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具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的 酵母

阅读：276发布：2020-05-11

专利汇可以提供具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且基于产量和滴度，具有增加的琥珀酸产生的改进的酵母细胞。磷酸戊糖途径中涉及的一种或多种酶的增加的活性、通过磷酸葡萄糖异构酶减少通量、增加至细胞质乙酰辅酶A的通量、苹果酸酶的设置和/或甲酸脱氢酶的设置导致增加的琥珀酸的产生。，下面是具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，包括通过磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰和增加至少一种琥珀酸生物合成途径中的至少一种酶的活性的至少一种基因修饰。
2.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述通过所述磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)的活性。
3.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述通过所述磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰降低葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸葡萄糖异构酶(PGI)的活性。
4.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述通过所述磷酸戊糖途径增加通量的至少一种基因修饰降低磷酸葡萄糖异构酶(PGI)的活性，并且增加选自由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)组成的组中的一种或多种酶的活性。
5.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述至少一种琥珀酸生物合成途径中的至少一种酶选自由苹果酸酶(MAE)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)、丙酮酸羧化酶(PYC)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、延胡索酸酶(FUM)和延胡索酸还原酶(FRD)组成的组中。
6.根据权利要求1所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括降低丙酮酸羧化酶的活性的至少一种基因修饰。
7.一种具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，包括增加苹果酸酶的活性的至少一种基因修饰和增加选自由NADH、NADPH和FADH组成的组中的至少一种还原辅因子可用性的至少一种基因修饰。
8.根据权利要求7所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述苹果酸酶是NADH依赖性苹果酸酶。
9.根据权利要求7所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述苹果酸酶是NADPH依赖性苹果酸酶。
10.根据权利要求7所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，增加至少一种还原辅因子的所述可用性的所述至少一种基因修饰是外源丙酮酸甲酸裂解酶的添加。
11.根据权利要求10所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括外源甲酸脱氢酶。
12.根据权利要求10所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括：
活化所述丙酮酸甲酸裂解酶的蛋白质，以及
 铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，或
黄素氧还蛋白和黄素氧还蛋白还原酶。
13.根据权利要求7所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括降低丙酮酸羧化酶的活性的至少一种基因修饰。
14.一种具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，包括外源苹果酸酶和增加选自由NADH、NADPH和FADH组成的组中的至少一种还原辅因子可用性的至少一种基因修饰。
15.根据权利要求14所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述外源苹果酸酶是NADH依赖性苹果酸酶。
16.根据权利要求14所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，所述外源苹果酸酶是NADPH依赖性苹果酸酶。
17.根据权利要求14所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，其中，增加至少一种还原辅因子的所述可用性的所述至少一种基因修饰是外源丙酮酸甲酸裂解酶的添加。
18.根据权利要求17所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括外源甲酸脱氢酶。
19.根据权利要求17所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括：
活化所述丙酮酸甲酸裂解酶的蛋白质，以及
铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，或
黄素氧还蛋白和黄素氧还蛋白还原酶。
20.根据权利要求14所述的具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的酵母细胞，进一步包括降低丙酮酸羧化酶的活性的至少一种基因修饰。

说明书全文

具有增加的琥珀酸产生的基因修饰的 酵母

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2017年6月30日提交的美国临时专利申请第62/527,351号的优先权。

[0003] 关于联邦资助的研究或开发的声明

[0004] 不适用

[0005] 联合研究协议

[0006] 不适用

背景技术

[0007] 本发明涉及基于生物的化学品产生。更具体地，本发明涉及使用基因修饰的酵母由可再生碳源产生琥珀酸。

[0008] 琥珀酸是三羧酸(TCA)循环中的中间产物，并且已知许多细菌都具有产生作为主发酵产物的琥珀酸的自然能力。对于琥珀酸或琥珀酸的盐(二者也被称为“琥珀酸盐”)的商业需求扩大。2004年美国能源部的一份名为“生物质带来的最高附加值化学品(Top Value Added Chemicals from Biomass)”报告确认了琥珀酸作为可由可再生原材料产生的十二种构成要素化学品之一。琥珀酸在多种特殊化学品(例如1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯和N-甲基吡咯烷酮)的制造中作为起始材料使用。琥珀酸作为大宗化学品具有用于制造各种产品的潜力，包括动物饲料、增塑剂、冷却剂、聚合物、纤维和塑料，尤其是聚琥珀酸丁二酯(也被称为“聚琥珀酸丁二醇酯”或“PBS”)。许多由琥珀酸盐制成的聚合物以比来源于石油的其他聚合物(例如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))以更快的速率生物降解。因而，由琥珀酸盐制成的塑料非常符合需要，因为其在填埋场或其他堆肥环境中会更快地腐烂。(Kunioka，Ninomiya，&Funabashi，2009)。在单体亚单元是生物来源的化合物或其化学等效物，而不是通常在生物体中不多见的石油化学来源的化合物时，这种性质也可推及许多其他聚合物和塑料。例如，在堆肥环境中，衍生自富马酸(富马酸盐)、苹果酸(苹果酸盐)、己二酸(己二酸盐)、L-乳酸(L-乳酸盐)、D-乳酸(D-乳酸盐)和/或其他自然存在的有机酸的聚合物都比许多石油化学来源的聚合物更容易降解。因而，为了人类的利益，用由生物化学品制成的聚合物和塑料来代替目前的由石油化学品制成的聚合物和塑料是合乎需要的。

[0009] 许多生物化学品，例如琥珀酸盐、富马酸盐和己二酸盐，都可由石油制造，并且目前使用的许多产生PBS和尼龙的工艺都使用石油来源的单体。然而，由于世界的石油供应是有限的，因此也需要开发通过可再生碳源，例如糖类、糖聚合物、甘油、脂肪酸、二氧化碳、木质素或任何其他形式的生物质或来源于生物质的废料发酵来生产生物化学品单体的原料和方法。因此，开发由可生物再生的资源制造可生物降解的塑料的方法是合乎需要的。

[0010] 产生许多上述的生物化学品的生物方法使用不能在低pH条件下生长的生物体。因此，当产生有机酸时，必须通过添加碱，通常是钠、钾、铵、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或它们的混合物来使培养基的pH保持在约5至约7.5。因此，有机酸在培养液中作为盐存在，并且大多数有机酸分子是带电的。带电状态有优点也有缺点。优点是，带电的盐不容易穿过细胞膜扩散进入细胞内。缺点是，使用有机酸的聚合化学物质或其他化学品通常要求有机酸的质子化形式(也被称为“游离酸”)，从而通过发酵产生的盐需要可能非常昂贵的下游处理来提供游离酸形式。因而，在低pH条件下(pH接近，或更优选地，低于有机酸的最低pKa)产生有机酸，从而使大部分分子为游离酸状态是有利的。此外其他的考虑是，低pH发酵液应该更为低廉以处理提供游离酸的纯制剂，因为在发酵期间必须提供并且然后在发酵后分离少得多的反离子(例如钠、钾、铵、镁、钙)以提供质子化的琥珀酸。

