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一种丹酚 酸化合物V、其制备方法和用途

阅读：347发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种丹酚酸化合物V、其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种丹酚酸化合物、其制备方法和用途、所述丹酚酸化合物结构式如下：本发明还涉及含有本发明丹酚酸化合物的药物组合物及其在制备治疗癌症化学预防、小胶质细胞活化介导的疾病、氧化应激介导的疾病的药物中的应用。，下面是一种丹酚酸化合物V、其制备方法和用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有式(Ⅰ)结构的丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐：
2.一种含有权利要求1所述的丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
3.权利要求1所述的丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肝癌、小胶质细胞活化介导的疾病、氧化应激介导的疾病的药物中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中，所述的氧化应激介导的疾病至少包括选自下列组中的一种：由缺氧引起的血管舒张功能障碍，缺氧、缺糖和过氧化状态引起的体外神经细胞损伤、心脑血管疾病，和急性心肌缺血、慢性脑供血不足及由心血淤阻引起的心绞痛；所述小胶质细胞活化介导的神经系统疾病至少包括选自下列组中的一种：慢性炎症、帕金森病、阿兹海默症和多发性硬化。
5.权利要求1所述的丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐在制备具有诱导醌还原酶活性的药物中的应用。
6.权利要求1所述丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取：将丹参药材或者丹参与其他药材的混合物进行水提，合并提取液用盐酸调节至酸性，放置，过滤，得澄明药液；
(2)分离：将所述步骤(1)中所得药液经水稀释后过聚酰胺柱层析，以碳酸氢钠溶液洗脱并收集，调PH值至酸性后再过大孔吸附树脂，以乙醇溶液洗脱，回收乙醇后冷冻、静置并过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至5.0—6.5，冷冻干燥，即得丹参多酚酸提取物；
(3)纯化：将所述步骤(2)所得丹参多酚酸提取物用流动相溶解配置成样品溶液，使用高压制备液相色谱仪进行初步分离得到含有丹酚酸化合物的混合物；所得混合物，再使用高压制备液相色谱仪经过先后两步纯化得到所述的目标化合物；其中，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为初步分离和第一步纯化使用乙腈-水-甲酸，第二步纯化使用甲醇：乙腈：
水：甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长288nm或254nm；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸化合物的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸化合物。
7.权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，将所述丹参药材或者丹参与其他药材的混合物切成饮片；所述水提步骤为加入4-8倍药材量体积的水，煎煮提取三次，每次0.5-3h，滤过；药渣继续用3-6倍量水煎煮0.5-3h，滤过；合并滤液，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置2～10小时后过滤；
所述步骤(2)中，过大孔吸附树脂柱，原药材与大孔吸附树脂重量比为5:1-1:1，用8-15倍量柱床体积的水冲洗；用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，所得浓缩液冷藏12～48小时后过滤；所述大孔吸附树脂选自AB-8、HPD450、HPD700、D101、D4020和X5型大孔吸附树脂中的一种。
8.权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤(3)中的样品溶液浓度为20-50mg/ml，每次进样量1ml，流速5-10ml/min；初步分离所采用的色谱条件为乙腈：水：甲酸＝25:75:0.1％；第一步纯化所采用的色谱条件为乙腈：水：甲酸＝21:79:0.1％，第二步纯化所采用的色谱条件为甲醇：乙腈：水：甲酸＝
18.7:9.3:72：0.1％。
9.权利要求1所述的丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐，其中所述药学上可接受的盐包括常规的、药学上可接受的无机碱或有机碱生成的盐，所述的盐通过常规的成盐方法制备而得，适合的盐的实例包括钠、钾、锂、镁、铝、钙、锌的盐，或与N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、黄连素形成的盐。
10.权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，是适用于口服、胃肠外、直肠和局部给药的制剂形式。

说明书全文

一种丹酚酸化合物V、其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及中药提取得到中药提取物，具体涉及一种经过分离提取得到的新的丹酚酸类化合物。

背景技术

[0002] 丹参为唇形科鼠尾草属植物的根部，性味苦，微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。现代药理研究证明，丹参具有扩张冠脉、改善微循环、保护心脏的作用，能抑制和解除血小板聚集，提高机体耐缺氧能力以及抗肝炎、抗肿瘤和抗病毒等活性。2001年，中国医学科学院协和医科大学药物研究所报道了丹参及其同属植物的水溶性活性成分共计13种酚酸类化合物及其药理作用(黎莲娘等人，医学研究通讯，2001年，第30卷，第7期)；2012年，南开大学药学院报道了丹参总酚酸提取物中15种酚酸类化合物，包括丹酚酸A、B、C、D、E、F、G、H、L、紫草酸、迷迭香酸及异丹酚酸B/E等(赵洪芝等人《药物分析杂志》2012年第32卷第4期)。2014年，李伟等报道了丹酚酸U和丹酚酸T的化学结构(李伟等人Fitoterapia 98(2014)248–253)。国外也对丹参水溶性活性成分进行了研究。1999年，美国乔治顿大学就“丹参酚酸类13个化学结构抗HIV整合酶和其他病毒”申请并获得了美国专利，表明丹参是一种极具潜力和开发价值的药用植物资源。

