同点为靶子的抗病毒剂。例如，已 开发出用于治疗逆转录病毒感染的抗病毒剂，其是以逆转录病毒特异性 酶如逆转录酶(RT)和整合酶为靶子。寻找其他抗病毒剂以对抗疾病(如 疱疹、肝炎和流感)的研究仍在继续。
抗逆转录病毒的抗病毒剂：以整合酶蛋白为靶子的抗病毒剂包括肽 抑制剂(美国专利号5578573)、核酸配体抑制剂(美国专利号5757287 和5587468)以及如伊快霉素(Equisetin)(美国专利号5759842)和 Ermophilane倍半萜类化合物(美国专利号5858738)。迄今为止，已经 鉴定了多种化合物并且已由FDA批准上市用于HIV，但仅批准了RT和 蛋白酶抑制剂。
作为抗病毒剂的咖啡酸：咖啡酸分离自野生九重葛属植物 (Bougainvillea spectabillis Wild)(Nyctaginaceae)的茎部，其 在民间已用来抗肝炎(Chang等人，《抗癌研究》(Anticancer Res)14: 501-6(1994))。据报导咖啡酸可抑制黄嘌呤氧化酶，该酶与若干疾病 如痛风、肝炎和肿瘤有关(Chan等人，《抗癌研究》15:703-7(1995)； 和Chang等人(1994))。咖啡酸氧化产物(KOP)抑制Ⅰ型和Ⅱ型人疱疹 病毒(Thiel等人，病毒学杂志(Acta Virol)27:200-8(1983))。根 据Kashiwada等人在《自然进程杂志》(J.Nat.Prod.)58: 392-400(1995)所述，咖啡酸四聚体和咖啡酸四聚体葡糖苷的二钾盐及 钾钠盐具有抗HIV活性。市售的咖啡酸也具有抗病毒活性，这已利用对 HIV的RT试验得到证实(Kreis等人《抗病毒研究》(Antiviral Res.)14 323-37(1990))。咖啡酸苯乙酯(CAPE)对于HIV-1的整合酶蛋白具有 抑制活性(Fesen等人《美国科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci,USA) 90:2399-2403(1993)；Fesen等人《生物化学和药理学》 (Biochem.Pharmacol.)48:595-608(1994)；Burke等人《药物化 学杂志》(J.Med.Chem.)38:4171-8(1995)；Mazumder等人《药物 化学杂志》39:2472-81(1996))。然而，用于制备咖啡酸聚合物的方 法影响其HIV-1和HIV-2抑制活性(Nakashima等人《化学和药学通讯》 (Chem.Pharm.Bull.)(东京)40:2102-5(1992))。咖啡酸与肉桂酸 和迷迭香酸(rosemarinic acid)一起还可用于治疗流感病毒，因其具 有抗氧活性(国际专利申请98/30228)。
作为抗病毒剂的迷迭香酸和紫草酸(lithospermic acids)：迷 迭香酸是咖啡酸的二聚体。迷迭香酸的二聚体是紫草酸。已经鉴定出在 SM根部的提取物中同时存在迷迭香酸和紫草酸(Kohda等人《化学和药 学通讯》(东京)37:1287-90(1989))。迷迭香酸具有抗HIV活性(Arda 等人《自然进程杂志》60:1170-3(1997))并且是有效的1型单纯疱疹 (HSV-1)抑制剂(Dimitrova等人，《保加利亚微生物学杂志》(Acta Microbiol.Bulg.)29:65-72(1993))。迷迭香酸被推荐用于治疗炎性 疾病和失调(美国专利号4329361)。
作为抗病毒剂的肉桂酸：取代肉桂酸酯抑制流感病毒A/香港(H3N2) 的感染活性(Serkedjieva等人《自然进程杂志》55:294-302(1992))； 肉桂酸衍生物的甾酯被证实在体外对于属于细小核糖核酸病毒科、正粘 病毒科、副粘病毒科和疱疹病毒科的病毒具有抗病毒活性(“肉桂酸衍 生物的胆甾醇酯的抗病毒活性”Z.Naturforsch 53:883-7(1998)； Conti等人《抗病毒化学和化学治疗法》(Antivir.Chem. Chemother.)9:511-5(1998))。取代肉桂酸的脱氢聚合物也被描述为 HIV-I治疗剂(美国专利号5346695和5632980)。
丹酚酸：文献中未报导丹酚酸具有抗病毒性质。若干形式的丹酚酸 (例如丹酚酸A、乙酰基丹酚酸)据报道具有抗氧特性(Lin等人《生物 化学和药理学杂志》51:1237-1241(1996))。丹酚酸也显示出可预防 肝损伤和纤维变性，与其抗脂质过氧化作用有关(Hu等人，Acta Pharmacol.Sin,18:478-480(1997))，并且可用于治疗冠心病(日本 专利2131423)。文献中公开的丹酚酸的其他形式包括分离自贵州鼠尾 草水提取物的那些(例如丹酚酸A、B、C、H和I)(Zhang等人《植物医 学》60:70-72(1994))或分离自丹参水提取物的那些(例如丹酚酸K， 一种咖啡酸三聚体)(Kasimu等人《化学和药学通讯》 46:500-504(1998)；和Tezuka等人《化学和药学通讯》46: 107-112(1998))。丹酚酸F2和F3可以通过Dalla等人在《四面体》 55:6923-2930(1999)；和Dalla等人《四面体通报》39: 8285-8286(1998)中所述的合成方法来制备。鼠尾草科的其他成员可以 用作获得丹参的来源，包括：南丹参，S.deserta,S.miltiorhiza var.miltiorhiza f.alba，皖鄂丹参，紫化拟丹参、甘西鼠尾、褐 毛甘西鼠尾、紫花浙皖丹参和三叶鼠尾草)(Kasiumu等人，1998)。产 生丹酚酸之类化合物高次级代谢水平植物的方法业已公开。见美国专利 号5869340(1999)。
(3,4-二羟基苯基)乳酸：SM的主要组分是“丹参素”，化学上称 作β-3,4-二羟基苯基乳酸钠(Fen等人，Acta Acad.Med.Primae Shanghai 10:133-6(1983))；Zhao等人，Chin Pharm.J.29: 291-93(1994))。它在细胞培养中是制备迷迭香酸的中间体化合物 (A1-Sereiti等人《印度实验生物学杂志》(Indian J.Exp.Biol.)37: 124-130(1999)；Bogucki等人《加拿大化学杂志》(Can.J.Chem.)75: 1783-94(1997)；和美国专利号5011775)。
用抗病毒剂治疗病毒介导的疾病可能相当昂贵。例如，采用逆转录 酶和蛋白酶抑制剂治疗HIV-1每年耗费每位患者约12000-20000美元。 由于大多数HIV感染患者居住在发展中国家，须开发其他更经济实惠的 医疗方法用于治疗HIV和其他病毒性疾病。本发明提供一种鉴定、制备 和应用新化合物的方法和用作抗病毒治疗剂的组合物。
发明概述
本发明的一个方面描述了含有具有至少一个得自β-(3,4-二羟基苯 基)乳酸和/或咖啡酸的部分的分子的组合物，该分子存在于鼠尾草属的 提取物中，所述部分如下式所示： 该活性物质具有至少190道尔顿的分子量。β-(3,4-二羟基苯基)乳酸 部分的R1可以是-OH、-O-或一个键，并且R2可以是-H或一个键。咖啡 酸部分的R3可以是-OH或-O-；R4可以是一个键或 其中R5是-OH或一个键；R6可以是-H或一个键，并且R7可以是-H或一 个键。
在另一实施方案中，本发明涉及偶联产物，其是丹酚酸和/或丹酚 酸的脱氢形式的单体单元的均聚物或杂聚物，该偶联产物具有约492 或更高的分子量，或其含乙酰基、酯或酸酐衍生物，或其可药用盐。在 一个优选实施方案中，该偶联产物是丹酚酸(Ⅰ)和/或丹酚酸脱氢形式 (Ⅱ)或(Ⅲ)的单体单元的均聚物或杂聚物，该丹酚酸具有以下结构： 并且丹酚酸的脱氢形式具有以下结构： 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢或一个键，该均聚物或杂聚物的单体 单元彼此通过R1、R2、R3、R4、R5和R6键合。
本发明还涉及一种制备抗病毒剂的方法，该方法包括将丹酚酸在碱 性pH下保温使均聚物或杂聚物形成，它们具有高于丹酚酸的抗病毒活 性。
本发明的试剂具有抗病毒活性且可以在可药用载体中全身或局部 给药。
附图简述
图1．实施例4的化合物5的三维图示。
图2．实施例4的化合物6的三维图示。
图3．实施例4的化合物7的三维图示。
图4．实施例4的化合物8的三维图示。
图5．实施例4的化合物9的三维图示。
图6．实施例4的化合物10的三维图示。
图7．实施例4的化合物11的三维图示。
图8．实施例4的化合物12的三维图示。
图9．实施例4的化合物13的三维图示。
图10．实施例4的通过丹酚酸碳24和38脱氢生成的化合物2的三 维图示。
图11．实施例4的通过丹酚酸碳24和35脱氢生成的化合物3的三 维图示。
图12．实施例4的通过丹酚酸碳27和38脱氢生成的化合物4的三 维图示。
图13．实施例4的化合物24的三维图示。
发明详述
本发明利用另外的途径来开发衍生自植物提取物的药物，特别是鼠 尾草属植物的提取物。这些活性剂在多种不同的病毒(包括逆转录病毒) 中抑制病毒整合。在一个优选实施方案中，所述活性剂抑制病毒基因组 全部或部分整合在宿主细胞的基因组内。该活性剂还可以通过干扰病毒 生活周期的其他位点抑制病毒感染、病毒增进和/或病毒增殖。
鼠尾草属(唇形科)含有约700种，它们位于世界的热带和温带地 区，并且约300种是在亚洲、欧洲和非洲而400种位于美洲(J.C. Willis，《开花植物和蕨类植物辞典》(第7版，剑桥大学出版社，1966)； J.Briquet,Labiatae,DIE NATURLICHEN PFLANZENFAMILIEN第 Ⅳ卷，3a,183-375(Engler & Prantl编辑，Englemann,Leipzig, 1897))。本发明的抗病毒化合物和组合物可以衍生自任何鼠尾草属的 物种，但优选来自SM和SY。 A．定义
术语“病毒抑制有效量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是 指活性剂以该量向患有病毒性感染或病毒介导疾病的对象给药时，所述 感染或疾病被缓解，或感染被抑制的程度超过任何由活性剂引起的有害 副作用。此类活性剂被认为是“抗病毒剂”。
术语“病毒介导病症”是指与病毒性感染有关的疾病表型。例如， AIDS相关综合征(ARC)是与HIV-1感染有关的病症。
术语“抗病毒活性”是指抑制或减轻病毒感染或与病毒感染有关病 症的能力。本发明具有抗病毒活性的化合物优选以≤1μM的剂量抑制体 外感染，或退一步体外优选小于或等于约10mM。
术语“整合酶活性”是指整合酶蛋白或可以整合病毒基因组或病毒 基因组片段进入宿主细胞基因组中的蛋白。绝大多数整合酶蛋白与逆转 录病毒科的成员有关。
术语“鼠尾草属植物”是指唇形科鼠尾草属的植物。优选用于分离 本发明化合物的鼠尾草植物是“丹参”或“SM”和“云南鼠尾草”“SY”。 术语“偶联衍生物”或“较大聚合物”是指包括二聚体、三聚体、 四聚体等的活性剂，其中单体单元是如下部分之一： 偶联衍生物或较大聚合物可以是上述残基的均聚二聚体、均聚三聚体、 均聚四聚体等，或杂二聚体、杂三聚体、杂四聚体等。偶联衍生物的一 个例子是紫草酸盐B，其是迷迭香酸的二聚体，而迷迭香酸是咖啡酸的 二聚体。 B．病毒
