一种Indel分子标记芯片的利用方法
阅读：97发布：2024-01-05
专利汇可以提供一种Indel分子标记芯片的利用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种Indel分子标记芯片的利用方法，该方法依次包括如下步骤：根据Indel分子标记设计合成 覆盖 全基因组的Indel探针步骤；合成的Indel探针点样于基片的点样步骤；Indel分子标记芯片的固定步骤；在固定后的所述Indel分子标记芯片上进行杂交的步骤；杂交后的Indel分子标记芯片的洗脱与扫描步骤。该方法简单，容易在实验室中实现，是一个开放式、低成本的实用技术体系，可以应用于指纹鉴定、基因 定位 、基因聚合鉴定筛选、 种子 真实度鉴定、遗传背景鉴定及分子标记辅助育种等多个方面，特别地，本发明设计的Indel分子标记芯片可以用于鉴定和筛选黄瓜抗枯萎病和靶斑病基因。，下面是一种Indel分子标记芯片的利用方法专利的具体信息内容。
1.一种Indel分子标记芯片的利用方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
根据Indel分子标记设计合成覆盖全基因组的Indel探针步骤；
合成的Indel探针点样于基片的点样步骤：先将合成的Indel探针干粉用去离子水配制成浓度为18-22μM的Indel探针溶液，再将所述探针溶液与点样缓冲液等体积混合均匀，然后将混合均匀的样品转移至多孔板上，并将基片置于点样仪上，按点样仪的点样程序将所述多孔板上的样品点样于基片上，从而得到Indel分子标记芯片；
所述Indel分子标记芯片的固定步骤；
在固定后的所述Indel分子标记芯片上进行杂交的步骤：首先，根据点样模式，在固定后的芯片周围贴上相应的围栏或反应舱，在所述围栏或反应舱内加入预杂交液，38-42℃放置15-20min后去除预杂交液；然后，将包含Indel分子标记的模板进行98℃10min变性，变性后即刻将装有所述模板的离心管置于冰水混合物中并于-20℃条件下放置5-10min；之后，向装有所述模板的离心管中加入杂交缓冲液，混合均匀后加入至已经过预杂交液处理的芯片的围栏或反应舱中，其中所述模板与杂交缓冲液的体积比为1:4-6；最后，将芯片置于湿盒，在40℃～60℃烘箱中进行杂交，杂交时间为1～16h；
杂交后的Indel分子标记芯片的洗脱与扫描步骤：吸去芯片上的溶液后加入洗液，于
38-42℃下放置5-10min，再吸干或离心甩干芯片，进行基因芯片荧光扫描；
所述Indel探针的碱基序列如序列表SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1的利用方法，其特征在于，在所述点样步骤中，在向所述基片点样之前将多孔板在离心机上离心以使样品沉淀到孔的底部。
3.根据权利要求1的利用方法，其特征在于，所述基片为氨基基片或醛基基片。
4.根据权利要求3的利用方法，其特征在于，在所述固定步骤中，当所述基片为氨基基片时，所述Indel分子标记芯片放置于254nm紫外条件下辐照400-800mJ，然后至于烘箱
80℃水合30min；或者所述Indel分子标记芯片直接置于烘箱80℃水合30-60min；当所述基片为醛基基片时，所述Indel分子标记芯片平放于湿盒过夜固定或直接放在点样仪平台上过夜固定。
5.根据权利要求1的利用方法，其特征在于，在所述杂交步骤中，所述预杂交液为上海艮驰生物科技有限公司编号为GCB02002的预杂交液A，所述杂交缓冲液为上海艮驰生物科技有限公司编号为GCB02003的杂交缓冲液B。
6.根据权利要求1的利用方法，其特征在于，在所述洗脱与扫描步骤中，所述洗液为上海艮驰生物科技有限公司编号为GCB02004的洗液C1和编号为GCB02005的洗液C2。
7.权利要求1所述的利用方法在鉴定和/或筛选黄瓜抗枯萎病和/或靶斑病方面的应用。
一种Indel分子标记芯片的利用方法
技术领域
[0001] 本发明属于芯片制备领域，具体涉及一种Indel分子标记的利用方法，该利用方法是将Indel分子标记设计为探针并将探针制作成芯片。
背景技术