[0003] 丹参酚酸类中，还有许多尚未分离的成分，为此，本发明人经过研究，分离出本发明所述的一种新的丹酚酸化合物，在此命名为丹酚酸V，该结构的化合物及药理作用迄今尚未见有报道，本发明对该化合物进行了药效实验，意外的发现其具有优良的药理效果。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种新的丹酚酸化合物V。

[0005] 本发明进一步的目的是提供含有丹酚酸V的药物组合物。

[0006] 本发明的又一目的是提供丹酚酸V的制备方法。

[0007] 本发明的再一目的是提供丹酚酸V在制备治疗癌症化学预防、小胶质细胞活化介导的疾病、氧化应激介导的疾病的药物中的应用。

[0008] 本发明所述的氧化应激介导的疾病至少包括选自下列组中的一种：由缺氧引起的血管舒张功能障碍，缺氧、缺糖和过氧化状态引起的体外神经细胞损伤、心脑血管疾病，和急性心肌缺血、慢性脑供血不足及由心血淤阻引起的心绞痛；所述小胶质细胞活化介导的神经系统疾病至少包括选自下列组中的一种：慢性炎症、帕金森病、阿兹海默症和多发性硬化等神经退行性疾病。

[0009] 本发明涉及的一种具有式(Ⅰ)结构的丹酚酸化合物或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物：

[0010]

[0011] 本发明的化合物V，经过化合物的理化性质、利用NMR、MS、ECD等波谱技术对注射用丹参多酚酸(SAFI)物质组中分离得到的新化合物样品的鉴定，确证了其结构。

[0012] 本发明的化合物为褐色粉状。

[0013] 本发明的化合物 (c 0.03,MeOH/H2O 3:2)。

[0014] 本发明的化合物HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 741.1426[M+Na]+:(calcd.for C36H30O16Na,741.1439)，得其分子式为C36H30O16，不饱和度为22。

[0015] 本发明的化合物1H-NMR(400MHz,CD3OD)：δH 7.87(1H,s),7.36(1H,d,J＝15.9Hz),7.31(1H,d,J＝8.4Hz),6.93(1H,d,J＝8.4Hz),6.71(1H,br.s),6.69(1H,d,J＝
8.0Hz),6.56(1H,br.s),6.53(2H,br.s),6.49(1H,br.d,J＝8.4Hz),6.54(1H,br.s),6.47(1H,br.s),6.19(1H,d,J＝15.9Hz),6.15(1H,br.d,J＝8.0Hz),5.02(2H,br.s),3.00(1H,br.s),2.95(2H,m),2.71(1H,m)

[0016] 本发明化合物13C-NMR(100MHz,CD3OD)：169.2,168.8,150.5,148.8,146.0,145.9,145.6,145.2,144.9,144.8,144.7,143.7,130.2,130.1,128.1,127.9,126.3,
125.2,123.3,122.0,122.0,121.9,121.2,118.6,117.5,116.6,116.4,116.4,116.3,
116.1,77.0,77.0,38.2,38.2

[0017] 本发明化合物的1H-NMR(400MHz,CD3OD)(Table 2)中低场区显示一组反式双键质子信号：δH 7.36(1H,d,J＝15.9Hz),6.19(1H,d,J＝15.9Hz)；另外7.31(1H,d,J＝8.4Hz),6.93(1H,d,J＝8.4Hz),6.71(1H,br.s),6.69(1H,d,J＝8.0Hz),6.15(1H,br.d,J＝8.0Hz),
6.56(1H,br.s),6.53(2H,br.s),6.49(1H,br.d,J＝8.4Hz),6.54(1H,br.s),6.47(1H,br.s)组成一对苯环AB系统和三对ABX偶合系统，此外还有δH 7.87(1H,s)为一双键上质子信号。δH 5.02(2H,br.s),3.00(1H,br.s),2.95(2H,m),2.71(1H,m)显示两组-CH(O-)-CH2-信号。13C-NMR(100MHz,CD3OD)(Table 2)中低场区169.2为羧基或酯基碳信号，δC 110～
152区间显示28个碳信号，除去一对反式双键碳信号δC 144.9,116.3外，还存在26个碳信号，提示可能存在4个苯环和一个双键，其中9个δC 140-152碳信号，提示可能存在4个邻二氧取代的苯环。

