基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法
阅读：71发布：2021-05-14
专利汇可以提供基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于食品检测技术领域，本发明公开了一种基于核酸 水 凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，包括如下步骤：构建以T-2毒素适体为linker交联剂的核酸水凝胶，所述的核酸水凝胶中均匀包埋着辣根过 氧 化物酶；向所述的核酸水凝胶中加入待测样，所述的待测样中T-2毒素浓度为0.01ng mL-1-10000ng mL-1，所述的T-2毒素适体与T-2毒素结合，凝胶破裂，释放出辣根过氧化物酶；在一定时间内，辣根过氧化物酶催化过氧化氢和碘化 钾 反应生成碘单质 刻蚀 金 纳米棒 ，根据金纳米棒在紫外分光光度计下呈现的吸收峰计算T-2毒素的含量。本发明方法检测方便、灵敏。，下面是基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法专利的具体信息内容。
1.一种基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建以T-2毒素适体为linker交联剂的核酸水凝胶，所述的核酸水凝胶中均匀包埋着辣根过氧化物酶；
向所述的核酸水凝胶中加入待测样，所述的待测样中T-2毒素浓度为0.01ng mL-1-
10000ng mL-1，所述的T-2毒素适体与T-2毒素结合，凝胶破裂，释放出辣根过氧化物酶；
在一定时间内，辣根过氧化物酶催化过氧化氢和碘化钾反应生成碘单质刻蚀金纳米棒，根据金纳米棒在紫外分光光度计下呈现的吸收峰计算T-2毒素的含量。
2.根据权利要求1所述的基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，所述的构建以T-2毒素适体为交联剂的核酸水凝胶包括如下步骤：
修饰有丙烯酰胺的互补链A100μM和互补链B100μM分别加入终浓度为4wt％丙烯酰胺，随后在35-40℃抽排空气10-15min，除去氧气；
加入终浓度为1.4％新鲜配制的过硫酸铵和终浓度为2.8％新鲜配制的四甲基乙二胺；
在35-40℃抽排空气，反应10-15min，可得到髙分子互补链A和互补链B；
将髙分子互补链A和互补链B混匀后在60-65℃下孵育5-10min，重复加热两次确保试剂完全混匀；随后加入不同浓度的交联剂(30、35、40、45μM)及辣根过氧化物酶，在60-65℃下孵育5-10min，重复加热3次确保试剂混匀，再冷却至室温形成核酸水凝胶；
用磷酸缓冲溶液洗涤胶平面，除去胶表面多余的辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1所述的基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，所述的金纳米棒由如下方法制备而得：
制备金种子：在0.5-1.0mL 0.5mM四氯金酸溶液中加入0.5-1.0mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液；振荡混匀后，立即加入0.1-0.2mL 6mM新鲜配制的硼氢化钠溶液；剧烈振荡
2-5min，种子溶液由黄色变成茶色，室温静置30-45min后即可得到金种子，常温保存，备用；
制备生长液：称取0.9-1.1g十六烷基三甲基溴化铵及0.11-0.13g 5-溴水杨酸于250mL圆底烧瓶中，用25-30mL温水(50-70℃)溶解；随后加入1.2-1.5mL 4.0mM硝酸银溶液；得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌
15-20min；最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液；
金纳米棒的生长：在上述得到的生长液中加入80-85μL制得的种子液，混匀后置于30-
37℃水浴锅中，静置12-14h，得到所需的金纳米棒；最后，得到的金纳米棒用0.05M十六烷基三甲基溴化铵离心重悬3遍除去生长液。
4.根据权利要求2所述的基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，所述的髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为110：100：45时，核酸水凝胶响应时间为15min。
5.根据权利要求1所述的基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，所述的碘化钾的浓度为0.10M。
