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一种乳酸检测 试剂及其检测方法

阅读：275发布：2023-12-11

专利汇可以提供一种乳酸检测试剂及其检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种乳酸检测试剂及其检测方法，检测试剂，包括：LOD，HRP，ABTS，缓冲液；乳酸检测反应体系配置范围为：ABTS溶液：LOD溶液:HRP溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；检测方法使用430nm 光谱读取吸光度值，利用酶标仪读取吸光度值，再作出标准曲线，即可利用标曲算出样品中乳酸含量；本发明用少量样品即可快捷、准确、大量地完成乳酸含量检测，同时实现降低单位样品检测的成本。，下面是一种乳酸检测试剂及其检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种乳酸检测试剂，其特征在于，包括：乳酸氧化酶，辣根过氧化物酶，2'-联氨-双-
3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，缓冲液；
乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；
所述2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液由2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-
6-磺酸用缓冲液稀释得到；
所述乳酸氧化酶溶液由乳酸氧化酶溶解于缓冲液中得到；
所述辣根过氧化物酶溶液由辣根过氧化物酶溶解于缓冲液中得到。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸检测试剂，其特征在于，所述乳酸检测反应体系配置为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液：辣根过氧化物酶溶液＝
5：2：2。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸检测试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度包括：10mg/L、25mg/L、50mg/L；
辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度包括：5mg/L、7mg/L、9mg/L；
2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度包括：0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml。
4.根据权利要求3所述的一种乳酸检测试剂，其特征在于，所述乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为10mg/L；辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为7mg/L；
2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为1mg/ml。
5.根据权利要求3所述的一种乳酸检测试剂，其特征在于，所述乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为10mg/L；辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为7mg/L；
2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为0.5mg/ml。
6.根据权利要求3所述的一种乳酸检测试剂，其特征在于，所述乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为50mg/L；辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为5mg/L；
2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为0.5mg/ml。
7.一种乳酸检测方法，其特征在于，包括如下内容：
在稀释板中加缓冲液，和样品或标准品，将样品或标准品稀释一百倍；
根据需要检测样品的个数，配制适量体积的乳酸检测反应液；
所述乳酸反应液包括：乳酸氧化酶，辣根过氧化物酶，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-
6-磺酸，缓冲液；
乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；
在检测板中加反应液，再在含有反应液的孔中加入被稀释后的样品及标准品，再稀释
10倍；
将含有样品或标准品的反应液避光放置15-20分钟，在酶标仪上用吸光波长为430nm检测样品乳酸浓度，作出标准曲线，计算样品乳酸含量。
8.根据权利要求7所述的一种乳酸检测方法，其特征在于，包括如下内容：
在稀释板中加90ul缓冲液，加入10ul样品或标准品，混匀，稀释10倍；
在稀释板中加90ul缓冲液，加入10ul稀释10倍后的样品或标准品，混匀，稀释100倍；
根据需要检测样品的个数，配制适量体积的乳酸检测反应液；
所述乳酸反应液包括：乳酸氧化酶，辣根过氧化物酶，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-
6-磺酸，缓冲液；
乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；
在检测板中加90ul反应液，再在含有反应液的孔中加入10ul被稀释后的样品及标准品，再稀释10倍；
将含有样品或标准品的反应液避光放置15-20分钟，在酶标仪上用吸光波长为430nm检测样品乳酸浓度，作出标准曲线，计算样品乳酸含量。
9.根据权利要求7或8所述的一种乳酸检测方法，其特征在于，所述稀释板为96孔稀释板，检测板为96孔检测板。
10.根据权利要求7或8所述的一种乳酸检测方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

说明书全文

一种乳酸检测试剂及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化学检测领域，特别是一种乳酸检测试剂及其检测方法。

