技术领域
[0001] 本
发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，是CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途。
背景技术
[0002] 中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CH0)细胞广泛应用于重组蛋白药物及
抗体药物的生产，其不仅能够提供稳定而准确的糖基化修饰，使表达产物最接近于天然
蛋白质分子，而且具有安全性高的特点，是目前少数FDA及各国药监部
门认可的合法合规的产业化工程细胞株。一般CHO细胞的培养是在商品化的培养基，如DMEM/F12
基础培养基中添加5～10％的胎
牛血清来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还提供了体外培养
细胞增殖所必需的生长因子。但血清的使用存在批次间差异大、
生物危害性
风险高、易被支原体和病毒等污染、成本高、不利于产物分离纯化等很多弊端，以及会影响细胞的生长及最终产物的
质量，不适于大规模工业化生产。
[0003] 为了解决上述问题，许多"化学成分明确"的培养基被开发。这些培养基经过特别的优化以支持某单一细胞类型的培养，不包含任何未定义或者成分未明确的补充剂和替代血清的纯化的生长因子、蛋白质、脂蛋白和其他物质。由于这种培养基的组分(或浓度)是精确已知的，通常被称为"限定培养基"。使用限定性培养基相比含血清或提取物的培养基，有利于研究培养基中特定的生长因子或其他成分在细胞生理学中的作用。此外，限定性培养基通常含有非常少量的蛋白质，不仅能能够简化产物纯化过程，还能降低纯
化成本，产业化应用前景十分广泛。
[0004] 中国
专利申请：201310106385.5公开了一种无血清无蛋白细胞培养基，不含有胰岛素和转
铁蛋白，但含有类固醇
激素。
[0005] 中国专利申请：200710307076.9公开了一种无蛋白细胞培养基，含有转铁蛋白和胰岛素替代物，但最高活细胞
密度不足350万/ml。
[0006] 中国专利申请：200910241670.1公开了一种无血清细胞培养基，该培养基是以DMEM/F12(1:1)为基础培养基，添加了胰岛素和转铁蛋白等物质，最高活细胞密度不足400万/ml。
[0007] 目前国内开发的大多数无血清培养基都能够支持细胞生长，但大多是在已有培养基如DMEM、DMEM/F12等基础上加入各种营养物质、胰岛素、转铁蛋白、蛋白
水解物等，成分复杂，产品的质量和安全性面临考验，同时也为下游纯化带来了困难。而国外Life、Thermo、Lonza等公司的无血清培养基虽然质量可靠稳定，不含蛋白质，但其价格相对较为昂贵，成分秘而不宣，不仅增加了细胞大规模培养的成本，减小了产能提升和成本降低的空间，而且不利于根据产品需要对培养基进行优化调整，大大减少了后续的优化空间。
[0008] 针对上述
缺陷，
发明人开发了一种适用于CHO细胞高密度悬浮培养的无血清无蛋白培养基，能适用于多种不同CHO细胞株生长和稳定传代，化学成分明确，成本低廉，支持CHO细胞更好的生长和更短的细胞倍增时间，为生物制品的规模化生产提供方便，关于本发明目前还未见有相关文献报道。
发明内容
[0009] 本发明的第一个目的是针对
现有技术的不足，提供一种CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基。
[0010] 本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基的制备方法。
[0011] 本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基的用途。
[0012] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基，由
氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、
碳水化合物和其他分子化合物组成；
[0014] 其中，氨基酸各成分为：甘氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-
色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸；
[0015] 维生素各成分为：生物素、D-泛酸
钙、叶酸、烟酰胺、维生素B6、
盐酸硫胺素、维生素B12、核黄素、氯化胆
碱、肌醇；
[0016] 无机盐各成分为：氯化镁、
硫酸镁、
氯化钙、氯化
钾、
碳酸氢钠、
氯化钠、
磷酸钠；
[0017] 微量元素各成分为：七水硫酸锌、五水硫酸
铜、九水
硝酸铁、七水硫酸亚铁、亚硒酸纳、氯化镍、氯化亚
锡、硝酸
银、氯化钴、氯化
铝、
醋酸钡、硫酸铬、氟化钠、偏
硅酸钠；
[0018] 碳水化合物和其他分子化合物各成分为：
葡萄糖、
乙醇胺、腐胺、硫辛酸、亚油酸、丙
酮酸钠、硫酸葡聚糖、PluronicF-68。
[0019] 作为本发明的一个优选实施方案，所述的氨基酸各成分终浓度分别为：甘氨酸65-200mg/L、L-精氨酸350-1200mg/L、L-天冬氨酸300-950mg/L、L-天冬酰胺745-1500mg/L、L-半胱氨酸105-450mg/L、L-甘氨酸20-110mg/L、L-谷氨酸50-250mg/L、L-组氨酸145-435mg/L、L-异亮氨酸425-850mg/L、L-亮氨酸260-780mg/L、L-赖氨酸370-1010mg/L、L-蛋氨酸65-
145mg/L、L-苯丙氨酸130-460mg/L、L-脯氨酸135-670mg/L、L-丝氨酸210-820mg/L、L-苏氨酸50-300mg/L、L-色氨酸160-420mg/L、L-酪氨酸180-540mg/L、L-缬氨酸160-720mg/L；