治疗或抑制任何对本发明抗病毒化合物和组合物产生反应的病毒 性感染都属于本发明的范围内。优选的病毒是下列病毒科：肝炎病毒、 疱疹病毒、正粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、多 瘤病毒和逆转录病毒。
逆转录病毒：本发明的化合物和组合物优选用于治疗逆转录病毒感 染。虽然逆转录病毒属于一个清楚限定的相对均一的病毒属，但它们历 史上被再分为三种分类组，主要是基于感染的病理结果。肿瘤病毒亚组 包括能够在感染宿主中引起肿瘤性疾病的逆转录病毒，以及若干有关但 显然是良性的病毒。慢病毒引起缓慢、长期的疾病，其通常但不总是缺 少肿瘤成分。慢病毒还有待与任何人体或动物的疾病清楚地关联。
逆转录病毒复制是由病毒体核穿透胞质内引发的，它是一个由病毒 包膜糖蛋白与特异性细胞表面受体的特定相互反应所介导的过程。此 后，与病毒体有关的依赖于RNA的DNA聚合酶将单链RNA基因组转录 成双链线性DNA原病毒中间体(逆转录)。整合蛋白(整合酶)特异性地 识别病毒DNA的两个末端并且从3，-末端脱去两个核苷酸(3’-供体加 工)。随后经加工的病毒DNA和整合酶迁移至核中，其中病毒整合酶使 逆转录病毒基因组共价连接在宿主染色体DNA上(链转移)，由此形成 逆转录原病毒。
作为重要的人体致病原，I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的出现提高 了对逆转录病毒的科研兴趣。特别是，有证据表明，上述单一生活周期 不能完全描述所有逆转录病毒的复制周期。例如，HIV-1除了特征逆转 录病毒Gag、Pol和Env以外编码不少于6个基因产物；这些翻译自一 组新的单剪接和多剪接病毒mRNA种类。这些附加蛋白中的至少两种(称 作Tat和Rev)以反式直接作用于调节HIV-1基因的表达。所以，穿透 和原病毒整合之间的步骤对于MLV(鼠科白血病病毒)和HIV-1两者似 乎相当类似，但发现整合后事件在后者中明显更加复杂。目前，已清楚 HIV-1仅仅是动物逆转录病毒这一大类型中的一种，这一大类目前称作 “复合”逆转录病毒。属于这种复合逆转录病毒的逆转录病毒包括所有 慢病毒，泡沫病毒，以及HTLV-1和有关病毒(表1)。
表1：逆转录病毒中的主要分类 类 亚组 原型 其他例子 单纯逆转录病毒 A组C型逆转录病毒 B组C型逆转录病毒 B型逆转录病毒 D型逆转录病毒 RSV MLV MMTV MPMV ALV,ASV FeLV,MSV SNV REV SSV SRV-1 复合逆转录病毒 慢病毒 T细胞白血病病毒 泡沫病毒 HIV-1 HTLV-1 HSRV HIV-2,SIV，绵 羊髓鞘脱落病 毒，FIV EIAV HTLV-II, STLV,BLV SFV,BFV
缩写：RSV，鲁斯氏肉瘤病毒；ALV，鸟白血病病毒；ASV，鸟肉瘤病毒； FeLV，猫白血病病毒；MSV，鼠科肉瘤病毒；SNV，脾坏死病毒；REV， 网状内皮组织增殖病毒；SSV，猿猴肉瘤病毒；MMTV，小鼠乳腺瘤病毒； MPMV,Mason-Pfizer猴病毒；SRV-1,Ⅰ型猿猴逆转录病毒；STLV， 猿猴T细胞白血病病毒；BFV，牛泡沫病毒。
参与原病毒整合的步骤对于单纯和复合逆转录病毒而言相当类似。 因为这种机理上的共同特性，逆转录病毒整合酶的抑制剂将抑制多种生 物如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病 毒(FIV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠科白血病病毒(MuLV)、鲁斯氏肉瘤 病毒(RSV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)。除 了这些逆转录病毒以外，本发明的活性剂可能用作抗整合酶样蛋白的抑 制剂用于抑制其他病毒如乙型肝炎病毒(HBV)的复制。
其他病毒：还可以考虑将本发明的活性剂用作治疗由例如肝炎病 毒、疱疹病毒、正粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒 和多瘤病毒引起的病毒性感染。优选用本发明的活性剂治疗的病毒包括 下表中所列的那些：
表2 病毒科名 通用名称 宿主动物 肝DNA病毒科 乙型肝炎病毒 土拨鼠肝炎病毒 鸭乙型肝炎病毒 人 土拨鼠 鸟类 疱疹病毒科 1型单纯疱疹病毒 2型单纯疱疹病毒 水痘带状疱疹病毒 EB病毒 巨细胞病毒 传染性牛鼻气管炎病毒 牛乳腺炎病毒 马流产病毒 假狂犬病病毒 马立克氏病 土耳其疱疹病毒 人 人 人 人 人 哺乳动物 哺乳动物 哺乳动物 哺乳动物 鸟类 鸟类 正粘病毒科 A型流感 B型流感 C型流感 许多物种 主要是人 主要是人 乳头瘤病毒科 牛乳头瘤病毒-1(BPV-1) 牛乳头瘤病毒-2(BPV-2) 牛乳头瘤病毒-4(BPV-4) CRPV DPV 人乳头瘤病毒-1(HPV-1) HPV-5 HPV-6 HPV-8 HPV-11 HPV-16 HPV-18 HPV-31 HPV-33 牛 牛 牛 兔子 鹿 人 人 人 人 人 人 人 人 人 副粘病毒科 人1-4型副流感病毒 SV5 腮腺炎病毒 新城疫病毒 麻疹病毒 犬瘟热病毒 牛瘟病毒 呼吸道合胞体病毒(RSV) 牛呼吸道合胞体病毒 人 狗 人 鸡 人 狗 牛 人 牛
细小核糖核酸病毒科 人脊髓灰质炎病毒 人柯萨奇病毒 人艾可病毒 人甲型肝炎病毒 猪肠道病毒1-11 牛肠道病毒1和2 人鼻病毒1-100 牛鼻病毒1和2 口蹄疫病毒1-7 脑心肌炎病毒 马鼻病毒1和2 人 人 人 人 猪 牛 人 牛 牛和人 马 多瘤病毒科 多瘤病毒 猿猴空泡形成病毒40(SV40) 嗜淋巴细胞乳多空病毒(LPN) BKV JCV 兔肾空泡形成病毒(RKV) 小鼠 猴子 猴子 人 人 兔子
参见《基础病毒学》(Bernard N.Fields等人编辑，1991)。 C．化合物的制备方法
下文实施例1中描述了由含有活性剂的鼠尾草属物种，更优选由 SM和SY制备植物提取物的一般条件。所述化合物可以如下文合成制得。 通过在0.1％NH4OH中将浓度为5mg/ml的各个化合物保温24小时可生 成含有β-(3,4-二羟基苯基)乳酸或丹酚酸和/或咖啡酸部分的不同化 合物。这些包括丹酚酸的脱氢形式，偶联二聚体和较大的聚合物。时间 优选是3-24小时。在0.1％NH4OH中保温时间超过48小时可能导致化 合物的失活。活化时间还取决于化合物的起始浓度。高浓度的化合物将 需要较长的活化保温时间。这种形成反应也可以通过用其它碱性试剂将 溶液中化合物的pH调节为大于pH=8来实现。通过加入酸(如1％乙酸) 终止该反应，由此所得溶液的pH小于或等于7。其它可影响新化合物 形成的因素是温度和氧合作用。 D．药物组合物及其给药
为了治疗或医治病毒性感染，本发明的化合物可以以含有常规无毒 可药用载体、辅剂和赋形剂的剂量单位制剂经口服、局部、非肠道、吸 入喷雾或直肠给药。此处所用术语“非肠道”包括皮下注射，静脉内、 肌肉内、血管内注射或输注技术。除了治疗温血动物如小鼠、大鼠、马、 牛、绵羊、狗、猫等，本发明的化合物和组合物可有效治疗人类对象中 的病毒性感染。
为了向中枢神经系统给药，组合物可以给药至脑脊液中。为了鞘内 给药，非肠道给药的载体，特别是如存在于水中的葡萄糖或盐水载体是 适用的。组合物还可以制备为脂质体以加强转运穿过膜屏障。组合物也 可被制成贴剂用于经皮给药。疏水性化合物给药所用的溶剂也适用于此 目的，例如DMSO或可穿透皮肤屏障的油。
为了非肠道给药，可以制备本发明治疗性化合物的溶液，例如采用 芝麻油或花生油或丙二醇水溶液。如果必要，应适当缓冲水溶液(优选 pH大于8)，并且液态稀释剂首先要等渗。此类水溶液适合于静脉内注 射。油性溶液适合关节内、肌肉内和皮下注射。通过所属领域普通技术 人员公知的标准制药技术很容易实施所有这些溶液在无菌条件下的制 备。
含有活性成分的药物组合物可以是适合口服的形式，例如片剂、含 片、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊、 糖浆剂或酏剂。用于口服的组合物可以根据任何制备药物组合物的已知 方法制备，并且此类组合物可以含有一种或多种选自如下的试剂：甜味 剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，从而提供药学上适口的制剂。片剂可以 含有与适合制备片剂的无毒可药用赋形剂混合的活性成分。
为了口服给药，含有多种赋形剂如微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、 磷酸二钙和甘氨酸的片剂可以与多种崩解剂合用，如淀粉(并且优选玉 米、马铃薯或木薯淀粉)、藻酸和某些复合硅酸盐，同时结合制粒粘合 剂如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，润滑剂如硬脂酸 镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉常用于制片。类似的固体组合物也可以在 明胶胶囊中用作填充剂；优选的材料还包括乳糖或奶糖，以及高分子量 聚乙二醇。当需要水混悬液和/或酏剂用于口服给药时，活性化合物或 化合物的混合物可以与不同的甜味剂或矫味剂、着色物或染料合用，并 且如果必要，还可与乳化剂和/或助悬剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二 醇、甘油及其不同的组合合用。口服制剂也可以以硬明胶胶囊提供，其 中活性成分与惰性固体稀释剂混合，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土；或以 软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油性介质混合，如花生油、液体 石蜡或橄榄油。
所述赋形剂可为例如：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷 酸钙、磷酸钠；制粒崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明 胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以未 包衣，或可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并由 此在较长时间内提供缓释作用。例如，可采用时间延迟材料如甘油一硬 脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。也可以通过美国专利号4256108、4166452 和4265874中所述的技术包衣形成控释或延迟的渗透治疗片剂。