[0002] 基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的，它是在基因探针的基础上研制出来的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片可把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。
[0003] 早在八十年代，Bains W.等人就将短的DNA片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。基因芯片技术可以用来筛选蔬菜作物的基因突变，并寻找高产、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因。
[0004] 目前，主要蔬菜作物的基因组测序工作基本完成，其中，我国科学家牵头或作物主要参与方先后完成了西瓜、白菜、黄瓜、番茄、甘蓝基因组序列测定工作。另外，甜瓜、辣椒等蔬菜作物的基因组也已发表，利用基因组学开展蔬菜作物分子生物学研究已迈入新的阶段。作为高通量筛选的代表技术基因芯片也逐步应用于蔬菜作物研究。基因芯片在蔬菜作物育种研究中具有广阔的应用前景，可用于遗传材料前景选择、背景鉴定、基因定位、基因聚合鉴定筛选、核酸指纹分析、种子真实度鉴定等多个方面。现在市场上常见的分子标记基因芯片多为SNP(单核苷酸差异)检测芯片，对于多碱基差异分子标记SSR(简单重复序列)、Indel(插入缺失差异)等分子标记芯片研究鲜有报道。但是由于蔬菜作物的分子生物学基础研究尚落后于模式植物拟南芥和粮食作物水稻、玉米。目前，进行性状定位研究，可用于分子标记辅助选择的分子标记大多为SSR、Indel，SNP分子标记较少；而与SSR分子标记相比，Indel分子标记探针涉及的基因重复序列较少，在全基因组背景下具有更好的保守性和多态性。而且，Indel分子标记较易设计开发共显性探针，即插入/缺失分别长片段探针和短片段探针；经过杂交反应，其中一方有信号为纯合，双方都有杂交信号为杂合的共显性探针。因此，Indel分子标记更适宜于进行芯片探针设计和开发应用。
发明内容
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 一种Indel分子标记芯片的利用方法，依次包括如下步骤：
[0008] 根据Indel分子标记设计合成覆盖全基因组的Indel探针步骤；
[0009] 合成的Indel探针点样于基片的点样步骤：先将合成的Indel探针干粉用去离子水配制成浓度为18-22μM的Indel探针溶液，再将所述探针溶液与点样缓冲液等体积混合均匀，然后将混合均匀的样品转移至多孔板上，并将基片置于点样仪上，按点样仪的点样程序将所述多孔板上的样品点样于基片上，从而得到Indel分子标记芯片；
[0010] 所述Indel分子标记芯片的固定步骤；
[0011] 在固定后的所述Indel分子标记芯片上进行杂交的步骤：首先，根据点样模式，在固定后的芯片周围贴上相应的围栏或反应舱，在所述围栏或反应舱内加入预杂交液，38-42℃放置15-20min后去除预杂交液；然后，将包含Indel分子标记的模板(比如PCR产物模板或基因组片段化后的模板等)进行98℃10min变性，变性后即刻将装有所述模板的离心管置于冰水混合物中并于-20℃条件下放置5-10min；之后，向装有所述模板的离心管中加入杂交缓冲液，混合均匀后加入至已经过预杂交液处理的芯片的围栏或反应舱中，其中所述模板与杂交缓冲液的体积比为1:4-6；最后，将芯片置于湿盒，在40℃～60℃烘箱中进行杂交，杂交时间为1～16h；
[0012] 杂交后的Indel分子标记芯片的洗脱与扫描步骤：吸去芯片上的溶液后加入洗液，于38-42℃下放置5-10min，再吸干或离心甩干芯片，进行基因芯片荧光扫描。
[0013] 在上述利用方法中，作为一种优选实施方式，在所述点样步骤中，在向所述基片点样之前将多孔板在离心机上离心以使样品沉淀到孔的底部。
[0015] 在上述利用方法中，作为一种优选实施方式，在所述固定步骤中，当所述基片为氨基基片时，所述Indel分子标记芯片放置于254nm紫外条件下辐照400-800mJ，然后至于烘箱80℃水合30min；或者所述Indel分子标记芯片直接置于烘箱80℃水合30-60min；当所述基片为醛基基片时，所述Indel分子标记芯片平放于湿盒过夜固定或直接放在点样仪平台上过夜固定。
