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合成丙 酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

阅读：833发布：2020-05-08

专利汇可以提供合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法及应用。本发明的重组大肠杆菌是通过敲除Escherichia coli BL21(DE3)中的丙酮酸脱氢酶复合体 aceEF基因、丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因、丙酮酸氧化酶 poxB基因、磷酸烯醇式丙酮酸合酶pps基因和乳酸脱氢酶ldhA基因，阻断丙酮酸进一步代谢的关键途径，并敲除了编码丙酮酸转运蛋白的基因btsT、cstA得到的。本发明利用L-氨基酸脱氨酶pm1催化D,L-丙氨酸，不仅可以将L-丙氨酸转化为丙酮酸，同时还能拆分得到D-丙氨酸，为D,L-丙氨酸的手性拆分提供了新的思路和方法。通过改造获得了高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的重组大肠杆菌，丙酮酸产量达到32.0g/L，L-丙氨酸的转化率达到80％，D/L-丙氨酸的拆分率达到80％。，下面是合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌敲除了大肠杆菌宿主中的丙酮酸脱氢酶复合体aceEF基因、丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因、丙酮酸氧化酶poxB基因、磷酸烯醇丙酮酸合酶pps基因和乳酸脱氢酶ldhA基因；所述的大肠杆菌宿主为表达L-氨基酸脱氨酶pm1的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌进一步敲除了编码丙酮酸转运蛋白的基因btsT、cstA。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌使用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因的敲除。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌宿主为Escherichia coli BL21(DE3)中表达L-氨基酸脱氨酶pm1。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的L-氨基酸脱氨酶pm1通过质粒pET20b-pm1-cybC在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中表达。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述的L-氨基酸脱氨酶pm1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.一种权利要求1～6任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA基因敲除同源臂片段以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增出btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA各基因的上下游同源臂片段，通过重叠PCR分别融合各基因上下游同源臂，得到片段btsT12、cstA12、aceEF12、pflB12、poxB12、pps12、ldhA12；
(2)pTarget质粒的构建
分别在各待敲除基因上选取N20区，设计引物，以pTarget为模板，通过PCR取代模板的N20区；将PCR产物转入E.coli JM109中，提取质粒，得到质粒pTarget-btsT、pTarget-cstA、pTarget-aceEF、pTarget-pflB、pTarget-poxB、pTarget-pps、pTarget-ldhA；
(3)基因敲除
将pCas9质粒转化E.coli BL21(DE3)(pET20b-pm1-cybC)，得到表达Cas9蛋白的宿主BL21(pCas9)，随后将pTarget-aceEF质粒和片段aceEF12电转入BL21(pCas9)，得到敲除aceEF基因的BLK01(pCas9)，消除pTarget-aceEF质粒，将pTarget-pflB质粒和片段pflB12电转入BLK01(Cas9)，敲除pflB基因，按此方法依次敲除各待敲除基因，最后消除pCas9得到所述的基因工程菌。
8.权利要求1～6任一项所述的基因工程菌在合成丙酮酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用所述的基因工程菌全细胞催化D/L-丙氨酸生成丙酮酸和D-丙氨酸。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的基因工程菌全细胞是通过将基因工程菌接种至发酵培养基中，在25-30℃下培养，以0.005～0.015mM的IPTG进行诱导10～
15h，离心收集所述的基因工程菌全细胞。

说明书全文

合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002] 丙酮酸(Pyruvic acid)是药物合成领域的重要中间体，广泛应用于食品、农药、生化等工业中。目前工业上丙酮酸的生产方法主要有化学合成法，酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法成本较高，而且其对于环境的污染较大；而微生物直接发酵法中，产物的成分复杂且分离难度大。生物催化法合成丙酮酸可以克服上述两种方法的不足和缺点，因此，在工业应用中具有广阔前景。

[0003] D-丙氨酸是生产维生素B6和泛酸钙的原料，具有镇痛作用，也可用作多种生化试剂和有机合成中间体。目前D-丙氨酸的价格比D/L-丙氨酸、L-丙氨酸都要高，然而D/L-丙氨酸的拆分困难，且成本较高。因此，寻找一种操作简单、成本低且效率高的D/L-丙氨酸的拆分方法很有意义。

[0004] L-氨基酸脱氨酶(EC 1.4.3.2)广泛存在于自然界各种生物中。每类L-氨基酸脱氨酶均对特定的一种或几种氨基酸或其氨基酸衍生物表现出较高的底物亲和性，而对其他氨基酸的亲和性较差。因此，不同来源的L-氨基酸脱氨酶具有高度保守性。Proteus mirabilis来源的L- 氨基酸脱氨酶pm1，能高效催化L-组氨酸、L-谷氨酸和L-丙氨酸生成相应的酮酸。