背景技术

[0002] 乳酸，一种有机酸，分子式C3H6O3。在细胞培养过程中，乳酸主要来源于代谢过程中葡萄糖的不完全氧化，当氧化不足时，过量的NADH积聚，即启动了糖酵解途径，乳酸随之产生，乳酸的累积，会使培养体系PH降低，细胞内酶活性受到影响从而限制细胞正常生长代谢，导致细胞酸化甚至死亡。此外，为调节pH而添加的碱液及高浓度的乳酸本身会导致体系渗透压的增加，进而影响到细胞生长与蛋白产量、质量。在细胞培养过程中，细胞液乳酸的监测及及时调控是维持细胞存活的关键因素，实现对乳酸代谢浓度的直接、非接触及实时监测对细胞培养而言具有重要意义。

[0003] 目前细胞发酵液中乳酸含量主要由全自动生化分析仪或紫外分光光度法检测，检测原理主要基于乳酸氧化酶法、乳酸脱氢酶法、固定酶电极技术等。仪器检测虽然自动化程度高，较为方便快捷，但受限于仪器通量，难以同时完成大批量样品检测，且易受试样中众多共存组分的干扰。此外，利用生化分析仪检测Lactate受仪器限制，需要配套的试剂、标定物及质控物，单位样品成本较高。紫外法虽然成本相对较低，但需要样品量相对较多，不利于小体积细胞培养使用。现有技术的检测成本较高，需求样品量大，不能同时完成大批量样品检测，使用受仪器、耗材、资源等限制；市场需要一种能够用少量样品即可快捷，准确，大量的完成乳酸含量检测的检测试剂，本发明解决这样的问题。

发明内容

[0004] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乳酸检测试剂及其检测方法，能够在细胞培养过程中用少量样品即可快捷、准确、大量地完成乳酸含量检测，同时实现降低单位样品检测的成本。

[0005] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

[0006] 一种乳酸检测试剂，包括：乳酸氧化酶，辣根过氧化物酶，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，缓冲液；

[0007] 乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；

[0008] 2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液由2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸用缓冲液稀释得到；

[0009] 乳酸氧化酶溶液由乳酸氧化酶溶解于缓冲液中得到；

[0010] 辣根过氧化物酶溶液由辣根过氧化物酶溶解于缓冲液中得到。

[0011] 前述的一种乳酸检测试剂，乳酸检测反应体系配置为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液：辣根过氧化物酶溶液＝5：2：2。

[0012] 前述的一种乳酸检测试剂，缓冲液为磷酸盐缓冲液；

[0013] 乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度包括：10mg/L、25mg/L、50mg/L；

[0014] 辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度包括：5mg/L、7mg/L、9mg/L；

[0015] 2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度包括：0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml。

[0016] 前述的一种乳酸检测试剂，乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为10mg/L；辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为7mg/L；2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为1mg/ml。

[0017] 前述的一种乳酸检测试剂，乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为10mg/L；辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为7mg/L；2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为0.5mg/ml。

[0018] 前述的一种乳酸检测试剂，乳酸氧化酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为50mg/L；辣根过氧化物酶溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为5mg/L；2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶解于磷酸盐缓冲液中的终浓度为0.5mg/ml。

[0019] 一种乳酸检测方法，包括如下内容：

[0020] 在稀释板中加缓冲液，和样品或标准品，将样品或标准品稀释一百倍；

[0021] 根据需要检测样品的个数，配制适量体积的乳酸检测反应液；

[0022] 乳酸反应液包括：乳酸氧化酶，辣根过氧化物酶，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，缓冲液；

[0023] 乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；

[0024] 在检测板中加反应液，再在含有反应液的孔中加入被稀释后的样品及标准品，再稀释10倍；

[0025] 将含有样品或标准品的反应液避光放置15-20分钟，在酶标仪上用吸光波长为430nm检测样品乳酸浓度，作出标准曲线，计算样品乳酸含量。

[0026] 前述的一种乳酸检测方法，包括如下内容：

[0027] 在稀释板中加90ul缓冲液，加入10ul样品或标准品，混匀，稀释10倍；

[0028] 在稀释板中加90ul缓冲液，加入10ul稀释10倍后的样品或标准品，混匀，稀释100倍；

[0029] 根据需要检测样品的个数，配制适量体积的乳酸检测反应液；

[0030] 乳酸反应液包括：乳酸氧化酶，辣根过氧化物酶，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，缓冲液；