[0011] 现有一些使用各种酵母作为产生宿主在低pH条件下产生有机酸的方法。WO 2012/103261公开了已被工程化为产生琥珀酸盐或苹果酸盐的东方伊萨酵母
(Issatchenkiaorientalis)菌株。这些菌株来源于从一组许多不同的酵母种中选出的作为在低pH条件下对高浓度琥珀酸盐耐受力最强的野生型亲代。尤其，当与马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)相比时，所选择的东方伊萨酵母(I.orientalis)菌株对琥珀酸盐的耐受力更强。然而，如之前公开的(WO2014/043591)，已经分离了马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的新的野生型菌株，在丰富培养基中生长时，其在低pH条件下比东方伊萨酵母(I.orientalis)菌株对于琥珀酸盐具有更好的耐受力。因此，在一个物种内不同的菌株之间在低pH条件下对有机酸的耐受力方面显然存在一些差异，并且筛选进行的精确条件可能会影响这些筛选的结果。另外，已经针对琥珀酸盐产生开发了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，但是再一次，公开(WO2014/043591)的马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)菌株在低pH条件下对琥珀酸盐的耐受性更强。而且，马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)可自然地发酵木糖，因此其作为产生琥珀酸盐的宿主酵母，相比于酿酒酵母(S.cerevisiae)具有第二个优点。

[0012] 尽管由于在酵母中以膜结合的细胞器的形式进行亚细胞区室化而在以酵母发酵的低pH条件中具有产生二元羧酸(例如，琥珀酸)的理论优势，但在酵母中产生工程化的琥珀酸盐几乎不像在大肠杆菌(E.coli)或其他细菌中那样直接。首先，在酵母属(Saccharomyces)中，并且如果不是全部的话，可能在大多数其他酵母中，在好氧条件下，TCA循环在线粒体或前线粒体内部运行(WO 2008/128522，WO 2010/043197)。在缺少特异性琥珀酸盐转运体的情况下，线粒体内膜对于琥珀酸盐而言是不可渗透的(Lee等人，2011)，但蛋白质转运体以交换富马酸盐或磷酸盐的方式将琥珀酸盐输入到线粒体中是已知的(Palmieri等人，2000)。然而，不存在从线粒体向细胞质分泌琥珀酸盐的已知机制，从而从TCA循环，甚至支路模式中产生的琥珀酸盐不容易被运输至线粒体外并由此到达细胞外。因而，在现有技术中认识到，通过在到苹果酸盐和琥珀酸盐的还原性途径中布置在线粒体外的细胞质中存在且活性足够高的关键酶(例如丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶)，从而在细胞质中工程化生物合成二元羧酸(例如苹果酸盐和琥珀酸盐)是合乎需要的(US 2008/0090273、US 2012/0040422、WO 2010/003728、WO 2011/023700、WO 2009/101180和WO 2012/038390、WO 2008/128522、WO 2010/043197)。然而，现有技术并未充分认识到或解决如何从线粒体输出琥珀酸盐或如何在厌氧或微好氧条件下达到氧化还原平衡，并同时从酵母中的葡萄糖或其他碳源最大化地产生琥珀酸盐的问题。而且，线粒体内和线粒体外的所有相关酶的产生和活性的规则极其复杂，并且如何达到工程化产生适当的水平也不明确。最后，线粒体膜对于NAD和NADH是不可渗透的，并且在厌氧或微好氧条件下如何在线粒体基质和细胞质之间达到有效的氧化还原平衡也不明确。本文公开的发明内容认识到了这些挑战并提供了解决这些问题的方案。

发明内容

[0013] 本发明提供了具有改变的代谢途径可用于在细胞质中产生有机酸，比如苹果酸、富马酸和琥珀酸的酵母细胞。更具体地，本发明提供了具有可在细胞质中运行的氧化还原平衡代谢途径，并且用于琥珀酸的产生的酵母细胞。

[0014] 在一个实施方式中，本发明的重组酵母细胞具有从磷酸烯醇丙酮酸盐至琥珀酸的还原性琥珀酸盐途径，其可在细胞质中运行并且涉及以下的酶：丙酮酸激酶、苹果酸酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶。

[0015] 在另一实施方式中，本发明的重组酵母细胞具有从磷酸烯醇丙酮酸盐至琥珀酸的还原性琥珀酸盐途径，其可在细胞质中运行并且涉及如下的酶：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶。

[0016] 本发明也提供了酵母细胞，其中，可在细胞质中运行的用于琥珀酸产生的还原性途径通过提高细胞质内运行的磷酸戊糖途径为氧化还原平衡的。由于磷酸戊糖途径的增强运行导致的还原等效物水平增加有助于满足在细胞质中用于琥珀酸产生的还原性途径运行所需的还原等效物。在本实施方式的一个方面中，通过增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性来实现磷酸戊糖途径运行的增强。在该实施方式的另一方面中，通过阻断磷酸葡萄糖异构酶的活性来实现磷酸戊糖途径运行的增强。在本发明的又一个实施方式中，通过增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性，并且通过阻断磷酸葡萄糖异构酶的活性来实现磷酸戊糖途径运行的增强。

[0017] 在又一个实施方式中，本发明提供了具有在细胞质中运行的修饰的乙醛酸支路的酵母细胞，其可提供为了氧化还原平衡细胞质中运行的琥珀酸盐途径的还原性途径所需的另外的还原等效物。在本实施方式的一个方面中，丙酮酸甲酸裂解酶在细胞质中表达，从而在细胞质中产生甲酸盐和乙酰辅酶A。由丙酮酸盐产生的甲酸盐在甲酸脱氢酶的作用之后产生NADH和CO2。在该实施方式的另一方面中，线粒体酶，例如柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶在细胞质中表达，以使得除了引入在细胞质中运行的琥珀酸产生的另外还原性途径之外，还存在由修饰的乙醛酸支路的运行直接产生琥珀酸。

[0018] 除非另外定义，否则本文中使用的所有术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解的相同的含义。本文中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以其整体通过引用并入本文。在存在冲突的情况下，以说明书(包括定义和术语)为准。本文中所包括的材料、方法、示例和附图仅仅是阐释性的而不期望是限制性的。

附图说明

[0019] 图1是描绘酵母细胞中碳流动途径的图。该图中外框表示酵母细胞的外膜/细胞壁。酵母细胞内的框表示线粒体。进入线粒体中的丙酮酸与草酰乙酸(OAA)结合并且启动如实心箭头所示的柠檬酸循环。来自柠檬酸循环的碳也进入如点画线和虚线的箭头所示的乙醛酸循环。在细胞溶质中还存在羧化反应，其导致丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)转化成草酰乙酸，并且最终导致通过如虚线箭头所示的还原性途径的琥珀酸的产生。由具有点画线的箭头显示从丙酮酸盐至乙醇的发酵途径。

