一种Rhodol衍生物染料及其应用
阅读：930发布：2023-12-24
专利汇可以提供一种Rhodol衍生物染料及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种Rhodol衍 生物 染料和一种 光声成像 PA探针，尤其涉及Rhodol衍生物染料和一种光声成像PA探针的制备及其应用。本发明设计合成的新的Rhodol衍生物染料Rhodol-NIR，具有大摩尔 消光系数 ，优异光 稳定性 和理想量子产率的新型Rhodol-NIR发色团，在设计高 对比度 激活式PA探针时表现出优异的光物理性质。本发明设计合成的Rhodol-PA探针被证明在体外通过PA吸收和 荧光 测量显示对hNQO1的高灵敏度和高选择性检测。本发明是国内外第一次利用螺内酯开环转换策略开发高对比度可激活PA探针。本发明的 开关 策略是一种普遍适用的设计，可为开发高对比度可激活PA探针提供新平台。，下面是一种Rhodol衍生物染料及其应用专利的具体信息内容。
1.一种Rhodol衍生物染料，其特征在于，所述染料在620nm至700nm的NIR区域内产生吸收带。
2.一种Rhodol衍生物染料，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，R1取自H、F、Cl。
3.一种如权利要求2所述的染料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将环己酮、浓H2SO4、4-二乙氨基酮酸、高氯酸混合、过滤、水洗后得到9-(2-羧基苯基)-6-(二乙胺基)-1,
2,3,4-四氢氧烷基，然后和3,5-二氟-4-羟基苯甲醛或3,5-二氯-4-羟基苯甲醛或羟基苯甲醛反应，得到染料。
4.一种利用如权利要求1或2所述的染料的螺内酯闭环-开环调控设计合成光声成像PA探针的应用。
5.一种光声成像PA探针，其特征在于，其结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，R2选自二甲基亚甲基醌丙酸根、磷酸根，半乳糖基，三氟甲磺酸根，苯酚基。
6.根据权利要求5所述的光声成像PA探针，其特征在于，其结构式如式(Ⅲ)所示：
7.一种如权利要求5所述的光声成像PA探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法是将Rhodol衍生物染料与三甲基锁的醌丙酸、磷酸、半乳糖苷、三氟甲磺酸酯或对溴苯酚中的任一种反应制备。
8.一种如权利要求6所述的光声成像PA探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括合成三甲基锁的醌丙酸，将Rhodol衍生物染料与合成的三甲基锁的醌丙酸混合制备。
9.根据权利要求8所述的光声成像PA探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、三甲基锁的醌丙酸的合成：将3,3-二甲基丙烯酸酯、2,3,5-三甲基-1,4-苯二醇、甲磺酸混合后，萃取、洗涤、真空浓缩、重结晶，得到6-羟基-3,3,5,7,8–五甲基环内酯-2-酮，向化合物1溶液中加入N-溴代琥珀酰亚胺，搅拌，除去溶剂，萃取、真空浓缩、纯化后得到3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-基)丁酸。
B、PA探针的制备：将Rhodol衍生物染料、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-基)丁酸、4-二甲基氨基吡啶混合反应后，洗涤、真空浓缩、纯化，获得光声成像PA探针。
10.一种如权利要求5或7所述的光声成像PA探针在活细胞和动物的高对比度PA/NIRF双模成像中的应用。
一种Rhodol衍生物染料及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 光声(PA)成像是一种功能强大的生物医学成像方式，能够以高空间分辨率在深层组织对分子和细胞水平上对生物过程进行无创可视化。利用近红外(NIR)操作窗口，PA可提供几厘米的穿透深度，分辨率约为100μm。由于其优点，它为各种疾病的临床成像包括癌症的诊断、转移评估和治疗监测提供了一种有用的工具。
