一种利用菌渣制作花脸香蘑栽培种的方法
阅读：946发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种利用菌渣制作花脸香蘑栽培种的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种花脸香蘑栽培种培养料，按重量百分比计，由以下组分组成：鸡粪38%，金针菇废菌渣35%，麦秸25%， 石膏 1%， 碳 酸 钙 1%。同时公开了花脸香蘑培养料培养花脸香蘑栽培种的方法。本发明通过将金针菇菌渣加入到花脸香蘑栽培种的培养料中，提高了培养基的营养，增强了菌种的活 力 ，促使菌丝具有较强的萌发力，并且菌丝生长快，菌丝体生长稠密、粗壮，与传统栽培种相比，本发明所述的培养料原料来源丰富、稳定，成本低，利用该培养料制备的栽培种胞外酶系丰富，萌发快，吃料能力强，易于推广和普及，并且很好的解决了金针菇菌渣的高效再利用问题。，下面是一种利用菌渣制作花脸香蘑栽培种的方法专利的具体信息内容。
1.一种花脸香蘑栽培种培养料，其特征在于，按重量百分比计，由以下组分组成：鸡粪
15-45%麦秸10-30%，石膏0.5-3.5%，碳酸钙0.5-3%，金针菇废菌渣10-50%。
2.根据权利要求1所述的一种花脸香蘑培养料，其特征在于，按重量百分比计，由以下组分组成：鸡粪38%，金针菇废菌渣35%，麦秸25%，石膏1%，碳酸钙1%。
3.采用权利要求1或2所述的花脸香蘑培养料培养花脸香蘑栽培种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预湿：按配方准确称取鸡粪、金针菇废菌渣、麦秸，按照料水比1:1.2-1:1.4加水，提前12-36h用1-2%的石灰水进行浸泡预湿；金针菇废菌渣经晒干后粉碎成粒径0.2-0.7cm的颗粒状，麦秸切成长1-4 cm的小段；
（2）装袋：按配方准确称取碳酸钙和石膏，用水溶解并搅拌均匀后加入经预湿的其它培养料中，调节培养基质中的含水量至55-65%，调节培养料酸碱度至pH7.5—pH9，选用17 cm× 33 cm规格的聚丙烯袋装料，每袋装湿料1000 g；
（3）灭菌冷却：使装完培养料的菌袋保持外壁干净，扣紧带通气滤膜的塑料盖封口，进行高压蒸汽灭菌，121℃，2h，冷却至25℃以下后接种；
（4）接种：将花脸香蘑菌种转接到改良的PDA平板培养基上，避光条件下置于25℃培养箱静置培育6-10d后即可得活化平板菌种；挑取8-10块经活化的花脸香蘑菌种块，每块
0.5cm2，接种到液体培养基中，在温度25-26℃，转速120r/min的摇床中震荡培养2d后，调整摇床温度为24-25℃，转速130-150r/min继续培养4-5d，即得液体菌种；无菌操作，每袋接种花脸香蘑液体菌种20mL，加入上述步骤（3）灭菌冷却的含金针菇菌渣配方的花脸香蘑培养料中；
（5）培养：调节恒温恒湿培养箱，控制温度为24-25℃，湿度为55-65%，培养50-60d，得到花脸香蘑栽培种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的改良的PDA平板培养基配方为：马铃薯20%，葡萄糖1%，蔗糖1%，酵母粉0.2%，琼脂2%。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的液体培养基配方为：玉米碴1%，葡萄糖1%，麦芽糖1%，蛋白胨0.2%，酵母粉0.3%，磷酸二氢钾0.1%，七水硫酸镁0.05%。
6.根据权利要求3所制备的花脸香蘑栽培种可转接到栽培袋中进行花脸香蘑出菇栽培。
7.根据权利要求3所制备的花脸香蘑栽培种经覆土后，可直接进行花脸香蘑出菇栽培。
一种利用菌渣制作花脸香蘑栽培种的方法
技术领域
背景技术
