一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法
阅读：402发布：2023-12-12
专利汇可以提供一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种培养基及其应用和诱导肌 腱 干细胞向骨细胞分化的方法。本发明将FBS、维生素C、地塞米松、β-甘油 磷酸 钠和BMP-2添加入 基础 培养基，作为肌腱干细胞成骨分化的诱导培养液。提高了肌腱干细胞向骨细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导肌腱干细胞，能够在21内即出现骨细胞的特性，细胞形态发生改变且茜素红 染色 细胞数目增多。诱导28天后，细胞形态逐渐改变，呈多 角 形，细胞间质内含有矿盐沉积的 钙 化结节，茜素红染色呈阳性。，下面是一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法专利的具体信息内容。
1.一种培养基，其特征在于，由基础培养基、FBS、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠和BMP-2组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述BMP-2的浓度为100ng/mL～900ng/mL。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述维生素C的浓度为10mg/L；地塞米松的浓度为100nmol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为20mmol/L。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述FBS的体积分数为10％。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为L-DMEM培养液。
6.权利要求1～5任一项所述的培养基在诱导肌腱干细胞向骨细胞分化中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肌腱干细胞为人跟腱来源肌腱干细胞。
8.一种诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法，其特征在于，以权利要求1～5任一项所述的培养基诱导肌腱干细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肌腱干细胞为第3代肌腱干细胞；诱导密度为5.0×103cells/cm2。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导每3天更换培养基；所述诱导的时间为4周。
一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法。
背景技术
[0002] 肌腱病在高运动量的人群中常见，以局部疼痛、肿胀、功能障碍为临床特征，常见发病部位为肩袖、岗上肌、髌腱及跟腱。目前肌腱病的发病机制尚未完全研究清楚，对肌腱病的治疗方法有限，疗效不明确，这与对该病病理机制缺乏深入了解有关。
[0003] 2007年美国学者从人和兔的肌腱中分离出一种具有自我更新能力的细胞，将其命名为肌腱干细胞或祖细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)。2010年香港学者从鼠肌腱中也分离出肌腱干细胞。该细胞具有多向分化潜能，并且在外源性前列腺素E2作用下异常分化。
[0004] 目前，有学者提出肌腱干细胞的异常分化可能是肌腱病的发病基础，但目前对肌腱干细胞的分化机制尚未研究清楚。为了了解慢性腱病组织病理学变化提供细胞生物学依据，也为慢性腱病的临床治疗提供新思路，应当进一步研究肌腱干细胞的分化机制，开发肌腱干细胞向骨细胞分化的方法。
发明内容
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法，本发明提供的培养基能够促进肌腱干细胞向骨细胞分化，其分化周期短，分化效率高。
[0006] 本发明提供的培养基包括基础培养基、FBS、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠和BMP-2。
[0007] 骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损修复。本发明实施例中，BMP-2的浓度为100ng/mL～900ng/mL。本发明实施例中，BMP-2的浓度为
100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、700ng/mL或900ng/mL。
100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、700ng/mL或900ng/mL。
[0008] 维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠是目前干细胞成骨诱导或称软骨诱导液中常见组分，其中，地塞米松通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。β-甘油磷酸钠可以为成骨细胞提供磷酸离子，同时促进生理性钙盐的沉积和钙化，是骨髓基质干细胞产生矿化结节的必要条件。维生素C(抗坏血酸)在体外能增加钙盐的沉积，促进矿化结节的形成，并通过间充质细胞间接调节破骨细胞的分化。本发明实施例中，维生素C的浓度为10mg/L；地塞米松的浓度为100nmol/L；β-甘油磷酸钠的浓度为20mmol/L。