[0020] 所述的维生素各成分终浓度分别为：生物素0.09-3.62mg/L、D-泛酸钙2-12.5mg/L、叶酸9.45-34.5mg/L、烟酰胺3.25-23mg/L、维生素B61-10 mg/L、盐酸硫胺素3.25-13mg/L、维生素B120.8-15mg/L、核黄素0.1-3.5mg/L、氯化胆碱18-180mg/L、肌醇10-75mg/L；
[0021] 所述的无机盐各成分终浓度分别为：氯化镁10-200mg/L、
硫酸镁30-200mg/L、氯化钙56-232mg/L、
氯化钾212-936mg/L、碳酸氢钠1200-3600mg/L、氯化钠800-4000mg/L、磷酸钠70-600mg/L；
[0022] 所述的微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌0.5-5mg/L、五水硫酸铜0.0001-0.01mg/L、九水硝酸铁0.05-0.45mg/L、七水硫酸亚铁0.4-15.5mg/L、亚硒酸纳
0.01-0.8mg/L、氯化镍0.00005-0.0005mg/L、氯化亚锡0.00005-0.0005mg/L、硝酸银
0.00001-0.0002mg/L、氯化钴0.0005-0.008mg/L、氯化铝0.0001-0.001mg/L、醋酸钡
0.0005-0.003mg/L、硫酸铬0.001-0.006mg/L、氟化钠0.0005-0.006mg/L、偏
硅酸钠0.005-
0.09mg/L；
[0023] 所述的碳水化合物和其他分子化合物各成分终浓度分别为：葡萄糖3000-9000mg/L、乙醇胺5-30mg/L、腐胺0.1-15mg/L、硫辛酸0.2-3mg/L、亚油酸0.01-0.9mg/L、
丙酮酸钠105-600mg/L、硫酸葡聚糖10-100mg/L、PluronicF-68100-3000mg/L。
[0024] 作为本发明的一个优选实施方案，所述的氨基酸各成分终浓度分别为：甘氨酸115-150mg/L、L-精氨酸650-900mg/L、L-天冬氨酸500-750mg/L、L-天冬酰胺1045-1200mg/L、L-半胱氨酸205-350mg/L、L-甘氨酸50-80mg/L、L-谷氨酸100-200mg/L、L-组氨酸245-
335mg/L、L-异亮氨酸625-650mg/L、L-亮氨酸460-580mg/L、L-赖氨酸670-710mg/L、L-蛋氨酸95-115mg/L、L-苯丙氨酸230-360mg/L、L-脯氨酸335-470mg/L、L-丝氨酸410-620mg/L、L-苏氨酸150-200mg/L、L-色氨酸260-320mg/L、L-酪氨酸280-440mg/L、L-缬氨酸360-520mg/L；
[0025] 所述的维生素各成分终浓度分别为：生物素1.09-2.62mg/L、D-泛酸钙6-8.5mg/L、叶酸19.45-24.5mg/L、烟酰胺8.25-18mg/L、维生素B63-8 mg/L、盐酸硫胺素6.25-10mg/L、维生素B125.8-10mg/L、核黄素1.1-2.5mg/L、氯化胆碱68-130mg/L、肌醇40-45mg/L；
[0026] 所述的无机盐各成分终浓度分别为：氯化镁90-120mg/L、硫酸镁80-150mg/L、氯化钙136-152mg/L、氯化钾512-636mg/L、碳酸氢钠2200-2600mg/L、氯化钠1800-3000mg/L、磷酸钠270-400mg/L；
[0027] 所述的微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌2.5-3mg/L、五水硫酸铜0.0006-0.0095mg/L、九水硝酸铁0.15-0.35mg/L、七水硫酸亚铁5.4-10.5mg/L、亚硒酸纳
0.31-0.5mg/L、
[0028] 氯化镍0.00025-0.0003mg/L、氯化亚锡0.00025-0.0003mg/L、硝酸银0.00006-0.00015mg/L、氯化钴0.0015-0.007mg/L、氯化铝0.0003-0.0008mg/L、醋酸钡0.0015-
0.002mg/L、硫酸铬0.003-0.004mg/L、氟化钠0.0025-0.004mg/L、偏硅酸钠0.035-0.06mg/L；
[0029] 所述的碳水化合物和其他分子化合物各成分终浓度分别为：葡萄糖5000-7000mg/L、乙醇胺15-20mg/L、腐胺5.1-10mg/L、硫辛酸1.2-2mg/L、亚油酸0.41-0.5mg/L、丙酮酸钠305-400mg/L、硫酸葡聚糖40-70mg/L、PluronicF-681100-2000mg/L。
[0030] 作为本发明的一个优选实施方案，所述的氨基酸各成分终浓度分别为：甘氨酸132.5mg/L、L-精氨酸775mg/L、L-天冬氨酸625mg/L、L-天冬酰胺1122.5mg/L、L-半胱氨酸
277.5mg/L、L-甘氨酸65mg/L、L-谷氨酸150mg/L、L-组氨酸290mg/L、L-异亮氨酸637.5mg/L、L-亮氨酸520mg/L、L-赖氨酸690mg/L、L-蛋氨酸105mg/L、L-苯丙氨酸295mg/L、L-脯氨酸
402.5mg/L、L-丝氨酸515mg/L、L-苏氨酸175mg/L、L-色氨酸290mg/L、L-酪氨酸360mg/L、L-缬氨酸440mg/L；
[0031] 所述的维生素各成分终浓度分别为：生物素1.855mg/L、泛酸钙7.25mg/L、叶酸21.975mg/L、烟酰胺13.125mg/L、维生素B65.5 mg/L、盐酸硫胺素8.125mg/L、维生素B127.9 mg/L、核黄素1.8mg/L、氯化胆碱99mg/L、肌醇42.5mg/L；
[0032] 所述的无机盐各成分终浓度分别为：氯化镁105mg/L、硫酸镁115mg/L、氯化钙144mg/L、氯化钾574mg/L、碳酸氢钠2400mg/L、氯化钠2400mg/L、磷酸钠335mg/L；
[0033] 所述的微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌2.75mg/L、五水硫酸铜0.00505mg/L、九水硝酸铁0.25mg/L、七水硫酸亚铁7.95mg/L、亚硒酸纳0.405mg/L、氯化镍