[0016] 在上述利用方法中，作为一种优选实施方式，在所述杂交步骤中，所述预杂交液为上海艮驰生物科技有限公司编号为GCB02002的预杂交液A，所述杂交缓冲液为上海艮驰生物科技有限公司编号为GCB02003的杂交缓冲液B。
[0017] 在上述利用方法中，作为一种优选实施方式，在所述洗脱与扫描步骤中，所述洗液为上海艮驰生物科技有限公司编号为GCB02004的洗液C1和编号为GCB02005的洗液C2。
[0019] 上述利用方法在鉴定和/或筛选黄瓜抗枯萎病和/或靶斑病方面的应用。
[0020] 本发明的有益效果为：本发明给出了Indel分子标记的利用方法，该方法简单，容易在实验室中实现，该方法得到了多碱基差异Indel分子标记芯片，是一个开放式(通量开发，可实现从1个、几个到以百、千为数量级的分子标记一次性筛选检测)、低成本(无需公司企业定制、每张芯片成本从20元到100元，1000个位点的芯片成本不超过100元，远低于国内外芯片公司的价格)的实用技术体系，对蔬菜作物实现不同数量分子标记一次性检测具有重要的现实意义。另外，建立的基于Indel分子标记的芯片技术体系可以应用于指纹鉴定、基因定位、基因聚合鉴定筛选、种子真实度鉴定、遗传背景鉴定及分子标记辅助育种等多个方面，同时中高通量的Indel分子标记芯片对实现高通量、大规模分子标记辅助育种具有重要的科学意义。
[0021] 另外，本发明中涉及的基片、围栏、反应舱及杂交液、洗液等试剂均为低价易耗品，另外涉及的仪器如杂交炉、真空泵价格不高，容易配置。通过计算本发明的成本，发现低通量芯片(以十为数量级的分子标记数目)芯片制作成本仅为20多元，高通量芯片(以百、千为数量级的分子标记数目)芯片制作成本不超过100元，仅为市场价格的十分之一、甚至几十分之一。附图说明
[0022] 图1是本发明利用Indel分子标记开发芯片并进行杂交的技术体系的构建流程示意图；
[0023] 图2是黄瓜抗病Indel分子标记芯片扫描结果图；
[0024] 图3是多个黄瓜抗病Indel分子标记芯片模拟图。
具体实施方式
[0025] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，目的在于更好地理解本发明内容，并非限制本发明于此。
[0026] 实施例1
[0027] 本实例以将黄瓜抗枯萎病和靶斑病Indel分子标记开发成Indel分子标记芯片并进行杂交为例对本发明的利用方法进行详细说明，该方法的流程图参见图1。
[0028] 1)供试材料：
[0029] 以抗枯萎病和靶斑病黄瓜材料WF2757(材料1)和PL212233(材料2)及感枯萎病和靶斑病材料津研二号(材料3)为试材。其中WF2757、PL212233和津研二号均购自北京市农作物种质资源库。
[0030] 2)黄瓜抗病Indel分子标记芯片探针设计
[0031] 根据对黄瓜抗枯萎病和靶斑病的定位研究结果(毛爱军等，黄瓜品系WIS2757对黄瓜枯萎病生理小种4和黑星病的抗性遗传与连锁分析，中国农业科学，2008，41(10):3382-3388)，结合对上述三种供试材料的重测序序列的生物信息学分析，筛选出了在黄瓜2号和6号染色体上两个抗病的Indel分子标记Indel1和Indel2(参见表1)。
Indel1和Indel2分别在抗/感材料中存在10bp和14bp的插入缺失差异。经过在相关遗传群体上对Indel1和Indel2的抗病筛选验证，确定了这2个Indel分子标记在研究群体中抗/感枯萎病和靶斑病筛选具有100％的准确性。利用Indel1和Indel2以及两翼DNA序列设计合成探针，探针序列分别为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的合成由生工生物工程(上海)有限公司完成，其中探针设计原则为：1)各探针特异性强；2)各探针杂交解链温度(即Tm值)尽量一致；3)探针集合的代价函数值要最小。
Indel1和Indel2分别在抗/感材料中存在10bp和14bp的插入缺失差异。经过在相关遗传群体上对Indel1和Indel2的抗病筛选验证，确定了这2个Indel分子标记在研究群体中抗/感枯萎病和靶斑病筛选具有100％的准确性。利用Indel1和Indel2以及两翼DNA序列设计合成探针，探针序列分别为序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的合成由生工生物工程(上海)有限公司完成，其中探针设计原则为：1)各探针特异性强；2)各探针杂交解链温度(即Tm值)尽量一致；3)探针集合的代价函数值要最小。