[0003] 分子探针在PA成像中是必不可少的，因为它们可以赋予分子或细胞特异性并增强成像对比度。 PA探针通常依赖于允许通过被动或主动靶向策略在疾病区域中选择性累积光子吸收剂的设计。激活式PA探针，其在与特定分子或细胞事件相互作用时可以产生增强的PA信号，是非常有应用前景的。这些探针具有低背景和高灵敏度的优点，有助于实现更高深度和空间分辨率的实时成像。目前激活式 PA探针是基于分子内电荷转移(ICT)和接触猝灭机制设计的。这两种机制已被充分证明用于激活式 PA探针并应用于探索了几种靶分子，如金属离子，活性氧，一氧化氮，厌氧和酶。然而，由于靶向分子诱导的吸收光谱移动或量子产率的变化都比较小，大多数的探针成像对比度都不高。然而，具有优异光物理性质的激活式PA探针，例如大的吸收光谱移动，强的近红外吸收，低量子产率和高光稳定性，最终提供高对比度PA信号的探针的合理设计仍然是难于实现的。
[0004] 常见的螺环蒽染料，Rhodol，因为它具有大的消光系数，理想的光稳定性和独特的分析物响应开环特性，羟基乙酰化后，形成螺内酯结构，处于闭环状态，常被用做激活式的荧光报告基团，但是它的最大吸收波长才550nm，最大荧光发射也才580nm，这限制了它的应用范围。且Rhodol只在可见光区域具有吸收带并且具有相对较大的量子产率，这不适合于体内PA成像，更加不适合PA/NIRF 双模成像。因此，设计一种具有近红外(NIR)吸收，较低量子产率和类似于Rhodol的螺内酯开环反应的Rhodol变体变得极为必要。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明目的之一是开发一种新型具有近红外(NIR)吸收、能够激活指示酶活性的高信倍比PA响应的染料。
[0006] 本发明的目的之二是利用新型染料其独特的螺内酯开环反应开发出一种新的高对比度激活式近红外PA探针，并确定它在hNQO1过度表达的肿瘤的PA/NIRF双模成像方面的应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
[0008] 一种Rhodol衍生物染料，其特征在于，所述染料在620nm至700nm的NIR区域内产生显著增强的吸收带。
[0009] 一种Rhodol衍生物染料，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
[0010]
[0011] 其中，R1取自H、F、Cl。
[0012] 所述的染料的制备方法，包括以下步骤：将环己酮、浓H2SO4、4-二乙氨基酮酸(1a)、高氯酸混合、过滤、水洗后得到9-(2-羧基苯基)-6-(二乙胺基)-1,2,3,4-四氢氧烷基(2a)，然后和3,5- 二氟-4-羟基苯甲醛或或3,5-二氯-4-羟基苯甲醛或羟基苯甲醛反应，得到染料。
[0013] 螺环蒽类染料，例如荧光素和Rhodol，具有π-共轭体系的“开环”形式和“闭合”螺内酯结构形式之间存在平衡。此外，与“闭合”的螺内酯结构相比，具有大的π-共轭体系的“开环”形式表现出大吸收光谱的红移和增强的吸收带。据我们所知，螺环蒽类染料的这种性质还没有用于激活式PA探针的设计。
[0014] 当其酚羟基通过酯化进行封闭时，发色团以螺内酯形式存在，由于共轭体系被打破而显示出可忽略不计的近红外吸收。分析物使得酚羟基部分释放出来同时具有“开环”反应，恢复其具有强NIR 吸收的共轭结构，并产生高对比度PA信号。
[0015] 为了利用螺内酯开环反应设计出激活式的PA探针，我们选择了一种常见的螺环蒽染料，Rhodol，因为它具有大的消光系数，理想的光稳定性和独特的分析物响应开环特性。然而，Rhodol只在可见光区域具有吸收带并且具有相对较大的量子产率，这不适合于体内PA成像。因此，我们开始设计一种具有NIR吸收，较低量子产率和类似于Rhodol的螺内酯开环反应的Rhodol变体。
[0016] 本发明通过将Rhodol核心的结构与二氟-4-羟基苯甲醛结构结合起来合成出新的Rhodol衍生物 (Rhodol-NIR)。这种新的Rhodol衍生物，不但具有大的π-共轭体系，而且氟离子能对酚羟基部分的质子化常数进行精细调节，在设计高对比度激活式PA探针时表现出优异的光物理性质。
[0017] 与现有Rhodol结构相比，我们通过偶联对羟基苯甲醛及衍生物，延长染料结构的共轭体系，使其具有近红外吸收和发射。
[0018] 本发明还提供了一种所述的染料的应用，利用所述染料其螺内酯闭环-开环调控实现光声成像PA 探针的设计。
[0019] 本发明还提供了一种光声成像PA探针，其结构式如式(Ⅱ)所示：
[0020]
[0022] 本发明还提供了一种光声成像PA探针的制备方法，所述制备方法包括将Rhodol衍生物染料与三甲基锁的醌丙酸、磷酸、半乳糖苷、三氟甲磺酸酯及对溴苯酚反应制备相应探针。
[0023] 所述Rhodol衍生物染料与三甲基锁的醌丙酸反应制备的探针可用于检测肿瘤细胞中过表达的生物标记酶氢醌还原酶；
[0024] 所述Rhodol衍生物染料与磷酸反应制备的探针可用于检测肿瘤细胞中过表达的生物标记酶碱性磷酸酯酶；