6.根据权利要求1所述的基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，所述的过氧化氢的浓度为0.075M。
7.根据权利要求1所述的基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，其特征在于，根据金纳米棒在紫外分光光度计下呈现的吸收峰计算T-2毒素的含量包括步骤：建立标准曲线：在上述水凝胶中加入10μL不同浓度的T-2毒素标准样品，室温下静置15min后，移出上清液于2mL 0.05mg/mL金纳米棒，5mL 0.10M碘化钾，20mL 0.075M过氧化氢中，室温下静置3min后，进行紫外光谱扫描。
基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法。
背景技术
[0003] 近年来，有关真菌毒素残留的食品安全问题层出不穷，常见的有单端孢霉毒素类、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，其中T-2毒素是单端孢霉A型毒素中最主要、也是毒性最强的一种。T-2毒素主要作用于细胞分裂旺盛的组织器官，能抑制DNA、RNA及蛋白质的合成，具有较强的基因毒性、免疫毒性、血液毒性，致癌致畸，有致死作用，对皮肤细胞以及遗传也具有毒性，还能诱导细胞凋亡。T-2毒素的纯品为白色针状结晶，分子式为C24H34O9，分子量为466.51，性质稳定，有很强的耐热性和紫外线耐受性，在室温条件下相当稳定，放置6～7年或加热至100～120℃1h毒性不减，因此在食物生产和加工过程中高压灭菌不易灭活。有研究表明T-2毒素可能与人类食物中毒性白细胞缺乏病症、大骨节病和克山病有着密切的关系。
[0004] 目前，许多分析技术已被用于T-2毒素检测，包括薄层层析法(Thin-layer Chromatography,TLC)、高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、气相质谱联用技术(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)和酶联免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)等，这些高灵敏度和高选择性的方法是T-2毒素定量分析最常用的方法。此外，基于抗原抗体特异性识别的免疫学分析方法也为T-2毒素定量快速检测方法的建立提供了技术支持。但这些方法仪器设备昂贵，检测费用高，要求样品经过严格的预处理，检测时间较长。
发明内容
[0005] 本发明实施例的目的是提供一种基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，本发明方法本发明方法简单、快捷、快速，具有良好的选择性和灵敏度，可用于食品安全检测中实际样品的分析。
[0006] 本发明实施例提供了一种基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，包括如下步骤：
[0008] 向所述的核酸水凝胶中加入加入待测样，待测样中T-2毒素浓度为0.01ng mL-1--110000ng mL ，所述的T-2毒素适体与T-2毒素结合，凝胶破裂，释放出辣根过氧化物酶；
[0010] 进一步的，所述的构建以T-2毒素适体为交联剂的核酸水凝胶包括如下步骤：
[0011] 修饰有丙烯酰胺的互补链A100μM和互补链B100μM分别加入终浓度为4wt％丙烯酰胺，随后在35-40℃抽排空气10-15min，除去氧气；
[0012] 加入终浓度为1.4％新鲜配制的过硫酸铵和终浓度为2.8％新鲜配制的四甲基乙二胺；在35-40℃抽排空气，反应10-15min，可得到髙分子互补链A和互补链B；
[0013] 将髙分子互补链A和互补链B混匀后在60-65℃下孵育5-10min，重复加热两次确保试剂完全混匀。随后加入不同浓度的交联剂(30、35、40、45μM)及辣根过氧化物酶，在60-65℃下孵育5-10min，重复加热3次确保试剂混匀，再冷却至室温形成核酸水凝胶。
[0014] 用磷酸缓冲溶液洗涤胶平面，除去胶表面多余的辣根过氧化物酶。
[0015] 进一步的，所述的金纳米棒由如下方法制备而得：
[0016] 制备金种子：在0.5-1.0mL 0.5mM四氯金酸溶液中加入0.5-1.0mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液；振荡混匀后，立即加入0.1-0.2mL 6mM新鲜配制的硼氢化钠溶液；剧烈振荡2-5min，种子溶液由黄色变成茶色，室温静置30-45min后即可得到金种子，常温保存，备用；
[0017] 制备生长液：称取0.9-1.1g十六烷基三甲基溴化铵及0.11-0.13g 5-溴水杨酸于250mL圆底烧瓶中，用25-30mL温水(50-70℃)溶解；随后加入1.2-1.5mL 4.0mM硝酸银溶液。