[0018] 本发明化合物的NMR数据与文献[4]报道一致，推测本发明化合物为丹酚酸E。

[0019] HMBC谱中δH 7.31(1H,d,J＝8.4Hz,H-6)与δC 126.3(C-1),128.1(C-2),144.7(C-7)相关；δH 7.36(1H,d,J＝15.9Hz,H-7)与δC 116.3(C-8),121.2(C-6),128.1(C-2),168.8(C-9)相关；δH 6.19(1H,d,J＝15.9Hz,H-8)与δC 126.3(C-1),144.7(C-7),168.8(C-9)相关证明有2-取代咖啡酸片段存在；δH 6.54(1H,br.s,H-2′)与δC121.9(C-6′),123.3(C-
8′),144.8(C-4′),145.2(C-7′)相关，δH 6.69(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′)与δC 130.1(C-1′),
121.9(C-6′),145.2(C-7′)相关，δH 6.54(1H,s,H-7′)与δC 116.1(C-2′),123.3(C-8′),
121.9(C-6′),128.1(C-2)相关证明A、B苯环之间通过一双键相连。δH 6.71(1H,br.s,H-2″)与δC 38.2(C-7″)相关，δH6.53(1H,br.s,H-5″)与δC 125.2(C-6″)相关，δH 6.69(1H,br.d,J＝8.4Hz,H-6″)与δC 118.6(C-5″)，δC 148.9(C-4″)相关证明7″-CH2连在C苯环上。δH
6.47(1H,br.s,H-2″′)与δC 38.2(C-7″′),122.0(C-1″′),144.9(C-4″′)相关,δH 6.53(1H,br.s,H-5″′)与δC 122.0(C-6″′),145.6(C-3″′),144.9(C-4″′)相关,δH 6.56(1H,br.s,H-
6″′)与δC38.2(C-7″′),116.4(C-5″′),117.5(C-2″′)相关证明7″′-CH2连在D苯环上。并通过HSQC和HMBC谱对本发明化合物进行了全归属。

[0020] 但本发明化合物δC 77.0(C-8″),77.0(C-8″′)表明C-8″,C-8″′位为S构型[1]。所以确定本发明化合物为(8″S,8″′S)-epi-丹酚酸E，经文献检索为未见报道的新化合物。

[0021] 所以，通过与现有技术比较，本发明的化合物为一新的丹酚酸类化合物，将其命名为丹酚酸V。

[0022]

[0023] 本发明化合物的NMR信号归属：见下表

[0024] 1H(400MHz)and 13C NMR(100MHz)data for compound 3in CD3OD

[0025]

[0026]

[0027] a Overlapping peaks

[0028] b signals can be changed

[0029] 在提取制备过程中，由于本发明的化合物可能发生构型、构象的变化，因此，波谱数据可能会有所变化。但由构型、构象变化所产生的各种异构体均在本发明的保护范围之内。

[0030] 根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明的化合物V还可以利用其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式。本发明的化合物V的药学上可接受的盐包括常规的、药学上可接受的无机碱或有机碱生成的盐，所述的盐通过常规的成盐方法制备而得。适合的盐的实例包括钠、钾、锂、镁、铝、钙、锌等的盐，或与N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、黄连素形成的盐。下文所提到的化合物V包括式(I)所表示的化合物V及其药学上可接受的盐、溶剂化物和可水解的酯。

[0031] 本发明的化合物V适宜以药物组合物的形式给药。这类组合物可以按照常规方式与一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂混合使用。若有可能，在治疗上将本发明的化合物V作为原料药给药，优选活性成分直接作为药物制剂。在与其他成分相容和对服药者无害的意义上，载体必须是药学上可接受的。

[0032] 因此，本发明进一步提供本发明的化合物V的药物制剂，包括本发明的化合物V和一种或多种药学上可接受的载体，以及含有或不含其他治疗和/或预防性成分。这些制剂适用于口服、胃肠外(包括皮下例如注射或药库片；真皮内；鞘内；肌内例如药库；静脉内等)、直肠和局部(如舌下)给药，但最适合的给药途径应取决于患者的病症。该制剂可以是单位制剂，并且可以通过用药学领域熟知的任一种方法制备。所有方法包括使本发明的化合物V与载体结合的步骤，该载体构成一种或多种辅助成分。一般来说，该制剂的制备过程如下：使本发明的化合物V与液体载体、或微细粉碎的固体载体、或二者的结合均匀而紧密的结合，然后，如果必要的话，使产物成型为所必须的制剂。

[0033] 通常可使用标准的制药技术，即可将本发明的化合物V和药用载体制得本发明药物组合物，这些方法包括混合、制粒和压制。本领域技术人员所熟知的是，可药用载体或稀释剂的形式和特性取决于与其混合的活性成分的量、给药途径和其他已知因素。在此，所用的药用载体是可与组合物联用给药的各种有机或无机载体，例如：用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂和包衣剂；也可使用药用添加剂，例如着色剂和甜味剂。所述药用载体选自：甘露醇、山梨醇等糖醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