[0025] 所述Rhodol衍生物染料与半乳糖苷反应制备的探针可用于检测肿瘤细胞中过表达的生物标记酶半乳糖苷酶；
[0026] 所述Rhodol衍生物染料与三氟甲磺酸酯反应制备的探针可用于检测炎症中超氧阴离子；
[0027] 所述Rhodol衍生物染料与对溴苯酚反应制备的探针可用于检测炎症中羟基自由基。
[0028] 优选的，一种光声成像PA探针，其结构式如式(Ⅲ)所示：
[0029]
[0030] 所述的光声成像PA探针的制备方法，其特征在于，包括合成三甲基锁的醌丙酸，将Rhodol衍生物染料与合成的三甲基锁的醌丙酸混合后自组装。
[0031] 所述的光声成像PA探针的制备方法，包括以下步骤：
[0032] A、三甲基锁的醌丙酸的合成：将3,3-二甲基丙烯酸酯、2,3,5-三甲基-1,4-苯二醇、甲磺酸混合后，萃取、洗涤、真空浓缩、重结晶，得到6-羟基-3,3,5,7,8–五甲基环内酯-2-酮，向化合物1溶液中加入N-溴代琥珀酰亚胺，搅拌，除去溶剂，萃取、真空浓缩、纯化后得到3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6- 二氧环己-1,4-二烯-1-基)丁酸。
[0033] B、PA探针的制备：将Rhodol衍生物染料、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧环己-1,4-二烯-1-基)丁酸、4-二甲基氨基吡啶混合反应后，洗涤、真空浓缩、纯化，获得光声成像PA探针。
[0034] 本发明还提供了所述光声成像PA探针在活细胞和动物的高对比度PA/NIRF双模成像中的应用。
[0035] 我们选择人醌氧化还原酶(hNQO1)，一种在肿瘤细胞中过表达的生物标记酶，作为研究的案例。用于hNQO1检测的PA探针通过用三甲基锁的醌丙酸部分(Q3)封闭羟基来设计。羟基的酯化促进 PA探针形成“闭合”的螺内酯结构，在可见区-近红外区域显示出可忽略的吸收。当hNQO1催化还原并消除PA探针中Q3部分，所得的Rhodol-NIR染料经历自发的开环过程并恢复其大的π-共轭体系。因此，这种消除反应能够激活高信倍比的PA信号和指示酶活性。
[0036] 除PA响应外，所述的Rhodol-NIR染料还提供理想的荧光信号，实现PA/NIRF的双模式检测。此外，我们证明PA探针具有非常低的NIR吸收背景和对hNQO1的高特异性，而酶反应后产生的 Rhodol-NIR染料表现出大的摩尔消光系数，优异的光稳定性和理想的量子产率。这些出色的光物理性质使PA探针可用于活细胞和动物的高对比度PA/NIRF双模成像。该探针还能够确定活细胞和肿瘤的hNQO1差异性表达，为与hNQO1过度表达相关疾病提供了巨大的诊断潜力。据我们所知，这是第一次基于螺内酯开环反应开发出的可激活的近红外PA探针。预计我们的方案可以为研究高对比度成像激活式PA探针提供新的平台。
[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
[0038] 1、本发明设计合成的新的Rhodol衍生物染料Rhodol-NIR，不但具有大的π-共轭体系，而且氟离子能对酚羟基部分的质子化常数进行精细调节，开发出具有大摩尔消光系数，优异光稳定性和理想量子产率的新型Rhodol-NIR发色团，在设计高对比度激活式PA探针时表现出优异的光物理性质。
[0039] 2、本发明设计合成的高对比度可激活PA探针，该探针基于独特的分析物诱导的螺环蒽染料的螺内酯开环策略。由于其“闭合”螺内酯结构，探针没有表现出NIR吸收，并且它与hNQO1的反应通过螺内酯开环转变产生Rhodol-NIR发色团，允许高对比度PA/NIRF双模式检测和hNQO1成像。
[0040] 3、本发明设计合成的Rhodol-PA探针被证明在体外通过PA和荧光测量显示对hNQO1的高灵敏度和高选择性检测。
[0042] 图1是本发明的Rhodol-NIR的pKa值；
[0043] 图2是本发明的Rhodol-NIR的光稳定性工作曲线图；
[0044] 图3是本发明的Rhodol-PA和对照探针对hNQO1的体外响应光谱图；
[0045] 图4是本发明的Rhodol-PA、Rhodol-NIR、Rhodol-PA与hNQO1反应混合物的高效液相色谱图；
[0046] 图5是本发明的Rhodol-PA与hNQO1反应混合物的高分辨质谱图；
[0047] 图6是本发明的Rhodol-PA探针体外检测hNQO1荧光光谱图；
[0048] 图7是本发明的Rhodol-PA探针体外检测hNQO1干扰实验的紫外吸收光谱图；