0.000275mg/L、氯化亚锡0.000275mg/L、硝酸银0.000105mg/L、氯化钴0.00425mg/L、氯化铝
0.00055mg/L、醋酸钡0.00175mg/L、硫酸铬0.0035mg/L、氟化钠0.00325mg/L、偏硅酸钠
0.0475mg/L；
[0034] 所述的碳水化合物和其他分子化合物各成分终浓度分别为：葡萄糖6000mg/L、乙醇胺17.5mg/L、腐胺7.55mg/L、硫辛酸1.6mg/L、亚油酸0.455mg/L、丙酮酸钠352.5mg/L、硫酸葡聚糖55mg/L、PluronicF-681550mg/L。
[0035] 优选地，CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基的制备方法为：将氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物加入到WFI中，室温搅拌30min后，加入氢
氧化钠助溶，然后加入碳酸氢钠，用盐酸调节pH到6.9～7.3，用0.22μm无菌
膜过滤，4℃长期保存备用，即可。
[0036] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0037] 如上任一所述的CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基的制备方法，包括如下步骤：将氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物加入到WFI中，室温搅拌30min后，加入氢氧化钠助溶，然后加入碳酸氢钠，用盐酸调节pH到6.9～7.3，用0.22μm无菌膜过滤，4℃长期保存备用，即可。
[0038] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0039] 如上任一所述的CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基在培养CHO细胞中的用途。
[0040] 优选地，CHO细胞为CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S、CHO-DXB11。
[0041] 如上任一所述的CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基在生产生物类药物中的应用，所述生物类药物包括抗体、融合蛋白、重组蛋白、酶或
疫苗。
[0042] 需要说明的是，本发明中所述的WFI是Water for injection，注射用水的意思。
[0043] 本发明优点在于：
[0044] 1、实验结果表明本发明的无血清无蛋白培养基不仅能够满足CHO细胞高密度的悬浮培养，而且可以维持更长时间更高活率的细胞状态，从而能够提高生产效率，降低生产成本，具有广泛的应用前景和价值。
[0045] 2、本发明的培养基不含血清和蛋白质，并去除了以往培养基中所使用的动物成分及
植物蛋白水解物，所有组分化学成分确定，有利于产物的纯化、生产批次的
稳定性，从而保证和提高了产品质量。且本发明的培养基支持高密度大规模细胞培养，可提高目的物的产量，本发明的培养基为国内研发产品，从整体上降低了生产成本，适用于大规模生产。
[0046] 综上，本发明的培养基弥补了现有化学成分确定培养基的不足，填补了国内无化学成分确定的培养基的空白。
附图说明
[0047] 附图1是驯化细胞稳定传代10代次后，在
显微镜下观察的图，结果显示细胞边缘清晰，形态饱满，无结团现象，适应良好。
[0048] 附图2是通过将驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基1的125ml三
角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm来培养细胞，每隔24小时取样计数的结果，结果显示细胞培养至第7天达到密度峰值，密度13×106细胞/ml，活率大于90％。
[0049] 附图3是将驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基2的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm来培养细胞，每隔24小时取样计数的结果，结果显示细胞培养至第9天达到密度峰值，密度15.5×106细胞/ml，活率大于90％。
[0050] 附图4是将驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基3的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm来培养细胞，每隔24小时取样计数的结果，结果显示细胞培养至第9天达到密度峰值，密度15.4×106细胞/ml，活率大于90％。
[0051] 附图5是用市售的培养基Dynamis培养细胞，每隔24小时取样计数的结果，结果显6
示第7天达到密度峰值，密度12.4×10细胞/ml，活率大于90％，但是在第9天细胞基本完全死亡。
具体实施方式
[0052] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些
实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或
修改，这些等价形式同样落于本申请所附
权利要求书所限定的范围。
[0053] 以下实施例中所述的CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(包括氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物各成分)均采购自Sigma；商业化培养基Dynamis采购自Gibco；细胞株CHO-K1的原始购买来源为ATCC。