[0034] 其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂，例如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂；胶囊剂，例如硬胶囊剂、软胶囊剂；口服液；口含剂；颗粒剂；冲剂；丸剂；散剂；膏剂；丹剂；混悬剂；粉剂；溶液剂；注射剂；栓剂；膏剂，例如软膏剂、硬膏剂；霜剂；喷雾剂；滴剂以及贴剂。本发明的制剂优选：口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；以及注射剂，如粉针剂、注射液、输液等。本发明的制剂最优选为片剂。

[0035] 其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂、粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

[0036] 优选的示例赋形剂包括：乳糖、D-甘露醇、D-山梨醇、淀粉如α-淀粉、糊精、结晶纤维素、低取代的羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、支链淀粉、轻质无水硅酸、合成硅酸铝、硅酸铝镁等。

[0037] 优选的示例润滑剂包括：硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石粉、硅胶等。

[0038] 优选的示例粘合剂包括：α-淀粉、蔗糖、明胶、阿拉伯胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、结晶纤维素、糖、D-甘露醇、海藻糖、糊精、支链淀粉、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、吡咯烷酮等。

[0039] 优选的示例崩解剂包括：乳糖、糖、淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、氨烷基钠、羧甲基淀粉钠、轻质无水硅酸、低取代的羟丙基纤维素等。

[0040] 优选的示例包衣剂包括：羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇等。

[0041] 优选的示例着色剂包括：水溶性食用枸橼黄染料(食用染料例如食用红No.2和No.3，食用黄No.4和No.5，食用蓝No.1和No.2)；水不溶性色沉染料(例如上述水溶性食用枸橼黄染料的铝盐)；天然染料(例如β-胡萝卜素、叶绿素、铁丹)等。

[0042] 优选的示例甜味剂包括：糖精钠、甘草次酸、阿斯帕坦、甜菊等。

[0043] 片剂的制备方法一般为，本发明的化合物V与一种或多种药学上可接受的辅料一起压制或模制。

[0044] 本发明的化合物V还可以制成口服液体制剂，例如水性或油性悬液、溶液、乳剂、糖浆剂等。本发明的化合物V还可以是干燥产品，使用前用水或其他适合的载体混合。这类液体制剂可以含有常规的添加剂，可以包括悬浮剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可以包括食用油)，如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇或乙醇；以及防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸。

[0045] 用于胃肠道外给药的制剂包括水性与非水性无菌注射液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、等渗剂等；以及水性与非水性无菌混悬液，其中可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以存放在单剂量或多剂量容器内，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以贮存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在临时用前加入无菌的液体载体，例如注射用水。

[0046] 用于直肠给药的制剂可以是栓剂，含有常规的栓剂基质，例如可可脂、硬脂肪酸或其他甘油酯，或乙二醇。

[0047] 用于口腔局部、例如颊部或舌下给药的制剂包括锭剂，其中在加味的基质中包含活性成分，该基质例如蔗糖和阿拉伯胶；还包括软锭剂，其中在基质中含有活性成分，该基质可以是明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶。

[0048] 本发明的化合物V还可以配制成药库制剂。这类长效制剂可以通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射给药。所以，本发明化合物V可以与适合的聚合物或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂进行配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性盐。

[0049] 根据本领域的普通技术知识和现有技术，本发明所涉及的治疗包括预防和既定疾病或症状的治疗。而且，用于治疗所需的本发明化合物V的量应根据所治疗病症的性质和患者条件而异，或遵医嘱。一般来说，用于成人治疗的剂量通常将在0.02-5000mg/天的范围，优选1-1500mg/天。所需剂量可以是单一的剂量或多次的剂量，按适当的间隔给药，例如每天给予两次、三次、四次或更多。根据本发明的制剂可以含有0.1-99wt％的活性成分，对片剂和胶囊剂优选含有30-95wt％的活性成分，液体制剂优选含有3-50wt％的活性成分。

[0050] 本发明的化合物是通过如下方法制备的：

[0051] (1)提取：将丹参药材或者丹参与其他药材的混合物进行水提，合并提取液用盐酸调节至酸性，放置，过滤，得澄明药液；

[0052] (2)分离：将所述步骤(1)中所得药液经水稀释后过聚酰胺柱层析，以碳酸氢钠溶液洗脱并收集，调PH值至酸性后再过大孔吸附树脂，以乙醇溶液洗脱，回收乙醇后冷冻、静置并过滤，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至5.0—6.5，冷冻干燥，即得丹参多酚酸提取物；

[0053] (3)纯化：将所述步骤(2)所得丹参多酚酸提取物用流动相溶解配置成样品溶液，使用高压制备液相色谱仪进行初步分离得到含有所述丹酚酸V的组合物；然后将分离所得组合物，再使用高压制备液相色谱仪经过先后两步纯化得到所述的目标化合物丹酚酸V；其中，色谱填料为C18反相硅胶柱，洗脱液为初步分离和第一步纯化使用乙腈-水-甲酸，第二步纯化使用甲醇：乙腈：水：甲酸，进行等度洗脱或梯度洗脱，检测波长288nm或254nm，；用高效液相色谱监测洗脱过程，收集含有丹酚酸V的洗脱液，浓缩后得所述丹酚酸V。