[0020] 图2是描绘酵母细胞中琥珀酸产生的还原性途径的图。通过磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pck)羧化磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)以产生草酰乙酸盐(OAA)的分子。当草酰乙酸盐的分子转化成琥珀酸盐的分子时，消耗了两个还原等效物。PEP也可经过丙酮酸盐激酶的作用以产生丙酮酸盐，其可被丙酮酸羧化酶羧化以产生草酰乙酸盐。

[0021] 图3是描绘细胞质中由磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)产生苹果酸的途径的图。丙酮酸激酶(Pyk)作用于PEP，以产生丙酮酸盐，丙酮酸盐在二氧化碳的存在下经历NADH依赖性苹果酸酶或NADPH依赖性苹果酸酶的作用，以产生苹果酸盐，苹果酸盐可进入还原性途径中。

[0022] 图4是描绘细胞质中由PEP产生苹果酸盐的途径的图。磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)被丙酮酸激酶(Pck)或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)羧化，以产生草酰乙酸，草酰乙酸使用NADH被苹果酸脱氢酶还原以产生苹果酸盐。PEP也可在经历Pyk作用后产生丙酮酸盐，丙酮酸盐可被羧化以获得草酰乙酸盐，草酰乙酸盐接着可被还原为苹果酸盐。另外，丙酮酸盐可被NADH依赖性苹果酸酶或NADPH依赖性苹果酸酶羧化，以产生苹果酸盐。无论产生的路径如何，在酵母细胞的细胞质中，苹果酸盐用作用于琥珀酸产生的还原性途径的起始点。

[0023] 图5是描绘通过磷酸戊糖途径的碳流动的图。葡萄糖-6-磷酸盐(葡萄糖)经历葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)的作用以产生核酮糖-5-磷酸盐(Ru5P)。在酵母细胞内的糖酵解反应的正常程序中，葡萄糖-6-磷酸盐通过磷酸葡萄糖异构酶转化成葡萄糖-1-磷酸盐(未描绘)。为了增强碳向磷酸戊糖途径中的流动，在降低或抑制磷酸葡萄糖异构酶活性的同时，增加了ZWF的活性。

[0024] 图6是描绘横跨如该图中两条垂直线显示的线粒体膜的丙酮酸盐和乙酸盐的流动的图。来自细胞质中糖酵解的丙酮酸盐通过简单扩散进入线粒体中。丙酮酸盐经过脱羧，以产生乙酰辅酶A，乙酰辅酶A用于产生琥珀酰辅酶A和乙酸盐。乙酸盐通过简单扩散而扩散至线粒体外，并且在经过乙酰辅酶A合成酶作用后产生乙酰辅酶A，乙酰辅酶A接着与草酰乙酸盐结合，以产生柠檬酸盐。柠檬酸盐进入乙醛酸(glyxoylate)支路，以产生乙醛酸盐和琥珀酸盐(SAC)。两条垂直线左边的区域表示线粒体，并且两条垂直线右边的区域表示细胞质。

[0025] 图7是描绘细胞质中乙酰辅酶A的形成的图。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)作用于丙酮酸盐，以产生甲酸盐和乙酰辅酶A。甲酸盐通过甲酸脱氢酶作用，以产生二氧化碳和NADH。乙酰辅酶A与草酰乙酸反应，以产生柠檬酸，柠檬酸异构化，以产生异柠檬酸盐，异柠檬酸盐接着分解成乙醛酸盐和琥珀酸盐。乙醛酸盐和乙酰辅酶A组合在一起，以产生苹果酸盐，苹果酸盐最终转化成琥珀酸。

具体实施方式

[0026] 为了便于本发明的理解，本文提供了一些定义和术语。

[0027] 来自细菌例如大肠杆菌(E.coli)的基因或编码区通常用斜体的三个小写字母来命名，有时后面接大写字母，例如“mdh”代表编码苹果酸脱氢酶的基因，并且“fumB”代表编码延胡索酸酶B的基因。可以用相同的字母来命名由基因编码的酶或蛋白质，但首字母为大写的且不为斜体，例如“Mdh”代表苹果酸脱氢酶，并且“FumB”代表延胡索酸酶B。来自酵母例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的基因或编码区通常用三个大写字母来命名，有时后面接整数，全部为斜体，例如“PDC1”表示编码丙酮酸脱羧酶的基因。可用相同的字母来命名由基因编码的酶或蛋白质，但使用大写首字母并且不为斜体，例如“Pck”表示磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。也可通过更具描述性的名称来指代酶或蛋白质，例如，用苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶B和PEP羧激酶代表前述的示例。当提到来自特定酵母种的基因或酶时，可在该基因或酶之前设置一对属和种首字母的缩写字母来表示该基因或酶的特定形式。例如，“ScMDH1”是指编码来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的苹果酸脱氢酶同工酶1的基因，而“KmMDH1”是指来自马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的苹果酸脱氢酶1同工酶。应当注意，这些命名不一定是唯一的，因此任何特定命名不限于特定的DNA或蛋白质序列，因为任何给定的种都可以具有许多不同的菌株，而不同的菌株可能具有执行相同功能的不同基因或酶。另外，由于历史上不同的起源或由于基因来自不同的种，编码具有特定催化活性的酶的一个示例的基因或编码区可以具有若干不同名称。在本说明书中，为了简洁的目的，并且由于基因可从一种微生物转移至另一种微生物，由三个大写字母组成的名称可以指代来自于细菌或酵母的基因或酶。例如，“PCK”可指细菌中或来自细菌的或酵母中或来自酵母的，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶或编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因。三个大写字母命名是否指代基因或蛋白质可从特定用途的上下文推断得出。

[0028] 可以通过使用游离酸名称(例如“琥珀酸”)指代任何羧酸或二羧酸，或称为盐、酯、硫酯或酰胺，在这种情况下名称为“琥珀酸盐”。在生理条件下，游离酸和盐都会在一定程度上存在，因此出于本发明的目的，这两种名称都应指代这两种形式。对于所有其他的有机酸也应同理。

[0029] 术语“表达盒”或“盒”意思是可为含有至少一个启动子以及编码酶或其他蛋白质的基因或区域的染色体或质粒的部分的DNA序列，使得由启动子表达编码区，并且由含有DNA序列的宿主细胞产生酶或蛋白质。“表达盒”可为至少部分合成的，或通过基因工程方法设置的，从而由与该编码区并非自然相关的启动子来表达该编码区。任选地，“表达盒”可含有转录终止子，其可为或可不为与编码区自然相关的终止子。“表达盒”可以具有针对多于一种蛋白质的编码区，在这种情况下，其可被称为操纵子或合成操纵子。