[0031] 乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5；

[0032] 在检测板中加90ul反应液，再在含有反应液的孔中加入10ul被稀释后的样品及标准品，再稀释10倍；

[0033] 将含有样品或标准品的反应液避光放置15-20分钟，在酶标仪上用吸光波长为430nm检测样品乳酸浓度，作出标准曲线，计算样品乳酸含量。

[0034] 前述的一种乳酸检测方法，稀释板为96孔稀释板，检测板为96孔检测板。

[0035] 前述的一种乳酸检测方法，缓冲液为磷酸盐缓冲液。

[0036] 本发明的有益之处在于：

[0037] 本方法利用乳酸氧化酶与辣根过氧化物酶在有氧条件下能专一性地催L-乳酸生成丙酮酸和过氧化氢，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)在过氧化氢的作用下转变为可溶性绿色阳离子根，可使用430nm光谱读取吸光度值，这样的检测方法需要细胞液样品量仅为10微升，无需进行离心等前处理工作；检测线性范围为0.5-4g/L，满足细胞培养检测需要；标曲拟合线性方程相关系数高，测定准确，操作简便，最多可同时检测89个样品；测定用酶标仪即可完成，原料简单易得，单位检测成本低廉；

[0038] 本发明经过对Cedex Bio和摸索实验中每个实验组的成本价、检测时间、检测可靠性、检测通量等各方面对比，筛选得到最优乳酸检测反应体系配置。附图说明

[0039] 图1是本发明实验一得到的标准曲线图。

具体实施方式

[0040] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

[0041] 检测原理：乳酸氧化酶(LOD)与辣根过氧化物酶(HRP)在有氧条件下能专一性地催化L-乳酸生成丙酮酸和过氧化氢，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)在过氧化氢的作用下转变为可溶性绿色阳离子根，可使用430nm光谱读取吸光度值。样品中乳酸含量越高，还原后生成的过氧化氢越多，颜色反应越明显，通过设置不同浓度的L-乳酸标准品与样品同时在透明96孔检测板中进行反应，反应15-20分钟后利用酶标仪读取吸光度值，作出标准曲线后即可利用标曲算出样品中乳酸含量。

[0042] 一种利用LOD、HRP氧化乳酸与ABTS显色反应测定样品中乳酸含量的方法，具体操作步骤如下：

[0043] 1.1实验用试剂配制：

[0044] ①LOD:溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度包括：10mg/L、25mg/L、50mg/L，2-8度保存；

[0045] ②HRP:溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度包括：5mg/L、7mg/L、9mg/L，终浓度为20mg/L,2-8度保存；

[0046] ③ABTS:用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，终浓度包括：0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml，2-8度保存；

[0047] ④标准品：用L-乳酸配制浓度为4.0g/L,3.0g/L,2.5g/L,2.0g/L,1.5g/L,1.0g/L和0.5g/L；

[0048] ⑤乳酸检测反应体系配置：ABTS：LOD:HRP＝2.5-5：1.4-2.6：2-5。

[0049] 1.2乳酸检测具体步骤：

[0050] ①在96孔稀释板中加90ul PBS，加入10ul样品或标准品，混匀，稀释10倍；

[0051] ②在96孔稀释板中加90ul PBS，加入10ul稀释10倍的样品或标准品，混匀，稀释100倍；

[0052] ③根据需要检测样品的个数，配制适量体积的乳酸检测反应液；

[0053] ④在96孔检测板中每孔加入90ul反应液，再在含有反应液的孔中加入10ul的样品及标准品；

[0054] ⑤将含有样品或标准品的反应液避光放置15-20分钟，在酶标仪上用吸光波长为430nm检测样品乳酸浓度，作出标准曲线，计算样品乳酸含量。

[0055] △实验一，实验验证本发明试剂和方法的精密度和准确度；

[0056] 一、验证标准

[0057] 精密度

[0058] 以3个待测样品，每个样品重复检测6次的相对标准偏差评估精密度，相对标准偏差值应在15％以内。

[0059] 准确度

[0060] 1、以低、中、高质控样品回收率评估准确度高、低质控样品回收率应在80-120％，中质控样品回收率应在85-115％，质控样品相对标准偏差应在10％以内。