[0054] 实施例1 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(一)
[0055] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0056] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸65mg/L、L-精氨酸350mg/L、L-天冬氨酸300mg/L、L-天冬酰胺745mg/L、L-半胱氨酸105mg/L、L-甘氨酸20mg/L、L-谷氨酸50mg/L、L-组氨酸145mg/L、L-异亮氨酸425mg/L、L-亮氨酸260mg/L、L-赖氨酸370mg/L、L-蛋氨酸65mg/L、L-苯丙氨酸130mg/L、L-脯氨酸135mg/L、L-丝氨酸210mg/L、L-苏氨酸50mg/L、L-色氨酸160mg/L、L-酪氨酸180mg/L、L-缬氨酸160mg/L；
[0057] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.09mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸9.45mg/L、烟酰胺3.25mg/L、维生素B61 mg/L、盐酸硫胺素3.25mg/L、维生素B120.8 mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱18mg/L、肌醇10mg/L；
[0058] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁10mg/L、硫酸镁30mg/L、氯化钙56mg/L、氯化钾212mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠800mg/L、磷酸钠70mg/L；
[0059] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌0.5mg/L、五水硫酸铜0.0001mg/L、九水硝酸铁0.05mg/L、七水硫酸亚铁0.4mg/L、亚硒酸纳0.01mg/L、氯化镍0.00005mg/L、氯化亚锡0.00005mg/L、硝酸银0.00001mg/L、氯化钴0.0005mg/L、氯化铝0.0001mg/L、醋酸钡0.0005mg/L、硫酸铬0.001mg/L、氟化钠0.0005mg/L、偏硅酸钠0.005mg/L；
[0060] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖3000mg/L、乙醇胺5mg/L、腐胺0.1mg/L、硫辛酸0.2mg/L、亚油酸0.01mg/L、丙酮酸钠105mg/L、硫酸葡聚糖
10mg/L、PluronicF-68100mg/L。
[0061] 实施例2 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(二)
[0062] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0063] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸200mg/L、L-精氨酸1200mg/L、L-天冬氨酸950mg/L、L-天冬酰胺1500mg/L、L-半胱氨酸450mg/L、L-甘氨酸110mg/L、L-谷氨酸250mg/L、L-组氨酸435mg/L、L-异亮氨酸850mg/L、L-亮氨酸780mg/L、L-赖氨酸1010mg/L、L-蛋氨酸145mg/L、L-苯丙氨酸460mg/L、L-脯氨酸670mg/L、L-丝氨酸820mg/L、L-苏氨酸
300mg/L、L-色氨酸420mg/L、L-酪氨酸540mg/L、L-缬氨酸720mg/L；
[0064] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素3.62mg/L、D-泛酸钙12.5mg/L、叶酸34.5mg/L、烟酰胺23mg/L、维生素B610 mg/L、盐酸硫胺素13mg/L、维生素B1215 mg/L、核黄素3.5mg/L、氯化胆碱180mg/L、肌醇75mg/L；
[0065] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁200mg/L、硫酸镁200mg/L、氯化钙232mg/L、氯化钾936mg/L、碳酸氢钠3600mg/L、氯化钠4000mg/L、磷酸钠600mg/L；
[0066] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌5mg/L、五水硫酸铜0.01mg/L、九水硝酸铁0.45mg/L、七水硫酸亚铁15.5mg/L、亚硒酸纳0.8mg/L、氯化镍0.0005mg/L、氯化亚锡0.0005mg/L、硝酸银0.0002mg/L、氯化钴0.008mg/L、氯化铝0.001mg/L、醋酸钡0.003mg/L、硫酸铬0.006mg/L、氟化钠0.006mg/L、偏硅酸钠0.09mg/L；
[0067] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖9000mg/L、乙醇胺30mg/L、腐胺15mg/L、硫辛酸3mg/L、亚油酸0.9mg/L、丙酮酸钠600mg/L、硫酸葡聚糖100mg/L、PluronicF-683000mg/L。
[0068] 实施例3 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(三)