[0054] 所述步骤(1)中，将所述丹参药材或者丹参与其他药材的混合物切成饮片；所述水提步骤为加入4-8倍药材量体积的水，煎煮提取三次，每次0.5-3h，滤过；药渣继续用3-6倍量水煎煮0.5-3h，滤过；合并滤液，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置2～10小时后过滤；

[0055] 所述步骤(2)中，过大孔吸附树脂柱，原药材与大孔吸附树脂重量比为5:1-1:1，用8-15倍量柱床体积的水冲洗；用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，所得浓缩液冷藏12～48小时后过滤；所述大孔吸附树脂选自AB-8、HPD450、HPD700、D101、D4020和X5型大孔吸附树脂中的一种。

[0056] 所述步骤(3)中的样品溶液浓度为20-50mg/ml，每次进样量1ml，流速5-10ml/min；初步分离所采用的色谱条件为乙腈：水：甲酸＝25:75:0.1％；第一步纯化所采用的色谱条件为乙腈：水：甲酸＝21:79:0.1％，第二步纯化所采用的色谱条件为甲醇：乙腈：水：甲酸＝
18.7:9.3:72：0.1％。

[0057] 实验材料和方法

[0058] 1.实验仪器和试剂

[0059] (1)制备型HPLC液相色谱仪：岛津L-6AD半制备型高效液相色谱仪

[0060] (2)制备型HPLC液相色谱柱：岛津ODS(C18 250mm*20mm/5μm)色谱柱

[0061] YMC(C18 250mm*20mm/5μm)色谱柱

[0062] (3)色谱纯试剂：Sigma-Aldrich色谱乙腈(4L)

[0063] Sigma-Aldrich色谱甲醇(4L)

[0064] 2.实验方法：将SAFI固体粉末，用流动相溶解，配置成25mg/ml的样品溶液，每次进样量1ml，流速10ml/min，检测波长288nm和254nm均可。

[0065] 以下通过药效实验数据说明本发明的有益效果：

[0066] 实验一、本发明化合物V(11号)醌还原酶诱导活性测试

[0067] 一实验目的：

[0068] 鼠肝癌细胞株Hepa 1c1c7中所能诱导出的醌还原酶(NQO1)很容易被测定。NQO1的诱导往往与二相酶水平的升高有关，因此在确定化合物的肿瘤化学预防作用时二相酶可以作为一种可信的生物指标。

[0069] 针对SAFI物质组和从SAFI中分离鉴定的新化合物11号、16号和丹酚酸B，应用鼠肝癌细胞株Hepa 1c1c7，测定其NQO1诱导活性。

[0070] 二实验材料：

[0071] 1.受试品：

[0072]

[0073] 2.实验细胞株及来源：

[0074] 鼠肝癌细胞株Hepa 1c1c7

[0075] 3.实验试剂与主要仪器：

[0076] 小牛血清(购自Hyclone)

[0077] 胎牛血清(TBD公司)；

[0078] 四甲基偶氮唑盐(MTT)美国Sigma(St.Louis,MO)

[0079] 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(上海生工)

[0080] 96孔细胞培养板(Costar公司)

[0081] 三实验方法：

[0082] 鼠肝癌细胞株Hepa 1c1c7的培养：

[0083] 每孔种104个细胞，在包含10％(v/v)胎牛血清、0.01％青霉素G、0.15％碳酸氢钠、0.01％硫酸链霉素的培养液中生长24小时，环境条件为37℃、含5％CO2的潮湿空气。

[0084] 药物的配制

[0085] 4种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，化合物11-1、16-1及B-1浓度为50mM，化合物SAFI 50mg/ml，储存于-20℃。临用时用IMDM培养液将其进行稀释，化合物11-
1、16-1及B-1依次稀释为10μM、20μM，物质组SAFI 40μg/ml、20μg/ml。DMSO终浓度<1‰。

[0086] 结晶紫法确定细胞存活率

[0087] 将已知浓度的待测化合物溶解在DMSO中加入各孔并保持24小时。每孔加入DMSO后应保证DMSO的终浓度<0.5％(v/v)。之后弃掉培养液，每孔加入200μL 0.2μM结晶紫(2％乙醇溶液)。常温下放置染色10分钟左右，弃掉结晶紫溶液，用水迅速洗涤3次，将水甩干并用吹风机吹干。每孔加入200μL 0.5％SDS(50％乙醇溶液)，常温下振荡5～10分钟，595nm下测定吸光度。测得的吸光度经空白组(没有种细胞的孔)进行校正，并以相当于对照组(没有处理的孔中细胞)吸光度的百分率表示细胞存活率。每组实验应至少独立重复3次并取平均值作为最后结果。