[0030] 术语“强组成型启动子”意思是这样的DNA序列，所述DNA序列通常位于DNA序列或基因的上游(当以传统的5’至3’取向进行描述时，指基因的5’侧)，通过RNA聚合酶转录并使得所述DNA序列或基因通过RNA聚合酶转录而以容易通过适当的分析程序直接或间接地检测的水平表达。适当的分析程序的示例包括(1)定量逆转录酶加聚合酶链式反应(PCR)、(2)编码的酶的酶分析、(3)考马斯蓝染色的蛋白质凝胶或(4)作为所述转录的结果间接产生的代谢产物的可测量产生，并且这样的可测量转录的发生与存在或不存在特异性调控转录水平的蛋白质、代谢产物或诱导剂化学物质无关。不是“强组成型启动子”的启动子的示例是大肠杆菌(E.coli)的乳糖操纵子启动子，或在KmLAC4基因之前的启动子，因为两个基因在不存在诱导子(例如乳糖)的情况下被负调控。通过使用本领域熟知的方法，可以用“强组成型启动子”来替代自然启动子(DNA序列或基因的上游自然存在的另外的启动子)，带来了表达盒，其可在质粒或染色体中设置并且提供水平高于自然启动子水平的期望DNA序列或基因的表达水平。强组成型启动子对于种或属可是特异性的，但来自细菌或酵母的强组成型启动子通常分别在在细菌或酵母的远亲中具有正常功能。例如，来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的启动子可在乳酸克鲁维酵母(K.lactis)或马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)中具有正常功能(Lee等人，2012)。强组成型启动子的示例是驱动编码糖酵解途径中的酶(例如ENO(烯醇化酶))或发酵途径中的酶(例如PDC或醇脱氢酶(ADH))的基因、编码核糖体蛋白质的基因以及编码翻译延伸因子(例如TEF1)的基因表达的启动子(Sun等人，2012)。

[0031] 术语基因或编码区的“过表达”意思是指在相同或相似的生长条件下，导致在宿主微生物中以高于在野生型宿主微生物中发现的水平产生由该基因或编码区编码的酶或蛋白质。其可通过例如，以下方法中的一种或多种来实现：(1)设置更强的启动子、(2)设置更强的核糖体结合位点、(3)设置终止子或更强的终止子、(4)改善编码区中一个或多个位点处密码子的选择、(5)改善mRNA稳定性以及(6)通过在染色体中引入多个拷贝或在多拷贝质粒上设置表达盒来增加基因的拷贝数。由过表达的基因产生的酶或蛋白质即为所述的“过度产生”。“过表达的”的基因或“过度产生”的蛋白质可为宿主微生物自然的，或其可以通过基因工程方法从供体生物移植到宿主微生物中，在这种情况下，酶或蛋白质以及编码酶或蛋白质的基因或编码区被称为“外源的”或“异源的”。由于外源的或异源的基因或蛋白质不存在于未工程化的宿主生物中，因而其被定义为过表达或过度产生。

[0032] 术语“质粒”意思是比染色体小得多，与微生物的一个或多个染色体分离，并且与一个或多个染色体分开复制的环状或线性DNA分子。“质粒”可以约每个细胞一个拷贝或以每个细胞多于一个拷贝存在。在微生物细胞中质粒的保持一般需要抗生素选择，但也可使用营养缺陷型的互补。

[0033] 表达盒的设置可通过非同源，或优选地同源地整合到染色体中，或通过含有期望表达盒(多个表达盒)的复制质粒的设置来实现。对于整合到染色体中或复制质粒中，将各自具有其自身启动子和终止子的多于一个的基因组装成可作为一个连续的DNA序列来操作的封装体是本领域熟知的(Shao等人，2012)。

[0034] 术语“异源的”意思是不是在生物体中自然或天然发现的，但可通过基因工程(比如通过转化、杂交或转导)引入到生物体中的基因或蛋白质。可将异源基因整合(插入)到染色体中或包含在质粒中。

[0035] 术语“外源的”意思是出于增加、降低或消除活性的目的，通过基因工程(比如通过转化、杂交、转导或诱变)已经引入到有机体中或在有机体中或在有机体中发生改变的基因或蛋白质。外源基因或蛋白质可为异源的，或其可为宿主生物自然的，但通过一种或多种方法改变的基因或蛋白质，例如，通过突变、删除、改变启动子、改变终止子、复制或在染色体中或在质粒中插入一个或多个另外拷贝。因此，例如，如果将KmPCK基因的第二个拷贝插入到与内源位点不同的染色体的位点处，则该第二拷贝就是外源的。

[0036] 术语第一基因、DNA序列或蛋白质的“同源物”是与所述第一基因、DNA序列或蛋白质执行相似的生物学功能并且(当使用适当的遗传密码比较多个蛋白质序列或比较来自一种基因序列的蛋白质序列时)与所述第一基因或蛋白质具有统计学显著的序列同一性的第二基因、DNA序列或蛋白质，如通过用于序列比对的BLAST计算机程序所确定的(Saliola等人，2004；Altschul等人，1997；Altschul等人，1990)，并且允许删除和插入。酿酒酵母(S.cerevisiae)基因ScURA3的同源物的编码乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶的示例是来自马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的KmURA3基因。

[0037] 术语第一基因、DNA序列或蛋白质的“类似物”是与所述第一基因、DNA序列或蛋白质实施相似的生物学功能，但(当比较多个蛋白质序列或比较来自多个基因序列的氨基酸序列时)与所述第一基因、DNA序列或蛋白质不具有统计学显著的序列同一性的第二基因、DNA序列或蛋白质，如通过用于序列比对的BLAST计算机程序所确定的(Altschul等人，1990；Altschul等人，1997)，并且允许删除和插入。例如，KmFum1p，来自马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的延胡索酸酶1，是来自大肠杆菌(E.coli)的FumB的类似物，因为二者均发挥延胡索酸酶的功能，但这两种酶或它们的各自基因之间又不具有显著的序列同源性。本领域中知识渊博的科学家知晓，可在许多不同的生物体中发现具有特定生物学功能的许多酶和蛋白质(例如延胡索酸酶或苹果酸脱氢酶)，作为同源物或类似物，并且由于这些酶或蛋白质的家族成员共有相同的功能，因而尽管它们在结构上可以稍有不同或显著不同，但在许多情况下可以使用目前的基因工程方法使用相同家族的不同成员来实施相同的生物学功能。因此，例如，来自马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的KmFum1p延胡索酸酶和来自大肠杆菌(E.coli)的FumB延胡索酸酶均催化相同的反应，从而在适当的条件下二者均可产生富马酸并且最终产生琥珀酸，并且最终选择使用哪一种可以取决于在相似的发酵条件下选择导致更高滴度的富马酸或琥珀酸的一个。