[0069] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0070] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸65mg/L、L-精氨酸1200mg/L、L-天冬氨酸300mg/L、L-天冬酰胺1500mg/L、L-半胱氨酸105mg/L、L-甘氨酸110mg/L、L-谷氨酸50mg/L、L-组氨酸435mg/L、L-异亮氨酸425mg/L、L-亮氨酸780mg/L、L-赖氨酸370mg/L、L-蛋氨酸145mg/L、L-苯丙氨酸130mg/L、L-脯氨酸670mg/L、L-丝氨酸210mg/L、L-苏氨酸300mg/L、L-色氨酸160mg/L、L-酪氨酸540mg/L、L-缬氨酸160mg/L；
[0071] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素3.62mg/L、D-泛酸钙2mg/L、叶酸34.5mg/L、烟酰胺3.25mg/L、维生素B610 mg/L、盐酸硫胺素3.25mg/L、维生素B1215 mg/L、核黄素0.1mg/L、氯化胆碱180mg/L、肌醇10mg/L；
[0072] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁200mg/L、硫酸镁30mg/L、氯化钙232mg/L、氯化钾212mg/L、碳酸氢钠3600mg/L、氯化钠800mg/L、磷酸钠600mg/L；
[0073] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌0.5mg/L、五水硫酸铜0.01mg/L、九水硝酸铁0.05mg/L、七水硫酸亚铁15.5mg/L、亚硒酸纳0.01mg/L、氯化镍0.0005mg/L、氯化亚锡0.00005mg/L、硝酸银0.0002mg/L、氯化钴0.0005mg/L、氯化铝0.001mg/L、醋酸钡0.0005mg/L、硫酸铬0.006mg/L、氟化钠0.0005mg/L、偏硅酸钠0.09mg/L；
[0074] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖3000mg/L、乙醇胺30mg/L、腐胺0.1mg/L、硫辛酸3mg/L、亚油酸0.01mg/L、丙酮酸钠600mg/L、硫酸葡聚糖10mg/L、PluronicF-683000mg/L。
[0075] 实施例4 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(四)
[0076] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0077] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸200mg/L、L-精氨酸350mg/L、L-天冬氨酸950mg/L、L-天冬酰胺745mg/L、L-半胱氨酸450mg/L、L-甘氨酸20mg/L、L-谷氨酸250mg/L、L-组氨酸145mg/L、L-异亮氨酸850mg/L、L-亮氨酸260mg/L、L-赖氨酸1010mg/L、L-蛋氨酸65mg/L、L-苯丙氨酸460mg/L、L-脯氨酸135mg/L、L-丝氨酸820mg/L、L-苏氨酸50mg/L、L-色氨酸420mg/L、L-酪氨酸180mg/L、L-缬氨酸720mg/L；
[0078] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素0.09mg/L、D-泛酸钙12.5mg/L、叶酸9.45mg/L、烟酰胺23mg/L、维生素B61 mg/L、盐酸硫胺素13mg/L、维生素B120.8 mg/L、核黄素3.5mg/L、氯化胆碱18mg/L、肌醇75mg/L；
[0079] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁10mg/L、硫酸镁200mg/L、氯化钙56mg/L、氯化钾936mg/L、碳酸氢钠1200mg/L、氯化钠4000mg/L、磷酸钠70mg/L；
[0080] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌5mg/L、五水硫酸铜0.0001mg/L、九水硝酸铁0.45mg/L、七水硫酸亚铁0.4mg/L、亚硒酸纳0.8mg/L、氯化镍0.00005mg/L、氯化亚锡0.0005mg/L、硝酸银0.00001mg/L、氯化钴0.008mg/L、氯化铝0.0001mg/L、醋酸钡0.003mg/L、硫酸铬0.001mg/L、氟化钠0.006mg/L、偏硅酸钠0.005mg/L；
[0081] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖9000mg/L、乙醇胺5mg/L、腐胺15mg/L、硫辛酸0.2mg/L、亚油酸0.9mg/L、丙酮酸钠105mg/L、硫酸葡聚糖100mg/L、PluronicF-68100mg/L。
[0082] 实施例5 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(五)
[0083] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0084] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸115mg/L、L-精氨酸650mg/L、L-天冬氨酸500mg/L、L-天冬酰胺1045mg/L、L-半胱氨酸205mg/L、L-甘氨酸50mg/L、L-谷氨酸100mg/L、L-组氨酸245mg/L、L-异亮氨酸625mg/L、L-亮氨酸460mg/L、L-赖氨酸670mg/L、L-蛋氨酸95mg/L、L-苯丙氨酸230mg/L、L-脯氨酸335mg/L、L-丝氨酸410mg/L、L-苏氨酸150mg/L、L-色氨酸260mg/L、L-酪氨酸280mg/L、L-缬氨酸360mg/L；