水混悬液可以含有与适合制备水混悬液的赋形剂混合的活性物质。 所述赋形剂包括：助悬剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲 基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或湿润 剂可以是天然磷脂，如卵磷脂，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物，如聚氧 乙烯硬脂酸酯；或氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，如十七亚乙氧基 鲸蜡醇；或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚 氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏 酯的缩合产物，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸。所述水混悬液也可 以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯。
通过将活性成分悬浮在植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油) 或矿物油(如液体石蜡)中可制得油性混悬液。油性混悬液可以含有增稠 剂，如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。通过加入抗氧剂如抗坏血酸保存这些 组合物。
可分散粉末和颗粒剂通过与水混合适合制备为水混悬液。这些组合 物可以提供与分散或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合在一起的 活性成分。适用的分散或湿润剂和助悬剂是如上文所例举的那些。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳液形式。油相可以是：植物 油，例如橄榄油或花生油；矿物油，例如液体石蜡；或它们混合物。适 用的乳化剂可以是天然树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然磷脂，如大 豆、卵磷脂；和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖 醇一硬脂酸酯)；和该偏酯与氧化乙烯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山 梨糖醇一硬脂酸酯)。
除其他本领域已知的方法外，含有本发明药物组合物的软膏通过将 活性成分与介质(由二元醇、低级烷醇和水组成)、胶凝剂和任选的辅剂 (如己二酸二异丙酯、癸二酸(sevacate)二乙酯、己酸(carproate) 乙酯和月桂酸乙酯)混合制得。适当的二元醇包括丙二醇、丁二醇、聚 乙二醇等。通常，用有机胺(如二异丙基胺和三乙胺)预中和的羧乙烯基 聚合物或纤维素(例如羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟 丙基纤维素)用作胶凝剂。
本发明的化合物和组合物也可以以栓剂的形式经直肠给药。这些组 合物可以通过将药物与适当的无刺激赋形剂混合制得，该赋形剂在常温 (如室温)下为固体但在直肠温度下为液体并且由此在直肠内熔融释放 出药物。适用的材料是可可脂和聚乙二醇类。
可以和载体物质混合以产生单一剂量的活性化合物或化合物混合 物的量取决于被治疗的宿主和给药的具体方式。单位剂量通常含有约 25mg至约1g的活性成分。活性成分的日剂量一般是在口服时为约1至 约300mg/kg体重并且在常规注射给药时为约0.1至100mg/kg体重。 药量可以一次给予或分二或多个等份在1天中给药。但应理解，对于任 一特定患者或对象的特定剂量水平应取决于多种因素，包括所用特定化 合物的活性、被治疗对象的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、 给药时间、给药途径、排泄速率、合用药物、病毒感染的时间和被治疗 的特定病毒感染的严重性。
本发明的化合物可以单独或与可药用载体或稀释剂组合在一起、通 过任何有效途径给药，优选上述三种途径中的一种给药途径。给药可以 以单剂量或多剂量进行。具体而言，本发明的新的治疗剂可以以多种不 同的剂型给药，即，它们可以与多种可药用惰性载体混合成为片剂、胶 囊、锭剂、含片、硬糖、散剂、喷雾剂、霜剂、油膏剂、栓剂、胶冻、 凝胶、糊剂、洗剂、软膏、水悬液、注射液、酏剂、糖浆剂等，如上文 所述。
下文提供的实施例仅供举例说明本发明的某些实施方案并不对本 发明构成限定。
实施例1
从SM和SY提取抗病毒剂
SM和SY的植物提取物制备如下：
步骤1：干燥的SY在Milli-Q蒸馏水(dH2O)(18.0mOhm/cm)中煮 沸且浓缩为终密度为1.30g/ml。随后用dH2O 1∶5稀释该提取物，在 GS-3转子中以8000rpm在25℃下离心90分钟。弃去沉淀，保留上清 液。向该上清液中加入十分之一体积的1.0N HCl溶液使HCl的终浓度 为0.1N。将此上清液在25℃下保温过夜。该溶液在GS-3转子中以 8000rpm在25℃下离心90分钟，所得沉淀用95％乙醇洗涤，随后经 0.2μm过滤系统过滤。重复该操作直至洗涤溶液变澄清。随后室温下令 沉淀在过滤部件中干燥，随后在70℃的烘箱中保温过夜。将粉末以沉 淀与水1∶5的比例重新悬浮在dH2O中，所得产物在Ti45转子中以 25000rpm在25℃下离心30分钟。弃去上清，所得沉淀重悬在50％乙 醇中。另外，上清液也可以重悬在50％甲醇中。
步骤2：将重悬液过滤除去不溶物。
步骤3：将滤液浓缩至原体积的五分之一(1/5)形成沉淀。沉淀用 蒸馏水洗涤。随后将洗涤的沉淀冷冻干燥过夜。干燥、洗涤后的沉淀称 作部分1。
步骤4：将由步骤3获得的干燥粉末溶解在50％甲醇中。将该溶 液离心除去任何不溶物。将上清液加载在用蒸馏水平衡的Sephadex LH-20柱上。用大量蒸馏水冲洗该柱且以下列顺序的溶液洗脱：含15 ％甲醇的水(v/v)，含30％甲醇和1％醋酸的水(v/v)，含40％甲醇的 水(v/v)，含50％甲醇的水(v/v),75％甲醇的水(v/v)，和100％甲 醇。所用溶液的顺序取决于起始溶液。浓缩用50％甲醇水溶液洗脱出 的流分且加载在HPLC反相柱(Ultrasphere ODS,4.6×250mm,5μM) 上，其用10％甲醇和0.1％甲酸平衡。该柱利用10％甲醇/0.1％甲酸 和100％甲醇/0.1％甲酸的25分钟梯度以1ml/min洗脱。通过在275nm 监测吸收度来检测化合物。
步骤5：通过质谱法分析由HPLC反相柱洗脱出的各流分的分子量。 质谱鉴定出下列化合物：
MW 化合物
1 180 啡酸(#1)
2 198 D-(3,4-二羟基苯基)乳酸(#2)
3 359 迷迭香酸(#3)
4 387 迷迭香酸的盐形式(Yunnaneic acid C
和Yunnaneic acid D)
5 494 2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)咖啡酸(#
5)或丹酚酸
7 717 紫草酸B(#7)
8 739 紫草酸镁B(#8)
9 853 迷迭香酸和2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)
咖啡酸的组合(#9)
10 987 MW为987的#5的二聚体(#10)，
如下文实施例4所述 这些化合物的结构式如下：
Yunnaneic Acid C
Yunnaneic Acid D
实施例2
抗病毒试验：病毒抑制的功效
体外HIV-1整合酶试验：已研制出用于监测HIV-1整合酶活性的 体外试验，如下文所述。这些试验利用纯化的重组HIV-1整合酶和代 表病毒DNA的LTR末端的寡核苷酸底物。体外试验所得数据的重要作 用在于试验反映了体内发生的实际功能活动。已开发出荧光分析(Lee 等人，《分析生物化学》227:295-301(1995))和放射性试验用来改进 上述公开的体外试验(Lee等人《生物化学》34:10205-10214(1995)； Lee等人《生物化学》34:10215-10223(1995))。此外，我们改进了 酶制剂，它提高了HIV-1整合酶样本的质量(Lee & Han，《生物化学》 35:3837-3844(1996)；Lee等人，《生物化学》36:173-180(1997))。 体外试验和样本制剂的上述改进已经能够更好地反映出体内发生的活 动。因此，当寻找有效整合酶抑制剂时，该体外试验的结果是极其有效 的病毒传染性的预示变量。
部分1在抑制HIV-1整合酶中的活性测定如下。首先将部分1溶 解在适当体积的0.1％NH4OH(w/v)使终浓度为15mg/ml。随后将这些样 本以10000rpm离心30分钟。如果形成沉淀，分离出上清液；干燥沉 淀且进一步溶解在0.1％NH4OH(w/v)中。所得溶液是提取物的储备液。 由此储备液，进行以下的稀释：1∶10,1∶50,1∶100,1∶200,1∶300, 1∶400,1∶500,1∶600,1∶700,1∶800,1∶900,1∶1000,1∶2000, 1∶3000,1∶4000,1∶5000和1∶10000。将各种这些稀释液的1μl分别 加入各反应混合物中，它们的终浓度分别相应为75,15,7.5,3.75, 2.5,1.875,1.5,1.25,1.07,0.9375,0.833,0.75,0.375,0.25, 0.1875,0.15和0.075μg/ml。随后按已述方法进行试验(Lee，《生 物化学》34:10205-10214(1995)；Lee等人，《生物化学》34: 10215-10233(1995)；Lee ＆ Han(1996))。
为了测定各部分的IC50和IC90，将凝胶暴露于PHOSPHORIMAGERTM 屏并且通过分子动力学PHOSPHORIMAGERTM测定裂解百分比。通过由阳 性对照的裂解百分比减去各部分的裂解百分比并且随后将该值除以阳 性对照的裂解百分比可测出抑制百分率。结果证实部分1在培养基中具 有0.2-1.2μg/ml的IC50和2.5-3.5μg/ml的IC90。所以，在活哺乳动 物中，血浓度高达约100X，该水平可被耐受和有效。
实施例3
SM提取物的体外试验
猫免疫缺陷病毒(FIV)模型是一种被接受的动物模型，用于研究抗 HIV感染的药物。FIV是分离自猫的T细胞营养性慢病毒。FIV在生物 学上和生物化学上类似于HIV，包括FIV和HIV整合酶间的高同源性。 FIV感染的猫会患猫获得性免疫缺陷综合征(FAIDS)，其类似于人体中 的成熟AIDS。