得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌15-20min；最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液；
得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌15-20min；最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液；
[0018] 金纳米棒的生长：在上述得到的生长液中加入80-85μL制得的种子液，混匀后置于30-37℃水浴锅中，静置12-14h，得到所需的金纳米棒。最后，得到的金纳米棒用0.05M十六烷基三甲基溴化铵离心重悬3遍除去生长液。
[0019] 进一步的，所述的髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为110：100：45时，核酸水凝胶响应时间为15min。
[0020] 进一步的，所述的碘化钾的浓度为0.10M。
[0021] 进一步的，所述的过氧化氢的浓度为0.075M。
[0022] 进一步的，根据金纳米棒在紫外分光光度计下呈现的吸收峰计算T-2毒素的含量包括步骤：建立标准曲线：在上述水凝胶中加入10μL不同浓度的T-2毒素标准样品，室温下静置15min后，移出上清液于2mL 0.05mg/mL金纳米棒，5mL 0.10M碘化钾20mL 0.075M过氧化氢中，室温下静置3min后，进行紫外光谱扫描。
[0023] 本发明实施例具有如下有益效果：
[0024] 本发明方法是基于金纳米棒和核酸水凝胶的食品中T-2毒素的快速检测方法。构建以T-2毒素适体为linker的核酸水凝胶，水凝胶中均匀包埋着辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)。毒素适体与毒素结合，凝胶破裂，释放出辣根过氧化物酶，在一定时间内，辣根过氧化物酶催化过氧化氢和碘化钾反应生成碘单质刻蚀金纳米棒，使金纳米棒呈现不同的颜色，并在紫外分光光度计下呈现不同位置的吸收峰。该发明方法检测T-2毒素的线性范围为0.01ng/mL～10000ng/mL，最低检测限为0.87pg mL-1。与现有技术相比，本发明方法简单、快捷、快速，具有良好的选择性和灵敏度，可用于食品安全检测中实际样品的分析。附图说明
[0025] 图1为本发明基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的流程示意图；
[0026] 图2为金纳米棒刻蚀前TEM图；
[0027] 图3为金纳米棒刻蚀后TEM图；
[0028] 图4为刻蚀前后金纳米棒的紫外吸收光谱图；
[0029] 图5为不可刻蚀性验证图；
[0030] 图6为水凝胶成胶条件的优化；
[0032] 图8为碘化钾浓度的优化；
[0033] 图9为过氧化氢浓度的优化；
[0034] 图10为未瓦解水凝胶TEM图；
[0035] 图11为完全瓦解水凝胶TEM图；
[0036] 图12为基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的紫外光谱图；
[0037] 图13为基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的标准曲线图；
[0038] 图14为不同放置时间水凝胶的稳定性图；
[0039] 图15为与其他真菌毒素的特异性图；
[0040] 图16为加标回收图。
具体实施方式
[0041] 下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
[0042] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
[0043] 结合图1，一种基于核酸水凝胶快速检测食品中T-2毒素的方法，包括如下步骤：
[0044] 构建以T-2毒素适体为linker交联剂的核酸水凝胶，所述的核酸水凝胶中均匀包埋着辣根过氧化物酶；
[0045] 向所述的核酸水凝胶中加入加入待测样，待测样中T-2毒素浓度为0.01ng mL-1-10000ng mL-1，所述的T-2毒素适体与T-2毒素结合，凝胶破裂，释放出辣根过氧化物酶；
[0046] 在一定时间内，辣根过氧化物酶催化过氧化氢和碘化钾反应生成碘单质刻蚀金纳米棒，根据金纳米棒在紫外分光光度计下呈现的吸收峰计算T-2毒素的含量。
[0047] 在本发明的一些实施例中，所述的构建以T-2毒素适体为交联剂的核酸水凝胶包括如下步骤：