[0085] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素1.09mg/L、D-泛酸钙6mg/L、叶酸19.45mg/L、烟酰胺8.25mg/L、维生素B63 mg/L、盐酸硫胺素6.25mg/L、维生素B125.8 mg/L、核黄素1.1mg/L、氯化胆碱68mg/L、肌醇40mg/L；
[0086] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、硫酸镁80mg/L、氯化钙136mg/L、氯化钾512mg/L、碳酸氢钠2200mg/L、氯化钠1800mg/L、磷酸钠270mg/L；
[0087] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌2.5mg/L、五水硫酸铜0.0006mg/L、九水硝酸铁0.15mg/L、七水硫酸亚铁5.4mg/L、亚硒酸纳0.31mg/L、氯化镍0.00025mg/L、氯化亚锡0.00025mg/L、硝酸银0.00006mg/L、氯化钴0.0015mg/L、氯化铝0.0003mg/L、醋酸钡0.0015mg/L、硫酸铬0.003mg/L、氟化钠0.0025mg/L、偏硅酸钠0.035mg/L；
[0088] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖5000mg/L、乙醇胺15mg/L、腐胺5.1mg/L、硫辛酸1.2mg/L、亚油酸0.41mg/L、丙酮酸钠305mg/L、硫酸葡聚糖
40mg/L、PluronicF-681100mg/L。
[0089] 实施例6 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(六)
[0090] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0091] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸150mg/L、L-精氨酸900mg/L、L-天冬氨酸750mg/L、L-天冬酰胺1200mg/L、L-半胱氨酸350mg/L、L-甘氨酸80mg/L、L-谷氨酸200mg/L、L-组氨酸335mg/L、L-异亮氨酸650mg/L、L-亮氨酸580mg/L、L-赖氨酸710mg/L、L-蛋氨酸115mg/L、L-苯丙氨酸360mg/L、L-脯氨酸470mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸
200mg/L、L-色氨酸320mg/L、L-酪氨酸440mg/L、L-缬氨酸520mg/L；
[0092] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素2.62mg/L、D-泛酸钙8.5mg/L、叶酸24.5mg/L、烟酰胺18mg/L、维生素B68 mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、维生素B1210 mg/L、核黄素2.5mg/L、氯化胆碱130mg/L、肌醇45mg/L；
[0093] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁120mg/L、硫酸镁150mg/L、氯化钙152mg/L、氯化钾636mg/L、碳酸氢钠2600mg/L、氯化钠3000mg/L、磷酸钠400mg/L；
[0094] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌3mg/L、五水硫酸铜0.0095mg/L、九水硝酸铁0.35mg/L、七水硫酸亚铁10.5mg/L、亚硒酸纳0.5mg/L、氯化镍0.0003mg/L、氯化亚锡0.0003mg/L、硝酸银0.00015mg/L、氯化钴0.007mg/L、氯化铝0.0008mg/L、醋酸钡0.002mg/L、硫酸铬0.004mg/L、氟化钠0.004mg/L、偏硅酸钠0.06mg/L；
[0095] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖7000mg/L、乙醇胺20mg/L、腐胺10mg/L、硫辛酸2mg/L、亚油酸0.5mg/L、丙酮酸钠400mg/L、硫酸葡聚糖70mg/L、PluronicF-682000mg/L。
[0096] 实施例7 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(七)
[0097] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0098] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸115mg/L、L-精氨酸900mg/L、L-天冬氨酸500mg/L、L-天冬酰胺1200mg/L、L-半胱氨酸205mg/L、L-甘氨酸80mg/L、L-谷氨酸100mg/L、L-组氨酸335mg/L、L-异亮氨酸625mg/L、L-亮氨酸580mg/L、L-赖氨酸670mg/L、L-蛋氨酸115mg/L、L-苯丙氨酸230mg/L、L-脯氨酸470mg/L、L-丝氨酸410mg/L、L-苏氨酸
200mg/L、L-色氨酸260mg/L、L-酪氨酸440mg/L、L-缬氨酸360mg/L；
[0099] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素2.62mg/L、D-泛酸钙6mg/L、叶酸24.5mg/L、烟酰胺8.25mg/L、维生素B68 mg/L、盐酸硫胺素6.25mg/L、维生素B1210 mg/L、核黄素1.1mg/L、氯化胆碱130mg/L、肌醇40mg/L；
[0100] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁120mg/L、硫酸镁80mg/L、氯化钙152mg/L、氯化钾512mg/L、碳酸氢钠2600mg/L、氯化钠1800mg/L、磷酸钠400mg/L；