[0038] 术语“突变”意思是使得DNA序列不同于相关野生型序列的DNA序列中的任何变化。“突变”可包括DNA序列中的单个碱基改变、删除、插入、替换、移码、倒位、复制或任意其他类型的改变。术语“突变”通常是指对基因或基因产物的功能有消极影响或使基因或基因产物的活性降低的变化，然而，在本文中，术语“突变”也可指使基因或基因产物的活性增加的改变。例如，在存在抑制剂(例如苯丙氨酸)的情况下，大肠杆菌(E.coli)的aroG基因中的抗反馈突变增加了AroG的活性。用不同的更强启动子替换启动子也导致可增加基因或基因产物活性的突变。术语“无效突变”指有效地去除基因功能的突变(比如，大多数或全部基因的删除)。

[0039] 术语“突变体”指与亲代或前体菌株相比时包括一个或多个突变的菌株或分离物。通过用斜体小写字母书写突变基因来命名酵母突变体基因型。例如，ura3是指URA3基因中包括突变的菌株。

[0040] 术语“基因变化”指插入到宿主细胞中的宿主细胞染色体或质粒中的，故意地获偶然地导致期望结果(比如，相比于不包括所述基因变化的相关细胞相比，由所述基因变化形成的细胞的酶活性的增加或降低，或稳定态浓度的增加或降低，或代谢产物的产生)的任何突变、基因或DNA序列插入或添加、基因盒插入或添加、基因或DNA序列复制、DNA序列缺失。在一些情况中，基因变化会导致酶活性的增加或降低，在这种情况下可通过酶活性的比活性来测量所需的结果，例如，整个细胞、透化细胞、细胞提取物、细胞器(例如，线粒体)制备物或细胞膜制备物的每毫克蛋白质的底物消耗或产物产生的微摩尔。在其他情况下，基因变化会导致期望的代谢产物(比如琥珀酸)的滴度、产率或比产生率增加，这可以通过适当的分析方法例如高压液相色谱(HPLC)来进行评价。在其他情况中，基因变化会导致不需要的代谢产物(比如丙酮酸或乙酸)的滴度、产率或比产生率降低。

[0041] 对酵母进行从葡萄糖产生琥珀酸的工程化的第一步是产生已经删除了不需要的发酵途径的宿主菌株。在酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和伊萨酵母属(Issatchenkia)的酵母中，主导的发酵途径为产生乙醇(加二氧化碳)和甘油。通过删除编码丙酮酸脱羧酶(PDC；EC 4.1.1.1)的基因可阻断乙醇途径。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有三个这样的基因，ScPDC1、ScPDC5和ScPDC6。乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)各自分别仅具有一种KlPDC1和KmPDC1。通过删除编码甘油-3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8；EC 1.1.99.5；EC1.1.1.177；EC 1.1.1.94)的全部基因可阻断甘油途径。酿酒酵母(S.cerevisiae)含有三种这样的基因，GUT2、GPD1和GPD2。乳酸克鲁维酵母含有两种这样的基因，KlGUT2(Saliola等人，2008)和KlGPD1(Neves等人，2004)。

[0042] 术语“主发酵产物”指除了水合二氧化碳之外，以高于任何其他发酵产物的浓度产生的发酵产物。

[0043] 可以通过若干本领域熟知的方法来实现基因的删除。在一种这样的方法中，可以用编码互补于营养缺陷型标记的基因的DNA序列替换编码缺失的靶基因(例如，PDC1)的DNA序列。常用的基因缺失和替换的标记包括尿嘧啶、组氨酸、腺嘌呤、色氨酸和亮氨酸营养缺陷型(例如在ura3、his3、ade1、trp5或leu2酵母突变体中)的互补物。使用营养缺陷型标记首先要求该菌株是生物合成途径中第一步所缺乏的。一种常用的营养缺陷型标记使用URA3基因。当将该URA3基因连接至功能性启动子和终止子时使得该菌株缺乏乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶(ura3)以在缺少尿嘧啶的基本培养基上生长。可通过发现可在5-氟乳清酸(5-FOA)上生长的突变体来选择乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶缺乏的菌株。具有功能性乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶的菌株将含氟化合物结合到RNA中且并不可行。以这样的方式可选择包括或不包括功能性URA基因的菌株。通常，在要求存在URA3的情况下，第一步涉及在缺乏尿嘧啶的培养基上进行选择。如果URA3基因位于相同DNA序列的至少一个拷贝的两端侧翼，则URA3标记可被删除并且之后在一轮或多轮另外的基因修饰中重复使用，从而在两个侧翼之间的同源重组会导致间隔URA3基因的缺失。这种方法以多种方式被称为使用“串联重复”、“串联重复的DNA序列”、“重复DNA序列”、“同向重复(direct repeats)”等等。当侧翼存在串联重复的具有URA3的菌株在5-FOA上生长时，该URA3基因为“环凸”或“划消(crossed out)”并且然后可在随后的基因工程中重复使用。

[0044] 必需基因的克隆可通过本领域熟知的多种方法中的任意方法来实现，例如在适当的质粒、粘粒、噬粒、细菌人工染色体或酵母人工染色体中设置基因文库，然后使用DNA探针进行筛选或通过在适当的突变体宿主细胞(例如，细菌或酵母菌株)中的功能性互补来进行选择。许多这种基因的DNA序列已被公开并且可在美国国家生物技术信息中心网站上获得，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/，例如，来自大肠杆菌、酿酒酵母(S.cereveisae)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的DNA序列。在这些情况下，可通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增和克隆期望的基因，然后在适当的载体中克隆。为了从DNA序列尚未公布的生物体，例如从东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)获得期望基因的DNA序列，人们可通过现有的成熟方法获得全基因组的DNA序列并且通过来自其他生物体的已知基因的同源性来定位期望的基因(Altschul等人，1997；Altschul等人，1990)。然后通过PCR来扩增期望的基因并且在适当的表达载体或表达盒中克隆。也可通过对合成序列进行排序来获得期望的DNA序列，例如，作为“gBlocks”，来自Integrated DNA Technologies，Woodland，得克萨斯州，USA。可通过常规连接或使用来自New England Biolabs，Ipswitch，马萨诸塞州，USA的NEBuilder 试剂盒通过“Gibson”方法来连接DNA片段。

