技术领域
[0001] 本
发明涉及一种利用纳他霉素发酵酶解废液发酵生产聚谷氨酸的方法，属于
微生物发酵技术领域。
背景技术
[0002] γ-聚谷氨酸能溶于
水、可
生物降解、可食用、对人体无毒性、对环境无污染。由于其特殊的物理和化学特性，可以在食品制作中作为
增稠剂、在医药行业作为药物载体、
保湿剂等，广泛用于食品、医药和
化妆品行业中，在农业中也可以作为保水剂，果蔬的保鲜剂、防冻剂，也可以作为
水处理过程中的絮凝剂和重金属螯合剂等。
[0003] γ-聚谷氨酸漫淹于
土壤中时，会在植株根毛表层形成一层
薄膜，不但具有保护根毛的功能，更是土壤中养份、水份与根毛亲密
接触的最佳输送平台，能很有效率的提高
肥料的溶解、存储、输送与吸收。阻止
硫酸根、
磷酸根、
草酸根与金属元素产生沉淀作用，使作物能更有效的吸收土壤中磷、
钙、镁及微量元素。促进作物根系的发育，加强抗病性。并对酸、
碱具有绝佳缓冲能
力，可有效平衡土壤酸碱值，避免长期使用化学肥料所造成的酸性土质。
[0004] 但在现有的γ-聚谷氨酸发酵生产中都是直接在发酵培养基中加入大量氮源，由于用量较大，在一定程度上增加了生产成本。且生产过程中使用酸以及酒精等
有机溶剂，后续处理过程中
有机溶剂易对环境造成污染。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于克服上述
现有技术的不足，提供一种利用纳他霉素发酵酶解废液发酵生产聚谷氨酸的方法，本发明首次利用纳他霉素发酵酶解废液进行聚谷氨酸生产，通过酶解将一些大分子物质分解成小分子，使其更容易被枯草芽孢杆菌利用，从而发酵生产低分子量的聚谷氨酸。本发明方法工艺简单，减少氮源的使用，使生产成本大大降低，并减少发酵废液直接排放对环境的污染，部分残留的纳他霉素对
农作物由
真菌引起的的病害(如根腐病、
炭疽病、
白粉病等)起到一定的抑制作用，增强聚谷氨酸的使用效果。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，一种利用纳他霉素发酵酶解废液发酵生产聚谷氨酸的方法，将纳他霉素生产过程中酶解离心后的废液，添加
碳源及谷氨酸钠，接入枯草芽孢杆菌发酵；发酵结束后，发酵液直接用
磷酸盐进行喷雾，即可获得农业级聚谷氨酸。
[0007] 具体的，包括以下步骤：
[0008] (1)发酵液培养：将纳他霉素酶解后离心废液中按比例接入
柠檬酸、MgSO4、磷酸氢二
钾、碳源和谷氨酸钠，配制成发酵培养基，以5％的接种量接种枯草芽孢杆菌，进行发酵培养，发酵时间50-60h。
[0009] (2)发酵液处理：发酵结束后，将发酵液中直接加入磷酸盐进行
喷雾干燥，得到农业级聚谷氨酸粗品。
[0010] 所述步骤(1)中的发酵培养基组成为：纳他霉素酶解离心废液中添加柠檬酸2～5g/L，MgSO4 0.1～0.5g/L，
磷酸氢二钾1-3g/L，碳源80～150g/L，谷氨酸钠50-70g/L，pH
7.2～7.5，115℃灭菌20min。
[0011] 所述碳源为
葡萄糖、
蔗糖、糖蜜、玉米浆中的一种或几种。
[0012] 所述步骤(1)中的发酵条件：
温度34～37℃、好
氧条件下搅拌培养120～260rpm，发酵时间50-60h。
[0013] 所述步骤(2)中的磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠中的一种或几种。所述步骤(2)中的磷酸盐用量为发酵液重量的3.5～4.0％。
[0014] 所述农业级聚谷氨酸，分子量为20-30万道尔顿。
[0015] 纳他霉素生产过程中酶解离心后的废液，其中
蛋白质含量约6.5％，单糖含量约3％，脂肪含量约2.3％。废液中有机氮含量高，酶解后的废液中蛋白质和脂肪等有机大分子物质被
水解成
水溶性的小肽和
脂肪酸等小分子物质，更有利于枯草芽孢杆菌的利用。因此，发酵产量更高。
[0016] 本发明的突出优点是：
[0017] (1)发酵产量高
[0018] 利用纳他霉素酶解废液发酵生产聚谷氨酸，产量较其他常规废液(如
味精母液、谷氨酸发酵废料)发酵提高15％以上。且不需要使用大量的氮源，降低了生产成本。
[0019] (2)产品为更适用农业中使用的低分量的聚谷氨酸
[0020] 使用本发明方法获得的聚谷氨酸分子量仅为20-30万道尔顿，与原本70万道尔顿以上相比，低分量的聚谷氨酸更利于农业中的使用。另外，残留部分纳他霉素晶体(占比约2‰)，可以在聚谷氨酸使用过程中，对农作物由真菌引起的的病害(如根腐病、炭疽病、白粉病等)起到一定的抑制作用，增强其使用效果。
