技术领域
[0001] 本
发明属于中药检测技术领域，具体地说，涉及一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法及其指纹图谱。
背景技术
[0002] 脉络通颗粒具有益气活血、化瘀止痛、通脉活络的功能。适用于
治疗胸痹引起的心胸
疼痛、胸闷气短、头痛眩晕及冠心病、心绞痛具有上述诸症，中
风引起的肢体麻木、半身不遂等症。
[0003] 脉络通颗粒组方出自《中药部颁标准》的“脉络通颗粒”，且于1987年独家生产、上市。脉络通颗粒的组方中，以党参、当归为君药，益气兼以养血；红花、丹参、川芎、地龙为臣药，辅助君药达到活血通脉的功效；山楂为佐药，通行气血，活血祛瘀止痛；木贼、葛根、槐米为使药，能够升清通痹，助药上行，直达病所。君臣佐使，全方配伍，益气活血、化瘀止痛，适用于气虚血瘀、心脉痹阻的冠心病心绞痛患者。
[0004] 中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或
光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的
基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品
质量的真实性、优良性和
稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国和法国也已经在用高效液相指纹图谱方法对
银杏叶提取物进行质量控制，美国最近几年也明确把指纹图谱作为混合物群的质量控制方法。随着研究的深入，人们发现，作为中医理论的实践产物，中药，尤其是复方中药，其中所含的任一种成分都不能代表其整体疗效。人们逐渐认识到，现行的参照化药质量控
制模式的质量标准不能恰当的反映中药内在的质量。从现行的质量控制模式向一种综合的、宏观的、可量化的
鉴别与主要有效成分含量测定结合已是发展的趋势。
[0005] 脉络通颗粒共有10味药材，现行质量标准中只对主成分葛根素进行含量测定是不够的，必须对它的物质群整体予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应该用某种“宏观分析”方法，从整体上有效的表征中药质量。所以建立一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法势在必行。
发明内容
[0006] 本
发明人开发了一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法及其指纹图谱，通过此方法可以保证脉络通颗粒的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保脉络通颗粒的安全性和有效性。
[0007] 本发明的目的是提供一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法。
[0008] 本发明的第二目的是提供用于脉络通颗粒的指纹图谱检测方法的指纹图谱。
[0009] 在本发明的实施方案中，本发明提供了一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法，包括采用高效液相色谱法对脉络通颗粒进行检测，其中，色谱条件包括：
[0010] 以十八烷基
硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以0.3体积％
甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱，流速0.5～1.5ml·min-1，柱温20～35℃，检测
波长210～360nm；理论塔板数按
芦丁峰计算应不低于3000。
[0011] 在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法，其中，梯度洗脱过程中，流动相A的比例变化为：0～3min，5体积％乙腈；3～50min，5体积％～42体积％乙腈；50～50.1min，42体积％～95体积％乙腈；50.1～60min，95体积％乙腈；即梯度洗脱程序如下表：
[0012]
[0013] 在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法，其中，所述的以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为phenomenenx luna(2)C18(4.6*250mm，5um)。
[0014] 在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法，还包括以下步骤：