[0101] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌2.5mg/L、五水硫酸铜0.0095mg/L、九水硝酸铁0.15mg/L、七水硫酸亚铁10.5mg/L、亚硒酸纳0.31mg/L、氯化镍0.0003mg/L、氯化亚锡0.00025mg/L、硝酸银0.00015mg/L、氯化钴0.0015mg/L、氯化铝0.0008mg/L、醋酸钡0.0015mg/L、硫酸铬0.004mg/L、氟化钠0.0025mg/L、偏硅酸钠0.06mg/L；
[0102] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖5000mg/L、乙醇胺20mg/L、腐胺5.1mg/L、硫辛酸2mg/L、亚油酸0.41mg/L、丙酮酸钠400mg/L、硫酸葡聚糖40mg/L、PluronicF-682000mg/L。
[0103] 实施例8 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(八)
[0104] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0105] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸150mg/L、L-精氨酸650mg/L、L-天冬氨酸750mg/L、L-天冬酰胺1045mg/L、L-半胱氨酸350mg/L、L-甘氨酸50mg/L、L-谷氨酸200mg/L、L-组氨酸245mg/L、L-异亮氨酸650mg/L、L-亮氨酸460mg/L、L-赖氨酸710mg/L、L-蛋氨酸95mg/L、L-苯丙氨酸360mg/L、L-脯氨酸335mg/L、L-丝氨酸620mg/L、L-苏氨酸150mg/L、L-色氨酸320mg/L、L-酪氨酸280mg/L、L-缬氨酸520mg/L；
[0106] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素1.09mg/L、D-泛酸钙8.5mg/L、叶酸19.45mg/L、烟酰胺18mg/L、维生素B63 mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、维生素B125.8 mg/L、核黄素2.5mg/L、氯化胆碱68mg/L、肌醇45mg/L；
[0107] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁90mg/L、硫酸镁150mg/L、氯化钙136mg/L、氯化钾636mg/L、碳酸氢钠2200mg/L、氯化钠3000mg/L、磷酸钠270mg/L；
[0108] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌3mg/L、五水硫酸铜0.0006mg/L、九水硝酸铁0.35mg/L、七水硫酸亚铁5.4mg/L、亚硒酸纳0.5mg/L、氯化镍0.00025mg/L、氯化亚锡0.0003mg/L、硝酸银0.00006mg/L、氯化钴0.007mg/L、氯化铝0.0003mg/L、醋酸钡0.002mg/L、硫酸铬0.003mg/L、氟化钠0.004mg/L、偏硅酸钠0.035mg/L；
[0109] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖7000mg/L、乙醇胺15mg/L、腐胺10mg/L、硫辛酸1.2mg/L、亚油酸0.5mg/L、丙酮酸钠305mg/L、硫酸葡聚糖70mg/L、PluronicF-681100mg/L。
[0110] 实施例9 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基组成(九)
[0111] 由氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组成，[0112] 其中，氨基酸是以下终浓度的各成分：甘氨酸132.5mg/L、L-精氨酸775mg/L、L-天冬氨酸625mg/L、L-天冬酰胺1122.5mg/L、L-半胱氨酸277.5mg/L、L-甘氨酸65mg/L、L-谷氨酸150mg/L、L-组氨酸290mg/L、L-异亮氨酸637.5mg/L、L-亮氨酸520mg/L、L-赖氨酸690mg/L、L-蛋氨酸105mg/L、L-苯丙氨酸295mg/L、L-脯氨酸402.5mg/L、L-丝氨酸515mg/L、L-苏氨酸175mg/L、L-色氨酸290mg/L、L-酪氨酸360mg/L、L-缬氨酸440mg/L；
[0113] 维生素是以下终浓度的各成分：生物素1.855mg/L、泛酸钙7.25mg/L、叶酸21.975mg/L、烟酰胺13.125mg/L、维生素B65.5 mg/L、盐酸硫胺素8.125mg/L、维生素B127.9 mg/L、核黄素1.8mg/L、氯化胆碱99mg/L、肌醇42.5mg/L；
[0114] 无机盐是以下终浓度的各成分：氯化镁105mg/L、硫酸镁115mg/L、氯化钙144mg/L、氯化钾574mg/L、碳酸氢钠2400mg/L、氯化钠2400mg/L、磷酸钠335mg/L；
[0115] 微量元素是以下终浓度的各成分：七水硫酸锌2.75mg/L、五水硫酸铜0.00505mg/L、九水硝酸铁0.25mg/L、七水硫酸亚铁7.95mg/L、亚硒酸纳0.405mg/L、氯化镍0.000275mg/L、氯化亚锡0.000275mg/L、硝酸银0.000105mg/L、氯化钴0.00425mg/L、氯化铝0.00055mg/L、醋酸钡0.00175mg/L、硫酸铬0.0035mg/L、氟化钠0.00325mg/L、偏硅酸钠0.0475mg/L；
[0116] 碳水化合物和其他分子化合物是以下终浓度的各成分：葡萄糖6000mg/L、乙醇胺17.5mg/L、腐胺7.55mg/L、硫辛酸1.6mg/L、亚油酸0.455mg/L、丙酮酸钠352.5mg/L、硫酸葡聚糖55mg/L、PluronicF-681550mg/L。