[0021] (3)本发明工艺流程简单，收集聚谷氨酸成品时，不需要使用酸调节pH，不使用酒精进行沉淀，发酵液直接采用喷雾的方式，收率提高20％以上。因此，生产成本大大降低并减少人力物力的消耗。
[0022] (4)充分利用废液，解决了纳他霉素酶解废液排放对环境的污染及物料的浪费问题。生产过程中不使用酸以及酒精等有机溶剂，降低了环境污染并减少物料的浪费。
附图说明
[0023] 图1为不同废液发酵聚谷氨酸产量对比；比较采用味精母液、谷氨酸发酵废料、纳他霉素酶解废液发酵生产聚谷氨酸产量。
[0024] 图2为纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸直接
喷雾法与醇沉法收率比较；比较10批次样品，直接喷雾所得收率远远高于常规醇沉法。
[0025] 图3为纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸与普通聚谷氨酸对小麦白粉病抑制作用比较。
具体实施方式
[0026] 下面结合具体试验方法对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述。应当理解，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0028] 纳他霉素酶解离心废液8L，按照如下比例加入原料：2g/L柠檬酸，0.2g/L MgSO4，葡萄糖100g/L，谷氨酸钠55g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的接种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH 7.3、温度35℃、搅拌转速200rpm，发酵时间55h，最终γ-聚谷氨酸含量达到60g/L。发酵结束后，向发酵液中添加3.5％的磷酸二氢钾，实验室小型喷塔160℃喷雾干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品。实验重复性好。
[0029] 实施例2
[0030] 纳他霉素酶解离心废液8T，按照如下比例加入原料：2.5g/L柠檬酸，0.3g/L MgSO4，葡萄糖120g/L，谷氨酸钠60g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的转种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH 7.4、温度37℃、搅拌转速150rpm，发酵时间52h，最终γ-聚谷氨酸含量达到65g/L。发酵结束后，向发酵液中添加4.0％的磷酸二氢铵，165℃喷雾干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品。实验重复性好。
[0031] 试验例1不同废液发酵聚谷氨酸产量对比
[0032] 分别利用纳他霉素酶解废液、味精母液、菌体废弃物、谷氨酸发酵废料生产聚谷氨酸，对比产量。
[0033] 实验一纳他霉素酶解废液8L，添加2.5g/L柠檬酸，0.25g/L MgSO4，磷酸氢二钾1.5g/L，葡萄糖120g/L，谷氨酸钠55g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的转种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH 7.4、温度37℃、搅拌转速200rpm，发酵时间55h，最终γ-聚谷氨酸发酵含量达到63g/L。
[0034] 实验二发酵培养基8L(纯化水配置)，组成为：
酵母蛋白胨35g/L，2.5g/L柠檬酸，0.25g/L MgSO4，磷酸氢二钾1.5g/L，葡萄糖120g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的转种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH
7.4、温度37℃、搅拌转速200rpm，发酵时间55h，发酵过程中流加味精母液(浓度45-50％)，控制谷氨酸钠浓度15-20g/L。最终γ-聚谷氨酸发酵含量达到50g/L。