[0015] (1)供试品溶液的制备：取脉络通颗粒2.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入70体积％
乙醇25～75ml，密塞，称定重量，超声处理(250w，40KHz)10～40分钟，放冷，用70体积％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0016] (2)对照品溶液的制备：取葛根素、芦丁、阿魏酸、党参炔苷、
丹酚酸B、槲皮素、山柰素适量，加70体积％乙醇制成每1ml含葛根素112μg、芦丁204μg、阿魏酸44μg、党参炔苷32μg、丹酚酸B 92μg、槲皮素40μg、山柰素28μg的混合对照品溶液，即得；
[0017] (3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2～10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版对图谱进行处理，即得脉络通颗粒的指纹图谱。
[0018] 在本发明的更优选实施方案中，本发明提供了一种脉络通颗粒的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：
[0019] (1)供试品溶液的制备：取脉络通颗粒2.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入70体积％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声(250w，40KHz)处理20分钟，放冷，用70体积％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0020] (2)对照品溶液的制备：取葛根素、芦丁、阿魏酸、党参炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素适量，加70体积％乙醇制成每1ml含葛根素112μg、芦丁204μg、阿魏酸44μg、党参炔苷32μg、丹酚酸B 92μg、槲皮素40μg、山柰素28μg的混合对照品溶液，即得；
[0021] (3)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版对图谱进行处理，即得脉络通颗粒的指纹图谱；
[0022] 这里，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；-1
以乙腈为流动相A；以0.3％甲酸水溶液为流动相B；梯度洗脱，流速1.0ml·min ；柱温25℃；
检测波长270nm；理论塔板数按芦丁甲峰计算应不低于3000。
[0023] 另一方面，本发明提供了通过上述脉络通颗粒的指纹图谱检测方法得到的脉络通颗粒指纹图谱，所述图谱中有21个共有峰。
[0024] 在本发明的优选实施方案中，本发明提供的脉络通颗粒指纹图谱，所述图谱中有21个共有峰，其中，各共有峰的保留时间分别为：共有峰1：13.234min；共有峰2：15.952min；
共有峰3：17.602min；共有峰4：20.612min；共有峰5：21.099min；共有峰6：21.321min；共有峰7：24.057min；共有峰8：27.190min；共有峰9：28.845min；共有峰10：29.452min；共有峰
11：29.830min；共有峰12：30.206min；共有峰13：33.715min；共有峰14：34.979min；共有峰
15：37.136min；共有峰16：38.789min；共有峰17：39.278min；共有峰18：39.610min；共有峰
19：41.671min；共有峰20：45.049min；共有峰21：48.173min。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] (1)用本发明所提供的方法所建立的脉络通颗粒指纹图谱，能有效地表征脉络通颗粒的质量，有利于全面监控药物的质量。
[0027] (2)指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而判定脉络通颗粒质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。
[0028] (3)本发明方法具有方法简便、稳定、精
密度高、重现性好的优点。
[0029] 在本发明的实施方案中，涉及“％”，如无特殊说明，都是指体积百分比。
附图说明
[0030] 图1为本发明测得的14批脉络通颗粒指纹图谱
叠加图。
[0031] 图2为通过本发明测得脉络通颗粒指纹图谱的对照图谱。
[0032] 图3为本发明测得的脉络通颗粒对照品溶液图谱，图中横坐标为时间(min)，纵坐标为吸光度(mAU)。