[0032] 表1分子标记Indel1和Indel2引物信息
[0033]
[0034] 3)黄瓜抗病Indel分子标记芯片探针点样
[0035] 将合成的探针SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2干粉分别用去离子水配制成浓度为20μM的溶液，然后将其与点样缓冲液等体积混合，取30μl混合液加入384孔点样载样板的各孔中，取待用基片置于点样仪上，按点样程序进行点样。
[0036] 注意：点样样品应该无颗粒、无沉淀，溶质均一，溶解于适宜的点样缓冲液中；样品浓度要适宜，不要太高或太低，浓度太高，容易堵塞针孔；将点样样品转移到96孔板或384孔板后，需要在离心机上短暂离心，使样品沉淀到底部，盖上塑料膜，点样或-20℃保存。
[0037] 本发明中使用的点样缓冲液(编号GCB02001)购自上海艮驰生物科技有限公司；点样仪为基因公司的OmniGrid Micro芯片点样仪。
[0038] 黄瓜抗病Indel分子标记芯片点样阵列的排放方式为：SEQ ID NO:1(探针1，用于筛选抗枯萎病基因)和SEQ ID NO:2(探针2，用于筛选抗靶斑病基因)在芯片上分别设置矩阵，每个探针均横行排列，各设5个位点作为重复，左半部分前两排为一组，右半部分前两排为左半部分的重复，具体参见图2，每种材料设置一个反应舱，图2中有三个反应舱，分别用于抗感材料DNA/PCR产物杂交验证。
[0039] 4)黄瓜抗病Indel分子标记芯片固定
[0040] 本发明选用氨基基片：将点样完毕的氨基基片放置于紫外(254nm)辐照400-800mJ，然后至于烘箱80℃水合30min，然后可以直接进行杂交或放置于真空干燥容器中保存待用。
[0041] 本发明中涉及的氨基基片和湿盒由上海艮驰生物科技有限公司提供；紫外交联仪为基因公司的UVP-HL-2000杂交炉；烘箱为基因公司的INFORSECOTRON温浴摇床；真空干燥器为上海艮驰生物科技有限公司的无油隔膜真空泵。
[0042] 5)黄瓜抗病Indel分子标记芯片杂交
[0043] 预杂交：根据芯片探针的点样模式，分别对每个样品的杂交反应贴置围栏(详见图2)；同时在相应围栏内加入150μL预杂交液A，40℃放置15min再除去预杂交液；
[0044] 杂交：
[0045] a)采用改良NaOH法高通量提取基因组DNA：
[0046] 供试材料：将浸种催芽后(胚芽长1cm左右)的黄瓜种子置于96孔中，[0047] 或直接将黄瓜种子(胚朝下)置于96孔板内，加适量水后27℃进行催[0048] 芽，期间注意观察，待胚芽长度超过1cm时为最佳。
[0049] 黄瓜种子/胚芽的预冻速冻及破碎处理：预冻前，吸取催芽过程中加入的水，然后向每个孔中放入2颗钢珠(直径3mm)，将装有试验材料和钢珠的深孔板(不盖盖子)放入液氮中速冻，然后利用组织破碎仪进行研磨3-5次，每次1500-2000转/分钟，植株组织样品以细粉状为宜。
[0050] Zephyr工作站结合NaOH法提取黄瓜种子基因组DNA，依次按照如下步骤进行：首先，研磨后，4000rpm，室温离心2分钟，确保样品粉末在深孔板底部，否则在后续加热过程中受热不均，影响DNA的提取效率。然后，将0.2mol/L NaOH溶液、枪头和96孔深孔板放在Zephyr工作站相应的位置，立即通过Zephyr MBW核酸工作站的96通道向96孔板每个孔内加入300μl的0.2mol/L NaOH溶液，一次可以加4个96孔板，即384个样品，然后将96孔板沸水浴1分钟，然后再加100μL、pH＝8.0的Tris-Hcl，混匀后将所述96孔板置沸水浴中2min，之后4000rpm，室温下离心5分钟。确保细胞成分杂质沉于底部，否则杂质混在上清液中，影响DNA纯度。之后，立即通过Zephyr MBW核酸工作站的96通道从各孔中取50μl上清液转移至新的96孔板，再向各孔的上清液中加入950μl0.2mol/L Tris-Hcl(pH8.0)进行稀释溶解。