细胞培养中的体外FIV模型：Crandell-Reese猫肾(CrFK)细胞系 对FIV感染敏感且支持病毒复制。CrFK细胞是生产病毒和分析FIV感 染的有效工具。虽然FIV不导致FIV感染的CrFK细胞出现细胞病变， 但已有筛选组织培养物中的FIV感染的诊断试验。研究证实了SY的功 效。
ED50的测定：对部分1保护CrFK细胞不被FIV感染的作用进行试 验。以一式三份，将CrFK细胞铺板，密度为1×105细胞/T25瓶。 随后培养24小时使细胞附着并且生长，将化合物的溶液加入细胞培养 物中24小时。该溶液是通过将本发明的活性剂溶解在磷酸盐缓冲液(pH 8)中使浓度为100mg/ml来制备，随后25℃下在Ti45转子中以 25000rpm离心30分钟。除去上清液，在开式真空下通过离心将三份 1ml等份试样干燥用于测定溶液的浓度。将活性剂进一步稀释为 2mg/ml，经0.2μm醋酸纤维膜过滤，通过测定干燥溶质的质量与标定 对照对比来测出浓度。
结果证实，部分1防止CrFK细胞的FIV感染的ED50为0.1至 1.0μg/ml；ED90为0.2至2.5μg/ml。通过这些结果，本发明的组合物 可以在可药用载体中给药并且应以足够的剂量给药以使血药浓度为 10nM至1000nM。然而，在一些情况下必须施用获得高达10000nM的血 药浓度的剂量。活性更高的药剂可以在低至1nM的血药浓度下有效。
实施例4
丹酚酸的偶联
在碱性条件下，丹酚酸(化合物1)可以产生另外三种脱氢形式(化 合物2-4)。丹酚酸及其衍生物(丹酚酸的脱氢形式)偶联为二聚体形式 导致形成若干种结构如下的化合物。这些偶联是丹酚酸与其脱氢形式的 均聚二聚体和/或杂二聚体。这些化合物在小于1μg/ml的浓度下显示 出抗HIV-1整合酶活性。
丹酚酸的基本结构(化合物1)为(如下所示)： A、B、C和D分别代表化合物1的碳24、27、35和38上的氢。这些 氢是偶联的潜在位点。所以，丹酚酸与其自身(化合物1)的偶联，即均 聚二聚体导致下列组合的形成(化合物5-13)：化合物5是A与A偶联 (图1)；化合物6是A与B偶联(图2)；化合物7是A与C偶联(图3)； 化合物8是A与D偶联(图4)；化合物9是B与B偶联(图5)；化合物 10是B与C偶联(图6)；化合物11是C与C偶联(图7)；化合物12 是C与D偶联(图8)；化合物13是D与D偶联(图9)；化合物24是化 合物1的B与化合物1的D偶联(图13)。
在碳24和38、碳24和35及碳27和38上脱氢可形成丹酚酸的 三种脱氢形式(化合物2-4)。这些形式具有如下基本结构： 化合物2,24-38(图10)： 化合物3,24-35(图11)： E代表偶联位点。 化合物4,27-38(图12)： F代表偶联的位点。
丹酚酸的脱氢形式(化合物2-4)可以形成均聚二聚体。这意味着化 合物3可以与其自身在位点E偶联形成化合物14，并且化合物4与其 自身在位点F偶联形成化合物15。
这些脱氢形式也可以与丹酚酸形成杂聚二聚体。形成的潜在杂聚二 聚体是：化合物1的A与化合物3的E偶联形成化合物16；化合物1 的B与化合物3的E偶联形成化合物17；化合物1的C与化合物3的 E偶联形成化合物18；化合物1的D与化合物3的E偶联形成化合物 19；化合物4的F与化合物1的A形成化合物20；化合物4的F与化 合物1的B偶联形成化合物21；化合物4的F与化合物1的C偶联形 成化合物22；和化合物4的F与化合物1的D偶联形成化合物23。
除了这些二聚体，可以形成此类的三聚体和更高聚合物。这些化合 物结构中的变化应为所属技术领域普通技术人员所公知。
可以预见，这些化合物可被修饰为含有乙酰基、成为该化合物的酯 类、酚酐或可药用盐。
实施例5
偶联所致的抗整合酶活性的时间依赖性活化
实施例4的化合物1被纯化并且利用质谱和NMR确认。随后化合 物1与0.1％NH4OH在浓度5mg/ml下保温不同的时间(5分钟，30分钟， 1小时，2小时，3小时，4小时，5小时和24小时)。加入1％乙酸终 止该反应并且测定抗HIV-1整合酶活性。结果证明经在0.1％NH4OH中 保温，样品被时间依赖性地活化。这种活化作用是化合物1的不同偶联物 的结果。结果如表3所示：
表3 时间 pH6.0 IC50(μg/ml) pH=6.0 3.5 5分 1.8 30分 1.7 1小时 1.5 2小时 1.5 3小时 1.05 4小时 1.0 5小时 0.9 24小时 0.5
将MW为492的纯化化合物(例如化合物2-4，如上所述)与0.1％ NH4OH在浓度5.0mg/ml下保温不同的时间(5分钟，30分钟，1小时， 1.5小时，2.0小时和3.0小时)。加入1％乙酸终止该反应并且测定抗 HIV-1整合酶活性。结果证明经在0.1％NH4OH中保温，化合物2-4被 时间依赖性地活化。但这种活化作用不如化合物1的偶联物那么大。结 果如表4所示：
表4 样品 IC50 5分钟 ＞7.5 30分钟 5.5 1小时 5.2 1.5小时 4.2 2.0小时 4.1 3.0小时 2.1
实施例6
活化化合物1的抗HIV-1整合酶活性
将0.8g的实施例4的化合物1在80ml的0.1％NH4OH中以终浓度 10mg/ml保温8小时。此活化样品随后加载在SEPHADEXLH20柱上 并用浓度递增的甲醇水溶液洗脱。将洗脱流分冷冻干燥且分析抗HIV-1 整合酶活性。结果如表5所示：
表5 流分 IC50(μg/ml) 原液 1.1 10％甲醇 1.1 20％甲醇 0.69 30％甲醇 0.81 40％甲醇 0.92 50％甲醇 0.4 60％甲醇 0.92 70％甲醇 3.2 80％甲醇 ＞7.5
50％的样本具有最佳活性，随后利用质谱分析。质谱显示出492 和986的两个主峰。这些峰与丹酚酸的单体和丹酚酸的二聚体相对应， 这表明这些物质是活性的抗病毒成分。所以，这些结果显示，产生整合 酶抑制作用的活性抗病毒剂是丹酚酸和/或其二聚体形式。
这些流分的抗HIV-1感染活性的功效采用CEMTART细胞评定。这些 细胞是对CEM按照实施例8中所述进行工程化。采用如实施例8中所 述的HIVp24抗原捕获试验。结果在下表6中所示：
表6 样品 IC50(μg/ml) 10％ 41 20％ 2.2 30％ 12 40％ 7 50％ 3.8 60％ 40 70％ 40 80％ 未测量
实施例7
抗HIV-1整合酶活性
将实施例1的部分1溶解在40％甲醇(水中)中并且在GSA转子中 以8000rpm离心30分钟。将上清液部分加载在用40％甲醇(水中)平 衡的SEPHADEXLH20柱上。该柱用40％甲醇溶液(水中)冲洗并且用 50％、60％、70％、80％和90％的甲醇溶液(水中)洗脱。随后将样本 冷冻干燥并且溶解在适当体积的甲醇中以使最终的储备浓度为 5mg/ml。这些流分用于测定抗HIV-1整合酶活性。试验浓度为5,2.5, 2,1.5,1.25,1,0.8,0.6,0.4和0.2μg/ml。通过由阳性对照的 裂解百分比减去各流分的裂解百分比并且随后将该值除以阳性对照的 裂解百分比可得出抑制百分率。
表7 体外HIV-1整合酶活性试验的结果 流分 IC50(μg/ml) 40 0.84 50 0.70 60 0.68 70 0.60 80 0.57 90 0.50
将SEPHADEXLH20柱60-80％的流分合并且溶解在40％甲醇水 溶液中。将重悬样本在GSA转子中以8000rpm离心30分钟。将上清液 加载在用水中的40％甲醇平衡的MCI GEL CHP20P(75-150μ)柱上。该 柱用40％甲醇溶液(水中)冲洗并且用50、60和70％的甲醇溶液(水中) 洗脱。随后将样本冷冻干燥且按照上述方法在不同条件下分析。
表8
体外HIV-1整合酶活性试验的结果 #样本 IC50,MeOH (μg/ml) IC50,pH6.0 (μg/ml) IC50,0.1％NH4OH (μg/ml) MCI40 0.32 0.70 0.44 MCI50 0.34 0.80 0.58 MCI60 0.42 1.00 0.62
随后通过质谱法(负离子模式)分析MCI GEL CHP20P(75-150μ)样品。 结果显示，MCI 40具有986的主峰和494的次峰。MCI 50具有492和 986的主峰。MCI60具有984和986的主峰。通过质谱和NMR测定可肯定 494峰代表丹酚酸。492峰代表丹酚酸的脱氢形式。986峰代表丹酚酸的 二聚体形式。984峰代表492和494的混合二聚体。这结果表明，部分1 的活性成分是分子量为984和/或986的化合物。这些试验数据表明，分 子量为984和986的二聚体化合物由化合物1生成。
实施例8
活性剂的抗HIV-1活性试验
用CEＭTART细胞评估MCI GEL CHP20P(75-150a)流分的抗HIV-1感 染活性。这些细胞由CEM细胞通过基因工程获得且在组成性地表达 HIV-1tat和rev基因。CEMTART细胞提供了评价HIV感染的安全体系， 因它们被基因工程化来生产HIV-1的复制不能形式，HIVΔtat/rev。利用 HIV p24抗原捕获试验评估化合物抑制HIV-1感染的功效。该试验采用 p24核心蛋白单克隆抗体包被的96孔平板，其中将细胞培养基或血清 培养2小时。在用HIVΔtat/rev感染至少1周后从细胞除去上清液。冲洗 孔，随后加入生物素化抗HIV-1 p24多克隆抗体。加入信号扩增底物 后，相对于已知标准直接定量p24的表达。
将MCI 40、50和60溶解在甲醇中，并且以下列浓度评定这些化 合物抑制HIV-1感染的性能：100,20,10,5和1μg/ml。向24孔组 织培养皿中加入2ml的3.33×104CEMTART细胞和试验浓度的化合物。 向其中加入5000 TCID50/106细胞的HIV-1接种物。每周更换2次培 养基，以使0.8ml的细胞混悬液重新悬浮在2ml的更换培养基中。随 后在p24存在下分析无细胞上清液。7天和10天后通过对比药物存在 或不存在下的HIV-1 p24抗原生产来评定抗HIV-1功效。结果如表9 和10所示：
表9：第7天 样品 浓度(μg/ml) ％抑制 MCI40 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI50 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI60 100 100 20 100 10 100 1 0
表10：第10天 样品 浓度(μg/ml) ％抑制 MCI40 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI50 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI60 100 100 20 100 10 100 1 0
上述所有参考文献在此引入作为参考。还引入母专利申请美国申请 号09/104363(提交于1998.6.25)作为参考。