[0061] 2、以低、中、高加样点回收率评估准确度高、低加样点回收率应在80-120％，中加样点回收率应在85-115％，质控样品相对标准偏差应在10％以内。

[0062] 二、标准曲线样品制备

[0063] 4g/L标准曲线样品：

[0064] 用1000μL移液枪吸取2mL 6g/L标准品储备液至15mLEP管中，并用该移液枪向其中加入1mL超纯水。混匀后，制成4g/L标准曲线样品。

[0065] 3g/L标准曲线样品：

[0066] 用1000μL移液枪吸取1.5mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中加入1.5mL超纯水。混匀后，制成3g/L标准曲线样品。

[0067] 2.5g/L标准曲线样品：

[0068] 用1000μL移液枪吸取1.25mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中加入1.75mL超纯水。混匀后，制成2.5g/L标准曲线样品。

[0069] 2g/L标准曲线样品：

[0070] 用1000μL移液枪吸取1mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中加入2mL超纯水。混匀后，制成2g/L标准曲线样品。

[0071] 1.5g/L标准曲线样品：

[0072] 用1000μL移液枪吸取0.75mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中加入2.25mL超纯水。混匀后，制成1.5g/L标准曲线样品。

[0073] 1g/L标准曲线样品：

[0074] 用1000μL移液枪吸取0.5mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中加入2.5mL超纯水。混匀后，制成1g/L标准曲线样品。

[0075] 0.5g/L标准曲线样品：

[0076] 用1000μL移液枪吸取0.25mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中2.75mL超纯水。混匀后，制成0.5g/L标准曲线样品。

[0077] 标准曲线样品制备好后于4℃冰箱保存备用。

[0078] 三、高、中、低质控点样品制备

[0079] 高质控点样品制备——3.2g/L乳酸标准品：

[0080] 用1000μL移液枪吸取1.6mL 6g/L标准品储备液至15mL EP管中，并用该移液枪向其中1.4mL超纯水。混匀后，制成3.2g/L高质控点样品。

[0081] 中质控点样品制备——1.6g/L乳酸标准品：

[0082] 用1000μL移液枪吸取0.8mL 6g/L高质控点样品至15mL EP管中，并用该移液枪向其中2.2mL超纯水。混匀后，制成1.6g/L中质控点样品。

[0083] 低质控点样品制备——1g/L乳酸标准品：

[0084] 制备过程参见二、标准曲线样品制备，制成1g/L低质控点样品。

[0085] 高、中、低质控点样品制备好后于4℃冰箱保存备用。

[0086] 四、高、中、低加样点样品&标准品制备

[0087] 高加样点样品&标准品：

[0088] 高加样点标准品——4g/L(取4g/L标准品储备液即可)

[0089] 从4℃冰箱中取出高质控点样品，与高加样点标准品1:1混合，摇匀后于4℃冰箱保存备用。

[0090] 中加样点样品&标准品：

[0091] 中加样点标准品——2g/L(取2g/L标准曲线样品储备液即可)

[0092] 从4℃冰箱中取出中质控点样品，与中加样点标准品1:1混合，摇匀后于4℃冰箱保存备用。

[0093] 低加样点样品&标准品：

[0094] 低加样点标准品——0.5g/L(取0.5g/L标准曲线样品储备液即可)；

[0095] 从4℃冰箱中取出低质控点样品，与低加样点标准品1:1混合，摇匀后于4℃。冰箱保存备用。

[0096] 五、尖孔板稀释

[0097] 1、将上述制备好的标准曲线样品；高、中、低质控点样品；高、中、低加样点样品&标准品；待测样品，各取10μL至尖孔板中，并向其中加入90μL磷酸盐缓冲液稀释10倍，混匀，[0098] 2、吸取10ul步骤1中混匀后的样品至尖孔板中，并向其中加入90ul磷酸盐缓冲液稀释10倍，混匀后静置，待后续使用。