[0002] 近几年来，随着人们生活水平的提高和健康饮食理念的深入人心，食用菌的市场需求不断上升，其中高档珍稀食用菌品种更是被人们所青睐，价格达到传统大宗食用菌种类的几倍甚至几十倍，利润非常可观，这也使人们逐渐认识到对食用菌栽培进行科学性研究尤其是对高档珍稀食用菌栽培进行科学研究意义重大。花脸香蘑作为一种珍稀食用菌品种，极具开发潜力。花脸香蘑分类学上属于担子菌门，伞菌纲，伞菌目，口蘑科，香蘑属。新鲜的花脸香蘑子实体菌盖扁半球形，颜色为紫色或粉紫色，菌柄圆柱形，颜色为浅紫色或藕粉色。花脸香蘑味道鲜美，色泽诱人且具有非常高的药用价值和营养价值，但是野生的花脸香蘑菌株数量很少且栽培难度大，十分珍贵。早在2000年，我国国内福建、云南等地开始出现有少量有关花脸香蘑的报道，但大多停留在初级阶段的研究，仅有小规模成功栽培报道，但是仍表现出生物转化率低，甚至不出菇等主要问题。因此花脸香蘑菌株人工栽培的研究是当前急需解决的问题，而花脸香蘑栽培种配方的选择又是解决问题的关键一环。花脸香蘑属于草腐真菌，生长过程中主要是以纤维素、半纤维素、木质素、淀粉等大分子物质作为碳源，因此，花脸香蘑栽培种是否能分泌出丰富能降解这些大分子物质的胞外酶系以及酶活的高低都直接影响到后期菌丝萌发以及吃料的能力，对于成功开展花脸香蘑的栽培至关重要。
[0003] 金针菇由于其高蛋白、低脂肪、低能量、富含矿质元素和维生素等优势，已成为人们日常饮食中不可缺少的一部分。进入80年代后，我国的食用菌发展极为迅速，已成为食用菌超级大国。金针菇是国内工厂化生产程度最高的食用菌种类，每天都会持续产生数量巨大的、来源稳定的、质量可控的金针菇菌渣，随着食用菌金针菇的发展，金针菇的菌渣即栽培金针菇后的废料也越来越多，我国每年产生的金针菇菌渣有数百万吨，由于大多数栽培人员对菌渣的营养价值不太了解，金针菇的菌渣往往被随地丢弃或燃烧，或者集中在饲料和肥料领域，对菌渣的利用缺乏多样化。菌渣中尚含有大量的菌丝体，仍含有丰富的营养物质，霉菌和害虫极易在其中繁衍增殖，一方面造成了资源的极大浪费，另一方面由于霉菌和害虫的生长，势必会增加空气中霉菌孢子和害虫的数量，造成空气污染。
[0004] 因此，我们创新性的研究出该发明中的含有金针菇菌渣的花脸香蘑栽培种培养料配方，以期为花脸香蘑这种高档珍稀食用菌的人工栽培和金针菇菌渣的高效利用开创一条新路径。
发明内容
[0005] 为了解决上述问题，本发明公开了一种花脸香蘑栽培种培养料，按重量百分比计，由以下组分组成：鸡粪38%，金针菇废菌渣35%，麦秸25%，石膏1%，碳酸钙1%。同时公开了利用该培养料栽培花脸香蘑的方法。为以后进一步探索高产栽培的配方，合理的栽培管理，以及金针菇菌渣的高效利用技术，提供一定的理论依据。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：一种花脸香蘑培养料，按重量百分比计，由以下组分组成：鸡粪15-45%，金针菇废菌渣
10-50%，麦秸10-30%，石膏0.5-3.5%，碳酸钙0.5-3%。
10-50%，麦秸10-30%，石膏0.5-3.5%，碳酸钙0.5-3%。
[0007] 优选地，花脸香蘑培养料，按重量百分比计，由以下组分组成：鸡粪38%，金针菇废菌渣35%，麦秸25%，石膏1%，碳酸钙1%。
[0008] 上述所述的花脸香蘑培养料生产花脸香蘑栽培种的方法，包括以下步骤：（1）预湿：按配方准确称取鸡粪、金针菇废菌渣、麦秸，按照料水比1:1.2-1:1.4加水，提前12-36h用质量分数1-2%的石灰水进行浸泡预湿；金针菇废菌渣经晒干后粉碎成粒径0.2-
0.7cm的颗粒状，麦秸切成长1-4 cm的小段；
（2）装袋：按配方准确称取碳酸钙和石膏，用水溶解并搅拌均匀后加入经预湿的其它培养料中，调节培养基质中的含水量至55-65%，调节培养料酸碱度至pH7.5—pH9，选用17 cm× 33 cm规格的聚丙烯袋装料，每袋装湿料1000 g；
（3）灭菌冷却：使装完培养料的菌袋保持外壁干净，扣紧带通气滤膜的塑料盖封口，进行高压蒸汽灭菌，121℃，2h，冷却至25℃以下后接种；
（4）接种：将花脸香蘑菌种转接到改良的PDA平板培养基上，避光条件下置于25℃培养箱静置培育6-10d后即可得活化平板菌种；挑取8-10块经活化的花脸香蘑菌种块，每块