[0048] 修饰有丙烯酰胺的互补链A100μM和互补链B100μM分别加入终浓度为4wt％丙烯酰胺，随后在35-40℃抽排空气10-15min，除去氧气；
[0049] 加入终浓度为1.4％新鲜配制的过硫酸铵和终浓度为2.8％新鲜配制的四甲基乙二胺；在35-40℃抽排空气，反应10-15min，可得到髙分子互补链A和互补链B；
[0050] 将髙分子互补链A和互补链B混匀后在60-65℃下孵育5-10min，重复加热两次确保试剂完全混匀。随后加入不同浓度的交联剂(30、35、40、45μM)及辣根过氧化物酶，在60-65℃下孵育5-10min，重复加热3次确保试剂混匀，再冷却至室温形成核酸水凝胶。
[0051] 用磷酸缓冲溶液洗涤胶平面，除去胶表面多余的辣根过氧化物酶。
[0052] 在本发明的一些实施例中，所述的金纳米棒由如下方法制备而得：
[0053] 制备金种子：在0.5-1.0mL 0.5mM四氯金酸溶液中加入0.5-1.0mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液；振荡混匀后，立即加入0.1-0.2mL 6mM新鲜配制的硼氢化钠溶液；剧烈振荡2-5min，种子溶液由黄色变成茶色，室温静置30-45min后即可得到金种子，常温保存，备用；
[0054] 制备生长液：称取0.9-1.1g十六烷基三甲基溴化铵及0.11-0.13g 5-溴水杨酸于250mL圆底烧瓶中，用25-30mL温水(50-70℃)溶解；随后加入1.2-1.5mL 4.0mM硝酸银溶液。
得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌15-20min；最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液；
得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌15-20min；最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液；
[0055] 金纳米棒的生长：在上述得到的生长液中加入80-85μL制得的种子液，混匀后置于30-37℃水浴锅中，静置12-14h，得到所需的金纳米棒。最后，得到的金纳米棒用0.05M十六烷基三甲基溴化铵离心重悬3遍除去生长液。
[0056] 在本发明的一些实施例中，所述的髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为110：100：45时，核酸水凝胶响应时间为15min。
[0057] 在本发明的一些实施例中，所述的碘化钾的浓度为0.10M。
[0058] 在本发明的一些实施例中，所述的过氧化氢的浓度为0.075M。
[0059] 在本发明的一些实施例中，根据金纳米棒在紫外分光光度计下呈现的吸收峰计算T-2毒素的含量包括步骤：建立标准曲线：在上述水凝胶中加入10μL不同浓度的T-2毒素标准样品，室温下静置15min后，移出上清液于2mL 0.05mg/mL金纳米棒，5mL 0.10M碘化钾20mL 0.075M过氧化氢中，室温下静置3min后，进行紫外光谱扫描。
[0060] 金纳米棒的制备
[0061] 制备金种子。在0.5-1.0mL 0.5mM四氯金酸溶液中加入0.5-1.0mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵溶液。振荡混匀后，立即加入0.1-0.2mL 6mM新鲜配制的硼氢化钠溶液。剧烈振荡2-5min，种子溶液由黄色变成茶色，室温静置30-45min后即可得到金种子，常温保存，备用。
[0062] 制备生长液。称取0.9-1.1g十六烷基三甲基溴化铵及0.11-0.13g 5-溴水杨酸于250mL圆底烧瓶中，用25-30mL温水(50-70℃)溶解。随后加入1.2-1.5mL 4.0mM硝酸银溶液。
得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌15-20min。最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液。
得到的溶液放入30-37℃的水浴锅中下静置15-20min后，加入25mL 1.0mM四氯金酸溶液，搅拌15-20min。最后加入0.2mL 0.064-0.072M抗坏血酸，混匀30-60s直至溶液变成无色，即可得到生长液。
[0063] 金纳米棒的生长。在上述得到的生长液中加入80-85μL制得的种子液，混匀后置于30-37℃水浴锅中，静置12-14h，得到所需的金纳米棒。最后，得到的金纳米棒用0.05M十六烷基三甲基溴化铵离心重悬3遍除去生长液，用于后续实验。
[0064] 金纳米棒刻蚀前TEM如图2所示，刻蚀后TEM如图3所示。分别对应的紫外吸收光谱图如图4所示。如图5所示，进行不可刻蚀性验证，在没有辣根过氧化物酶存在时一定时间内过氧化氢和碘化钾不会反应，无碘单质成，不会刻蚀金纳米棒产生峰位移。