[0009] 胎牛血清(fetal calf serum，简称FBS)是血清中的一种，能够提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。本发明实施例中，FBS的体积分数为10％。
[0010] DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(低于4500mg/L)和低糖型(低于1000mg/L)。本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明实施例中，基础培养基为L-DMEM培养液。即低糖型DMEM培养液，其中葡萄糖的浓度为1000mg/L。
[0011] 一个具体实施例中，培养基包括：
[0012]
[0013] 一个具体实施例中，培养基包括：
[0014]
[0015]
[0016] 一个具体实施例中，培养基包括：
[0017]
[0018] 一个具体实施例中，培养基包括：
[0019]
[0020] 一个具体实施例中，培养基包括：
[0021]
[0022] 本发明提供的培养基在诱导肌腱干细胞向骨细胞分化中的应用。
[0023] 本发明中，肌腱干细胞为人跟腱来源肌腱干细胞。
[0024] 本发明还提供了一种诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法，以本发明提供的培养基诱导肌腱干细胞。
[0025] 本发明提供的方法中，肌腱干细胞为人跟腱来源肌腱干细胞，其分离培养方法包括：
[0026] 步骤1：将跟腱组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块，以浓度为3mg/mL的I型胶原酶37℃消化2h后，经70μm滤器过滤形成单细胞悬液；
[0027] 步骤2：将单细胞悬液以300×g离心5min，将细胞沉淀以500个/cm2细胞密度接种至完全培养基(含10v％FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基)培养10d后，经质量分数为0.25％胰蛋白酶消化后，标记为原代细胞，以完全培养基传代。
[0028] 本发明进行诱导的肌腱干细胞为第3代肌腱干细胞；诱导密度为5.0×103cells/cm2。
[0029] 本发明中诱导每3天更换培养基；所述诱导的时间为4周。
[0030] 本发明将FBS、维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠和BMP-2添加入基础培养基，作为肌腱干细胞成骨分化的诱导培养液。提高了肌腱干细胞向骨细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导肌腱干细胞，能够在21天内即出现骨细胞的特性，细胞形态发生改变且茜素红染色细胞数目增多。诱导28天后，细胞形态逐渐改变，呈多角形，细胞间质内含有矿盐沉积的钙化结节，茜素红染色呈阳性。附图说明
[0031] 图1示各组细胞的茜素红染色的情况。
具体实施方式
[0032] 本发明提供了一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向骨细胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0033] 本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0034] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0035] 实施例1
[0036] 无菌条件下取人跟腱组织，PBS冲洗3次，剪除表面部分结缔组织，分离跟腱组织。将跟腱剪成1mm×1mm×1mm的碎块，3mg/mLⅠ型胶原酶37℃消化2h，70μm滤器过滤形成单细胞悬液。将单细胞悬液以300×g离心5min，弃上清，将细胞沉淀在完全培养基(含10％FBS、
100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基)中重悬，以500个/cm2细胞密度接种至直径10cm培养皿中，培养10d，0.25％胰蛋白酶消化后混合，标记为原代细胞。细胞铺满瓶底达
90％后传代，弃培养液，无菌PBS清洗2次，0.25％胰蛋白酶消化3min，加入完全培养基终止
3
消化；细胞悬液以180g离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，计数细胞按5×10个/cm2细胞密度接种至细胞培养瓶。取第1～3代细胞用于后续实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。
100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的L-DMEM培养基)中重悬，以500个/cm2细胞密度接种至直径10cm培养皿中，培养10d，0.25％胰蛋白酶消化后混合，标记为原代细胞。细胞铺满瓶底达
90％后传代，弃培养液，无菌PBS清洗2次，0.25％胰蛋白酶消化3min，加入完全培养基终止
3
消化；细胞悬液以180g离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，计数细胞按5×10个/cm2细胞密度接种至细胞培养瓶。取第1～3代细胞用于后续实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。
[0037] 从跟腱组织消化获得的有核细胞以500个/cm2密度接种后，细胞呈克隆样生长。原代培养10d可见多个散在分布的簇状细胞集落，呈由中心向外辐射样贴壁生长，细胞形态不规则，以多角形为主，细胞核聚集于中心，细胞质形成的突起向外呈放射状。