[0045] 在克隆了每一个期望的基因之后，可删除或突变将自然(野生型)蛋白质引入到亚细胞细胞器中而不是细胞质中的任何序列，从而基本上防止蛋白质被转运到所述细胞器中。用于实现上述目的的方法在文献中是熟知的。例如，可以删除靶向于线粒体基质(线粒体的内腔)的蛋白质的N-端蛋白质序列以使蛋白质重定向至细胞质是熟知的。“N-端靶序列”也被称为基质导向序列(MTSs)，因为其也携带N末端跨内膜进入基质。在没有进一步排序信息的情况下，其将蛋白质引入到基质中。人们已经对其进行了相当细致的研究，并且已经知晓其主要特征超过十年之久。其由约10-80个可能与一个疏水残基和一个带正电荷的面形成两亲性螺旋的氨基酸残基组成。一级结构中不存在共有序列，其即使在密切相关的直系同源物(ortholog)之间也常常有很大的差异。然而，这些两亲性螺旋的一般性质“在真菌和动物中是广泛地保守的”(Neuport和Hermann，2007)。一个具体示例是由ScFUM1基因编码的野生型延胡索酸酶被引入到线粒体和细胞质中，但是如果编码N-端17个氨基酸的DNA序列缺失，则在线粒体中找不到酶(Stein等人，1994)。将过氧体苹果酸脱氢酶重定向至细胞质的一个示例是通过从MDH3基因删除编码C-端三肽序列SKL的9个碱基对来实现的(Zelle等人，2008)。除了删除或致突变靶向细胞器的序列之外，可将每一种期望酶的基因可功能性地联结至组成型启动子。在优选的实施方式中，将每一种期望的基因都联结至不同的启动子，从而可将单个基因表达盒在一个途径表达盒中组装在一起，而在途径表达盒中不具有任何实质上重复的DNA序列，其接着使得更加方便地将组装的途径表达盒作为引入途径表达盒载体整合到期望的宿主菌株的染色体或质粒中。在途径表达盒组装之后，如上文所述将其设置在宿主菌株中。

[0046] 可通过非同源或优选地同源整合插入染色体，或通过插入含有表达盒(多个表达盒)的复制质粒来实现表达盒的插入。任选地，表达盒的插入可与一个或多个不需要的基因(例如KmPDC1)的缺失相组合，以使得表达盒代替不需要的基因，实际上同时实现了所需步骤中的两个。不需要的基因的启动子可布置为用于驱动期望基因之一的表达。例如，可设计一种设计用于在KmPDC1基因座处表达大肠杆菌pck基因的表达盒的整合，以pck开放阅读框精确替代KmPDC1开放阅读框。如果多于一个基因由表达盒被表达，则其可布置为使得阵列的最后一个基因功能性联结至KmPCD1终止子。

[0047] 术语“琥珀酸生物合成途径”意思是始于一种或多种碳源(比如，糖或甘油)并且最终产生琥珀酸的一系列酶促的，以及任选地非酶促的化学反应。存在三种传统的琥珀酸生物合成途径：还原性TCA支路、氧化性TCA支路和乙醛酸支路(图1)。涉及苹果酸酶的第四种新途径为本专利的一个方面。“苹果酸酶”是一种通过二氧化碳和还原等效物的添加从而绕过作为中间产物的草酰乙酸盐，将丙酮酸盐直接转化成苹果酸盐的酶。自然界中发现了两种类型的苹果酸酶。第一种类型命名为“NADH依赖性苹果酸酶”，也称为EC 1.1.1.39和EC 1.1.1.38，相比NADPH其优选NADH作为其辅因子。换句话说，相比对于NADPH，酶对于NADH具有更高的亲和性(更低的Km)，或相比使用NADPH作为辅底物时，使用NADH作为辅底物时其可达到更高的Vmax。第二种类型命名为“NADPH依赖性苹果酸酶”，也称为EC 1.1.1.40，相比NADH其优选NADPH作为其辅因子。换句话说，相比对于NADH，酶对于NADPH具有更高的亲和性(更低的Km)，或相比使用NADH作为辅底物时，使用NADPH作为辅底物时其可达到更高的Vmax。

[0048] 还原性TCA支路(琥珀酸产生的还原性途径)始于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸的羧基化，以产生草酰乙酸盐(图2)。PEP的羧基化可以通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)来进行。在产生琥珀酸的途径中优选使用PCK酶，因为与草酰乙酸盐一起产生一个三磷酸腺苷(ATP)。可通过丙酮酸羧化酶(PYC)来实现丙酮酸的羧基化。通过苹果酸脱氢酶(MDH)将草酰乙酸盐还原成苹果酸盐。通过延胡索酸酶(FUM)将苹果酸盐转化成富马酸盐。最后，通过延胡索酸还原酶(FRD)从富马酸盐产生琥珀酸盐。还原性TCA支路是高产途径，但其也是NADH、NADPH和/或FADH形式的还原等效物的净消耗。术语“还原等效物”指氧化还原辅因子所携带的化学还原形式的氢并且可通过酶来使用以化学还原底物。例如，NADH是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式，其可通过酶延胡索酸还原酶为富马酸提供其还原氢原子以形成琥珀酸。在这样的反应中，辅因子转化成氧化形式，在该示例NAD中，其接着需要还原回到还原形式以在琥珀酸生物合成途径中发挥作用。术语“氧化还原辅因子”指在酶促反应中用作辅底物以为其他底物提供还原等效物或从其他底物接受还原等效物的任何化合物。氧化还原以还原形式和氧化形式成对存在。这样的配对的示例包括但不限于NADH/NAD(有时写作NAD+)、NADPH/NADP(有时写作NADP+)、FAD/FADH(有时写作NADH2)和FMN/FMNH(有时写作FMNH2)。术语“还原辅因子”指氧化还原辅因子的化学还原形式，例如NADH、NADPH、FADH或FMNH。在糖酵解过程中，在PEP产生期间产生一个还原等效物(NADH)，但将PEP转化成琥珀酸需要两个还原等效物(例如，NADH、NADPH和/或FADH)。使用由氧化的琥珀酸盐途径或乙醛酸琥珀酸盐途径产生的还原等效物为在细胞质中产生琥珀酸的还原性途径的运行提供所需水平的还原等效物是指在细胞质中产生琥珀酸的还原性途径的氧化还原平衡。

[0049] 相比还原性TCA支路，氧化性TCA支路和乙醛酸支路均提供琥珀酸的较低产量途径，但二者可提供在厌氧或微好氧条件下实现经由还原性途径从葡萄糖或其他碳水化合物碳源生物合成琥珀酸的氧化还原平衡的另外还原等效物。氧化性TCA支路(琥珀酸氧化产生)始于从乙酰辅酶A和草酰乙酸盐形成柠檬酸的柠檬酸合酶(CIT)。通过顺乌头酸酶(ACN)将柠檬酸转化成异柠檬酸盐。异柠檬酸脱氢酶(IDH)将异柠檬酸盐转化成α-酮戊二酸盐，α-酮戊二酸盐又通过α-酮戊二酸脱氢酶(KGD)进一步转化成琥珀酰辅酶A。然后通过琥珀酰辅酶A合成酶(SCS)或琥珀酸硫激酶或琥珀酸辅酶A连接酶从琥珀酰辅酶A产生琥珀酸盐。琥珀酸辅酶A连接酶是催化琥珀酰辅酶A至琥珀酸盐的可逆反应的酶。对于经由氧化性TCA支路产生的每个琥珀酸盐，产生五个还原等效物。在乙醛酸支路(琥珀酸产生的乙醛酸途径)运行过程中，异柠檬酸盐通过异柠檬酸裂解酶(ICL)分解成琥珀酸盐和乙醛酸盐。苹果酸合酶(MLS)从乙醛酸盐和乙酰辅酶A形成苹果酸盐。然后苹果酸盐转化成富马酸，之后转化成琥珀酸盐。经由乙醛酸支路产生的最大还原等效物为，每由三个葡萄糖分子产生四个琥珀酸盐分子，产生八个还原等效物。