[0049] 图8是本发明的Rhodol-PA探针对不同浓度hNQO1的PA响应图；
[0050] 图9是本发明的Rhodol-PA探针在680nm处的光声信号强度与不同浓度的hNQO1拟合线性工作曲线图；
[0051] 图10是在两种细胞系HT-29细胞和MDA-MB-231细胞探索的Rhodol-PA探针对hNQO1的多光谱光学断层扫描(MSOT)成像系统成像；
[0052] 图11是本发明Rhodol-PA对HT-29和MDA-MB-231细胞的细胞毒性实验结果图；
[0053] 图12是活体实验Rhodol-PA探针尾静脉注射给药HT-29和MDA-MB-231肿瘤小鼠的MSOT和荧光成像图；
[0054] 图13是活体实验对照尾静脉注射给药HT-29和MDA-MB-231肿瘤小鼠的MSOT和荧光成像图。
具体实施方式
[0055] 以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0056] 实施例1
[0057] Rhodol衍生物染料--Rhodol-NIR的设计和合成。
[0058] 将新蒸馏的环己酮(3.3mL，31.9mmol)滴加到浓H2SO4(35mL)中并将混合物冷却至0℃。然后，在搅拌下分批加入4-二乙氨基酮酸(16mmol)。在90℃下反应1.5小时后，将混合物倒入冰(150g)中。然后加入高氯酸(70％，3.5mL)，过滤所得沉淀物并用冷水(50mL)洗涤，得到9-(2-羧基苯基)-6-(二乙胺基)-1,2,3,4-四氢氧烷基(2a)，使用9-(2-羧基苯基)-6-(二乙胺基) -1,2,3,4-四氢氧烷基(237.6mg，0.5mmol)和3,5-二氟-4-羟基苯甲醛(118.5mg，0.75mmol)，在乙酸中110℃高温回流，旋干过硅胶柱得到Rhodol-NIR，为蓝色固体(89.2mg，产率29％)，具体合成过程如下所示：
[0059]
[0060] Rhodol-NIR结构式如式(Ⅳ)所示：
[0061]
[0062] 在初步研究中，发现该π-共轭体系延伸反应不仅容易合成，而且还具有理想的低量子产率的非刚性结构，有利于增强PA信号。
[0063] 实施例2
[0064] Rhodol-NIR的光物理性质
[0065] 操作步骤：
[0066] 为了测定Rhodol-NIR的pKa值，利用NaOH和盐酸调节pH，配制含有0.5％DMSO作为共溶剂且具有不同pH值的磷酸盐缓冲溶液，将Rhodol-NIR(15μM)与不同的缓冲体系混合，利用UV-1800 分光光度计测定Rhodol-NIR在不同pH缓冲体系的吸收光谱，并利用FS5荧光仪测定Rhodol-NIR在不同pH缓冲体系的荧光光谱，激发波长为620nm。然后使用650nm处的吸光度和720nm处的荧光强度绘制pH曲线。根据亨德森-哈塞尔巴奇方程计算化合物的pKa，具体结果如图1所示。
[0067] Rhodol-NIR具有最大吸收值为630nm，但它在620nm至700nm的宽NIR区域内产生显著增强的吸收带。从图1中可以看出，Rhodol-NIR的pKa值为6.1，证明了我们的设计，即引入吸电子取代基有利于pKa的降低和增强Rhodol衍生物的NIR吸收。总之，结果表明，Rhodol-NIR为开发可激活的PA探针提供了一种理想的发色团。
[0068] 我们发现Rhodol-NIR在630nm处表现出较大的摩尔消光系数(ε＝2.67×105M-1·cm-1)，这与现有的用于PA成像的小分子生色团相比是有利的。
[0069] Rhodol-NIR的量子产率在PBS(pH7.4)中测定，用甲酚紫(MeOH中的Φs＝0.54)为参考，根据方程式1计算量子产率：
[0070] ΦX＝ΦS(ASFX/AXFS)(nX/n)2 (1)
[0071] Φ：量子产率；A：激发波长处的吸光度；F：相同激发波长下荧光光谱的积分面积；n：溶剂的折射率；S和X分别代表参考标准样品和未知样品。
[0072] 在pH＝7.4磷酸缓冲溶液中Rhodol-NIR的量子产率ΦF计算为1.0％。该量子产率表明，Rhodol-NIR 在PA成像的光-热转换中具有高效率，考虑到它没有与重原子取代产生其它竞争性光转换途径。这种量子产率也能够用于荧光成像的研究并具有合适的灵敏度。
[0073] Rhodol-NIR也具有好的光稳定性，如图2所示。
[0074] 具体步骤如下：为了测定Rhodol-NIR的光稳定性，将配置好的Rhodol-NIR(15μM)样品置于显微镜上，并用汞灯(100W)照射。每隔约5min将样品取出，用FS5荧光仪测定荧光光谱。为了进行比较，还研究了在相同条件下的吲哚菁绿(ICG)的光稳定性。以Rhodol-NIR和ICG的最大荧光强度值随着时间的变化做出工作曲线。