[0033] 图4为通过本发明测得的脉络通颗粒典型供试品溶液指纹图谱，图中横坐标为时间(min)，纵坐标为吸光度(mAU)。
具体实施方式
[0034] 对比例
[0035] 脉络通颗粒现行质量标准中只通过葛根素这一个指标来控制药品质量，有一定的片面性；而本发明的脉络通颗粒指纹图谱检测方法可以将测得的指纹图谱与对照图谱通过相似度
软件进行21个共有峰的全面对比，能更全面准确的表征药品的质量。根据历史数据表明，脉络通颗粒中葛根素含量在4.5mg左右，从下表中可见，葛根素含量在4.5mg附近的的批次药品指纹图谱的相似度较小，究其原因发现16110281和16101141两批次指纹图谱中芦丁峰与对照图谱相差较大，16102381批次指纹图谱中丹酚酸B峰与对照图谱相差较大，16101041批次指纹图谱中槲皮素峰与对照图谱相差较大，导致与对照图谱的相似度不高。
而含量较低的2个批次药品指纹图谱相似度较高，通过对比分析发现虽然葛根素峰稍小，但其余20个峰与对照图谱接近，所以与对照图谱相似度高。简单的说，脉络通颗粒指纹图谱是通过对比21个峰来体现药品的质量，比单指标葛根素控制更全面准确。
[0036] 表1脉络通颗粒质量控制对比
[0037]
[0039] 脉络通颗粒指纹图谱的构建方法，采用液相色谱法对脉络通颗粒进行测定，具体方法如下：
[0040] (1)对照品溶液的制备：
[0041] 取葛根素、芦丁、阿魏酸、党参炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素适量，加70％体积乙醇制成每1ml含葛根素112μg、芦丁204μg、阿魏酸44μg、党参炔苷32μg、丹酚酸B 92μg、槲皮素40μg、山柰素28μg的混合对照品溶液，即得。
[0042] (2)供试品溶液的制备：
[0043] 取脉络通颗粒2.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入70体积％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声(250w，40KHz)处理20分钟，放冷，用70体积％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0044] (3)色谱条件及系统适用性
[0045] 色谱柱：phenomenenx luna(2)C18(4.6*250mm，5um)；
[0046] 流动相：A
泵：乙腈；B泵：0.3体积％甲酸；
[0047] 梯度洗脱程序：
[0048]时间(min) A(乙腈)体积％ B(0.30体积％甲酸)体积％
0 5 95
3 5 95
50 42 58
50.1 95 5
60 95 5
[0049] 检测波长：270nm；
[0050] 流速：1.0ml；
[0051] 柱温：25℃
[0052] 理论塔板数按芦丁计不低于3000。
[0053] (4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版对图谱进行处理，即得脉络通颗粒的指纹图谱。见图1-2。
[0054] 液相色谱仪为Agilent 1260 Infinity Series高效液相色谱仪。
[0055] 指纹图谱中有21个共有峰，通过对对照品溶液和供试品溶液同时检测，鉴别出其中4号峰为葛根素、8号峰为芦丁、9号峰为阿魏酸、13号峰为党参炔苷、15号峰为丹酚酸B、19号峰为槲皮素、21号峰为山柰素。另外通过LC-MS检测，又推测出12个化合物，分别为1号峰党参酸、2号峰6-羟基山柰酚3-芸香糖-6-
葡萄糖苷、3号峰染料木苷、5号峰葛根素木糖苷、6号峰3/-甲
氧基葛根素、7号峰大豆苷、10号峰党参苷I、11号峰红花黄色素A、16号峰大豆
苷元、17号峰丹酚酸A、18号峰鹰嘴豆芽素A、20号峰丹酚酸C。见图3-4。
[0056] 供试品制备方法考察
[0058] 分别考察了10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、乙醇，结果70％乙醇和甲醇提取效果相当，从环保和节约成本考虑，选择70％乙醇作为脉络通颗粒的提取溶剂。
[0059] (2)不同提取溶剂体积的考察
[0060] 分别对25ml、50ml、75ml三种不同体积的提取溶剂进行考察(对应的进样量为2.5ul、5ul、7.5ul)，结果提取溶剂为50ml时样品峰面积普遍大于提取溶剂为25ml时的样品峰面积，但75ml提取溶剂跟50ml比较并无优势，选择50ml 70％乙醇作为脉络通颗粒的提取溶剂体积。
[0061] (3)不同提取方式的考察
[0062] 比较了回流提取和超声提取两种提取方式，结果显示两者无明显区别，选择超声提取作为脉络通颗粒的提取方式。
[0063] (4)不同提取时间的考察