0.5cm2，接种到液体培养基中，在温度25-26℃，转速120r/min的摇床中震荡培养2d后，调整摇床温度为24-25℃，转速130-150r/min继续培养4-5d，即得液体菌种；无菌操作，每袋接种花脸香蘑液体菌种20mL，加入上述步骤（3）灭菌冷却的含金针菇菌渣配方的花脸香蘑培养料中；
（5）培养：调节恒温恒湿培养箱，控制温度为24-25℃，湿度为55-65%，培养50-60d，得到花脸香蘑栽培种。
0.7cm的颗粒状，麦秸切成长1-4 cm的小段；
（2）装袋：按配方准确称取碳酸钙和石膏，用水溶解并搅拌均匀后加入经预湿的其它培养料中，调节培养基质中的含水量至55-65%，调节培养料酸碱度至pH7.5—pH9，选用17 cm× 33 cm规格的聚丙烯袋装料，每袋装湿料1000 g；
（3）灭菌冷却：使装完培养料的菌袋保持外壁干净，扣紧带通气滤膜的塑料盖封口，进行高压蒸汽灭菌，121℃，2h，冷却至25℃以下后接种；
（4）接种：将花脸香蘑菌种转接到改良的PDA平板培养基上，避光条件下置于25℃培养箱静置培育6-10d后即可得活化平板菌种；挑取8-10块经活化的花脸香蘑菌种块，每块
0.5cm2，接种到液体培养基中，在温度25-26℃，转速120r/min的摇床中震荡培养2d后，调整摇床温度为24-25℃，转速130-150r/min继续培养4-5d，即得液体菌种；无菌操作，每袋接种花脸香蘑液体菌种20mL，加入上述步骤（3）灭菌冷却的含金针菇菌渣配方的花脸香蘑培养料中；
（5）培养：调节恒温恒湿培养箱，控制温度为24-25℃，湿度为55-65%，培养50-60d，得到花脸香蘑栽培种。
[0011] 上述方法所制备的花脸香蘑栽培种可转接到栽培袋中进行花脸香蘑出菇栽培。
[0012] 上述方法所制备的花脸香蘑栽培种经覆土后，可直接进行花脸香蘑出菇栽培。
[0013] 有益效果本发明通过将金针菇菌渣加入到花脸香蘑的培养料中，提高了培养基的营养，增强了菌种的活力，促使菌丝具有较强的萌发力，并且菌丝生长快，菌丝体生长稠密、粗壮，与传统栽培种相比，本发明所述的培养料原料来源丰富，稳定，成本低，利用该培养料制备的栽培种胞外酶系丰富，萌发快，吃料能力强，易于推广和普及，并且很好的解决了金针菇菌渣的高效再利用问题。
[0014] 食用菌废菌渣，是利用秸秆、木屑等农副产品下脚料进行食用菌栽培时，鲜菇采收结束后剩余的培养基，是食用菌菌丝残体及经食用菌酶解、结构发生质变的粗纤维等成分的复合物，菌糠中含有丰富的蛋白质、多糖及其他营养成分这些营养成分非常适合菌丝生长。选用加入35%金针菇废菌渣的配方作为培养基质时，特别适用于花脸香蘑的培养，能够显著促进花脸香蘑的生长，经过酶活测定得到花脸香蘑菌株中4种酶的酶活与常规培养料配方和其它菌渣培养料配方比较，均为最高。其中花脸香蘑菌株CMC酶活高达1.00U，花脸香蘑半纤维素酶活力较高为1.78U，淀粉酶酶活力高达1.58U，漆酶酶活高达0.90U。因此可以从菌丝生长状况、菌丝生长速率和胞外酶活三个方面都可以佐证配方（鸡粪38%、金针菇废菌渣35%、麦秸25%、石膏1%、碳酸钙1％）为最优培养基质。这对未来解决花脸香蘑人工驯化栽培中产量低、成本高、周期长等缺点具有重大意义。附图说明
[0015] 图1葡萄糖测定标准曲线；图2木糖测定标准曲线；
图3不同培养时间花脸香蘑菌丝生长速率的比较；
图4不同栽培种配方花脸香蘑生长速率的比较；
图5不同栽培种配方花脸香蘑CMC酶活力比较；
图6不同栽培种配方花脸香蘑栽培种半纤维素酶活力比较；
图7不同栽培种配方花脸香蘑栽培种淀粉酶活力比较；
图8不同栽培种配方花脸香蘑栽培种漆酶活力比较。
图3不同培养时间花脸香蘑菌丝生长速率的比较；
图4不同栽培种配方花脸香蘑生长速率的比较；
图5不同栽培种配方花脸香蘑CMC酶活力比较；
图6不同栽培种配方花脸香蘑栽培种半纤维素酶活力比较；
图7不同栽培种配方花脸香蘑栽培种淀粉酶活力比较；
图8不同栽培种配方花脸香蘑栽培种漆酶活力比较。
具体实施方式