[0051] b)PCR产物模板即黄瓜抗病Indel分子标记芯片模板的获得：根据检测位点序列信息，分别设计扩增引物进行PCR扩增，引物序列如序列表SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示，其用于扩增包含Indel1分子标记的基因片段，引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增包含Indel2分子标记的基因片段，扩增产物进行同位素标记(由生工生物工程上海有限公司完成标记)，然后将两个PCR扩增产物混合均匀，从而获得基因序列信息丰富的黄瓜抗病Indel分子标记芯片模板。
[0052] PCR反应体系(20μL)如下：50ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)4μL，ddH2O补足到
20μL。
20μL。
[0053] PCR反应程序为：阶段1：95℃预变性3min；阶段2：94℃30s，60℃1min，72℃1min，退火温度每个循环降1℃，共8个循环；阶段3：94℃30s，53℃30s，72℃1min，共32个循环；阶段4：72℃延伸5min；阶段5:4℃保存；其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler。
[0054] c)取步骤b)PCR产物模板20μL置于0.2ml离心管中，在金属浴或PCR仪进行98℃10min变性，然后速将离心管置于冰水混合物中并放置于-20℃冰箱放置5-10min；然后加入100μL杂交缓冲液B并混合均匀，再加入至已经过预杂交液处理的芯片上的围栏中。将芯片置于湿盒，放置于40℃～60℃烘箱中进行杂交，杂交时间为1～16hr。
[0055] 本发明中涉及的围栏、预杂交液A(编号GCB02002)、杂交缓冲液B(编号GCB02003)购自上海艮驰生物科技有限公司，杂交仪器为基因公司的SCIGENE777芯片洗涤工作站。
[0056] 6)黄瓜抗病Indel分子标记芯片杂交后洗脱与扫描
[0057] 经过杂交反应后吸去杂交液，依次加入150μL洗液C1和150μL洗液C2，于40℃下放置5min，然后利用普通移液器吸干芯片上的液体；最后直接利用基因芯片扫描仪进行结果显影扫描。
[0058] 本发明涉及的洗液C1(编号GCB02004)和洗液C2(编号GCB02005)购自上海艮驰生物科技有限公司，基因芯片荧光扫描仪为基因公司的InnoScan710生物芯片扫描系统。
[0059] 黄瓜抗病Indel分子标记芯片显影扫描结果参见图2，从图2中可见，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2探针在两种抗病材料中显示较强信号，且每个探针点重复都显示了均匀一致的高亮信号。而在感病材料中没有杂交信号，每个重复都无明显杂交信号产生。杂交结果验证了两个标记Indel1和Indel2在抗/感亲本材料中的序列差异，证实了本发明方法利用黄瓜抗病Indel分子标记开发的芯片检测分子标记的有效性，同时，该结果证实了Indel分子标记芯片技术体系的成功建立。在此基础上，我们可以利用多个Indel分子标记进行分析(如图3所示)。
[0060] 实施例2
[0061] 本实例以一未知群体来验证本发明的可靠性。具体操作如下：
[0062] 1)供试材料：
[0063] 以津春3号和长春密刺为亲本，构建600株F2遗传群体。其中津春3号和长春密刺购自北京市农作物种质资源库。
[0064] 2)黄瓜枯萎病和靶斑病病情指数调查
[0065] 将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。等子叶充分展开，并露出第一片真叶时，供接种用。
[0066] 供试菌种黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小种4号是通过黄仲生等的中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治文献(中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治，华北农学报，1994，9(4)：81-86)中记载的方法分离获得。采用翁祖信等(黄瓜枯萎病抗病性鉴定方法研究—胚根接种法，中国蔬菜,1985年02期)的方法制备黄瓜枯萎病菌液，血球计数板测定孢子浓度。采用浸根接种法:当黄瓜幼苗子叶展平时，6 6