[0065] 核酸水凝胶的制备
[0066] 修饰有丙烯酰胺的互补链A和互补链B(各100μM)分别加入终浓度为4wt％丙烯酰胺，随后在35-40℃抽排空气10-15min，除去氧气。
[0067] 加入终浓度为1.4％新鲜配制的过硫酸铵和终浓度为2.8％新鲜配制的四甲基乙二胺。在35-40℃抽排空气，反应10-15min，可得到髙分子互补链A和互补链B。
[0068] 将髙分子互补链A和互补链B混匀后在60-65℃下孵育5-10min，重复加热两次确保试剂完全混匀。随后加入不同浓度的交联剂(30、35、40、45μM)及辣根过氧化物酶，在60-65℃下孵育5-10min，重复加热3次确保试剂混匀，再冷却至室温形成核酸水凝胶。
[0069] 用磷酸缓冲溶液洗涤胶平面，除去胶表面多余的辣根过氧化氢酶。
[0070] 水凝胶成胶条件的优化
[0071] 优化了髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比，比例范围在100：100：40-100：100：55之间。如图6所示，如图6a所示，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为100：100：40时，20min后实验组上清310nm处吸光值较大，说明水凝胶瓦解充分；然而，对照组在静置20min后上清310nm吸光值随时间的增加而明显增大了，说明当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为100：100：40时，水凝胶不稳定，即使在无靶标存在时，自身也会瓦解。如图6b所示，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为100：100：45时，随着时间的增加，实验组上清中辣根过氧化物酶的吸收值逐渐増加，且20min后吸收值几乎保持不变，说明20min后水凝胶基本瓦解充分；同时，对照组上清液的310nm吸收值在20min内基本保持不变，说明此条件下水凝胶非常稳定。如图6c和6d所示，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为100：100：50/55时，虽然40min内两组对照组上清液的310nm吸收值几乎保持不变，水凝胶很稳定，然而静置40min后，其对应的实验组上清310nm吸收值都较小，说明该条件下，水凝胶太稳定了，1μM毒素只能使水凝胶发生微弱的瓦解，响应效果不佳。综上所述，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为100：100：45时，核酸水凝胶对毒素的响应最佳。
[0072] 水凝胶水解时间的优化
[0073] 优化了髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比，比例范围在90：100：45-120：100：45之间。如图7所示，如图7a所示，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为90：100：45时，10min后对照组上清液的310nm吸收值几乎保持不变，水凝胶很稳定，然而静置10min后，其对应的实验组上清310nm吸收值较小，说明该条件下，水凝胶太稳定了，1μM毒素只能使水凝胶发生微弱的瓦解，响应效果不佳。如图7b所示，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为100：100：45时，随着时间的增加，实验组上清中辣根过氧化物酶的吸收值逐渐増加，且20min后吸收值几乎保持不变，说明20min后水凝胶基本瓦解充分；同时，对照组上清液的310nm吸收值在20min内基本保持不变，说明此条件下水凝胶非常稳定。但对比图7c，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为110：100：45时，现象与图7b基本相同，但在15min时实验组上清中辣根过氧化物酶的吸收值几乎保持不变，说明15min后水凝胶已基本瓦解充分。时间更短。如图7d所示，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为120：
100：45时，15min后实验组上清310nm处吸光值较大，说明水凝胶瓦解充分；然而，对照组在静置15min后上清310nm吸光值随时间的增加而明显增大了，说明当linker浓度为40μM时，水凝胶不稳定，即使在无靶标存在时，自身也会瓦解。综上所述，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为110：100：45时，核酸水凝胶对毒素的响应最佳，响应时间为15min。