[0050] 使用琥珀酸盐产生的氧化性途径(比如TCA循环或乙醛酸途径的氧化方向)的运行产生的还原等效物在细胞质中琥珀酸盐产生的还原性途径的氧化还原平衡并不容易实现，因此仍需要在提供在细胞质中琥珀酸产生的还原性途径的运行所需还原等效物的酵母细胞中确定途径。琥珀酸产生的另外途径需要产生足够的还原等效物。

[0051] 还原等效物的一种可选来源是磷酸戊糖途径(PPP)。磷酸戊糖途径是还原等效物(NADPH)的来源以及核苷酸合成所需的二氧化碳和五碳糖磷酸的来源。在葡萄糖进入细胞并且被磷酸化为葡萄糖-6-磷酸之后，氧化的PPP通过如下的酶将葡萄糖-6-磷酸与分子的NADPH和一分子的CO2一起转化成核酮糖-5-磷酸：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD或ZWF)、6-磷酸葡糖酸内酯酶(SOL或PGL)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)。通过增加葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)和/或6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)的活性，和/或通过降低葡萄糖6-磷酸异构酶(PGI)的活性，人们可通过PPP指导碳通量的增加，产生平衡产生琥珀酸的还原性TCA支路所需的还原等效物(图3)。通过基因缺失或其他突变可使PGI活性降低或完全失活从而迫使来自葡萄糖的全部碳通量通过PPP。PGI缺失导致在酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisiae)种在葡萄糖上生长最少，但在其他微生物(例如，细菌大肠杆菌或乳酸克鲁维酵母)中可以容忍PGI缺失。在这些PGI缺陷菌株背景中细胞生长通常受阻，至少是在最初。已经研究了PGI突变体并且已经表征了更快生长突变体(Sekar等人，2017)。为了恢复部分或全部相当于野生菌株的生长，细胞需要使用经由PPP产生的超额还原等效物。在大肠杆菌中，NADPH可转化成NADH，其可容易地被细胞使用以用于琥珀酸生物合成。进化菌株经常保持可溶性或膜结合转氢酶中的突变从而使得这些还原等效物可彼此转化。另外，通过增加ZWF活性在PPP中增加的通量已显示出改善PGI缺陷菌株的生长速率(Sekar等人，2017)。因此，在一个实施方式中，通过增加PPP的一种或多种酶的活性和/或通过增加或消除磷酸葡萄糖异构酶(PGI)活性阻断或降低直接通过Embden-Meyerhof-Parnas途径的通量一个或多个基因变化使得通过PPP从葡萄糖-6-磷酸至甘油醛-3-磷酸和果糖-
6-磷酸的通量得到增强。PPP的酶包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)、6-磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(GND)、转酮醇酶(TKT)、转醛醇酶(TAL)、核酮糖-5-磷酸差向异构酶(RPE)和核酮糖-5-磷酸异构酶(RPI)。

[0052] 如前面提到的，乙醛酸支路通常被用作琥珀酸盐产生期间的还原等效物的来源，但尤其在酵母中该途径遇到了明显的局限性。在工程化用于除乙醇之外的产物产生的酵母中，丙酮酸脱羧酶(PDC)造成非期望的副产物，乙醛和乙醇。从酵母消除丙酮酸脱羧酶也就消除了乙酰辅酶A的唯一全部细胞溶质来源。在PDC缺陷菌株的情况中，丙酮酸必须被转运至线粒体中并通过丙酮酸脱氢酶(PDH)转化成乙酰辅酶A。然后乙酰辅酶A在线粒体内转化成乙酸然后被转运回细胞溶质中，在细胞溶质中乙酰辅酶A合成酶(ACS)可将乙酸盐转化成乙酰辅酶A。这种迂回的途径不仅低效，而且还会导致细胞的更高能量消耗。通过ACS产生的乙酰辅酶A使用ATP并导致产生AMP，这比经由传统途径形成乙酰辅酶A需要明显更多的能量。常见的产生乙酰辅酶A的细菌途径依赖丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)。PFL将丙酮酸盐转化成乙酰辅酶A和甲酸盐。甲酸盐可通过甲酸脱氢酶(FDH)进一步被氧化为CO2产生琥珀酸盐产生所需的还原等效物。PFL需要催化性蛋白质和活化的酶。已知PFL是需要重新活化以获得活性的氧敏感酶。之前的研究组已经在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达了PFL并且描绘其可通过该细胞在代替自然途径产生所需的乙酰辅酶A。进一步研究已显示出，当在酵母中表达时，铁氧还蛋白的共表达可显著改善酶的氧耐受(Zhang等人，2015)。可通过乙醛酸支路中的酶使用从PFL产生的乙酰辅酶A，并且通过FDH形成的还原等效物可用于还原性TCA支路(图4和图5)。

[0053] 实施例

[0054] 实施例1

[0055] 还原性TCA支路的设置

[0056] 在酵母中，将TCA循环中涉及的酶靶向至线粒体。决定丙酮酸盐和草酰乙酸盐产生的糖酵解发生在细胞质中。为了具有最佳琥珀酸盐产生途径，优选在细胞质中具有全部必需的酶。对于细胞质还原性TCA支路而言，MDH、FUM和FRD酶均应定位至细胞质。这可通过表达缺乏线粒体靶向序列的细菌基因或通过消除在酵母蛋白中出现的线粒体靶序列来实现。此外，也期望增加的PCK活性，以产生对于琥珀酸盐更强大的有利途径。MDH、FUM、FRD和PCK的高活性可通过将基因的表达与高强度启动子连接来实现。这种高强度启动子的示例包括但不限于PDC、TDH(丙糖磷酸脱氢酶)、ENO(烯醇化酶)、TPI(丙糖磷酸异构酶)、TEF(翻译延伸因子)、ADH(醇脱氢酶)和GDP(甘油-3-磷酸脱氢酶)。通常，糖酵解中涉及的基因的启动子是强组成型表达的启动子并且是用于基因过表达的良好选择。

[0057] 表达盒的设置可通过非同源或优选同源整合到染色体中，或通过含有期望的表达盒(多个表达盒)的复制质粒的设置来实现。基因组中的整合位点可在含有不需要的副产物(比如，乙醇形成中涉及的PDC或ADH，或甘油形成中涉及的GPP和GDP)的基因的基因座处进行。对于整合到染色体中或复制质粒中，将各自具有自身启动子和终止子的多于一个的基因组装成可作为一个的连续的DNA序列操作的封装体是本领域中熟知的(Shao等人，2012)。