SM植物具有数种可提取的部位。根部首先用乙醇提取随后用冷水 提取(SM(I))或用热水(SM(I))提取。两种用水提取的部分都显示出抗 病毒活性。
目前开发了以病毒生命周期中不同点为靶子的抗病毒剂。例如，已 开发出用于治疗逆转录病毒感染的抗病毒剂，其是以逆转录病毒特异性 酶如逆转录酶(RT)和整合酶为靶子。寻找其他抗病毒剂以对抗疾病(如 疱疹、肝炎和流感)的研究仍在继续。
抗逆转录病毒的抗病毒剂：以整合酶蛋白为靶子的抗病毒剂包括肽 抑制剂(美国专利号5578573)、核酸配体抑制剂(美国专利号5757287 和5587468)以及如伊快霉素(Equisetin)(美国专利号5759842)和 Ermophilane倍半萜类化合物(美国专利号5858738)。迄今为止，已经 鉴定了多种化合物并且已由FDA批准上市用于HIV，但仅批准了RT和 蛋白酶抑制剂。
作为抗病毒剂的咖啡酸：咖啡酸分离自野生九重葛属植物 (Bougainvillea spectabillis Wild)(Nyctaginaceae)的茎部，其 在民间已用来抗肝炎(Chang等人，《抗癌研究》(Anticancer Res)14: 501-6(1994))。据报导咖啡酸可抑制黄嘌呤氧化酶，该酶与若干疾病 如痛风、肝炎和肿瘤有关(Chan等人，《抗癌研究》15:703-7(1995)； 和Chang等人(1994))。咖啡酸氧化产物(KOP)抑制Ⅰ型和Ⅱ型人疱疹 病毒(Thiel等人，病毒学杂志(Acta Virol)27:200-8(1983))。根 据Kashiwada等人在《自然进程杂志》(J.Nat.Prod.)58: 392-400(1995)所述，咖啡酸四聚体和咖啡酸四聚体葡糖苷的二钾盐及 钾钠盐具有抗HIV活性。市售的咖啡酸也具有抗病毒活性，这已利用对 HIV的RT试验得到证实(Kreis等人《抗病毒研究》(Antiviral Res.)14 323-37(1990))。咖啡酸苯乙酯(CAPE)对于HIV-1的整合酶蛋白具有 抑制活性(Fesen等人《美国科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci,USA) 90:2399-2403(1993)；Fesen等人《生物化学和药理学》 (Biochem.Pharmacol.)48:595-608(1994)；Burke等人《药物化 学杂志》(J.Med.Chem.)38:4171-8(1995)；Mazumder等人《药物 化学杂志》39:2472-81(1996))。然而，用于制备咖啡酸聚合物的方 法影响其HIV-1和HIV-2抑制活性(Nakashima等人《化学和药学通讯》 (Chem.Pharm.Bull.)(东京)40:2102-5(1992))。咖啡酸与肉桂酸 和迷迭香酸(rosemarinic acid)一起还可用于治疗流感病毒，因其具 有抗氧活性(国际专利申请98/30228)。
作为抗病毒剂的迷迭香酸和紫草酸(lithospermic acids)：迷 迭香酸是咖啡酸的二聚体。迷迭香酸的二聚体是紫草酸。已经鉴定出在 SM根部的提取物中同时存在迷迭香酸和紫草酸(Kohda等人《化学和药 学通讯》(东京)37:1287-90(1989))。迷迭香酸具有抗HIV活性(Arda 等人《自然进程杂志》60:1170-3(1997))并且是有效的1型单纯疱疹 (HSV-1)抑制剂(Dimitrova等人，《保加利亚微生物学杂志》(Acta Microbiol.Bulg.)29:65-72(1993))。迷迭香酸被推荐用于治疗炎性 疾病和失调(美国专利号4329361)。
作为抗病毒剂的肉桂酸：取代肉桂酸酯抑制流感病毒A/香港(H3N2) 的感染活性(Serkedjieva等人《自然进程杂志》55:294-302(1992))； 肉桂酸衍生物的甾酯被证实在体外对于属于细小核糖核酸病毒科、正粘 病毒科、副粘病毒科和疱疹病毒科的病毒具有抗病毒活性(“肉桂酸衍 生物的胆甾醇酯的抗病毒活性”Z.Naturforsch 53:883-7(1998)； Conti等人《抗病毒化学和化学治疗法》(Antivir.Chem. Chemother.)9:511-5(1998))。取代肉桂酸的脱氢聚合物也被描述为 HIV-I治疗剂(美国专利号5346695和5632980)。
丹酚酸：文献中未报导丹酚酸具有抗病毒性质。若干形式的丹酚酸 (例如丹酚酸A、乙酰基丹酚酸)据报道具有抗氧特性(Lin等人《生物 化学和药理学杂志》51:1237-1241(1996))。丹酚酸也显示出可预防 肝损伤和纤维变性，与其抗脂质过氧化作用有关(Hu等人，Acta Pharmacol.Sin,18:478-480(1997))，并且可用于治疗冠心病(日本 专利2131423)。文献中公开的丹酚酸的其他形式包括分离自贵州鼠尾 草水提取物的那些(例如丹酚酸A、B、C、H和I)(Zhang等人《植物医 学》60:70-72(1994))或分离自丹参水提取物的那些(例如丹酚酸K， 一种咖啡酸三聚体)(Kasimu等人《化学和药学通讯》 46:500-504(1998)；和Tezuka等人《化学和药学通讯》46: 107-112(1998))。丹酚酸F2和F3可以通过Dalla等人在《四面体》 55:6923-2930(1999)；和Dalla等人《四面体通报》39: 8285-8286(1998)中所述的合成方法来制备。鼠尾草科的其他成员可以 用作获得丹参的来源，包括：南丹参，S.deserta,S.miltiorhiza var.miltiorhiza f.alba，皖鄂丹参，紫化拟丹参、甘西鼠尾、褐 毛甘西鼠尾、紫花浙皖丹参和三叶鼠尾草)(Kasiumu等人，1998)。产 生丹酚酸之类化合物高次级代谢水平植物的方法业已公开。见美国专利 号5869340(1999)。
(3,4-二羟基苯基)乳酸：SM的主要组分是“丹参素”，化学上称 作β-3,4-二羟基苯基乳酸钠(Fen等人，Acta Acad.Med.Primae Shanghai 10:133-6(1983))；Zhao等人，Chin Pharm.J.29: 291-93(1994))。它在细胞培养中是制备迷迭香酸的中间体化合物 (A1-Sereiti等人《印度实验生物学杂志》(Indian J.Exp.Biol.)37: 124-130(1999)；Bogucki等人《加拿大化学杂志》(Can.J.Chem.)75: 1783-94(1997)；和美国专利号5011775)。
用抗病毒剂治疗病毒介导的疾病可能相当昂贵。例如，采用逆转录 酶和蛋白酶抑制剂治疗HIV-1每年耗费每位患者约12000-20000美元。 由于大多数HIV感染患者居住在发展中国家，须开发其他更经济实惠的 医疗方法用于治疗HIV和其他病毒性疾病。本发明提供一种鉴定、制备 和应用新化合物的方法和用作抗病毒治疗剂的组合物。
发明概述
本发明的一个方面描述了含有具有至少一个得自β-(3,4-二羟基苯 基)乳酸和/或咖啡酸的部分的分子的组合物，该分子存在于鼠尾草属的 提取物中，所述部分如下式所示： 该活性物质具有至少190道尔顿的分子量。β-(3,4-二羟基苯基)乳酸 部分的R1可以是-OH、-O-或一个键，并且R2可以是-H或一个键。咖啡 酸部分的R3可以是-OH或-O-；R4可以是一个键或 其中R5是-OH或一个键；R6可以是-H或一个键，并且R7可以是-H或一 个键。
在另一实施方案中，本发明涉及偶联产物，其是丹酚酸和/或丹酚 酸的脱氢形式的单体单元的均聚物或杂聚物，该偶联产物具有约492 或更高的分子量，或其含乙酰基、酯或酸酐衍生物，或其可药用盐。在 一个优选实施方案中，该偶联产物是丹酚酸(Ⅰ)和/或丹酚酸脱氢形式 (Ⅱ)或(Ⅲ)的单体单元的均聚物或杂聚物，该丹酚酸具有以下结构： 并且丹酚酸的脱氢形式具有以下结构： 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢或一个键，该均聚物或杂聚物的单体 单元彼此通过R1、R2、R3、R4、R5和R6键合。
本发明还涉及一种制备抗病毒剂的方法，该方法包括将丹酚酸在碱 性pH下保温使均聚物或杂聚物形成，它们具有高于丹酚酸的抗病毒活 性。
本发明的试剂具有抗病毒活性且可以在可药用载体中全身或局部 给药。
附图简述
图1．实施例4的化合物5的三维图示。
图2．实施例4的化合物6的三维图示。
图3．实施例4的化合物7的三维图示。
图4．实施例4的化合物8的三维图示。
图5．实施例4的化合物9的三维图示。
图6．实施例4的化合物10的三维图示。
图7．实施例4的化合物11的三维图示。
图8．实施例4的化合物12的三维图示。
图9．实施例4的化合物13的三维图示。
图10．实施例4的通过丹酚酸碳24和38脱氢生成的化合物2的三 维图示。
图11．实施例4的通过丹酚酸碳24和35脱氢生成的化合物3的三 维图示。
图12．实施例4的通过丹酚酸碳27和38脱氢生成的化合物4的三 维图示。
图13．实施例4的化合物24的三维图示。
发明详述
本发明利用另外的途径来开发衍生自植物提取物的药物，特别是鼠 尾草属植物的提取物。这些活性剂在多种不同的病毒(包括逆转录病毒) 中抑制病毒整合。在一个优选实施方案中，所述活性剂抑制病毒基因组 全部或部分整合在宿主细胞的基因组内。该活性剂还可以通过干扰病毒 生活周期的其他位点抑制病毒感染、病毒增进和/或病毒增殖。
鼠尾草属(唇形科)含有约700种，它们位于世界的热带和温带地 区，并且约300种是在亚洲、欧洲和非洲而400种位于美洲(J.C. Willis，《开花植物和蕨类植物辞典》(第7版，剑桥大学出版社，1966)； J.Briquet,Labiatae,DIE NATURLICHEN PFLANZENFAMILIEN第 Ⅳ卷，3a,183-375(Engler & Prantl编辑，Englemann,Leipzig, 1897))。本发明的抗病毒化合物和组合物可以衍生自任何鼠尾草属的 物种，但优选来自SM和SY。 A．定义
术语“病毒抑制有效量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是 指活性剂以该量向患有病毒性感染或病毒介导疾病的对象给药时，所述 感染或疾病被缓解，或感染被抑制的程度超过任何由活性剂引起的有害 副作用。此类活性剂被认为是“抗病毒剂”。
术语“病毒介导病症”是指与病毒性感染有关的疾病表型。例如， AIDS相关综合征(ARC)是与HIV-1感染有关的病症。
术语“抗病毒活性”是指抑制或减轻病毒感染或与病毒感染有关病 症的能力。本发明具有抗病毒活性的化合物优选以≤1μM的剂量抑制体 外感染，或退一步体外优选小于或等于约10mM。
术语“整合酶活性”是指整合酶蛋白或可以整合病毒基因组或病毒 基因组片段进入宿主细胞基因组中的蛋白。绝大多数整合酶蛋白与逆转 录病毒科的成员有关。