[0075] 结果如图2所示，结果显示并且在连续照射70min后显示出可忽略不计的荧光下降，而商业NIR 染料吲哚菁绿(ICG)的荧光则降低了90％。NIR区域的高摩尔消光系数，理想的低量子产率和高光稳定性表明Rhodol-NIR为PA成像提供了理想的造影剂。
[0076] 实施例3
[0077] 基于Rhodol-NIR的PA探针设计和合成
[0078] 具体合成过程为：
[0079] B、三甲基锁的醌丙酸的合成：将3,3-二甲基丙烯酸酯(1.60mL，12mmol)加入到2,3,5-三甲基 -1,4-苯二醇(1.52g，10mmol)和甲磺酸(15mL)的混合物中，混合物为在70℃下搅拌2小时。冷却至室温后，将反应混合物用水稀释至150mL并用70mL二氯甲烷萃取三次。萃取物用饱和 NaHCO3溶液和NaCl溶液洗涤，用无水Na2SO4干燥并真空浓缩。用30％CHCl3在石油醚中重结晶，得到6-羟基-3,3,5,7,8–五甲基环内酯-2-酮，为白色固体(1.85g，产率
79.2％)。
79.2％)。
[0080] 向6-羟基-3,3,5,7,8–五甲基环内酯-2-酮(1.17g，5mmol)的乙腈(60mL)和水(25mL)溶液中加入NBS(0.98g，5.5mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌1小时。除去大部分有机溶剂后，用30mL二氯甲烷萃取残余物三次。用无水Na2SO4干燥有机层并在真空下浓缩。使用PE/EtOAc 2:1 (v/v)作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化粗产物，得到三甲基锁的醌丙酸(0.92g，产率73.5％)。
[0081] C、PA探针的制备：将Rhodol-NIR(234.0mg，0.38mmol)缓慢加入到1-(3-二甲基氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐(72.8mg，0.38mmol)，三甲基锁的醌丙酸(167.3mg，0.58mmol)的溶液中，在0℃下，在CH2Cl2(30mL)中加入4-二甲基氨基吡啶(46.4mg，
0.38mmol)。反应12小时后，将混合物用HCl(1M)洗涤。用MgSO4干燥有机层，过滤并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，使用CH2Cl2-MeOH(100:1至20:1)作为洗脱液，获得紫色固体的Rhodol-PA探针(164.7mg，产率58％)。
0.38mmol)。反应12小时后，将混合物用HCl(1M)洗涤。用MgSO4干燥有机层，过滤并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，使用CH2Cl2-MeOH(100:1至20:1)作为洗脱液，获得紫色固体的Rhodol-PA探针(164.7mg，产率58％)。
[0082] 具体路线下所示：
[0083]
[0084] 实施例4
[0085] Rhodol-PA探针的响应性能。
[0086] 操作步骤如下：为了测试Rhodol-PA对hNQO1的体外响应性能，首先用PBS缓冲液(10mM， pH＝7.4)配置15μM的Rhodol-PA溶液含有0.5％(v/v)二甲基亚砜和100μM NADH，然后将Rhodol-PA 与hNQO1(3.0μg/mL)在37℃孵育1.5h，利用UV-1800分光光度计测定紫外吸收光谱。
[0087] 如预期的那样，得到的Rhodol-PA探针在NIR区域没有显示出吸收带(图3)。NIR吸收的消失意味着Rhodol-PA探针主要存在形式为具有打破的π-共轭结构的“闭环”的螺内酯结构。
[0088] 在探针与hNQO1孵育90min后，我们观察到在630nm处的NIR吸收带急剧增加，表明 Rhodol-NIR的产生(图3)。该发现表明了hNQO1催化反应的两步机制，当Rhodol-PA中封闭团Q3被还原-消除之后，螺内酯开环反应自发地随后进行。发现Rhodol-NIR能与hNQO1特异性响应，并且具有大的红移(△λ＞230nm)和高吸收信倍比(在630nm处>57倍，在680nm处>110倍)。这种理想的性能归功于我们的螺内酯开环设计，其中探针表现出具有打破的π-共轭体系的“闭环”螺内酯结构，而产物具有延伸的大π-共轭体系的“开环”形式。
[0089] 实施例5
[0090] 验证螺环开环设计的必要性
[0091] 我们使用不含螺环部分的Rhodol变体合成了对照发色团。还通过用hNQO1的识别底物Q3酯化对照发射团来制备对照探针。