[0064] 分别考察了5min、10min、20min、30min、40min作为脉络通颗粒样品的提取时间，结果提取时间为20min、30min、40min时三者峰面积相差不大，但比5min、10min优势明显，选择20min为脉络通颗粒的超声提取时间。
[0065] 脉络通颗粒色谱条件的考察
[0066] (1)洗脱系统的考察
[0067] 分别对比了乙腈-水、乙腈-酸水、甲醇-水、甲醇-酸水4种不同类型的洗脱系统，结果有机相为乙腈时出峰较快，50min内绝大部分物质都能被洗脱，当流动相中加入酸时，特征峰阿魏酸和丹酚酸B出峰时间提前且峰型较好，故选择乙腈-酸水做为本品的洗脱系统。
[0068] (2)不同种类酸的考察
[0069] 对比了乙腈-0.3％甲酸、乙腈-0.5％乙酸、乙腈-0.05％
磷酸3种实验室常用种类及浓度的酸进行比较，发现乙腈-0.3％甲酸、乙腈-0.05％磷酸分离效果要较乙腈-0.5％乙酸好，又考虑到磷酸不能进液质联用系统，最终选择甲酸作为脉络通颗粒流动相的PH调节剂。
[0070] (3)不同酸浓度的考察
[0071] 分别对比了0.2％甲酸、0.3％甲酸、0.4％甲酸，结果0.3％甲酸分离效果最好，所以最终选择乙腈-0.3％甲酸作为脉络通颗粒的流动相。
[0072] (4)不同色谱柱的考察
[0073] 分别对比了phenomenenx luna(2)C18(4.6*250mm，5um)、Agilent plus C18(4.6*250mm，5um)、waters Atlantis T3C18(4.6*250mm，5um)3种不同品牌的C18色谱柱，结果只/
有phenomenenx luna(2)C18色谱柱能将葛根素木糖苷和3-甲氧基葛根素分开，其他2款色谱柱完全未分开，故选择phenomenenx luna(2)C18(4.6*250mm，5um)作为脉络通颗粒指纹图谱分析时的色谱柱。
[0074] (5)不同柱温的考察
[0075] 对比了20℃、25℃、30℃3种柱温，结果25℃分离效果最好，故选择25℃作为脉络通颗粒指纹图谱分析时的柱温。
[0076] (6)不同波长的考察
[0077] 通过对比250nm、260nm、270nm、300nm、280nm、290nm、325nm、360nm波长下的图谱可以发现，270nm波长下的色谱图各峰出峰情况较均衡，且党参炔苷最大吸收波长在270nm。故选择270nm做为脉络通颗粒指纹图谱分析时的检测波长。
[0078] 方法学考察
[0079] (1)精密度考察
[0080] 取批号为16102381的脉络通颗粒2.0g，按照供试品制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，并对6张图谱进行相似度比较。结果图谱间的相似度均为1.000，表明仪器精密度良好，见表2。
[0081] 表2脉络通颗粒精密度实验结果(16102381)
[0082]
[0083]
[0084] (2)重复性考察
[0085] 取批号为16102381的脉络通颗粒，按照供试品制备方法制备6份供试品溶液。按照上述色谱条件进样，记录色谱图，并对6张图谱进行相似度比较。结果图谱间的相似度均为1.000，表明该方法重复性良好，见表3。
[0086] 表3脉络通颗粒重复性实验结果(16102381)
[0087]
[0088] (3)稳定性考察
[0089] 取批号为16102381的脉络通颗粒2.0g，按照供试品制备方法制备供试品溶液，分别于制样后0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进样，记录色谱图，并对8张图谱的全峰进行相似度比较。结果图谱间的相似度均为1.000，表明样品稳定性良好，见表4。
[0090] 表4脉络通颗粒稳定性实验结果(16102381)
[0091]
[0092] 相似度比较
[0093] 将采集到的14批脉络通颗粒的HPLC图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，与生成的对照指纹图谱进行相似度对比，结果见表5。
[0094] 表5 14批脉络通颗粒样品相似度评价结果
[0095]
[0096]
[0097] 上述数据表明，14批脉络通颗粒与对照指纹图谱的相似度均在0.9以上，说明产品的质量稳定性良好。
[0098] 相比
现有技术，本发明提供的脉络通颗粒指纹图谱检测方法稳定性和重复性好，可以客观、全面、准确的评价脉络通颗粒的质量，对控制脉络通颗粒的质量和保证临床疗效具有重要意义。
[0099] 以上所述仅是示例性本发明实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以根据现有技术做出改进和优化，这些改进和优化也属于本发明的保护范围。