[0035] 实验三发酵培养基8L(纯化水配置)，组成为：菌体蛋白水解液10％，2.5g/L柠檬酸，0.25g/L MgSO4，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠50g/l，葡萄糖120g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的转种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH 7.4、温度37℃、搅拌转速200rpm，发酵时间55h，最终γ-聚谷氨酸发酵含量达到33g/L。
[0036] 实验四谷氨酸提取后浓缩废液8L(谷氨酸浓度10-15g/L)，酵母蛋白胨30g/L，2.5g/L柠檬酸，0.25g/L MgSO4，磷酸氢二钾1.5g/L，谷氨酸钠20g/l，葡萄糖120g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的转种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH 7.4、温度37℃、搅拌转速200rpm，发酵时间55h，最终γ-聚谷氨酸发酵含量达到32g/L。
[0037] 如图1所示，以上实验结果显示，使用不同废料进行聚谷氨酸生产时，差别较明显，使用纳他霉素发酵酶解废液，因其废液中有机氮含量高，酶解后的废液中蛋白质和脂肪等有机大分子物质被水解成水溶性的小肽和脂肪酸等小分子物质，更有利于枯草芽孢杆菌的利用。因此，发酵产量更高。
[0038] 试验例2纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸直接喷雾法与醇沉法收率比较[0039] 纳他霉素酶解离心废液8T，按照如下比例加入原料：2.0g/L柠檬酸，0.3g/L MgSO4,，葡萄糖120g/L，谷氨酸钠65g/L，pH 7.2～7.5，115℃灭菌20min。使用枯草芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵，以5％的转种量接种发酵培养基，发酵条件：初始pH 7.5、温度37℃、搅拌转速160rpm，发酵时间55h，最终γ-聚谷氨酸含量达到67g/L。发酵结束后，均分成20份，分别采用醇沉和直接喷雾的方法进行聚谷氨酸回收，计算批收率。
[0040] 直接喷雾法：取其中一份(约400L)发酵液，添加16kg磷酸二氢钾，170℃直接喷雾干燥。实验共进行10次，重复性良好，批收率95％以上。
[0041] 常规醇沉法：取其中一份(约400L)发酵液，
盐酸调pH至2.8-3.2，加入约2T-2.5T成品酒精进行沉淀，抽走上清(上清含量约1.2-1.5g/l)，再分次加入无水
乙醇进行脱水，干燥。实验共进行10次，重复性良好，批收率80％左右。
[0042] 如图2所示，以上结果显示，醇沉法回收聚谷氨酸因沉淀脱水次数较多，上清损失较大，而发酵液加入一定比例辅料直接喷雾可最大可能的将发酵液中含有的聚谷氨酸及菌体全部
回收利用，其收率远远高于醇沉法。
[0043] 试验例3纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸对小麦白粉病的抑制效果[0044] 选取长势良好的小麦
幼苗(实验室提前培养)共2000株，随机分成两等份，标注实验组1和实验组2。
[0045] 分别配置1％常规聚谷氨酸水溶液和1％纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸水溶液，备用。
[0046] 野外采集患白粉病的小麦
叶片，实验室进行病原真菌分离培养，备用。
[0047] 实验开始前3天，分别使用1％常规聚谷氨酸水溶液喷洒实验组1，使用1％纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸水溶液喷洒实验组2，之后开始进行实验。
[0048] 实验开始时，在实验组1和2小麦叶片先均匀喷洒1％常规聚谷氨酸水溶液和1％纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸水溶液，过2小时后再喷洒上白粉病致病菌群。
[0049] 之后每隔5天喷洒一次聚谷氨酸水溶液，观察记录小麦幼苗发病情况，实验共进行30天。
[0050] 如图3所示，实验结果显示，使用1％纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸水溶液喷洒的实验组2发病缓慢，实验进行30天发病率仅35％，而使用1％常规聚谷氨酸水溶液喷洒的实验组1进行30天发病率高达90％以上，说明纳他霉素酶解废液发酵后聚谷氨酸抑制霉菌效率远远高于常规聚谷氨酸。