[0092] 对照探针的制备工艺为：将对照发色团(234.0mg，0.38mmol)缓慢加入到1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(72.8mg，0.38mmol)，3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧环己-1,4-二烯 -1-基)丁酸(167.3mg，0.58mmol)的溶液中，在0℃下，在CH2Cl2(30mL)中加入4-二甲基氨基吡啶(46.4mg，0.38mmol)。反应12小时后，将混合物用HCl(1M)洗涤。用MgSO4干燥有机层，过滤并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，使用CH2Cl2-MeOH(100:1至20:1)作为洗脱液，获得紫色固体的对照探针(164.7mg，产率58％)。
[0093] 具体路线如下所示：
[0094]
[0095] 其中，Control probe是指对照探针。同样，本发明测试了对照探针对hNQO1的体外响应性能，首先用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)配置15μM的Control probe溶液含有0.5％(v/v)二甲基亚砜和100μM NADH，然后与hNQO1(3.0μg/mL)混合，在37℃反应1.5h，UV-1800分光光度计测定紫外吸收光谱。
[0096] 令人惊讶的是，对照探针确实表现出明显的vis-NIR吸收带(图3)。值得注意的是，对照探针与Rhodol-PA探针具有相同的母体结构。因此，对照探针和Rhodol-PA的不同吸收光谱为Rhodol-PA 中打破的π-共轭体系提供了直接证据，验证了Rhodol-PA中“闭环”的螺内酯结构。
[0097] 此外，根据图3示，在对照探针与hNQO1反应后，在吸收峰中出现轻微的增加，最大值仅增强 3倍。由于在酶促反应中形成游离酚羟基，这种轻微的吸收增加归因于增强的分子内电荷转移效应。基于这些结果，我们推断Rhodol-PA的高对比度响应归因于螺内酯开环机制，验证了这种开发高对比度可激活PA探针的新策略的潜力。
[0098] 实施例6
[0099] Rhodol-PA探针的反应机理探究
[0100]
[0101] 如上式所示，当闭环形式的探针Rhodol-PA与hNQO1共同孵育时，hNQO1与识别位点反应，释放出开环形式的染料Rhodol-NIR，产生光声和荧光信号。
[0102] 为了验证Rhodol-PA探针的反应机理，首先我们进行了Rhodol-PA、Rhodol-NIR及Rhodol-PA与 hNQO1反应产物的高效液相色谱分析。以甲醇/水(0.2％CF3COOH＝90/10(v/v)，流速1ml/min，检测波长550nm的C18柱(250nm×4.6mm，5μm)为色谱条件，为了进一步验证反应机理，使用高分辨质谱方法分析了Rhodol-PA与hNQO1的反应产物。在含有0.5％(v/v)二甲基亚砜和100μM NADH 的PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，在37℃下用hNQO1(1.5μg/ml)培养1.5小时。然后向反应混合物中滴加1mL MeCN，并以10000转每分钟速度离心15分钟。取其上清液以正离子模式进行质谱分析。
[0103] 对于来自探针和hNQO1之间反应的产物，分别在8.8min和5.0min获得两个洗脱峰，对应于 Rhodol-NIR发色团和未反应的探针(图4)。此外，反应液显示出两个新的峰，一个对应于Rhodol-NIR (计算[M+H]+m/z 516.1981，发现516.1987)，另一个作为还原副产物(计算为[M+H]+)m/z 235.1289，发现235.0541)，如图5所示。该结果暗示Rhodol-PA探针在与hNQO1反应后转化为 Rhodol-NIR。
[0104] 实施例7
[0105] PA探针对hNQO1的体外性能
[0106] 使用所合成的Rhodol-PA探针，我们随后研究了其作为探针在体外检测hNQO1的性能。
[0107] 操作步骤如下：为了测试Rhodol-PA对hNQO1的体外响应性能，首先用PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)配置15μM的Rhodol-PA溶液含有0.5％(v/v)二甲基亚砜和100μM NADH，然后将Rhodol-PA 与hNQO1(3.0μg/mL)在37℃反应1.5h，分别利用inVision256-TF多波长光声成像系统(MSOT) 采集光声光谱信号，利用FS5荧光仪测定荧光光谱。