[0005] 大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一种可用于高效表达含T7启动子的表达载体的菌株，其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作异源表达重要化学品合成途径的生产宿主。

[0006] 此前，本人已在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶来催化合成丙酮酸同时通过手性拆分D,L-丙氨酸获得D-丙氨酸。然而，全细胞催化的过程中，细胞本身会大量消耗产物丙酮酸，使得丙酮酸产量较低。

[0007] 因此，如何利用大肠杆菌，通过生物转化法高效合成丙酮酸和D-丙氨酸，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供一种高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法及应用。敲除表达L-氨基酸脱氨酶pm1的大肠杆菌中的丙酮酸脱氢酶复合体aceEF 基因、丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因、丙酮酸氧化酶poxB基因、磷酸烯醇式丙酮酸合酶pps 基因和乳酸脱氢酶ldhA基因，阻断丙酮酸进一步代谢的关键途径，并敲除了编码丙酮酸转运蛋白的基因btsT、cstA，获得高效合成丙酮酸的重组大肠杆菌。

[0009] 本发明的第一个目的是提供一种合成丙酮酸与D-丙氨酸的基因工程菌，所述的基因工程菌敲除了大肠杆菌宿主中的丙酮酸脱氢酶复合体aceEF基因、丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因、丙酮酸氧化酶poxB基因、磷酸烯醇丙酮酸合酶pps基因和乳酸脱氢酶ldhA基因；所述的大肠杆菌宿主为表达L-氨基酸脱氨酶pm1的大肠杆菌。

[0010] 进一步地，所述的基因工程菌进一步敲除了编码丙酮酸转运蛋白的基因btsT、cstA。

[0011] 进一步地，所述的基因工程菌使用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行基因的敲除。

[0012] 进一步地，所述的大肠杆菌宿主为Escherichia coli BL21(DE3)中表达L-氨基酸脱氨酶pm1。

[0013] 进一步地，所述的L-氨基酸脱氨酶pm1通过质粒pET20b-pm1-cybC在大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)中表达。

[0014] 进一步地，所述的L-氨基酸脱氨酶pm1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0015] 进一步地，所述的丙酮酸脱氢酶复合体aceEF基因的NCBI编号为944834、944794，丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因的ID为945514，丙酮酸氧化酶poxB基因的ID为946132，磷酸烯醇丙酮酸合酶pps基因的ID为946209，乳酸脱氢酶ldhA基因的ID为946315。

[0016] 本发明的第二个目的是提供所述的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

[0017] (1)构建btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA基因敲除同源臂片段[0018] 以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增出btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、 ldhA各基因的上下游同源臂片段，通过重叠PCR分别融合各基因上下游同源臂，得到片段 btsT12、cstA12、aceEF12、pflB12、poxB12、pps12、ldhA12；

[0019] (2)pTarget质粒的构建

[0020] 分别在各待敲除基因上选取N20区，设计引物，以pTarget为模板，通过PCR取代模板的N20区；将PCR产物转入E.coli JM109中，提取质粒，得到质粒pTarget-btsT、 pTarget-cstA、pTarget-aceEF、pTarget-pflB、pTarget-poxB、pTarget-pps、pTarget-ldhA；

[0021] (3)基因敲除

[0022] 将pCas9质粒转化E.coli BL21(DE3)(pET20b-pm1-cybC)，得到表达Cas9蛋白的宿主BL21(pCas9)，随后将pTarget-aceEF质粒和片段aceEF12电转入BL21(pCas9)，得到敲除aceEF基因的BLK01(pCas9)，消除pTarget-aceEF质粒，将pTarget-pflB质粒和片段pflB12 电转入BLK01(Cas9)，敲除pflB基因，按此方法依次敲除各待敲除基因，最后消除pCas9 得到所述的基因工程菌。

[0023] 本发明的第三个目的是提供所述的基因工程菌在合成丙酮酸中的应用。

[0024] 进一步地，所述的应用是采用所述的基因工程菌全细胞催化D/L-丙氨酸生成丙酮酸和 D-丙氨酸。

[0025] 进一步地，所述的基因工程菌全细胞是通过将基因工程菌接种至发酵培养基中，在 25-30℃下培养，以0.005～0.015mM的IPTG进行诱导10～15h，离心收集所述的基因工程菌全细胞。