[0088] 细胞成活率％＝给药组OD值的平均值/空白乳组OD值的平均值×100％

[0089] 4.醌还原酶诱导活性测定

[0090] NQO1诱导测定的基本原理是葡萄糖-6-磷酸可在辅因子NADP存在的条件下被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶还原，这时可产生NADPH，NADPH一旦形成便作为一种供电子体使甲萘醌还原为甲萘氢醌，甲萘氢醌可使MTT还原为甲臜，最后可对甲臜进行吸光度的测定。NADP和甲萘醌在该催化循环过程中可再生，所以实验中不用对其进行补充。NQO1诱导剂可增加甲萘氢醌的产生，从而使更多的甲臜形成。在该实验中，所采用化合物的浓度要预先经过Hepa 1c1c7细胞筛选，其浓度应满足使细胞存活率>55％。

[0091] NQO1活性的测定在96孔板上用鼠肝癌细胞进行，过程如下所述：细胞培养后将已知浓度的待测化合物溶解在DMSO中加入各孔并保持24小时。每孔加入DMSO后应保证DMSO的终浓度<0.5％(v/v)。在这之后，将培养液倒出并加入含有0.8％(w/v)洋地黄皂苷和2mM EDTA，搅动10分钟以消化细胞。在每孔加入“完全反应混和液”200μl。该混和液应临用前配置，配置方法如下：将7.5mL 0.5M的Tris-Cl(pH＝7.4)、100mg小牛血清、1mL 1.5％的吐温20、0.1mL 7.5mM的FAD、1mL 150mM的葡萄糖-6-磷酸、90μL 50mM的NADP、300单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、45mg MTT用去离子水配置成150mL的溶液。在加入混和液之前加入0.2μL甲萘醌(50mM，溶解在乙腈中)。待加入完成后96孔板轻轻振摇5分钟。将0.3mM双香豆素溶解在
0.5％DMSO和5mM磷酸二氢钾中(pH＝7.4)吸取50μL加入板上每孔中以终止反应。在590nm波长下测定吸光度。空白组中不含细胞，对照组为Hepa 1c1c7细胞和含0.5％DMSO基质液但不含待测化合物。待测化合物的NQO1诱导活性的计算方法：先将给药组和对照组的吸光度减去空白组的吸光度，然后用给药组的吸光度指比上对照组的吸光度值(IR)作为NQO1诱导活性的指标。每组实验应至少独立重复3次。

[0092] 四实验结果：

[0093] 表1SAFI物质组和从中分离的单体化合物的NQO1诱导活性测试结果

[0094]

[0095] 4'-Bromoflavone作为阳性对照药

[0096] 六实验结论：

[0097] 在保证细胞存活率高于55％的情况下，IR大于2即表明测试样品具有显著地NQO1诱导作用，IR值介于1和2之间表示具有一定程度的NQO1诱导活性。由上表结果可知，SAFI物质组和从中分离得到的三个单体化合物在测试浓度下未表现出细胞毒性，其中化合物1在20μM浓度下表现出了显著的NQO1诱导活性，化合物2和3表现出中等强度的诱导活性。

[0098] 实验二、本发明化合物V(11号)清除DPPH自由基作用

[0099] 一、实验目的

[0100] 氧化应激与体内多种疾病的发病机制密切相关，如心脑血管疾病、神经退行性疾病等。酚酸类化合物因其结构中具有还原性的酚羟基而表现出显著的抗氧化、清除自由基的活性。本实验中根据目标化合物的结构特点，测试其清除DPPH自由基的活性。

[0101] DPPH·(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)为一种稳定的自由基，具有使空余电子转移的作用。当存在状态为1时，其乙醇或甲醇溶液呈现深紫色，在517nm处有最大吸收。当DPPH·溶液加入供氢化合物时，即存在状态为2时，由于picryl基团存在，呈现浅黄色，[0102] 紫色减退至消失。

[0103] 以Z·代表DPPH·，AH代表供氢分子，其主要的反应如下：

[0104] Z·+AH＝ZH+A·

[0105]

[0106] 据此可检测自由基被消除的情况。

[0107] 二、实验材料

[0108] 1.受试品：

[0109]

[0110]

[0111] 2.实验试剂与仪器：

[0112]

[0113] 三、实验方法：

[0114] 1.DPPH自由基清除实验

[0115] 量取1mL 1×10-4mol/L DPPH·甲醇溶液，并加入1mL试样液，摇匀，氮气保护下，暗处反应40min后，用甲醇做参比液，测定反应体系在517nm处的吸光度Ai。同时测定1mL DPPH·溶液与等体积甲醇混合液的吸光度Ac及试样液与等体积甲醇混合液的吸光度Aj。根据公式(1)计算样品的清除率，以Vc作为阳性对照重复上述实验。

[0116] 抗氧化活性的大小主要通过DPPH·的减少率来表示：

[0117]

