一条SmbZIP1基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用
阅读：91发布：2020-05-11
专利汇可以提供一条SmbZIP1基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一条SmbZIP1基因及其在提高丹参中 丹酚酸 含量中的应用，通过 酵母 双杂交筛库的方法从丹参酵母文库中筛到全长474bp的SmbZIP1基因，通过在丹参中过表达SmbZIP1基因可以提高丹参中丹酚酸含量，具体方法为：根据丹参SmbZIP1基因序列，把SmbZIP1基因构建于 植物 过表达 调控序列 ，形成含SmbZIP1基因的植物过表达载体；将所得的含SmbZIP1基因的植物表达载体转化发根农杆菌；利用所转化的发根农杆菌菌株遗传转化侵染丹参无菌苗外植体，取侵染后的根系经PCR检测为阳性的即为过表达；本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，能够为解决丹酚酸供不应求的市场局面打开一个新的缺口，具有较高的应用价值与研究价值。，下面是一条SmbZIP1基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用专利的具体信息内容。
1.一条SmbZIP1基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述SmbZIP1基因在提高丹参中丹酚酸含量中的应用，其特征在于，通过在丹参中过表达SmbZIP1基因来提高丹参中丹酚酸含量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述在丹参中过表达SmbZIP1基因具体包括如下步骤：
(1)把SmbZIP1基因构建于植物过表达调控序列，形成含SmbZIP1基因的植物过表达载体；
(2)将步骤(1)所得的含SmbZIP1基因的植物表达载体转化发根农杆菌；
(3)利用步骤(2)所转化的发根农杆菌菌株遗传转化侵染丹参无菌苗外植体，取侵染后的根系经PCR检测为阳性的即为过表达。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，植物过表达载体为pHB-YFP。pHB-YFP包含CaMV35S启动子、YFP荧光标签、NOS终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，发根农杆菌选自菌株C58C1。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，丹参无菌苗外植体的侵染和PCR检测方法如下：
(3.1)丹参无菌苗的预培养：将丹参无菌苗外植体平铺于1/2MS固体培养基上，放置
48h；
共培养：将预培养的外植体与发根农杆菌共同混合进行侵染，混合时间10分钟，之后用无菌纸吸干表面菌液，再次放置在1/2MS固体培养基上，放置48h；
降抗：将共培养的外植体放在含有羧苄抗生素的1/2MS固体培养基上，每隔两周降一次抗直至无抗；
分单克隆：在无抗的1/2MS固体培养基上将单独的毛状根剪下，单独放在1/2MS固体培养基上；
继代：将长大的单克隆剪下一部分用于继代，最终获得稳定的根系。
(3.2)设计发根农杆菌位点基因rolB的特异PCR引物，其基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，进行PCR扩增；
(3.3)过表达株系鉴定：在SmbZIP1基因内部设计上游特异性引物，在载体YFP序列内设计下游特异性引物，上游引物为SmbZIP1-QF，其基因序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物为pHB-R，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，进行PCR扩增；
(3.4)紫外线下观察目的条带，出现目的条带则为阳性转基因丹参毛状根根系。
一条SmbZIP1基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一条SmbZIP1基因，过表达基因SmbZIP1基因可以提高丹参中丹酚酸的含量，属于基因工程技术领域。
背景技术
[0002] 丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)始载于《神农本草经》，被列为上品，是一种常用中药材，隶属于唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia)，是一种多年生的双子叶草本植物，因其根红似参而得名丹参，其干燥的根和根茎常被用药，具有很高的药用价值。作为一种传统中药，为强壮性通经剂，多被用作复方药物，已被纳入《中华人民共和国药典》。