[0016] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0017] 实施例11材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
花脸香蘑LS菌株，青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室分离、保藏。
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
花脸香蘑LS菌株，青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室分离、保藏。
[0018] 1.1.2 药品与试剂表1 试验药品
1.1.3 供试培养料配方
表2栽培种配方设计
1.2 试剂配制
1.2.1 DNS试剂的配置
在烧杯中加入1L蒸馏水同时打开水浴锅，调节温度在45℃以下，放入烧杯。用天平准确称取二硝基水杨酸12.6g，酒石酸钾钠370g依次加入烧杯中，量取浓度2mol/L NaOH 524ml加入烧杯中，再在烧杯中加入10g苯酚和10g亚硫酸钠。使用磁力搅拌器使药品完全溶解。最后等温度降低后，蒸馏水补足至2L。
1.1.3 供试培养料配方
表2栽培种配方设计
1.2 试剂配制
1.2.1 DNS试剂的配置
在烧杯中加入1L蒸馏水同时打开水浴锅，调节温度在45℃以下，放入烧杯。用天平准确称取二硝基水杨酸12.6g，酒石酸钾钠370g依次加入烧杯中，量取浓度2mol/L NaOH 524ml加入烧杯中，再在烧杯中加入10g苯酚和10g亚硫酸钠。使用磁力搅拌器使药品完全溶解。最后等温度降低后，蒸馏水补足至2L。
[0019] 1.2.2 ABTS试剂的配置0.5mmol/L的ABTS溶液制备:用分析天平准确称取药品ABTS的质量为0.13g。加入事先配置好pH 4.0 的2-羟基丙烷-1，2，3-三羧缓冲液中，边加边搅拌，待药品充分溶解，最后定容至1L。
[0020] 1.2.3 缓冲液的配置1.2.3.1 pH 4.8柠檬酸缓冲液的配制
用分析天平精确称取84.4g的2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸和56.8gNaH2PO4，倒入烧杯中，加入一定量的蒸馏水，此过程中需要不断对药品进行搅拌，最后使药品完全溶解，定容到2L，分别选取两个试剂瓶杯装A液以及B液。准确量取A液986mL和B液1014mL，混匀，即得。
用分析天平精确称取84.4g的2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸和56.8gNaH2PO4，倒入烧杯中，加入一定量的蒸馏水，此过程中需要不断对药品进行搅拌，最后使药品完全溶解，定容到2L，分别选取两个试剂瓶杯装A液以及B液。准确量取A液986mL和B液1014mL，混匀，即得。
[0021] 1.2.3.2 pH 4.0柠檬酸缓冲液的配置用分析天平精确称取21.1g 柠檬酸和28.4g NaH2PO4，倒入烧杯中，此过程中需要不断对药品进行搅拌，目的是配得均一的溶液药品完全溶液，最后加蒸馏水定容到1L，分别选取两个试剂瓶杯装A液以及B液。准确量取A液385.5mL，B液614.5mL，使其彻底混匀，即可。
[0022] 1.2.3.3 pH 4.6醋酸缓冲液的配置用分析天平精确称取称取无水乙酸钠的质量为4.1g，量取浓度为0.2mol/L 醋酸溶液溶解药品，向容量瓶中加入0.2mol/L 醋酸溶液逐渐直至精确定容到500mL
1.2.3.4 10mg/mL木聚糖溶液配置
用分析天平精确称取5g的木聚糖，边加入醋酸溶液边搅拌，此过程中需要不断对药品进行搅拌，目的是配得均一的溶液药品完全溶解，最后精确定容到500mL。
1.2.3.4 10mg/mL木聚糖溶液配置
用分析天平精确称取5g的木聚糖，边加入醋酸溶液边搅拌，此过程中需要不断对药品进行搅拌，目的是配得均一的溶液药品完全溶解，最后精确定容到500mL。