[0108] 正如预期的那样，Rhodol-PA探针在680nm至800nm范围内表现出非常低的PA信号(图6) 探针与hNQO1反应后，获得了强的PA响应信号，在680nm处具有～11倍的倍比值。类似地，Rhodol-PA 探针仅具有非常低的荧光，而其与hNQO1反应后荧光信号显著增强，在720nm处具有～59倍的信倍比。结果暗示了Rhodol-PA对hNQO1的高对比度PA/NIRF双模成像的潜力。
[0109] 为了测试其特异性，进行对照实验，其中探针与各种生物相关物种一起培育没有吸收响应(图7) 证明了Rhodol-PA探针对hNQO1的高选择性。
[0110] 从HT-29细胞的两种裂解物的测定中获得了进一步的证据，其已知过表达hNQO1。在将探针与 HT-29细胞裂解物培育后，我们获得了吸收信号(图7)。相反，在用过量双香豆素(一种特异性hNQO1 抑制剂)预处理的HT-29细胞裂解物的测定中观察到可忽略的吸收信号。另外，用探针测定 MDA-MB-231细胞的裂解物，据报道其具有极低的hNQO1表达，在紫外吸收显示出非常小的响应(图 7)。总之，这些结果清楚地证明了Rhodol-PA探针对hNQO1的高度特异性。
[0111] 实施例8
[0112] 测定Rhodol-PA探针的定量能力
[0113] 试验方法具体如下：为了检测Rhodol-PA对hNQO1的定量能力，分别用不同浓度的hNQO1(0-3.0 μg/mL)培养15μM Rhodol-PA 37℃反应1.5h，利用inVision256-TF多波长光声成像系统采集光声信号，然后用680nm处的光声信号强度与不同浓度的hNQO1拟合线性工作曲线。
[0114] 发现在680nm处的PA信号在0.25-3.0μg/mL的浓度范围内表现出对hNQO1的动态响应(图8) 响应信倍比值为～11，表明在hNQO1的PA检测中具有高对比度。在0.25至1.1μg/mL的范围内获得线性相关，估计的检测限(LOD)为0.08μg/mL(图9)。
[0115] 实施例9
[0116] Rhodol-PA探针对活细胞中成像hNQO1的能力
[0117] 在理想的体外结果的推动下，我们随后使用两种细胞系HT-29细胞和MDA-MB-231细胞探索了 Rhodol-PA探针对活细胞中PA/NIRF成像hNQO1的能力。
[0118] 具体操作步骤：将HT-29或MDA-MB-231细胞(约7×106细胞置于75cm 2的细胞培养瓶中) 与Rhodol-PA(30μM)在37C下孵育2h，用10mL PBS洗涤3次，然后0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，并用TC20TM自动细胞计数器计数。用离心微管(200μL)收集细胞悬浮液。将带有细胞颗粒的试管插入MSOT成像系统支架上，并用MSOT成像系统进行成像。进行抑制剂研究时，细胞在与Rhodol -PA(30μM)孵育之前，先用双香豆素(100μM)抑制剂预处理HT-29细胞1h，后续的步骤与没有加入双香豆素抑制剂的相同。
[0119] 离心细胞(7×106)以获得细胞沉淀，用多光谱光学断层扫描(MSOT)成像系统成像(图10)。如所预期的，与Rhodol-PA探针一起培育的HT-29细胞在680nm处的PA信号显着增加(图10)当用hNQO1抑制剂双香豆素预处理细胞，然后用探针孵育时，观察到低得多的PA信号。此外，与探针一起孵育的MDA-MB-231细胞显示出可忽略不计的PA信号。这些结果与文献报道一致，即HT-29 细胞过表达hNQO1水平，MDA-MB-231细胞的hNQO1含量非常低。这一结果表明，Rhodol-PA探针提供了特异性分化的活性分子工具，以及使用MSOT成像检测活细胞中的hNQO1活性。
[0120] 此外，我们还进行了Rhodol-PA对HT-29和MDA-MB-231细胞的细胞毒性实验测定。
[0121] 细胞毒性实验操作：采用标准MTT法研究了Rhodol-PA对HT-29和MDA-MB-231细胞的细胞毒性。分别将HT-29和MDA-MB-231细胞接种于5×103细胞/孔的96孔板中，培养基为100μL。将细胞在37℃培养24小时，然后用新鲜培养基培养含有不同浓度的Rhodol-PA(0-
300μM)12小时，然后去除培养基，用冷PBS洗涤细胞3次。将细胞与MTT试剂(10μL，5mg/ml)在
37℃孵育4h。然后添加DMSO(100μL/孔)10min以溶解沉淀的甲山紫晶体。使用ELX800TM微孔板阅读器测量570 nm处的吸收值。