[0003] 据世卫统计显示，心、脑血管疾病已经成为人类健康的“头号杀手”，每年患病人数以数百万人口增加，而丹参作为临床上治疗心、脑血管疾病的主要药物，近些年来面临着生长缓慢，质量低下，种质资源匮乏、有效成分含量低的形势。这也使如何提高丹参次级代谢产物含量与质量成为了近些年的研究热点，已经有实验结果证明通过代谢工程手段能够很好的提高丹参中有效次级代谢产物的含量，这也为我们的研究提供了一个新的方向。
[0004] 丹酚酸作为丹参中的水溶性成分，主要为多聚酚酸类。主要包括咖啡酸、迷迭香酸(RA)、丹酚酸(SA)A、B、C、D、E、G等，其中RA和SAB含量最高。丹酚酸类化合物主要的药理作用具体体现在以下几个方面：(1)能够对心脏起到保护作用；(2)对大脑的保护作用；(3)抗肝纤维化作用；(4)能够治疗消化性溃疡；
[0005] 丹酚酸具有很高的药用价值以及广阔的市场前景，研究人员便以提高丹参中主要次级代谢产物为目的展开研究，已有结果表明通过基因工程手段能有效的提高活性成分丹酚酸的含量。利用基因工程过表达一个或数个合成通路中的关键酶基因只能提高该通路中主要的次级代谢产物，而且提高倍数有限，这对挖掘该合成通路中未知关键酶基因的帮助甚少。近些年来转录因子作为研究热点，被广泛的报道能够参与调控植物次级代谢。
[0006] 已有研究表明，一些bZIP家族的转录因子受ABA诱导并能够调控次生代谢产物的生物合成，因此挖掘丹参自身的bZIP转录因子来提高丹参中主要的此生代谢产物具有重大的意义。利用基因工程手段，将丹参转录因子SmbZIP1基因遗传转化丹参外植体获得SmbZIP1过表达的转基因丹参毛状根能够显著提高丹酚酸的含量。目前尚未发现与本发明主题所提及的通过过表达SmbZIP1基因提高丹参中丹酚酸的方法的相关报道。因此，本发明在实际解决丹酚酸药源紧缺性的问题上具有积极意义。
发明内容
[0007] 本发明的目的就是为了解决野生丹参中丹酚酸含量低下的问题而提供一条SmbZIP1基因及其在提高丹参中丹酚酸含量中的应用。
[0008] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009] 本发明通过酵母双杂交筛库手段获得一条474bp的SmbZIP1基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010] 所述SmbZIP1基因在提高丹参中丹酚酸含量中的应用，通过在丹参中过表达SmbZIP1基因来提高丹参中丹酚酸含量。
[0011] 本发明综合应用分子和生化技术如载体构建、遗传转化、分子检测、定量PCR分析、蛋白互作、靶点探究、化合物的提取及含量测定等，发明了一种通过过表达SmbZIP1基因提高丹参中丹酚酸的方法。本发明获得的过表达SmbZIP1转基因丹参毛状根根系中总丹酚酸含量最高表达量为19.29mg/g干重，是对照组(4.66mg/g干重)的8.5倍。本发明为商业化大量生产丹酚酸提供了可能，也为满足市场对丹酚酸需求提供了重要来源。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0013] 1、显著提高丹参毛状根中丹酚酸的含量。
[0014] 2、深度解析SmbZIP1在生物合成丹酚酸的调控机制。
[0015] 3、发明方法效果可靠。
[0016] 4、获取丹酚酸的成本低。
[0018] 图1酵母双杂交筛库获得目的基因以及双分子荧光互补实验验证；
[0019] 图2SmbZIP1相关载体构建示意图；
[0020] 图3SmbZIP1敲除载体构建示意图；
[0021] 图4SmbZIP1的亚细胞定位的分析结果图。YFP，黄色荧光蛋白；BF，明场；Merged，黄色荧光蛋白与明场的合并图；SmbZIP1::YFP，SmbZIP1的瞬时荧光表达；YFP，空载体荧光表达；
[0022] 图5重组蛋白SmbZIP1的SDS-PAGE分析与纯化结果；
[0023] 图6丹参SmbZIP1在不同激素处理下的表达分析，其中，a为脱落酸ABA诱导，b为乙烯ETH处理，c为水杨酸SA，d为酵母提取物YE，e为赤霉素GA3，f为茉莉酸MJ；
[0024] 图7SmbZIP1相关转基因丹参毛状根的获得与阳性鉴定，以及SmbZIP1的表达分析结果图。其中，Control为pHB-YFP空载体侵染获得的毛状根；其中，a为发根流程，I为无菌苗，II为预配养，III为共培养，IV为单克隆分离，V为摇根。b为过表达阳性鉴定，c为对照阳性鉴定，d为敲除阳性鉴定，e为敲除测序，f为在阳性毛状根中对SmbZIP1基因定量。