术语“鼠尾草属植物”是指唇形科鼠尾草属的植物。优选用于分离 本发明化合物的鼠尾草植物是“丹参”或“SM”和“云南鼠尾草”“SY”。 术语“偶联衍生物”或“较大聚合物”是指包括二聚体、三聚体、 四聚体等的活性剂，其中单体单元是如下部分之一： 偶联衍生物或较大聚合物可以是上述残基的均聚二聚体、均聚三聚体、 均聚四聚体等，或杂二聚体、杂三聚体、杂四聚体等。偶联衍生物的一 个例子是紫草酸盐B，其是迷迭香酸的二聚体，而迷迭香酸是咖啡酸的 二聚体。 B．病毒
治疗或抑制任何对本发明抗病毒化合物和组合物产生反应的病毒 性感染都属于本发明的范围内。优选的病毒是下列病毒科：肝炎病毒、 疱疹病毒、正粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒、多 瘤病毒和逆转录病毒。
逆转录病毒：本发明的化合物和组合物优选用于治疗逆转录病毒感 染。虽然逆转录病毒属于一个清楚限定的相对均一的病毒属，但它们历 史上被再分为三种分类组，主要是基于感染的病理结果。肿瘤病毒亚组 包括能够在感染宿主中引起肿瘤性疾病的逆转录病毒，以及若干有关但 显然是良性的病毒。慢病毒引起缓慢、长期的疾病，其通常但不总是缺 少肿瘤成分。慢病毒还有待与任何人体或动物的疾病清楚地关联。
逆转录病毒复制是由病毒体核穿透胞质内引发的，它是一个由病毒 包膜糖蛋白与特异性细胞表面受体的特定相互反应所介导的过程。此 后，与病毒体有关的依赖于RNA的DNA聚合酶将单链RNA基因组转录 成双链线性DNA原病毒中间体(逆转录)。整合蛋白(整合酶)特异性地 识别病毒DNA的两个末端并且从3，-末端脱去两个核苷酸(3’-供体加 工)。随后经加工的病毒DNA和整合酶迁移至核中，其中病毒整合酶使 逆转录病毒基因组共价连接在宿主染色体DNA上(链转移)，由此形成 逆转录原病毒。
作为重要的人体致病原，I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)的出现提高 了对逆转录病毒的科研兴趣。特别是，有证据表明，上述单一生活周期 不能完全描述所有逆转录病毒的复制周期。例如，HIV-1除了特征逆转 录病毒Gag、Pol和Env以外编码不少于6个基因产物；这些翻译自一 组新的单剪接和多剪接病毒mRNA种类。这些附加蛋白中的至少两种(称 作Tat和Rev)以反式直接作用于调节HIV-1基因的表达。所以，穿透 和原病毒整合之间的步骤对于MLV(鼠科白血病病毒)和HIV-1两者似 乎相当类似，但发现整合后事件在后者中明显更加复杂。目前，已清楚 HIV-1仅仅是动物逆转录病毒这一大类型中的一种，这一大类目前称作 “复合”逆转录病毒。属于这种复合逆转录病毒的逆转录病毒包括所有 慢病毒，泡沫病毒，以及HTLV-1和有关病毒(表1)。
表1：逆转录病毒中的主要分类 类 亚组 原型 其他例子 单纯逆转录病毒 A组C型逆转录病毒 B组C型逆转录病毒 B型逆转录病毒 D型逆转录病毒 RSV MLV MMTV MPMV ALV,ASV FeLV,MSV SNV REV SSV SRV-1 复合逆转录病毒 慢病毒 T细胞白血病病毒 泡沫病毒 HIV-1 HTLV-1 HSRV HIV-2,SIV，绵 羊髓鞘脱落病 毒，FIV EIAV HTLV-II, STLV,BLV SFV,BFV
缩写：RSV，鲁斯氏肉瘤病毒；ALV，鸟白血病病毒；ASV，鸟肉瘤病毒； FeLV，猫白血病病毒；MSV，鼠科肉瘤病毒；SNV，脾坏死病毒；REV， 网状内皮组织增殖病毒；SSV，猿猴肉瘤病毒；MMTV，小鼠乳腺瘤病毒； MPMV,Mason-Pfizer猴病毒；SRV-1,Ⅰ型猿猴逆转录病毒；STLV， 猿猴T细胞白血病病毒；BFV，牛泡沫病毒。
参与原病毒整合的步骤对于单纯和复合逆转录病毒而言相当类似。 因为这种机理上的共同特性，逆转录病毒整合酶的抑制剂将抑制多种生 物如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病 毒(FIV)、猫白血病病毒(FeLV)、鼠科白血病病毒(MuLV)、鲁斯氏肉瘤 病毒(RSV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)。除 了这些逆转录病毒以外，本发明的活性剂可能用作抗整合酶样蛋白的抑 制剂用于抑制其他病毒如乙型肝炎病毒(HBV)的复制。
其他病毒：还可以考虑将本发明的活性剂用作治疗由例如肝炎病 毒、疱疹病毒、正粘病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、细小核糖核酸病毒 和多瘤病毒引起的病毒性感染。优选用本发明的活性剂治疗的病毒包括 下表中所列的那些：
表2 病毒科名 通用名称 宿主动物 肝DNA病毒科 乙型肝炎病毒 土拨鼠肝炎病毒 鸭乙型肝炎病毒 人 土拨鼠 鸟类 疱疹病毒科 1型单纯疱疹病毒 2型单纯疱疹病毒 水痘带状疱疹病毒 EB病毒 巨细胞病毒 传染性牛鼻气管炎病毒 牛乳腺炎病毒 马流产病毒 假狂犬病病毒 马立克氏病 土耳其疱疹病毒 人 人 人 人 人 哺乳动物 哺乳动物 哺乳动物 哺乳动物 鸟类 鸟类 正粘病毒科 A型流感 B型流感 C型流感 许多物种 主要是人 主要是人 乳头瘤病毒科 牛乳头瘤病毒-1(BPV-1) 牛乳头瘤病毒-2(BPV-2) 牛乳头瘤病毒-4(BPV-4) CRPV DPV 人乳头瘤病毒-1(HPV-1) HPV-5 HPV-6 HPV-8 HPV-11 HPV-16 HPV-18 HPV-31 HPV-33 牛 牛 牛 兔子 鹿 人 人 人 人 人 人 人 人 人 副粘病毒科 人1-4型副流感病毒 SV5 腮腺炎病毒 新城疫病毒 麻疹病毒 犬瘟热病毒 牛瘟病毒 呼吸道合胞体病毒(RSV) 牛呼吸道合胞体病毒 人 狗 人 鸡 人 狗 牛 人 牛
细小核糖核酸病毒科 人脊髓灰质炎病毒 人柯萨奇病毒 人艾可病毒 人甲型肝炎病毒 猪肠道病毒1-11 牛肠道病毒1和2 人鼻病毒1-100 牛鼻病毒1和2 口蹄疫病毒1-7 脑心肌炎病毒 马鼻病毒1和2 人 人 人 人 猪 牛 人 牛 牛和人 马 多瘤病毒科 多瘤病毒 猿猴空泡形成病毒40(SV40) 嗜淋巴细胞乳多空病毒(LPN) BKV JCV 兔肾空泡形成病毒(RKV) 小鼠 猴子 猴子 人 人 兔子
参见《基础病毒学》(Bernard N.Fields等人编辑，1991)。 C．化合物的制备方法
下文实施例1中描述了由含有活性剂的鼠尾草属物种，更优选由 SM和SY制备植物提取物的一般条件。所述化合物可以如下文合成制得。 通过在0.1％NH4OH中将浓度为5mg/ml的各个化合物保温24小时可生 成含有β-(3,4-二羟基苯基)乳酸或丹酚酸和/或咖啡酸部分的不同化 合物。这些包括丹酚酸的脱氢形式，偶联二聚体和较大的聚合物。时间 优选是3-24小时。在0.1％NH4OH中保温时间超过48小时可能导致化 合物的失活。活化时间还取决于化合物的起始浓度。高浓度的化合物将 需要较长的活化保温时间。这种形成反应也可以通过用其它碱性试剂将 溶液中化合物的pH调节为大于pH=8来实现。通过加入酸(如1％乙酸) 终止该反应，由此所得溶液的pH小于或等于7。其它可影响新化合物 形成的因素是温度和氧合作用。 D．药物组合物及其给药
为了治疗或医治病毒性感染，本发明的化合物可以以含有常规无毒 可药用载体、辅剂和赋形剂的剂量单位制剂经口服、局部、非肠道、吸 入喷雾或直肠给药。此处所用术语“非肠道”包括皮下注射，静脉内、 肌肉内、血管内注射或输注技术。除了治疗温血动物如小鼠、大鼠、马、 牛、绵羊、狗、猫等，本发明的化合物和组合物可有效治疗人类对象中 的病毒性感染。
为了向中枢神经系统给药，组合物可以给药至脑脊液中。为了鞘内 给药，非肠道给药的载体，特别是如存在于水中的葡萄糖或盐水载体是 适用的。组合物还可以制备为脂质体以加强转运穿过膜屏障。组合物也 可被制成贴剂用于经皮给药。疏水性化合物给药所用的溶剂也适用于此 目的，例如DMSO或可穿透皮肤屏障的油。
为了非肠道给药，可以制备本发明治疗性化合物的溶液，例如采用 芝麻油或花生油或丙二醇水溶液。如果必要，应适当缓冲水溶液(优选 pH大于8)，并且液态稀释剂首先要等渗。此类水溶液适合于静脉内注 射。油性溶液适合关节内、肌肉内和皮下注射。通过所属领域普通技术 人员公知的标准制药技术很容易实施所有这些溶液在无菌条件下的制 备。
含有活性成分的药物组合物可以是适合口服的形式，例如片剂、含 片、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊、 糖浆剂或酏剂。用于口服的组合物可以根据任何制备药物组合物的已知 方法制备，并且此类组合物可以含有一种或多种选自如下的试剂：甜味 剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，从而提供药学上适口的制剂。片剂可以 含有与适合制备片剂的无毒可药用赋形剂混合的活性成分。
为了口服给药，含有多种赋形剂如微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、 磷酸二钙和甘氨酸的片剂可以与多种崩解剂合用，如淀粉(并且优选玉 米、马铃薯或木薯淀粉)、藻酸和某些复合硅酸盐，同时结合制粒粘合 剂如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，润滑剂如硬脂酸 镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉常用于制片。类似的固体组合物也可以在 明胶胶囊中用作填充剂；优选的材料还包括乳糖或奶糖，以及高分子量 聚乙二醇。当需要水混悬液和/或酏剂用于口服给药时，活性化合物或 化合物的混合物可以与不同的甜味剂或矫味剂、着色物或染料合用，并 且如果必要，还可与乳化剂和/或助悬剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二 醇、甘油及其不同的组合合用。口服制剂也可以以硬明胶胶囊提供，其 中活性成分与惰性固体稀释剂混合，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土；或以 软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油性介质混合，如花生油、液体 石蜡或橄榄油。
所述赋形剂可为例如：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷 酸钙、磷酸钠；制粒崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明 胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以未 包衣，或可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并由 此在较长时间内提供缓释作用。例如，可采用时间延迟材料如甘油一硬 脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。也可以通过美国专利号4256108、4166452 和4265874中所述的技术包衣形成控释或延迟的渗透治疗片剂。