[0099] 六、96孔板反应

[0100] 取尖孔板中稀释100倍后的各溶液10μL，加至96孔板中后，向各个加样孔加入90μL反

[0101] 应液，混匀后避光静置15-20min，待后续检测使用。

[0102] 反应液：ABTS(过氧化物酶底物)溶液：2.5-5/9；

[0103] HRP(辣根过氧化物酶)溶液：1.4-2.6/9；

[0104] LOD(乳酸氧化酶)溶液：2-5/9；

[0105] 七、酶标仪检测：

[0106] 待96孔板避光反应结束后，放入酶标仪中，震荡20-30次，于430nm波长进行检测。

[0107] 八、实验结果：

[0108] 1.精密度实验如下表1所示：

[0109]

[0110]

[0111] 表1

[0112] 结果分析：待测样品相对标准偏差在15％范围内。

[0113] 2.准确度实验

[0114] 质控点数据如图表2所示：

[0115]

[0116] 表2

[0117] 加样点数据如表3所示：

[0118]

[0119]

[0120] 表3

[0121] 质控点和加样点经检测值计算的回收率均在90-110％范围内，且相对标准偏差均在10％范围内(高加样点相对标准偏差最大接受范围在10％-15％)。

[0122] 结果分析：

[0123] 高浓度待测样品、中浓度待测样品、低浓度待测样品乳酸含量分别为4g/L、2g/L、0.5g/L，相对标准偏差满足要求。

[0124] 质控点&加样点经检测值计算的回收率&相对标准偏差均满足要求。

[0125] 由以上实验结果可知，该方法能准确检测样品乳酸含量，精密度&准确度均满足要求。

[0126] △实验二，验证本发明的试剂和检测方法是否符合线性要求。

[0127] 检测得到的原始数据：

[0128] 96孔板检测位置图如表4所示：

[0129]

[0130] 表4

[0131] 检测温度：25.3℃

[0132] 吸光度：Lm1 430nm

[0133] 检测时间12:55 2019/5/15

[0134] 标准曲线原始数据如表5所示：

[0135]样品浓度(g/L) 检测值(g/L)
1 0.5 0.506
2 1.0 0.968
3 1.5 1.471
4 2.0 1.845
5 2.5 2.616
6 3.0 2.914
7 4.0 3.975

[0136] 表5

[0137] 样品检测原始数据如表6所示：

[0138]

[0139]

[0140] 表6

[0141] 根据原始数据绘制如图1的回归线性方程：Log(y)＝-0.829+0.448+Log(x)；R2＝1.000；

[0142] 结果分析：由此可知本发明的检测试剂和检测方法得到的结果符合线性要求。

[0143] 实验三：优化成分浓度实验：

[0144] 工作液中各成分浓度及与样品反应时间摸索实验设计思路：

[0145] ①将LOD终浓度设置3个梯度，分别为：10mg/L、25mg/L、50mg/L；

[0146] ②将HRP终浓度设置3个梯度，分别为：5mg/L、7mg/L、9mg/L；

[0147] ③将ABTS终浓度设置为3个梯度，分别为：0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml；

[0148] ④与样品混合后反应时间设置为5min、10min、15min、20min、30min。

[0149] 根据以上实验设计思路，将工作液内含有的3种试剂根据不同终浓度制定实验方案，共得到27组实验组，如下表7所示：

[0150]

[0151]

[0152] 表7

[0153] 1.2实验用剂配制：

[0154] ①LOD：称取1mg LOD试剂粉末溶解于10ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为100mg/L，2-8度保存备用；

[0155] ②HRP：称取1mg HRP试剂粉末溶解于10ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为100mg/L，2-8度保存备用；

[0156] ③ABTS：称取50mg ABTS试剂粉末溶解于10ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为1mg/ml，2-8度保存备用；

[0157] ④称取0.3g乳酸锂试剂粉末溶解于50ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为6g/L，2-8度保存备用；