[0025] 图8丹酚酸生物合成相关基因的表达分析结果图。其中，EV是空载体；SmbZIP1基因的双荧光素酶报告实验；SmbZIP1对C4H1的酵母单杂交实验以及凝胶阻滞实验；图中，a为过表达阳性毛状根株系中酚酸途径关键酶基因的定量，b为敲除株系中酚酸途径关键酶基因的定量，c为SmbZIP1对酚酸途径的关键酶基因的Dual-LUC实验。
[0026] 图9SmbZIP1转基因丹参毛状根中丹酚酸含量检测结果图。其中，EV是空载体。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0029] 实施例1
[0030] 丹参SmbZIP1基因的获得
[0031] 1.1.丹参混合组织cDNA酵母双杂交文库建立
[0032] 该文库由上海欧易生物医学有限公司建立。
[0033] 1.2.用SmMYB1作为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛库
[0034] 筛库流程参考上海欧易生物医学有限公司所提供的筛库说明书，严格按照步骤进行筛库。对于阳性克隆经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。序列结果如SEQ ID NO.1所示。
[0035] 1.3.验证筛库结果
[0036] 为了验证筛库的准确性，将获得的SmbZIP1基因重新构建酵母双杂交载体pGADT7，重新进行酵母双杂交实验。具体步骤：AH109酵母感受态的制备；共转含有不同转录因子的pGADT7/pGBKT7质粒；涂布SD-Trp-Leu二缺平板；最后挑取单克隆点板至SD-Trp-Leu-His-Ade四缺平板检验互作，验证验证筛库的准确性，结果如图1a所示。
[0037] 为了确定在体内SmbZIP1与SmMYB1在蛋白水平发生互作依旧存在，将获得的SmbZIP1基因构建于双分子荧光互补实验载体pXY104上，SmMYB1构建于pXY106上。然后将含有不同基因的双分子荧光互补实验载体转化根瘤农杆菌；再将两种根瘤农杆菌等体积比混合，用无菌注射器吸取混合后的农杆菌菌液对生长良好的烟草叶片进行瞬时转化；最后先暗培养24小时后光照培养24小时，取烟草叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片(避免产生气泡)，于激光共聚焦显微镜下观察。在YFP场下可以清楚的观察到荧光信号的存在，而对照却没有相应的荧光存在(见图1b)，该结果表明SmbZIP1能够与SmMYB1在蛋白水平发生互作。
[0038] 实施例2
[0039] 丹参SmbZIP1基因的植物表达载体的构建及转化
[0040] 2.1.pHB-SmbZIP1-YFP载体的构建
[0041] 根据已经克隆获得的丹参SmbZIP1的序列，设计植物过表达载体构建的引物(序列见SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，构建pHB-SmbZIP1-YFP载体，并将pHB-SmbZIP1-YFP质粒转化发根农杆菌C58C1，本实施例中购买自上海唯地生物技术有限公司，但不限于此，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmbZIP1的植物过表达载体pHB-SmbZIP1-YFP已经成功转化到发根农杆菌C58C1中，可以用于后续的遗传转化和侵染发根实验。
[0042] 引物名称 序列 序列号pHB-SmbZIP1-HindIII-KF: 5’-CAAGCTTATGCAAGAGCAAGCCACGA-3’ SEQ ID NO.2pHB-SmbZIP1-BamHI-KR: 5’-CGGATCCCTTTCTTCCCTCTTGCGGG-3’ SEQ ID NO.3[0043] 2.2.1300-Crispr-Cas9-SmbZIP1载体的构建
[0044] 依据5’-NGG原则在SmbZIP1第一外显子上找寻靶标序列(避开第一内含子)设计sgRNA引物(序列见SEQ ID NO.10)，将靶标整合至中间载体18T-Cas9，最后将sgRNA-Cas9一起整合至pCAMBIA1300终载体。将构建好的1300-Crispr-Cas9-SmbZIP1质粒转化发根农杆菌C58C1，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmbZIP1-sgRNA-Cas9的植物过表达载体1300-Crispr-Cas9-SmbZIP1已经成功转化到发根农杆菌C58C1中，可以用于后续的遗传转化和侵染发根实验(见图3)。
[0045] 实施例3
[0046] 丹参SmbZIP1基因的亚细胞定位分析