水混悬液可以含有与适合制备水混悬液的赋形剂混合的活性物质。 所述赋形剂包括：助悬剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲 基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或湿润 剂可以是天然磷脂，如卵磷脂，或氧化烯与脂肪酸的缩合产物，如聚氧 乙烯硬脂酸酯；或氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，如十七亚乙氧基 鲸蜡醇；或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚 氧乙烯山梨糖醇单油酸酯；或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏 酯的缩合产物，如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸。所述水混悬液也可 以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯。
通过将活性成分悬浮在植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油) 或矿物油(如液体石蜡)中可制得油性混悬液。油性混悬液可以含有增稠 剂，如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。通过加入抗氧剂如抗坏血酸保存这些 组合物。
可分散粉末和颗粒剂通过与水混合适合制备为水混悬液。这些组合 物可以提供与分散或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合在一起的 活性成分。适用的分散或湿润剂和助悬剂是如上文所例举的那些。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳液形式。油相可以是：植物 油，例如橄榄油或花生油；矿物油，例如液体石蜡；或它们混合物。适 用的乳化剂可以是天然树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然磷脂，如大 豆、卵磷脂；和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖 醇一硬脂酸酯)；和该偏酯与氧化乙烯的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山 梨糖醇一硬脂酸酯)。
除其他本领域已知的方法外，含有本发明药物组合物的软膏通过将 活性成分与介质(由二元醇、低级烷醇和水组成)、胶凝剂和任选的辅剂 (如己二酸二异丙酯、癸二酸(sevacate)二乙酯、己酸(carproate) 乙酯和月桂酸乙酯)混合制得。适当的二元醇包括丙二醇、丁二醇、聚 乙二醇等。通常，用有机胺(如二异丙基胺和三乙胺)预中和的羧乙烯基 聚合物或纤维素(例如羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟 丙基纤维素)用作胶凝剂。
本发明的化合物和组合物也可以以栓剂的形式经直肠给药。这些组 合物可以通过将药物与适当的无刺激赋形剂混合制得，该赋形剂在常温 (如室温)下为固体但在直肠温度下为液体并且由此在直肠内熔融释放 出药物。适用的材料是可可脂和聚乙二醇类。
可以和载体物质混合以产生单一剂量的活性化合物或化合物混合 物的量取决于被治疗的宿主和给药的具体方式。单位剂量通常含有约 25mg至约1g的活性成分。活性成分的日剂量一般是在口服时为约1至 约300mg/kg体重并且在常规注射给药时为约0.1至100mg/kg体重。 药量可以一次给予或分二或多个等份在1天中给药。但应理解，对于任 一特定患者或对象的特定剂量水平应取决于多种因素，包括所用特定化 合物的活性、被治疗对象的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、 给药时间、给药途径、排泄速率、合用药物、病毒感染的时间和被治疗 的特定病毒感染的严重性。
本发明的化合物可以单独或与可药用载体或稀释剂组合在一起、通 过任何有效途径给药，优选上述三种途径中的一种给药途径。给药可以 以单剂量或多剂量进行。具体而言，本发明的新的治疗剂可以以多种不 同的剂型给药，即，它们可以与多种可药用惰性载体混合成为片剂、胶 囊、锭剂、含片、硬糖、散剂、喷雾剂、霜剂、油膏剂、栓剂、胶冻、 凝胶、糊剂、洗剂、软膏、水悬液、注射液、酏剂、糖浆剂等，如上文 所述。
下文提供的实施例仅供举例说明本发明的某些实施方案并不对本 发明构成限定。
实施例1
从SM和SY提取抗病毒剂
SM和SY的植物提取物制备如下：
步骤1：干燥的SY在Milli-Q蒸馏水(dH2O)(18.0mOhm/cm)中煮 沸且浓缩为终密度为1.30g/ml。随后用dH2O 1∶5稀释该提取物，在 GS-3转子中以8000rpm在25℃下离心90分钟。弃去沉淀，保留上清 液。向该上清液中加入十分之一体积的1.0N HCl溶液使HCl的终浓度 为0.1N。将此上清液在25℃下保温过夜。该溶液在GS-3转子中以 8000rpm在25℃下离心90分钟，所得沉淀用95％乙醇洗涤，随后经 0.2μm过滤系统过滤。重复该操作直至洗涤溶液变澄清。随后室温下令 沉淀在过滤部件中干燥，随后在70℃的烘箱中保温过夜。将粉末以沉 淀与水1∶5的比例重新悬浮在dH2O中，所得产物在Ti45转子中以 25000rpm在25℃下离心30分钟。弃去上清，所得沉淀重悬在50％乙 醇中。另外，上清液也可以重悬在50％甲醇中。
步骤2：将重悬液过滤除去不溶物。
步骤3：将滤液浓缩至原体积的五分之一(1/5)形成沉淀。沉淀用 蒸馏水洗涤。随后将洗涤的沉淀冷冻干燥过夜。干燥、洗涤后的沉淀称 作部分1。
步骤4：将由步骤3获得的干燥粉末溶解在50％甲醇中。将该溶 液离心除去任何不溶物。将上清液加载在用蒸馏水平衡的Sephadex LH-20柱上。用大量蒸馏水冲洗该柱且以下列顺序的溶液洗脱：含15 ％甲醇的水(v/v)，含30％甲醇和1％醋酸的水(v/v)，含40％甲醇的 水(v/v)，含50％甲醇的水(v/v),75％甲醇的水(v/v)，和100％甲 醇。所用溶液的顺序取决于起始溶液。浓缩用50％甲醇水溶液洗脱出 的流分且加载在HPLC反相柱(Ultrasphere ODS,4.6×250mm,5μM) 上，其用10％甲醇和0.1％甲酸平衡。该柱利用10％甲醇/0.1％甲酸 和100％甲醇/0.1％甲酸的25分钟梯度以1ml/min洗脱。通过在275nm 监测吸收度来检测化合物。
步骤5：通过质谱法分析由HPLC反相柱洗脱出的各流分的分子量。 质谱鉴定出下列化合物：
MW 化合物
1 180 啡酸(#1)
2 198 D-(3,4-二羟基苯基)乳酸(#2)
3 359 迷迭香酸(#3)
4 387 迷迭香酸的盐形式(Yunnaneic acid C
和Yunnaneic acid D)
5 494 2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)咖啡酸(#
5)或丹酚酸
7 717 紫草酸B(#7)
8 739 紫草酸镁B(#8)
9 853 迷迭香酸和2-(3,4-二羟基苯基乙烯基)
咖啡酸的组合(#9)
10 987 MW为987的#5的二聚体(#10)，
如下文实施例4所述 这些化合物的结构式如下：
Yunnaneic Acid C
Yunnaneic Acid D
实施例2
抗病毒试验：病毒抑制的功效
体外HIV-1整合酶试验：已研制出用于监测HIV-1整合酶活性的 体外试验，如下文所述。这些试验利用纯化的重组HIV-1整合酶和代 表病毒DNA的LTR末端的寡核苷酸底物。体外试验所得数据的重要作 用在于试验反映了体内发生的实际功能活动。已开发出荧光分析(Lee 等人，《分析生物化学》227:295-301(1995))和放射性试验用来改进 上述公开的体外试验(Lee等人《生物化学》34:10205-10214(1995)； Lee等人《生物化学》34:10215-10223(1995))。此外，我们改进了 酶制剂，它提高了HIV-1整合酶样本的质量(Lee & Han，《生物化学》 35:3837-3844(1996)；Lee等人，《生物化学》36:173-180(1997))。 体外试验和样本制剂的上述改进已经能够更好地反映出体内发生的活 动。因此，当寻找有效整合酶抑制剂时，该体外试验的结果是极其有效 的病毒传染性的预示变量。
部分1在抑制HIV-1整合酶中的活性测定如下。首先将部分1溶 解在适当体积的0.1％NH4OH(w/v)使终浓度为15mg/ml。随后将这些样 本以10000rpm离心30分钟。如果形成沉淀，分离出上清液；干燥沉 淀且进一步溶解在0.1％NH4OH(w/v)中。所得溶液是提取物的储备液。 由此储备液，进行以下的稀释：1∶10,1∶50,1∶100,1∶200,1∶300, 1∶400,1∶500,1∶600,1∶700,1∶800,1∶900,1∶1000,1∶2000, 1∶3000,1∶4000,1∶5000和1∶10000。将各种这些稀释液的1μl分别 加入各反应混合物中，它们的终浓度分别相应为75,15,7.5,3.75, 2.5,1.875,1.5,1.25,1.07,0.9375,0.833,0.75,0.375,0.25, 0.1875,0.15和0.075μg/ml。随后按已述方法进行试验(Lee，《生 物化学》34:10205-10214(1995)；Lee等人，《生物化学》34: 10215-10233(1995)；Lee ＆ Han(1996))。
为了测定各部分的IC50和IC90，将凝胶暴露于PHOSPHORIMAGERTM 屏并且通过分子动力学PHOSPHORIMAGERTM测定裂解百分比。通过由阳 性对照的裂解百分比减去各部分的裂解百分比并且随后将该值除以阳 性对照的裂解百分比可测出抑制百分率。结果证实部分1在培养基中具 有0.2-1.2μg/ml的IC50和2.5-3.5μg/ml的IC90。所以，在活哺乳动 物中，血浓度高达约100X，该水平可被耐受和有效。
实施例3
SM提取物的体外试验
猫免疫缺陷病毒(FIV)模型是一种被接受的动物模型，用于研究抗 HIV感染的药物。FIV是分离自猫的T细胞营养性慢病毒。FIV在生物 学上和生物化学上类似于HIV，包括FIV和HIV整合酶间的高同源性。 FIV感染的猫会患猫获得性免疫缺陷综合征(FAIDS)，其类似于人体中 的成熟AIDS。