[0058] 实施例2

[0059] 通过磷酸戊糖途径和消除或降低PGI活性具有增加的通量的琥珀酸盐途径[0060] 一旦设置了具有还原性TCA支路表达的宿主菌株，就需要另外的还原等效物用于高产琥珀酸盐途径。可产生另外的还原等效物的一种方式是通过经磷酸戊糖途径(PPP)的碳通量的重定向。至少部分的重定向可使用早前描述的过表达方法通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF)的活性的增加来实现。更加完全的碳重定向可通过葡萄糖6-磷酸异构酶(PGI)活性的降低或删除来实现。消除将使得当在葡萄糖上生长时，通过PPP的NADPH的产生最高。在另一实施方式中，ZWF、PGL和/或GND活性的增加以及葡萄糖6-磷酸异构酶的消除或降低都工程化至相同的细胞中。

[0061] 在一个实施方式中，用侧翼具有同向重复的URA3基因代替PGI DNA序列。在第二步骤中，当使用5-FOA选择时，去除URA3标记。在其他的实施方式中，不是仅去除PGI DNA序列而且用编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的DNA序列代替。这不仅通过消除PGI而向PPP引入通量，而且还在单个步骤中增加了ZWF活性。另一实施方式允许使用通过PPP产生的NADPH，用于通过苹果酸酶的引入或苹果酸酶的活性的增加的苹果酸、富马酸或琥珀酸产生。苹果酸酶可为优选NADPH作为底物或优选NADH作为底物的苹果酸酶。优选NADPH的苹果酸酶，换句话说，相比NADH对NADPH具有更低的Km，或相比NADH与NADPH具有更高的Vmax的苹果酸酶，出于简洁在本文和权利要求中应称为“NADPH依赖性苹果酸酶”。在优选的实施方式中，由于NADPH是通过PPP产生的还原等效物的形式，苹果酸酶优选NADPH作为底物。编码这种活性的基因的一个示例是大肠杆菌的maeB基因。苹果酸酶(MaeB)使用一个NADPH将丙酮酸羧酸化，产生苹果酸盐。接着，产生的苹果酸盐通过MDH、FUM和FRD进一步转化成琥珀酸盐。

[0062] 在另一实施方式中，细胞被工程化为具有优选NADH的苹果酸酶的活性的增加，换句话说，相比对NADPH，对NADH具有更低的Km的苹果酸酶，或与NADPH相比，与NADH具有更高的Vmax的苹果酸酶，出于简洁在本文和权利要求中称为“NADH依赖性苹果酸酶”。编码该活性的基因的一个示例是大肠杆菌的maeA或sfcA基因。苹果酸酶(MaeA)将丙酮酸羧酸化，产生NADH和苹果酸盐。接着，产生的苹果酸盐可通过MDH、FUM和FRD进一步转化成富马酸盐和/或琥珀酸盐。

[0063] 实施例3

[0064] 通过PFL产生乙酰辅酶A的外源途径

[0065] 用于使还原性TCA支路平衡需要还原等效物也可通过运行乙醛酸支路来产生。自然地，乙醛酸支路为细胞提供了在作为唯一碳源的乙酸或2-碳单位上生长的方式。乙醛酸支路始于通过柠檬酸裂解酶(CIT)从乙酰辅酶A和草酰乙酸盐形成柠檬酸盐。接着，通过顺乌头酸酶(ACO)从柠檬酸盐形成异柠檬酸盐。异柠檬酸裂解酶(ICL)将异柠檬酸盐转化成乙醛酸盐和琥珀酸盐。苹果酸合酶(MLS)将乙酰辅酶A和乙醛酸缩合，以形成苹果酸盐。接着，产生的苹果酸盐通过FUM和FRD进一步转化成琥珀酸盐。在酵母中通常经PDC产生细胞溶质乙酰辅酶A。然而，在工程化用于乙醇之外的产物的酵母中，PDC通常是失活的。这使得细胞难以产生细胞溶质乙酰辅酶A。这可通过使用线粒体产生的乙酸盐并且将其转运到细胞质中，然后将乙酸盐转化成乙酰辅酶A来实现，但这需要将ATP转化成AMP，这在细胞能量学上是一种昂贵的反应。在能量使用(例如，ATP)和还原电位方面都更为有利的生物化学品途径使用丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和甲酸脱氢酶(FDH)。出于功能性考虑，PFL需要两种多肽，PflA和PflB。PflA是一种活化的酶，其在催化酶PflB中产生甘氨酰自由基。PFL不自然存在于任何已知酵母中，但先前的研究已经显示PFL可在酵母中功能表达。一个潜在的问题在于，已知PFL为一种厌氧酶，并且依赖于培养条件(例如，高通气)，PFL会失活。最近的研究已经显示出，通过黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白与其各自的伴侣还原酶的过表达，PFL在酵母中的好氧功能性可得到增强。“黄素氧还蛋白”和“铁氧还蛋白”指在氧化还原反应中发挥作用的大量小蛋白中的任一种，并且其可通过活化、再活化或保护形势氧化用于增加PFL的比活性。功能性PFL将产生可进入乙醛酸支路途径的乙酰辅酶A，并且也产生甲酸。甲酸可通过甲酸脱氢酶被进一步转化成CO2，同时还产生一个NADH以进一步增强该途径的可用的还原力。一个宿主菌株工程化以表达细胞溶质还原性TCA支路，使用前文所述的方法也可在细胞质中表达乙醛酸支路必需的四种酶(CIT、ACO、ICL和MLS)。可在染色体上或在质粒上向该菌株引入来自大肠杆菌的pflA和plfB基因。另外，如果需要增加PFL的活性或保护其不失活，也可添加和/或过表达铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白及其相关的伴侣氧化还原酶，例如来自谷氨酸棒杆菌(Corynebaeteriumglutamicum)ATCC 13032的fdxB和CG0639或来自大肠杆菌K-
12的fldAfpr。最后，可通过设置来自酿酒酵母(S.cerevisiae)或细菌来源的基因来添加或增加FDH(甲酸脱氢酶)的活性。经过工程化包括添加的或增加的甲酸脱氢酶活性以产生琥珀酸的菌株除了葡萄糖之外可任选地进料甲酸，以提供NADH形式的用于还原琥珀酸盐途径的还原等效物。

[0066] 工程化以通过使用苹果酸酶和来自PPP的还原等效物提供草酰乙酸盐的菌株可任选地工程化为降低或消除丙酮酸羧化酶(PYC)活性，以迫使细胞更多地依赖于苹果酸酶途径，用于草酰乙酸盐生物合成。

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