[0047] 3.1.pHB-SmbZIP1-YFP载体转化根癌农杆菌EHA105
[0048] 取2.1中构建得到的pHB-SmbZIP1-YFP质粒和空载体pHB-YFP转化根癌农杆菌EHA105，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmbZIP1的植物过表达载体pHB-SmbZIP1-YFP已经成功转化到根癌农杆菌EHA105中。
[0049] 3.2.在烟草中的瞬时表达
[0050] 用无菌注射器吸取3.1构建好的含有载体pHB-SmbZIP1-YFP和空载体的pHB-YFP的根癌农杆菌EHA105对生长良好的烟草叶片进行瞬时转化，先暗培养24小时后光照24小时，取叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片(避免产生气泡)，于激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，SmbZIP1在细胞核中表达，与它们作为转录因子的功能是一致的(见图4)。
[0051] 实施例4
[0052] 丹参SmbZIP1基因的原核表达分析以及蛋白纯化
[0053] 4.1.pET28a-SmbZIP1载体的构建
[0054] 根据已经克隆获得的丹参SmbZIP1的序列，设计原核表达载体构建的引物(序列如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33)，并构建pET28a-SmbZIP1质粒，将pET28a-SmbZIP1质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆菌落进行PCR验证。结果表明，含有SmbZIP1的亚细胞定位载体pET28a-SmbZIP1已经成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，可以用于后续蛋白表达及纯化(见图5)。
[0055] 实施例5
[0056] 丹参SmbZIP1对不同诱导子的处理的响应分析
[0057] 向已经生长45天的C58C1毛状根的液体培养基中加入不同的诱导子进行处理，一共选取了6个诱导子分别为ABA,ETH,SA,YE，MJ,GA3，并平行进行对照试验即向生长45天的C58C1毛状根的液体培养基中加入相同体积的相应诱导子所用溶剂。选取不同时间点收取毛状根冻于液氮下进行RNA抽提，将抽提的RNA进行反转录得到cDNA，定量SmbZIP1在不同诱导子的处理下处于一个怎样的变化；每个诱导子都选取了不同的时间点，为了验证SmbZIP1在不同时间点下对该诱导子的相应情况。SmbZIP1响应ABA,ETH,SA,YE的诱导，但对于不同的诱导子SmbZIP1呈现出不同的变化：当用ABA处理时，SmbZIP1基因的表达水平在6h达到顶峰，是对照组的12倍多；当用ETH处理时，SmbZIP1基因的表达水平在4小时达到顶峰，是对照的3倍多；当用SA处理时，SmbZIP1基因的表达呈现波动式的变化，在1h达到一个峰值是对照的3倍左右，但在6h恢复对照水平，在12h再次达到峰值是对照的4倍多；当YE处理时，SmbZIP1的表达在4h达到最低值，基本下调90％多；然而当MJ,GA3诱导时，SmbZIP1的表达与对照变化一致，基本没有差异。依据以上结果说明SmbZIP1受ABA,ETH，YE,SA的诱导，不受MJ,GA3的诱导。(见图6)。
[0058] 实施例6
[0059] 6.1.经过一系列遗传转化手段得到单克隆毛状根
[0060] 丹参无菌苗预培养：将丹参无菌苗外植体平铺于1/2MS固体培养基上，放置48h；
[0061] 共培养：将预培养的丹参无菌苗外植体与发根农杆菌C58C1共同混合进行侵染，之后用无菌纸吸干表面菌液，再次放置在1/2MS固体培养基上，放置48h；
[0062] 降抗：将共培养的外植体放在含有300mg/ml羧苄抗生素的1/2MS固体培养基上，每隔两周降一次抗，最终无抗；本实施例中降3次至无抗，降抗的浓度依次为200、100、50mg/ml羧苄抗生素。
[0063] 分单克隆：在降抗后的无抗的1/2MS固体培养基上将单独的毛状根剪下，单独放在1/2MS固体培养基上；继代：将长大的单克隆剪下一部分用于继代；最终获得稳定的根系(见图7a)。
[0064] 6.2.转基因毛状根基因组DNA的提取
[0065] 采用CTAB法提取6.1中得到的转基因毛状根基因组DNA，具体操作流程参看CTAB操作说明书。
[0066] 6.3.转基因毛状根的阳性鉴定