[0158] 1.3乳酸样品的配制：

[0159] ①4g/L样品：取300ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入150ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0160] ②3g/L样品：取350ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入350ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0161] ③2.5g/L样品：取300ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入420ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0162] ④2.0g/L样品：取240ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入480ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0163] ⑤1.5g/L样品：取120ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入360ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0164] ⑥1.0g/L样品：取60ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入300ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0165] ⑦0.5g/L样品：取30ul 6g/L乳酸锂标准品于1.5ml EP管中，加入330ul PBS后混匀，2-8度保存备用；

[0166] 1.4.Cedex Bio标准曲线校准及质量控制：

[0167] ①标准曲线校准：实验开始前对Cedex Bio乳酸检测项目进行标准曲线校准，详细操作步骤根据Cedex Bio操作说明书进行；

[0168] ②质量控制：用Cedex Bio乳酸检测项目的商业质控品进行质量控制，该质控品分为A质控品与B质控品，说明书中明确说明A质控品乳酸浓度为27.0mg/L，B质控品乳酸浓度为490.5mg/L。详细质量控制操作步骤根据Cedex Bio操作说明书进行，经Cedex Bio检测A质控品实际乳酸浓度值为28.42mg/L，B质控品实际乳酸浓度值为478.39mg/L，回收率均在90％-110％，因此确定Cedex Bio实际检测结果可靠性高。

[0169] ③取备用的4g/L、3g/L、2.5g/L、2g/L、1.5g/L、1g/L、0.5g/L样品于Cedex Bio进行乳酸检测，7个样品Cedex Bio检测完成需要18～20分钟，平均每个样品需要2.5～2.8min，得到检测结果为如表8：

[0170]

[0171]

[0172] 表8

[0173] 1.5实验详细操作步骤：

[0174] 取备用的浓度为100mg/L LOD、100mg/L HRP、1mg/ml ABTS溶液，96孔板中每孔反应总体系为100ul，其中包括10ul样品和90ul反应工作液，根据实验方案表1，每孔中需加入的对应的各溶液体积如下表9所示：

[0175]

[0176]

[0177] 表9

[0178] ①取4g/L、3g/L、2.5g/L、2g/L、1.5g/L、1g/L、0.5g/L为一组样品，96孔稀释板中加入90ul PBS，加入10ul样品，混匀；

[0179] ②在96孔稀释板中加90ul PBS，加入10ul①中的样品，混匀；

[0180] ③在96孔检测板中加入表2中对应体积的各溶液，再在含有反应液的孔中加入10ul②中的样品；

[0181] ④将含有样品的反应液避光放置5-30分钟，分别在反应后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟时在酶标仪上用吸光波长为430nm检测样品乳酸浓度，作出标准曲线，计算样品乳酸含量。

[0182] 1.6检测结果

[0183] ①与样品反应5分钟后酶标仪检测原始数据

[0184] 检测板P1：96孔板检测位置图，原始数据如表10所示：

[0185]

[0186]

[0187] 表10

[0188] 检测板P2：96孔板检测位置图，原始数据如表11所示：

[0189]

[0190] 表11

[0191] 检测板P3：96孔板检测位置图，原始数据如表12所示：

[0192]

[0193]

[0194] 表12

[0195] ②与样品反应10分钟后酶标仪检测原始数据

[0196] 检测板P1：96孔板检测位置图，原始数据如表13所示：

[0197]

[0198] 表13

[0199] 检测板P2：96孔板检测位置图，原始数据如表14所示：

[0200]

[0201]

[0202] 表14

[0203] 检测板P3：96孔板检测位置图,原始数据如表15所示：

[0204]

[0205] 表15

[0206] ③与样品反应15分钟后酶标仪检测原始数据；

[0207] 检测板P1：96孔板检测位置图，数据如表16所示：

[0208]

[0209]

[0210] 表16

[0211] 检测板P2：96孔板检测位置图，数据如表17所示：

[0212]

[0213] 表17

[0214] 检测板P3：96孔板检测位置图，数据如表18所示：

[0215]

[0216]

[0217] 表18

[0218] ④与样品反应20分钟后酶标仪检测原始数据；

[0219] 检测板P1：96孔板检测位置图，数据如表19；

[0220]