300μM)12小时，然后去除培养基，用冷PBS洗涤细胞3次。将细胞与MTT试剂(10μL，5mg/ml)在
37℃孵育4h。然后添加DMSO(100μL/孔)10min以溶解沉淀的甲山紫晶体。使用ELX800TM微孔板阅读器测量570 nm处的吸收值。
[0122] 此外，细胞毒性实验测定显示，超过300μM的Rhodol-PA探针浓度对两种细胞系HT-29和 MDA-MB-231的细胞活力(>90％)几乎没有影响(图11)表明使用这种低细胞毒性Rhodol-PA探针用于生物学应用的潜力。
[0123] 实施例10
[0124] 尾静脉给药证明Rhodol-PA探针在PA检测活动物中hNOQ1活性的能力[0125] 具体试验步骤：对于MSOT成像，将200μL Rhodol-PA(300μM)经尾静脉注射到HT-29肿瘤或MDA-MB-231肿瘤小鼠中。对照组注射灭菌PBS(200μL)。首先，将小鼠在含1％异氟醚-氧气氛围的麻醉盒中麻醉。然后，将超声凝胶涂在小鼠肿瘤部位，用聚乙烯膜包裹小鼠以使组织和水介质之间的耦合。放置在34℃的水浴中，从680nm到800nm范围之间，每隔10nm收集不同波长处的光声信号，并利用850nm光声强度做为背景。对肿瘤部位，每隔0.3毫米进行数据采集。采集Rhodol-PA 注射前(0分钟)和注射后不同时间点(0，0.5h，1h,3h,5h,7h和12h)的MSOT图像。利用光声仪器的独立成分光谱分析技术对采集信号进行数据分析，将响应后探针的信号与组织中的其它背景光吸收剂(如血红蛋白)的信号分离，获得光声成像图。并求算同一时间点肿瘤不同部位的平均光声信号强度，扣除注射前的肿瘤不同部位的平均光声信号强度，获得增强的光声信号强度。
[0126] 在该研究中，Rhodol-PA探针(2.56mg/kg)或PBS分别通过尾部注射给药HT-29和MDA-MB-231 肿瘤小鼠。MSOT和荧光成像图像在注射后不同的间隔(0,0.5,1,3,5，7,12h)是被获得的。我们在注射探针后1小时观察到明显PA信号，并且在HT-29细胞异种移植小鼠的肿瘤区域中注射5小时后获得最强信号(图12a1)。注射PBS对照后的PA信号在整个实验中没有显示出明显的增加，证明PA 信号的激活来自肿瘤区域中探针的反应(图13)。在注射探针后，在MDA-MB-231细胞异种移植小鼠的肿瘤区域中未发现PA信号的明显增加(图12a1)。荧光图像在HT-29和MDA-MB-231细胞异种移植小鼠的肿瘤区域中表现出相似的响应(图12a1)。在重复测定中从六只HT-29肿瘤小鼠收集的数据显示，肿瘤区域中的平均PA信号在注射后1小时显示出快速增加，并且在5小时达到最大值，然后逐渐降低至12小时(图12a2)。
相反，植有MDA-MB-231肿瘤的小鼠仅在注射后显示肿瘤区域中 PA信号的仅有轻微增加。
HT-29肿瘤与MDA-MB-231肿瘤的平均信号比率约为7倍，证实使用 Rhodol-PA探针实现了hNQO1过表达肿瘤的高对比度PA成像。此外，我们发现在注射后5小时获得的植有HT-29肿瘤的小鼠的肿瘤区域的体内PA光谱在680nm处显示最大PA信号，其光谱分布类似于体外光谱(图12a3)。该结果进一步证实HT-29肿瘤中的PA信号归因于在HT-29细胞中过表达的hNQO1介导的Rhodol-PA探针的特异性激活。来自携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠的体内PA光谱也显示出相似但较小的特征，表明hNQO1在这些细胞中的低表达。
相反，植有MDA-MB-231肿瘤的小鼠仅在注射后显示肿瘤区域中 PA信号的仅有轻微增加。
HT-29肿瘤与MDA-MB-231肿瘤的平均信号比率约为7倍，证实使用 Rhodol-PA探针实现了hNQO1过表达肿瘤的高对比度PA成像。此外，我们发现在注射后5小时获得的植有HT-29肿瘤的小鼠的肿瘤区域的体内PA光谱在680nm处显示最大PA信号，其光谱分布类似于体外光谱(图12a3)。该结果进一步证实HT-29肿瘤中的PA信号归因于在HT-29细胞中过表达的hNQO1介导的Rhodol-PA探针的特异性激活。来自携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠的体内PA光谱也显示出相似但较小的特征，表明hNQO1在这些细胞中的低表达。
[0127] 总之，活体小鼠成像结果表明，我们的探针可以在活体动物的hNQO1上调肿瘤中被选择性激活，使得hNQO1过度表达的肿瘤的PA/NIRF双模成像成为可能，这意味着其具有体内肿瘤诊断和治疗评估的潜力。
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