[0067] 鉴定过表达株系时只需要设计含有载体序列的引物pHB-R：5’-TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT-3’，与SmbZIP1基因的定量引物进行PCR阳性鉴定即可。因为丹参本身就含有内源SmbZIP1基因，我们要确认的是外源引入的SmbZIP1目的基因是否真正的整合插入到丹参基因组上，具体引物设计为SmbZIP1-QF定量引物上游与pHB-R序列下游，序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.6。
[0068] 鉴定敲除株系时要确保敲除载体是否整合至基因组，需要用到载体上游M13F引物(SEQ ID NO.9)与敲出基因的靶标sgRNA的下游(SEQ ID NO.10)进行PCR阳性鉴定，鉴定成功的，进一步在阳性敲除毛状根株系的基因组DNA上扩增靶标sgRNA上下游各300bp左右的片段，送测序，看是否敲除成功，有无脱靶现象，对于峰图有变化的即为敲除成功，分为杂合突变与纯合突变。
[0069] 鉴定pHB-YFP空载转化的对照毛状根株系用卡纳霉素Kana-F和Kana-R引物进行鉴定，序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示(自己设计引物长度大约300bp)。另外，所有阳性转基因毛状根都需要进行rolB基因的鉴定，引物为rolB-F和rolB-R，序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，以此来确定Ri质粒确实整合至丹参基因组中(主要是确定为毛状根)。
[0070] PCR鉴定为阳性的株系只能表明它们确实整合至丹参基因组中，但是整合至基因组后的表达量怎么样，需要我们进一步来确认，因为表达量的不同也可能对该转录因子发挥功能有很大影响，对参与调控次级代谢也有很大影响。对于选取的阳性株系，提取阳性株系的RNA，并用天根公司生产的的反转录试剂盒进行反转获得cDNA，得到的cDNA模板用于后期定量实验。本实施例中分别选取100个SmbZIP1转基因毛状根株系和Crispr-SmbZIP1敲除株系进行了PCR鉴定，选取其中为阳性的株系SmbZIP1-4，SmbZIP1-10，SmbZIP1-85，SmbZIP1-91的4个克隆以及敲除株系Crispr-SmbZIP1-11，Crispr-SmbZIP1-18，Crispr-SmbZIP1-23，Crispr-SmbZIP1-46的4个克隆和pHB-YFP的空载转基因毛状根株系作为对照。在SmbZIP1转基因毛状根株系中，SmbZIP1-4，SmbZIP1-10，SmbZIP1-85，SmbZIP1-91这4个株系都是过表达株系，其中SmbZIP1-4和SmbZIP1-91号两个株系上调最为显著，均达到230倍左右的提高，SmbZIP1-10和SmbZIP1-85号两个株系也均有3到10倍的上调；在敲除株系中Crispr-SmbZIP1-11，Crispr-SmbZIP1-18，Crispr-SmbZIP1-23，Crispr-SmbZIP1-46这4个株系均显示下调结果，说明Crispr发挥了作用，但并没有完全被敲掉(见图7e)。
[0071] 本实施例中选择发根农杆菌C58C1是一种优选实施方式，在实际选择上，发根农杆菌的菌株不限于C58C1，可以根据具体情况选择其他菌株，如发根农杆菌K599等。
[0072] 名称 序列 序列号rolB-F 5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’ SEQ ID NO.4
rolB-R 5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’ SEQ ID NO.5
pHB-R 5’-TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT-3’ SEQ ID NO.6
Kana-F 5’-ATGGCTAAAATGAGAATATCACCGGAA-3’ SEQ ID NO.7
Kana-R 5’-CGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAAT-3’ SEQ ID NO.8
M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ SEQ ID NO.9
SmbZIP1-SgRNA-R 5’-AAACCCGCCCCCATCTCCGGCACC-3’ SEQ ID NO.10
CC-SmbZIP1-F3 5’-CTTAGGATTGACGTGCATTGGCG-3’ SEQ ID NO.11
CC-SmbZIP1-R3 5’-GGATAAGGATAGGCCTAACTCACAC-3’ SEQ ID NO.12