[0038] 取第3代细胞，用无菌PBS洗涤2次，0.25％胰蛋白酶消化，室温下以350×g离心5min，将细胞沉淀重悬于染色缓冲液，4℃放置15min。每100微升细胞悬液分别依次加入藻红蛋白标记的CD44、CD90、CD34、CD105一抗，FITC标记的CD45一抗，CD146一抗；同时每管样品设立同型阴性对照，4℃孵育15min。用含2％牛血清白蛋白的预冷PBS洗涤细胞3次后，流式细胞仪检测。结果表明，hATDSCs的MSCs特异性表面标志CD44、CD90和CD105阳性率分别为
99.75％±0.21％、99.84％±0.12％和95.76％±0.64％；造血干细胞表面标志CD34、白细胞表面标志CD45以及内皮细胞表面标志CD146的阳性表达率分别为3.34％±0.36％、
4.72％±0.24％和4.37％±0.17％。
99.75％±0.21％、99.84％±0.12％和95.76％±0.64％；造血干细胞表面标志CD34、白细胞表面标志CD45以及内皮细胞表面标志CD146的阳性表达率分别为3.34％±0.36％、
4.72％±0.24％和4.37％±0.17％。
[0039] 实施例2
[0040] 1)、按照表1配制培养基：
[0041] 表1培养基配方
[0042]
[0043]
[0044] 2)、取第3代细胞，以5×104个/孔密度接种于6孔板，分为成骨诱导组和对照组。其中，成骨诱导组采用表1中组1～6的培养基，对照组采用完全培养基。成骨诱导组贴壁细胞生长融合后更换成骨诱导培养基2mL，对照组继续以完全培养基培养2mL培养。每3天更换培养基，至4周时行茜素红染色鉴定。
[0045] 3)、培养20天，组1～5的细胞形态逐渐改变，呈多角形，细胞间质内含有矿盐沉积的钙化结节，茜素红染色呈阳性；培养28天，组6细胞形态逐渐改变，呈多角形，细胞间质内含有矿盐沉积的钙化结节，茜素红染色呈阳性；完全培养基对照组为阴性。
[0046] 以成功被茜素红染色作为细胞分化成骨细胞的标准，统计成骨诱导的天数。并根据茜素红染色的情况统计矿化结节的面积，如表2、图1：
[0047] 表2诱导结果
[0048]分组 成骨诱导天数 矿化面积％
对照 ∞ 0
组1 26天 30％
组2 25天 35％
组3 20天 75％
组4 20天 80％
组5 20天 75％
组6 28天 15％
组7 21天 15％
对照 ∞ 0
组1 26天 30％
组2 25天 35％
组3 20天 75％
组4 20天 80％
组5 20天 75％
组6 28天 15％
组7 21天 15％
[0049] 结果显示，组1～7提供的培养基皆能够有效诱导细胞分化成为骨细胞，但相对于组6～7，组1～5的培养基能够缩短成骨诱导天数，增加矿化面积。而其中，组3～5的培养基相对于其他培养基能够更显著的缩短诱导天数并增加矿化面积，经分析，该效果具有统计学差异，p<0.05。
[0050] 4)、碱性磷酸酶活性(ALP)测定
[0051] 对各组MDSCs分别于诱导分化培养0d、7d、14d和21d对细胞进行碱性磷酸酶活性定量测定。具体测定方法为：
[0052] 弃原培养液，PBS洗3次，每孔加200μL 0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，镜下可见细胞裂解完全，吸出裂解液至新离心管，离心后取上清，留作备用。
[0053] 对上述裂解液进行蛋白含量测定，于96孔板中进行。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书要求设置测定孔、标准孔和空白孔，每组设3个复孔，每孔液体20μL，37℃孵育30min后检测562nmOD值，空白孔调零。根据标准孔OD值绘制蛋白浓度标准曲线，代入各孔OD值，算出各组的蛋白浓度。
[0054] 对上述裂解液进行碱性磷酸酶活性测定，于96孔板中进行。按碱性磷酸酶测定试剂盒说明书要求设置测定孔、标准孔和空白孔，37℃孵育15min，每组设3个复孔，每孔加150μL显色液，轻轻震荡孔板混匀。检测520nmOD值，空白孔调零。根据以下公式计算碱性磷酸酶活性：
[0055] 碱性磷酸酶活性(U/gprot)＝(测定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(标准孔吸光度-空白孔吸光度)×酚标准品浓度÷待测样本蛋白浓度(gprot/mL)。
[0056] 表3 ALP活性
[0057]天数-d 0d 7d 14d 21d
对照 10.5±2.1 562.2±56.6 988.6±103.5 1253.2±157.4
组3 10.4±2.0 994.3±135.2 1665.5±142.2 2756.3±136.2
组6 10.3±2.2 655.5±111.7 1224.5±155.4 1736.2±152.2
组7 10.1±1.8 481.3±88.5 985.5±140.2 1533.2±142.2
对照 10.5±2.1 562.2±56.6 988.6±103.5 1253.2±157.4
组3 10.4±2.0 994.3±135.2 1665.5±142.2 2756.3±136.2
组6 10.3±2.2 655.5±111.7 1224.5±155.4 1736.2±152.2
组7 10.1±1.8 481.3±88.5 985.5±140.2 1533.2±142.2
[0058] 结果显示，培养第7，14，21天相对于对照组，组3、6、7的ALP活性皆与对照组存在统计学差异；其中，组3的ALP活性最高，显著性的高于组6～7，p<0.05。
[0059] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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