[0118] 4种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，化合物11-1、16-1及B-1浓度为100mM，储存于-20℃。临用时用甲醇将其进行稀释，化合物11-1、16-1及B-1依次稀释为2mM、
0.5mM、0.125mM。

[0119] 四、实验结果

[0120] 1.3种化合物DPPH自由基清除活性的测试结果

[0121] 表1三种化合物清除DPPH自由基活性测试结果

[0122]

[0123]

[0124] Vc为阳性对照药

[0125] 五、实验结论

[0126] 化合物2、3在三个测试浓度下(0.125mM，0.5mM，2mM)均具有显著的DPPH自由基清除活性，其作用强度强于阳性对照药Vc。化合物1在2mM浓度下具有显著的DPPH自由基清除活性。SAFI物质组因本底颜色干扰过大，在中、高浓度均未得到有效数据，在低浓度(0.125mM)表现出了中等强度的DPPH自由基清除活性。

[0127] 实验三、本发明化合物V(11号)抑制小胶质细胞活化作用

[0128] 一、实验目的

[0129] 小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等[1,2]。

[0130] 本实验通过建立体外LPS激活N9小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，在4种化合物中筛选对小胶质细胞活化有抑制作用的化合物。

[0131] 二、实验材料

[0132] 1.受试品：

[0133]

[0134]

[0135] 2.实验细胞株及来源：

[0136] N9：小鼠小胶质细胞株。

[0137] 3.实验试剂与仪器：

[0138]

[0139] 三、实验方法：

[0140] 1.小鼠小胶质细胞系N9的培养

[0141] 细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以IMDM培养基作为基础配制成内含5％胎牛血清及50μg/ml 2-巯基乙醇的细胞培养液。小胶质细胞以约4×105cells/ml的浓度在5％CO2，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积50-60％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-80℃超低温冰箱冻存复苏后的N9作为第一代，选择第3-8代N9细胞进行实验。

[0142] 2.药物配制方法

[0143] 4种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，化合物11-1、16-1及B-1浓度为100mM，化合物SAFI 100mg/ml，储存于-20℃。临用时用IMDM培养液将其进行稀释，化合物
11-1、16-1及B-1依次稀释为100μM、30μM、10μM、3μM、1μM，化合物SAFI 100μg/ml、30μg/ml、
10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml。DMSO终浓度<1‰。

[0144] 3.Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用[1,3]

[0145] 取对数生长期的N9小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜IMDM培养基将细胞密度调至5×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。4种化合物设剂量100、30、10、3、1μM(μg/ml)与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO2-含量。

[0146] 4.MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响[2]

[0147] 取对数生长期培养的N9小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜IMDM培养基将细胞密度调至5×105cells/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37℃，5％CO2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。4种化合物设剂量100、30、10、3、1μM(μg/ml)与LPS共同作用。同时设空白对照。各给药组中LPS终浓度为100ng/ml。细胞加药后继续培养24h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μl/well，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入100μl的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品6个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。

[0148] 细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％

[0149] 5.统计方法

[0150] 全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，方差齐性时采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，方差不齐时采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

[0151] 四、实验结果

[0152] 1.4种化合物对LPS激活N9小胶质细胞一氧化氮释放的影响

[0153] 实验结果显示，化合物1、2、3作用24h后对LPS活化的小鼠小胶质细胞株N9的NO释放有抑制作用(见表1)。

[0154] 表1.4种化合物对LPS激活N9小胶质细胞释放一氧化氮(％)的影响(Mean±SE)[0155]

[0156] Significance:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001compared to LPS groups.###P<0.001compared to control groups.

[0157] 2.4种化合物对LPS活化的N9小胶质细胞存活率的影响

[0158] 实验结果显示，测试样品均不降低LPS活化的N9细胞存活率(见表2)。

[0159] 表2.4种化合物对LPS活化的N9小胶质细胞存活率(％)的影响(Mean±SE)

[0160]

[0161]

[0162] Significance:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001compared to control groups.[0163] 五、实验结论

[0164] 化合物1、2、3能够显著抑制LPS刺激的N9小胶质细胞NO释放，并且在其发挥抑制作用的浓度范围内不影响小胶质细胞存活率。提示以上样品能够抑制LPS诱导的小胶质细胞活化，其可能具有减轻小胶质细胞活化介导的神经系统疾病(如神经退行性疾病)的潜在作用。从以上实验结果可知，本发明化合物具有优良的药理效果，和现有技术相比副作用低，疗效好，物理化学性质特别适合开发成适宜的药物。附图说明

[0165] 图1 7个组分分离情况

[0166]