SmbZIP1-QF 5'-TGCAAGAGCAAGCCACGAGTTC-3' SEQ ID NO.13
rolB-R 5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’ SEQ ID NO.5
pHB-R 5’-TGGTGCAGATGAACTTCAGGGT-3’ SEQ ID NO.6
Kana-F 5’-ATGGCTAAAATGAGAATATCACCGGAA-3’ SEQ ID NO.7
Kana-R 5’-CGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAAT-3’ SEQ ID NO.8
M13F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ SEQ ID NO.9
SmbZIP1-SgRNA-R 5’-AAACCCGCCCCCATCTCCGGCACC-3’ SEQ ID NO.10
CC-SmbZIP1-F3 5’-CTTAGGATTGACGTGCATTGGCG-3’ SEQ ID NO.11
CC-SmbZIP1-R3 5’-GGATAAGGATAGGCCTAACTCACAC-3’ SEQ ID NO.12
SmbZIP1-QF 5'-TGCAAGAGCAAGCCACGAGTTC-3' SEQ ID NO.13
[0073] 实施例7
[0074] 定量PCR检测转基因丹参毛状根中相关基因的表达
[0075] 7.1.毛状根液体培养
[0076] 选择实施例6中在阳性毛状根中定量SmbZIP1基因的表达量，进而筛选出4株过表达阳性毛状根(两高两低，确保转基因效果的准确性)；同时筛选出4个敲除效果较好的Crispr株系，进行扩大培养，避光培养45天左右即可进行收根。取适量新鲜毛状根用吸水纸吸干表面水分后，用锡箔纸包装好进入液氮中冷冻后保存于-80℃用于RNA提取，其余毛状根烘干后用于丹酚酸含量的提取。
[0077] 7.2RNA的提取及cDNA第一链的合成
[0078] 抽提总RNA，并分别进行纯度和浓度检测。然后反转录成cDNA，用于定量PCR分析，反应体系用TIANGEN公司提供的SuperReal PreMix(SYBR Green)试剂盒，用SmActin作为内参基因7.3引物的设计和合成。
[0079] 根据丹参基因SmbZIP1及丹酚酸生物合成相关基因的编码序列分别用Primer5.0设计引物用于检测丹参毛状根中相关基因的表达情况，看家基因Actin用来作为内参。引物同实施例3，所用引物由上海生工生物工程公司合成。
[0080]
[0081] 7.4.转基因丹参毛状根的定量PCR检测
[0082] 以相同量的上述cDNA(稀释10倍)第一链为模板，分别用上述设计的引物进行定量PCR扩增(SEQ ID NO.16-31)。参照美国Applied Biosystem公司生产的Biosystem StepOne仪器的说明书进行定量PCR操作，采用天根公司的定量PCR试剂盒。定量PCR反应体系如下：
[0083] 试剂 使用量RNAse-free ddH2O 5.8μl
2×PreMix 10μl
50×ROX 2μl
正向引物(QF) 0.6μl
反向引物(QR) 0.6μl
模板(cDNA) 1μl
2×PreMix 10μl
50×ROX 2μl
正向引物(QF) 0.6μl
反向引物(QR) 0.6μl
模板(cDNA) 1μl
[0084] PCR反应条件：94℃15分钟，40个循环(94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒)，72℃10分钟。目的基因及看家基因各做三次重复。
[0085] 丹酚酸生物合成途径定量PCR结果显示：在过表达SmbZIP1株系中除SmCYP98A14无明显变化以外，其余关键酶基因均有不同程度的上调与下调。其中SmPAL1、Sm4CL1、SmTAT1、SmRAS四个关键酶基因的表达量下调，而SmC4H1、SmHPPR均有上调；在敲除株系中SmPAL1、SmTAT1、SmCYP98A14均轻微上调，而SmC4H1、SmHPPR、SmRAS均有不同程度的下调，其中SmC4H1下调最为显著，由于敲除效果的差异导致Sm4CL1在敲除株系中两株上调显著，两株较过表达而言也是上调，但上调幅度较小，总体来说在敲除株系中Sm4CL1呈现一个上调趋势(见图8a和8b)。因而推测SmbZIP1在丹酚酸的生物合成调控中很可能扮演着一个正调控因子的角色，且这些变化的关键酶基因很有可能作为SmbZIP1的潜在调控靶基因。同时，也注意到，在过表达SmbZIP1转基因株系中，SmC4H1、SmHPPR两个关键酶基因的表达量出现了上调的现象，而丹酚酸合成途径代谢分支也是从这两个关键酶下游的底物开始的，初步推测这可能是由于SmbZIP1不仅作用于丹酚酸合成通路，同时也对支路途径也有很大影响。由于上游关键酶的上调，导致生成底物的积累，进而使酚酸途径的产物含量得到提高(见图9)。