细胞培养中的体外FIV模型：Crandell-Reese猫肾(CrFK)细胞系 对FIV感染敏感且支持病毒复制。CrFK细胞是生产病毒和分析FIV感 染的有效工具。虽然FIV不导致FIV感染的CrFK细胞出现细胞病变， 但已有筛选组织培养物中的FIV感染的诊断试验。研究证实了SY的功 效。
ED50的测定：对部分1保护CrFK细胞不被FIV感染的作用进行试 验。以一式三份，将CrFK细胞铺板，密度为1×105细胞/T25瓶。 随后培养24小时使细胞附着并且生长，将化合物的溶液加入细胞培养 物中24小时。该溶液是通过将本发明的活性剂溶解在磷酸盐缓冲液(pH 8)中使浓度为100mg/ml来制备，随后25℃下在Ti45转子中以 25000rpm离心30分钟。除去上清液，在开式真空下通过离心将三份 1ml等份试样干燥用于测定溶液的浓度。将活性剂进一步稀释为 2mg/ml，经0.2μm醋酸纤维膜过滤，通过测定干燥溶质的质量与标定 对照对比来测出浓度。
结果证实，部分1防止CrFK细胞的FIV感染的ED50为0.1至 1.0μg/ml；ED90为0.2至2.5μg/ml。通过这些结果，本发明的组合物 可以在可药用载体中给药并且应以足够的剂量给药以使血药浓度为 10nM至1000nM。然而，在一些情况下必须施用获得高达10000nM的血 药浓度的剂量。活性更高的药剂可以在低至1nM的血药浓度下有效。
实施例4
丹酚酸的偶联
在碱性条件下，丹酚酸(化合物1)可以产生另外三种脱氢形式(化 合物2-4)。丹酚酸及其衍生物(丹酚酸的脱氢形式)偶联为二聚体形式 导致形成若干种结构如下的化合物。这些偶联是丹酚酸与其脱氢形式的 均聚二聚体和/或杂二聚体。这些化合物在小于1μg/ml的浓度下显示 出抗HIV-1整合酶活性。
丹酚酸的基本结构(化合物1)为(如下所示)： A、B、C和D分别代表化合物1的碳24、27、35和38上的氢。这些 氢是偶联的潜在位点。所以，丹酚酸与其自身(化合物1)的偶联，即均 聚二聚体导致下列组合的形成(化合物5-13)：化合物5是A与A偶联 (图1)；化合物6是A与B偶联(图2)；化合物7是A与C偶联(图3)； 化合物8是A与D偶联(图4)；化合物9是B与B偶联(图5)；化合物 10是B与C偶联(图6)；化合物11是C与C偶联(图7)；化合物12 是C与D偶联(图8)；化合物13是D与D偶联(图9)；化合物24是化 合物1的B与化合物1的D偶联(图13)。
在碳24和38、碳24和35及碳27和38上脱氢可形成丹酚酸的 三种脱氢形式(化合物2-4)。这些形式具有如下基本结构： 化合物2,24-38(图10)： 化合物3,24-35(图11)： E代表偶联位点。 化合物4,27-38(图12)： F代表偶联的位点。
丹酚酸的脱氢形式(化合物2-4)可以形成均聚二聚体。这意味着化 合物3可以与其自身在位点E偶联形成化合物14，并且化合物4与其 自身在位点F偶联形成化合物15。
这些脱氢形式也可以与丹酚酸形成杂聚二聚体。形成的潜在杂聚二 聚体是：化合物1的A与化合物3的E偶联形成化合物16；化合物1 的B与化合物3的E偶联形成化合物17；化合物1的C与化合物3的 E偶联形成化合物18；化合物1的D与化合物3的E偶联形成化合物 19；化合物4的F与化合物1的A形成化合物20；化合物4的F与化 合物1的B偶联形成化合物21；化合物4的F与化合物1的C偶联形 成化合物22；和化合物4的F与化合物1的D偶联形成化合物23。
除了这些二聚体，可以形成此类的三聚体和更高聚合物。这些化合 物结构中的变化应为所属技术领域普通技术人员所公知。
可以预见，这些化合物可被修饰为含有乙酰基、成为该化合物的酯 类、酚酐或可药用盐。
实施例5
偶联所致的抗整合酶活性的时间依赖性活化
实施例4的化合物1被纯化并且利用质谱和NMR确认。随后化合 物1与0.1％NH4OH在浓度5mg/ml下保温不同的时间(5分钟，30分钟， 1小时，2小时，3小时，4小时，5小时和24小时)。加入1％乙酸终 止该反应并且测定抗HIV-1整合酶活性。结果证明经在0.1％NH4OH中 保温，样品被时间依赖性地活化。这种活化作用是化合物1的不同偶联物 的结果。结果如表3所示：
表3 时间 pH6.0 IC50(μg/ml) pH=6.0 3.5 5分 1.8 30分 1.7 1小时 1.5 2小时 1.5 3小时 1.05 4小时 1.0 5小时 0.9 24小时 0.5
将MW为492的纯化化合物(例如化合物2-4，如上所述)与0.1％ NH4OH在浓度5.0mg/ml下保温不同的时间(5分钟，30分钟，1小时， 1.5小时，2.0小时和3.0小时)。加入1％乙酸终止该反应并且测定抗 HIV-1整合酶活性。结果证明经在0.1％NH4OH中保温，化合物2-4被 时间依赖性地活化。但这种活化作用不如化合物1的偶联物那么大。结 果如表4所示：
表4 样品 IC50 5分钟 ＞7.5 30分钟 5.5 1小时 5.2 1.5小时 4.2 2.0小时 4.1 3.0小时 2.1
实施例6
活化化合物1的抗HIV-1整合酶活性
将0.8g的实施例4的化合物1在80ml的0.1％NH4OH中以终浓度 10mg/ml保温8小时。此活化样品随后加载在SEPHADEXLH20柱上 并用浓度递增的甲醇水溶液洗脱。将洗脱流分冷冻干燥且分析抗HIV-1 整合酶活性。结果如表5所示：
表5 流分 IC50(μg/ml) 原液 1.1 10％甲醇 1.1 20％甲醇 0.69 30％甲醇 0.81 40％甲醇 0.92 50％甲醇 0.4 60％甲醇 0.92 70％甲醇 3.2 80％甲醇 ＞7.5
50％的样本具有最佳活性，随后利用质谱分析。质谱显示出492 和986的两个主峰。这些峰与丹酚酸的单体和丹酚酸的二聚体相对应， 这表明这些物质是活性的抗病毒成分。所以，这些结果显示，产生整合 酶抑制作用的活性抗病毒剂是丹酚酸和/或其二聚体形式。
这些流分的抗HIV-1感染活性的功效采用CEMTART细胞评定。这些 细胞是对CEM按照实施例8中所述进行工程化。采用如实施例8中所 述的HIVp24抗原捕获试验。结果在下表6中所示：
表6 样品 IC50(μg/ml) 10％ 41 20％ 2.2 30％ 12 40％ 7 50％ 3.8 60％ 40 70％ 40 80％ 未测量
实施例7
抗HIV-1整合酶活性
将实施例1的部分1溶解在40％甲醇(水中)中并且在GSA转子中 以8000rpm离心30分钟。将上清液部分加载在用40％甲醇(水中)平 衡的SEPHADEXLH20柱上。该柱用40％甲醇溶液(水中)冲洗并且用 50％、60％、70％、80％和90％的甲醇溶液(水中)洗脱。随后将样本 冷冻干燥并且溶解在适当体积的甲醇中以使最终的储备浓度为 5mg/ml。这些流分用于测定抗HIV-1整合酶活性。试验浓度为5,2.5, 2,1.5,1.25,1,0.8,0.6,0.4和0.2μg/ml。通过由阳性对照的 裂解百分比减去各流分的裂解百分比并且随后将该值除以阳性对照的 裂解百分比可得出抑制百分率。
表7 体外HIV-1整合酶活性试验的结果 流分 IC50(μg/ml) 40 0.84 50 0.70 60 0.68 70 0.60 80 0.57 90 0.50
将SEPHADEXLH20柱60-80％的流分合并且溶解在40％甲醇水 溶液中。将重悬样本在GSA转子中以8000rpm离心30分钟。将上清液 加载在用水中的40％甲醇平衡的MCI GEL CHP20P(75-150μ)柱上。该 柱用40％甲醇溶液(水中)冲洗并且用50、60和70％的甲醇溶液(水中) 洗脱。随后将样本冷冻干燥且按照上述方法在不同条件下分析。
表8
体外HIV-1整合酶活性试验的结果 #样本 IC50,MeOH (μg/ml) IC50,pH6.0 (μg/ml) IC50,0.1％NH4OH (μg/ml) MCI40 0.32 0.70 0.44 MCI50 0.34 0.80 0.58 MCI60 0.42 1.00 0.62
随后通过质谱法(负离子模式)分析MCI GEL CHP20P(75-150μ)样品。 结果显示，MCI 40具有986的主峰和494的次峰。MCI 50具有492和 986的主峰。MCI60具有984和986的主峰。通过质谱和NMR测定可肯定 494峰代表丹酚酸。492峰代表丹酚酸的脱氢形式。986峰代表丹酚酸的 二聚体形式。984峰代表492和494的混合二聚体。这结果表明，部分1 的活性成分是分子量为984和/或986的化合物。这些试验数据表明，分 子量为984和986的二聚体化合物由化合物1生成。
实施例8
活性剂的抗HIV-1活性试验
用CEＭTART细胞评估MCI GEL CHP20P(75-150a)流分的抗HIV-1感 染活性。这些细胞由CEM细胞通过基因工程获得且在组成性地表达 HIV-1tat和rev基因。CEMTART细胞提供了评价HIV感染的安全体系， 因它们被基因工程化来生产HIV-1的复制不能形式，HIVΔtat/rev。利用 HIV p24抗原捕获试验评估化合物抑制HIV-1感染的功效。该试验采用 p24核心蛋白单克隆抗体包被的96孔平板，其中将细胞培养基或血清 培养2小时。在用HIVΔtat/rev感染至少1周后从细胞除去上清液。冲洗 孔，随后加入生物素化抗HIV-1 p24多克隆抗体。加入信号扩增底物 后，相对于已知标准直接定量p24的表达。
将MCI 40、50和60溶解在甲醇中，并且以下列浓度评定这些化 合物抑制HIV-1感染的性能：100,20,10,5和1μg/ml。向24孔组 织培养皿中加入2ml的3.33×104CEMTART细胞和试验浓度的化合物。 向其中加入5000 TCID50/106细胞的HIV-1接种物。每周更换2次培 养基，以使0.8ml的细胞混悬液重新悬浮在2ml的更换培养基中。随 后在p24存在下分析无细胞上清液。7天和10天后通过对比药物存在 或不存在下的HIV-1 p24抗原生产来评定抗HIV-1功效。结果如表9 和10所示：
表9：第7天 样品 浓度(μg/ml) ％抑制 MCI40 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI50 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI60 100 100 20 100 10 100 1 0
表10：第10天 样品 浓度(μg/ml) ％抑制 MCI40 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI50 100 100 20 100 10 100 1 0 MCI60 100 100 20 100 10 100 1 0
上述所有参考文献在此引入作为参考。还引入母专利申请美国申请 号09/104363(提交于1998.6.25)作为参考。
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