[0167] 图2 Fr.2HPLC色谱图

[0168]附图标记组分
7 丹酚酸H/I
8 丹酚酸D
10 丹酚酸B异构体
11 11号目标化合物V

[0169] 图3 Fr.3HPLC色谱图

[0170] 附图标记组分10 丹酚酸B异构体
11 11号目标化合物V
14 紫草酸
15 丹酚酸B

[0171] 图4对Fr.2进行二次制备(色谱条件：乙腈：水：甲酸21:79:0.1％)，得到Fr.2‐1和Fr.2‐2，谱图

[0172] 图5对2‐2再制备(色谱条件：甲醇：乙腈：水：甲酸18.7:9.3:72：0.1％)，得到11号目标成分，谱图

[0173] 图6对11号目标峰纯度验证，谱图

[0174] 图7为本发明化合物的质谱图

具体实施方式

[0175] 以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

[0176] 实施例1

[0177] 化合物V的制备

[0178] (1)提取：将丹参药材加水进行水提，方法如下：加入4-8倍药材量体积的水，煎煮提取三次，每次0.5-3h，滤过；药渣继续用3-6倍量水煎煮0.5-3h，滤过；合并滤液，冷却，用盐酸溶液调节至酸性，放置2-10小时后过滤；

[0179] (2)分离：将所述步骤(1)中所得药液经水稀释后过聚酰胺柱层析，以碳酸氢钠溶液洗脱并收集，调PH值至酸性后再过大孔吸附树脂，其中原药材与大孔吸附树脂重量比为5:1-1:1，用8-15倍量柱床体积的水冲洗；用3-8倍量的50％-95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，所得浓缩液冷藏12～48小时后过滤；所述大孔吸附树脂选自AB-8、HPD450、HPD700、D101、D4020和X5型大孔吸附树脂中的一种。过滤后的滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至
5.0—6.5，冷冻干燥，即得丹参多酚酸提取物；

[0180] (3)纯化：将所述步骤(2)所得丹参多酚酸提取物用流动相溶解配置成样品溶液，样品溶液浓度为20-50mg/ml，使用高压制备液相色谱仪进行初步分离得到含有所述化合物V的混合物；然后继续分离所得混合物，再使用高压制备液相色谱仪经过先后两步纯化得到所述的目标化合物化合物V；其中，色谱填料为C18反相硅胶柱，每次进样量1ml，流速5-10ml/min；初步分离所采用的色谱条件为乙腈：水：甲酸＝25:75:0.1％；第一步纯化所采用的色谱条件为乙腈：水：甲酸＝21:79:0.1％，第二步纯化所采用的色谱条件为甲醇：乙腈：
水：甲酸＝18.7:9.3:72：0.1％。

[0181] 实施例2

[0182] 续实施例1

[0183] 应用制备型HPLC法对样品溶液进行了初步分离，按照色谱峰保留时间和相对分离度将其分为6个目标组分。6个组分分离情况如图1中所示，色谱条件：乙腈：水：甲酸25:75:0.1％。对粗分的到的6个组分(Fr.1，Fr.2，Fr.3，Fr.4，Fr.5，Fr.6)进行分析检测，Fr.2和Fr.3中含有本发明化合物V(11号)目标峰。图2为Fr.2HPLC色谱图，图3为Fr.3HPLC色谱图；
对Fr.2进行二次制备(色谱条件：乙腈：水：甲酸21:79:0.1％)，得到Fr.2‐1和Fr.2‐2，见图
4，对2‐2再制备(色谱条件：甲醇：乙腈：水：甲酸18.7:9.3:72：0.1％)，得到11号目标成分见图5，对11号目标峰纯度验证，谱图见图6。

[0184] 实验材料和方法

[0185] 1.实验仪器和试剂

[0186] (1)制备型HPLC液相色谱仪：岛津L‐6AD半制备型高效液相色谱仪

[0187] (2)制备型HPLC液相色谱柱：岛津ODS(C18 250mm*20mm/5μm)色谱柱

[0188] YMC(C18 250mm*20mm/5μm)色谱柱

[0189] (3)色谱纯试剂：Sigma‐Aldrich色谱乙腈(4L)

[0190] Sigma‐Aldrich色谱甲醇(4L)

[0191] 2.实验方法：将SAFI固体粉末，用流动相溶解，配置成25mg/ml的样品溶液，每次进样量1ml，流速10ml/min，检测波长288nm和254nm均可。

[0192] 实施例3化合物V制剂

[0193] 取实施例1的化合物V0.5g与10.5g聚乙二醇-6000混合均匀，加热熔融，化料后移至滴丸滴灌中，药液滴至6-8℃液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。

[0194] 实施例4化合物V制剂

[0195] 取实施例1的化合物V0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸钠0.9g和蒸馏水1ml，上述组分混合均匀后，冷冻干燥，分装500支，即得。

[0196] 实施例5化合物V制剂

[0197] 取实施例1的化合物V0.5g、微晶纤维素20g、淀粉20g，上述组分混匀后，制粒压片制备成500片片剂，即得。

[0198] 实施例6，

[0199] 将化合物V和以下的碱性物质反应根据酸碱中和反应的原理形成相应的盐：

[0200] 钠、钾、锂、镁、铝、钙、锌等的氢氧化物，N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、黄连素。

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