[0086] 实施例8
[0087] 体内验证SmbZIP1基因的作用靶点
[0088] 8.1.Dual-luciferase assays
[0089] 丹参SmbZIP1基因的体内Dual-LUC实验，由于bZIP转录因子可识别的元件较多，其中属CACGTG最为保守，将丹酚酸途径关键酶基因启动子全长约为1.2-1.8kb构建进入入终载体pGreen0800。根据定量结果筛选可能的靶基因进行Dual-luciferase assays，因为定量结果是SmbZIP1转基因结果最直接的体现。结果表明对于丹酚酸途径基因：SmbZIP1转录因子在转录水平上可轻微抑制SmTAT1，SmRAS1，但对SmC4H1，Sm4CL1，SmHPPR这些关键酶基因可能有激活能力(见图8c)，为了进一步确定SmbZIP1的靶点，将上述关键酶基因的启动子元件进行分析，方便进行后续实验。
[0090] 实施例9
[0091] 体外验证作用靶点
[0092] 9.1酵母单杂交实验
[0093] 通过Dual-LUC实验结果与查找这些启动子的结合元件再次确认SmbZIP1的作用靶点，将SmbZIP1与这些基因的启动子的元件(主要是G-Box元件CACGTG)进行酵母单杂交实验，结果证明SmbZIP1可以与丹酚酸合成通路中的关键酶基因SmC4H1启动子中的G-Box-like元件发生结合，说明SmC4H1是SmbZIP1的直接调控靶点(见图8e)。
[0094] 9.2凝胶阻滞实验
[0095] 为了进一步确认SmbZIP1的作用靶点，将SmbZIP1与这些启动子的元件(G-box元件CACGTG)进行EMSA实验。结果发现，含有G-box元件的SmC4H1的探针能够和纯化的带有His标签的SmbZIP1蛋白发生结合，从而能够在C300化学发光成像仪中看相关大小条带。说明SmbZIP1能够直接通过结合SSmC4H1启动子中的G-box-like元件来对它们进行调控，也进一步证实了SmC4H1是SmbZIP1的直接调控靶点(见图8f)。
[0096] 本实施方式中利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹酚酸含量，具体如下：
[0097] 10.1毛状根中丹酚酸含量的提取
[0098] 收获的毛状根烘干至恒重，研磨成粉末，准确称取0.05g毛状根粉末于50mL离心管中，加入10mL乙醇：水(4：1，v/v)，超声30min，8000rpm，离心10min，吸取上清萃取液于旋转蒸发仪中65℃真空干燥，残余物重新用2mL的双蒸水溶解，将样品用0.22μm的水相滤膜过滤后待测。
[0099] 10.2毛状根中丹酚酸含量的HPLC测定
[0100] 精密称取丹酚酸B、迷迭香酸标准品用甲醇分别配置成浓度为1mg/mL的标准品贮备液，保存于-20℃备用。
[0102] 10.3丹酚酸含量分析
[0103] 将上述标准品贮备液分别取相应梯度的量在相应色谱条件下进样，使标准品完全分离，且峰型良好，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品浓度(X，mg/mL)进行回归分析。
[0104] 上述0.22μm滤膜过滤后的丹酚酸粗提物取100μL，用高效液相色谱仪检测，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算即得样品成分的含量。
[0105] 在本发明中，在过表达毛状根根系中，迷迭香酸和丹酚酸B两种丹酚酸的含量相对于对照组明显上调，总丹酚酸的含量也明显提高。其中，表达量最高的转基因毛状根中丹酚酸的含量19.29mg/g干重，是对照组(4.66mg/g干重)的8.5倍。本发明为商业化大量生产丹酚酸提供了可能，也为满足市场对丹酚酸需求提供了重要来源(见图9)。
[0106] 本发明采用过表达SmbZIP1基因的代谢工程策略获得了高产丹酚酸的丹参转基因毛状根根系，为商业化大量生产丹酚酸提供了可能，也为满足市场对丹酚酸需求提供了重要来源。
[0107] 上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用该发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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