[0026] 本发明的有益效果是：

[0027] 本发明的重组大肠杆菌是通过敲除Escherichia coli BL21(DE3)中的丙酮酸脱氢酶复合体 aceEF基因、丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因、丙酮酸氧化酶poxB基因、磷酸烯醇式丙酮酸合酶pps基因和乳酸脱氢酶ldhA基因，阻断丙酮酸进一步代谢的关键途径，并敲除了编码丙酮酸转运蛋白的基因btsT、cstA得到的。本发明利用L-氨基酸脱氨酶pm1催化D,L-丙氨酸，不仅可以将L-丙氨酸转化为丙酮酸，同时还能拆分得到D-丙氨酸，为D,L-丙氨酸的手性拆分提供了新的思路和方法。通过改造获得了高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的重组大肠杆菌，丙酮酸产量达到32.0g/L，L-丙氨酸的转化率达到80％，D/L-丙氨酸的拆分率达到80％。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好应用前景。
附图说明

[0028] 图1为本发明中基因敲除后的菌落PCR验证核酸电泳图

[0029] 图2为本发明实施例5中BL21(pET20b-pm1-cybC)、BLK05(pET20b-pm1-cybC)、 BLK07(pET20b-pm1-cybC)产量的比较。

具体实施方式

[0030] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0031] 丙酮酸的测定方法：

[0032] 高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，伯乐有机酸色谱柱(300×7.8mm， 9μl)，流动相：5mM的H2SO4，流速0.6mL/min，柱温40℃，进样体积为10μL。

[0033] 实施例1：

[0034] 基因敲除同源臂片段的构建

[0035] 表1

[0036]

[0037]

[0038] 根据E.coli BL21(DE3)序列信息，设计如上表中所示引物,使用上述引物以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，PCR扩增出btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA各基因的上下游同源臂片段，通过Overlapping PCR分别融合各基因上下游同源臂，得到片段 btsT12、cstA12、aceEF12、pflB12、poxB12、pps12、ldhA12。

[0039] 实施例2：

[0040] pTarget质粒的构建

[0041] 分别在各待敲除基因上选取N20区(CRISPR/Cas9系统中用于靶向待敲除基因的20bp 的碱基序列)，设计引物，以pTarget为模板，通过PCR取代模板的N20区。将PCR产物转入E.coli JM109中，提取质粒，得到7个质粒，pTarget-btsT、pTarget-cstA、pTarget-aceEF、 pTarget-pflB、pTarget-poxB、pTarget-pps、pTarget-ldhA。

[0042] 实施例3：

[0043] 基因敲除

[0044] 将pCas9质粒转化E.coli BL21(DE3)，得到表达Cas9蛋白的宿主BL21(pCas9)，随后将pTarget-aceEF质粒和片段aceEF12电转入BL21(pCas9)，得到敲除aceEF基因的BLK01 (pCas9)，消除pTarget-aceEF质粒，将pTarget-pflB质粒和片段pflB12电转入BLK01(Cas9)，敲除pflB基因，按此方法依次敲除各待敲除基因，最后消除pTarget和pCas9质粒，得到aceEF、 pflB、poxB、pps、ldhA基因敲除的BLK05以及btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA 基因敲除的BLK07。BLK07的基因敲除菌落PCR验证结果如图1所示。

[0045] 实施例4：

[0046] 构建高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的重组大肠杆菌

[0047] 将质粒pET20b-pm1-cybC转入工程菌BLK05、BLK07，得到高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的重组大肠杆菌BLK05(pET20b-pm1-cybC)、BLK07(pET20b-pm1-cybC)。

[0048] 实施例5：

[0049] 全细胞催化合成丙酮酸与D-丙氨酸

[0050] 将BL21(pET20b-pm1-cybC)、BLK05(pET20b-pm1-cybC)、BLK07(pET20b-pm1-cybC) 种子液以OD值0.1-0.2的接种量接入发酵培养基中，发酵培养基的配方为：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4g/L，磷酸氢二钾2.31g/L，三水磷酸氢二钾16.42g/L。当OD值达到2时，在25-30℃下，以0.01mM的IPTG进行诱导12h，离心收集细胞，用缓冲液悬浮后加入底物D/L-丙氨酸，37℃、220rpm催化24h。催化反应在250mL的三角瓶中进行，催化体系总体积25mL，细胞2.5g/L，D/L-丙氨酸80g/L，缓冲液为pH7.0的0.1M的磷酸钠缓冲液。

[0051] 催化结束时，使用高效液相色谱测定上清中丙酮酸的含量，结果如图2所示，BLK07 (pET20b-pm1-cybC)菌株催化生产丙酮酸的产量达到32g/L，比BLK05产量提高15.5％，比原始菌株的产量提高113％，L-丙氨酸的转化率达到80％，D/L-丙氨酸的拆分率达到80％。

[0052] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

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