拔出幼苗，用水洗净根部，在1×10～5×10 个孢子/mL的接种液中浸根，然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(规格6.5cm×6.5cm)中，在温室中培养。白天维持在24～28℃，夜间在16～20℃。3次重复，每次重复30株。
拔出幼苗，用水洗净根部，在1×10～5×10 个孢子/mL的接种液中浸根，然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(规格6.5cm×6.5cm)中，在温室中培养。白天维持在24～28℃，夜间在16～20℃。3次重复，每次重复30株。
[0067] 按上述方法接种后7～10d进行病情调查。病情分级标准为：0级：无症状；1级：1片子叶黄化；2级：2片子叶黄化或萎蔫；3级：1片真叶轻度萎蔫；4级：1～2片真叶明显萎蔫；5级：全株严重萎蔫或枯死。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。
[0068] 黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola(Berk.Curt.)Wei.]是通过高苇等在文献(河北青县黄瓜棒孢叶斑病病原菌种群分化的研究，华北农学报，2011，26(5):9-15)中记载的分离方法获得的。采用阚琳娜等(黄瓜褐斑病防治药剂的5
活体筛选，中国蔬菜，2007(4):22～24)的方法制备黄瓜靶斑病菌液，浓度为1×10个孢子/mL，血球计数板测定孢子浓度。于黄瓜幼苗期进行悬浮菌液喷雾接种，用小型手持喷雾器将制备好的悬浮菌液均匀地喷洒于黄瓜叶片上，以叶片有水滴流淌为度。接种后置于25℃光照培养箱中保湿培养。进行3次重复，每次重复30株。
活体筛选，中国蔬菜，2007(4):22～24)的方法制备黄瓜靶斑病菌液，浓度为1×10个孢子/mL，血球计数板测定孢子浓度。于黄瓜幼苗期进行悬浮菌液喷雾接种，用小型手持喷雾器将制备好的悬浮菌液均匀地喷洒于黄瓜叶片上，以叶片有水滴流淌为度。接种后置于25℃光照培养箱中保湿培养。进行3次重复，每次重复30株。
[0069] 按上述方法接种后7～10d进行病情调查。病情分级标准为：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；2级：病斑面积占5％～25％；3级：病斑面积占26％～
50％；4级：病斑面积占51％～75％；5级：病斑面积达75％以上。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。
50％；4级：病斑面积占51％～75％；5级：病斑面积达75％以上。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。
[0070] 对亲本及各群体的枯萎病和靶斑病病情进行精确统计。
[0071] 接种鉴定结果表明，亲本“津春3号”枯萎病和靶斑病具有完全抗性，“长春密刺”感枯萎病和靶斑病，杂交后代F1抗枯萎病和靶斑病，600株F2群体接种后，感病单株有144株，抗病单株456株。
[0072] 3)采用实施例1方法对本实施例步骤1)的供试材料进行检测，包括黄瓜抗病Indel分子标记芯片探针设计、探针序列、PCR模版的获得、点样、固定、杂交及洗脱与扫描，这些操作步骤与实施例1的相应步骤相同。
[0073] 采用本发明黄瓜枯萎病和靶斑病抗病Indel分子标记芯片对本实施例步骤1)的供试材料进行盲测的结果表明，“津春3号”和F1中显示较强信号，且每个探针点重复都显示了均匀一致的高亮信号。而在“长春密刺”中没有杂交信号，每个重复都无明显杂交信号产生。600株F2群体中，460株显示较强信号，且每个探针点重复都显示了均匀一致的高亮信号，140株没有杂交信号，每个重复都无明显杂交信号产生。盲测结果与其田间抗病性表现的吻合率达到98％以上，证实了本发明方法可以用于辅助育种。
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