[0117] 实施例10 CHO细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基
[0118] 制备方法如下：将1L用量实施例1-8任一所述终浓度的氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、碳水化合物和其他分子化合物组分加入800ml的WFI中，室温搅拌30min后，加入一定量的氢氧化钠助溶，然后加入碳酸氢钠，用盐酸调节pH到6.9～7.3，用0.22μm无菌膜过滤，4℃长期保存备用，即可。
[0119] 实施例11效果验证
[0120] 1、细胞培养基的制备
[0121] 培养基1：取1L用量实施例1所述的终浓度的各成分加入800ml的WFI中，室温搅拌30min后，加入一定量的氢氧化钠助溶，然后加入碳酸氢钠，用盐酸调节pH到6.9～7.3，用
0.22μm无菌膜过滤，4℃长期保存备用。
[0122] 培养基2：取1L用量实施例9所述的终浓度的各成分加入800ml的WFI中，室温搅拌30min后，加入一定量的氢氧化钠助溶，然后加入碳酸氢钠，用盐酸调节pH到6.9～7.3，用
0.22μm无菌膜过滤，4℃长期保存备用。
[0123] 培养基3：取1L用量实施例2所述的终浓度的各成分加入800ml的WFI中，室温搅拌30min后，加入一定量的氢氧化钠助溶，然后加入碳酸氢钠，用盐酸调节pH到6.9～7.3，用
0.22μm无菌膜过滤，4℃长期保存备用。
[0124] 商品化培养基MEM(购自上海信帆生物科技有限公司)添加10％(V/V)新生牛血清作为对照组。
[0125] 2、细胞培养和检测
[0126] 2.1培养基1内细胞的培养方法
[0127] 2.1.1驯化细胞：
[0128] 将可表达量Anti-Her2的CHO-K1细胞株以0.8×106细胞/ml的密度接种至含20ml培养基1的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm；当细胞密度约3×106细胞/ml时，以0.8×106细胞/ml的密度接种传代，直至细胞传代10次以上。
[0129] 2.1.2将步骤2.1.1驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基1的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm。
[0130] 2.2培养基2内细胞的培养方法
[0131] 2.2.1驯化细胞
[0132] 大致同步骤2.1.1驯化细胞方法，区别仅在于使用培养基2驯化细胞。
[0133] 2.2.2将步骤2.2.1驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基2的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm。
[0134] 2.3培养基3内细胞的培养方法
[0135] 2.3.1驯化细胞
[0136] 大致同步骤2.1.1驯化细胞方法，区别仅在于使用培养基3驯化细胞。
[0137] 2.3.2将步骤2.3.1驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml培养基3的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm。
[0138] 2.4对照组培养基内细胞的培养方法
[0139] 2.4.1大致同步骤2.1.1驯化细胞方法，区别仅在于使用市售的商品化培养基Dynamis来驯化细胞。
[0140] 2.4.2将步骤2.4.1驯化好的CHO细胞以0.8×106细胞/ml的密度接种至含30ml商品化培养基Dynamis的125ml三角摇瓶中，将三角摇瓶置于含5％CO2的摇床中37℃培养，转速120rpm。
[0141] 3、结果和分析
[0142] 3.1根据方法2.1驯化细胞，稳定传代10代次后，在显微镜下观察，细胞边缘清晰，形态饱满，无结团现象，适应良好(如图1所示)；
[0143] 3.2根据方法2.2用培养基1培养细胞，每隔24小时取样计数，细胞培养至第7天达到密度峰值，密度13×106细胞/ml，活率大于90％(如图2所示)；
[0144] 3.3根据方法2.3用培养基2培养细胞，每隔24小时取样计数，细胞培养至第9天达到密度峰值，密度15.5×106细胞/ml，活率大于90％(如图3所示)；
[0145] 3.4根据方法2.4用培养基3培养细胞，每隔24小时取样计数，细胞培养至第9天达到密度峰值，密度15.4×106细胞/ml，活率大于90％(如图4所示)；
[0146] 3.5用市售的商品化培养基Dynamis培养细胞，，每隔24小时取样计数，结果对照组第7天达到密度峰值，密度12.4×106细胞/ml，活率大于90％，但是在第9天细胞基本完全死亡，而按照本配方配置的培养基1、培养基2和培养基3的CHO细胞活率依然高于90％(如图5所示)
[0147] 4、结论
[0148] 上述实验结果表明本配方不仅能够满足CHO细胞高密度的悬浮培养，而且可以维持更长时间更高活率的细胞状态，从而能够提高生产效率，降低生产成本，具有广泛的应用前景和价值。
[0149] 本发明的培养基不含血清和蛋白质，并去除了以往培养基中所使用的动物成分及植物蛋白水解物，所有组分化学成分确定，有利于产物的纯化、生产批次的稳定性，从而保证和提高了产品质量。且本发明的培养基支持高密度大规模细胞培养，可提高目的物的产量，本发明的培养基为国内研发产品，从整体上降低了生产成本，适用于大规模生产。本发明的培养基弥补了现有化学成分确定培养基的不足，填补了国内无化学成分确定的培养基的空白。
[0150] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