[0221] 表19

[0222] 检测板P2：96孔板检测位置图，如表20所示：

[0223]

[0224]

[0225] 表20

[0226] 检测板P3：96孔板检测位置图，原始数据如表21所示：

[0227]

[0228] 表21

[0229] ⑤与样品反应30分钟后酶标仪检测原始数据

[0230] 检测板P1：96孔板检测位置图，如表22所示：

[0231]

[0232]

[0233] 表22

[0234] 检测板P2：96孔板检测位置图如表23所示：

[0235]

[0236] 表23

[0237] 检测板P3：96孔板检测位置图如表24所示：

[0238]

[0239]

[0240] 表24

[0241] ⑥不同实验组在不同反应时间后检测到的对应的R2值，如表25所示：

[0242]

[0243]

[0244] 表25

[0245] 根据以上实验结果，实验组1、实验组9、实验组16、实验组23、实验组24、实验组26、实验组27均不能在设定的实验条件内达到R2＞0.990，其它实验组均能在设定的实验条件2
下达到R＞0.990。

[0246] 结果分析：实验2、实验5、实验19的结果都较好，实验2、实验19虽然结果好，但是成本贵，经过对Cedex Bio和以上摸索实验中每个实验组的成本价、检测时间、检测可靠性、检测通量等各方面对比，决定采用利用LOD、HRP氧化乳酸与ABTS显色反应测定样品中乳酸含量的方法为基础，采用摸索实验中的实验组5的实验方案为最终检测方法，因为实验组5的实验方案能在设定的实验条件下达到实验要求，且所需要的成本价更低、同时检测的样品通量为89个样品，所以采用以上摸索实验中的实验组5为最终的实验方案；乳酸检测反应体系的最优配置为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液：辣根过氧化物酶溶液＝5：2：2。

[0247]

[0248] 为提高该检测方法的可操作性，需对检测反应液各试剂的初始浓度作出调整但检测反应液各试剂的终浓度不变。将LOD、HRP、ABTS的初始浓度分别由100mg/L、100mg/L、5mg/L调整为50mg/L、35mg/L、2mg/L。各实验组终浓度依然如表7。

[0249] 根据以上摸索实验结果，即根据在设定的实验条件下达到R2＞0.990的实验组的实验数据，得到结论：

[0250] (1)当LOD初始浓度为50mg/L时，在每100ul的反应体系中，LOD终浓度在10mg/L-25mg/L时，即LOD占反应液总体积比例的20％-50％时，试剂占比合理且得到的实验结果符合要求。

[0251] (2)当HRP初始浓度为35mg/L时，在每100ul的反应体系中，HRP终浓度在5mg/L-9mg/L时，即HRP占反应液总体积比例的14％-26％时，试剂占比合理且得到的实验结果符合要求。

[0252] (3)当ABTS初始浓度为2mg/L时，在每100ul的反应体系中，ABTS终浓度在0.5mg/L-1mg/L时，即ABTS占反应液总体积比例的25％-50％时，试剂占比合理且得到的实验结果符合要求。

[0253] 由此可知：乳酸检测反应体系配置范围为：2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸溶液：乳酸氧化酶溶液:辣根过氧化物酶溶液＝2.5-5：1.4-2.6：2-5。

[0254] 本发明利用乳酸氧化酶与辣根过氧化物酶在有氧条件下能专一性地催L-乳酸生成丙酮酸和过氧化氢，2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)在过氧化氢的作用下转变为可溶性绿色阳离子根，可使用430nm光谱读取吸光度值，这样的检测方法需要细胞液样品量仅为10微升，无需进行离心等前处理工作；检测线性范围为0.5-4g/L，满足细胞培养检测需要；标曲拟合线性方程相关系数高，测定准确，操作简便，最多可同时检测89个样品；测定用酶标仪即可完成，原料简单易得，单位检测成本低廉；再经过对Cedex Bio和摸索实验中每个实验组的成本价、检测时间、检测可靠性、检测通量等各方面对比，筛选得到最优乳酸检测反应体系配置。

[0255] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

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