100：45时，15min后实验组上清310nm处吸光值较大，说明水凝胶瓦解充分；然而，对照组在静置15min后上清310nm吸光值随时间的增加而明显增大了，说明当linker浓度为40μM时，水凝胶不稳定，即使在无靶标存在时，自身也会瓦解。综上所述，当髙分子互补链A、髙分子互补链B、交联剂三者的物质的量之比为110：100：45时，核酸水凝胶对毒素的响应最佳，响应时间为15min。
[0074] 碘化钾浓度的优化
[0075] 优化了5个浓度，分别为0.08M、0.09M、0.10M、0.11M、0.12M，如图8所示，当碘化钾浓度在0.08M-0.10M时，其峰位移逐渐增加，当碘化钾浓度在0.10M时，其峰位移达到最大值，故最佳浓度为0.10M。
[0076] 过氧化氢浓度的优化
[0077] 优化了5个浓度，分别为0.065M、0.070M、0.075M、0.080M、0.085M，如图9所示，当过氧化氢浓度在0.065M-0.075M时，其峰位移逐渐增加，当过氧化氢浓度在0.075M时，其峰位移达到最大值，故最佳浓度为0.075M。
[0078] 标准曲线的建立
[0079] 在上述水凝胶中加入10μL不同浓度的T-2毒素标准样品，室温下静置15min后，移出上清液于2mL 0.05mg/mL金纳米棒，5mL 0.10M碘化钾，20mL 0.075M过氧化氢中，室温下静置3min后，进行紫外光谱扫描。其中图10为未瓦解水凝胶TEM图，图11为完全瓦解水凝胶TEM图。
[0080] 在以上实验条件的情况下，使用一系列稀释浓度的T-2毒素标准样品绘制标准曲线。如图12所示，峰位移随着T-2毒素浓度的增加而增大，该趋势可以做如下解释：当不同浓度的T-2毒素加入水凝胶中时，水凝胶中的交联剂会与毒素特异性结合，使水凝胶破裂，变为溶液，释放出水凝胶中包埋的辣根过氧化物酶，释放辣根过氧化物酶的量与毒素含量成正比。将水凝胶体系中的液体移入金纳米棒中，辣根过氧化物酶催化过氧化氢和碘化钾反应生成碘单质刻蚀金纳米棒，使金纳米棒呈现不同的颜色，并在紫外分光光度计下呈现不同位置的吸收峰，金纳米棒的峰位移与T-2毒素浓度成正比。如图13所示，以T-2毒素浓度为横坐标，金纳米棒的峰位移为纵坐标，得到的标准曲线为Y＝32.3129lgX+54.0285，R2＝0.9991，T-2毒素浓度在0.01ng/mL～10000ng/mL呈良好的线性关系，最低检出限为0.87pg mL-1。
[0081] 检测方法的稳定性
[0082] 为了评价本发明方法的稳定性，分别取制作30天、20天、10天、1天的水凝胶，加入高中低不同浓度的T-2毒素标准样品。如图14所示，不同储存时间的水凝胶检测时得到的峰位移差别不大。说明本方法制得的水凝胶稳定性良好。
[0083] 检测方法的特异性
[0084] 为了评价本发明方法的特异性，选取了和T-2毒素都属于真菌毒素的干扰物赭曲霉毒素(OTA)、伏马镰刀毒素(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)，从理论上讲，该方法的特异性主要取决于T-2毒素和T-2毒素适体的特异性结合，如果T-2毒素适体和其它真菌毒素结合，则会产生假阳性信号。如图15所示，加入10ng/mL不同毒素后，T-2毒素的峰位移最为明显。说明本方法制得的水凝胶特异性良好。
[0085] 实际样品的检测
[0086] 采用加标回收实验。选取玉米、大豆、咖啡作为实际样品。称取1-1.5g玉米粉、大豆粉、咖啡粉加入到5mL离心管中，之后加入2-3mL浓度为100ng/mL的T-2毒素溶液(用甲醇：PBS＝7:3稀释)，涡旋震荡5-7min后10000rpm/min离心15-20min，取上清液，0.45μm过滤膜进行过滤，然后稀释为50ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL(用甲醇：PBS＝7:3稀释)进行加标回收实验。在检测范围内设置高中低不同浓度(50ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL)，每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，如图16所示，本发明的加标回收率在93.72％～103.07％，其中相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)在3.87％～7.07％之间。说明本发明方法准确可靠。
[0087] 应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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