[0023] 1.2.3.5 1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液的配置用分析天平精确称取羧甲基纤维素钠的质量为5g备用，量取事先配置好的1.2.3.3醋酸缓冲液，边加入醋酸缓冲溶液边搅拌，使羧甲基纤维素钠完全溶解，最后向容量瓶中加醋酸缓冲溶液直至定容到500mL。
[0024] 1.3菌丝性状观察、生长速率测定方法1.3.1栽培种制作
预湿：称按配方准确称取鸡粪7500g、金针菇废菌渣1500g、香菇废菌渣1500g、杏鲍菇废菌渣1500g、麦秸4700g、玉米秸3000g。麦秸、玉米秸切成长1-4cm，金针菇废菌渣、香菇废菌渣、杏鲍菇废菌渣晒干揉碎。按照料水比1:1.2-1:1.3，提前24h进行浸泡预湿。
预湿：称按配方准确称取鸡粪7500g、金针菇废菌渣1500g、香菇废菌渣1500g、杏鲍菇废菌渣1500g、麦秸4700g、玉米秸3000g。麦秸、玉米秸切成长1-4cm，金针菇废菌渣、香菇废菌渣、杏鲍菇废菌渣晒干揉碎。按照料水比1:1.2-1:1.3，提前24h进行浸泡预湿。
[0025] 装袋：记录培养料吸水情况，称重培养料计算含水量，待培养料充分吸水后开始进行装袋，将事先称量溶解的碳酸钙和石膏搅拌均匀加入培养料中，调节培养基质中的含水量，使含水量在60%左右。调节pH，控制在pH =8.5。选用17 cm x 33 cm规格的聚丙烯袋装料，装完菌渣称重使每袋装湿料1000 g。
[0026] 灭菌冷却：使装完培养料的菌袋保持外壁干净，扣紧带通气滤膜的塑料盖，封口，进行高压灭菌，121℃，2h，冷却至25℃以下接种。
[0027] 接种：将供试菌种转接到改良的PDA平板培养基上，避光条件下置于25℃培养箱静置培养得活化平板菌种。挑取8-10块(每块约0.5cm2)活化后的花脸香蘑菌种，接种到液体培养基中，在温度25℃左右，转速120r/min左右的摇床中震荡培养6-8d后，即得液体菌种。无菌操作，每袋接种花脸香蘑液体菌种20mL。
[0028] 培养：控制恒温恒湿培养箱的温度为25℃左右，湿度为60%左右。放入接种后的花脸香蘑栽培种避光培养，每天定时观察记录萌发及生长情况。
[0029] 1.3.1.4菌丝生长状况测定每天定时记录菌丝长势、菌丝颜色，最后记录下菌袋长满的天数。菌丝长势分三个等级：稠密、较密、较稀，菌丝颜色分为三个等级：粉紫、淡紫、较白。
[0030] 待菌丝长满料面，每间隔10d对菌丝生长情况进行测量，计算菌丝生长速率。
[0031] 菌丝生长速率（cm/d）=菌丝生长深度（cm）/培养时间(d)。
[0032] 1.4.花脸香蘑四种胞外酶酶活测定具体步骤1.4. 1 漆酶活力测定
采用1.2.3.2配制的缓冲液将粗酶液稀释，取稀释后的粗酶液3mL加入试管中，再取
0.5mmol/L的ABTS2mL将试管定容至10mL，打开水浴锅在30℃，将实验所用到的试剂放置在
30℃水浴锅中。将ABTS溶液与稀释的粗酶液混合均匀，然后酶解反应启动，在420nm下测量吸光值，每3min记录反应液OD值的变化情况，酶解过程中需要至少记录6个数据。
采用1.2.3.2配制的缓冲液将粗酶液稀释，取稀释后的粗酶液3mL加入试管中，再取
0.5mmol/L的ABTS2mL将试管定容至10mL，打开水浴锅在30℃，将实验所用到的试剂放置在
30℃水浴锅中。将ABTS溶液与稀释的粗酶液混合均匀，然后酶解反应启动，在420nm下测量吸光值，每3min记录反应液OD值的变化情况，酶解过程中需要至少记录6个数据。
[0033] 漆酶酶活计算公式：U/L=A*V*10^6/(εLtv）A：连续两次吸光值的差值；
V：反应体系总体积；
ε=3.6*10^4(mol/L)-1cm-1;
L：比色皿直径；
t：反应时间；
v：样品体积；
1.4. 2 羧甲基纤维素酶活力测定
取1%羧甲基纤维素钠溶液加入试管将粗酶液稀释，再取1mL稀释后的粗酶液于试管中，打开水浴锅，调节温度到40℃，水浴30min，取1.5mL3.5-二硝基水杨酸试剂加入试管中，调节水浴锅温度为100℃，水浴5min，冷却到室温后，加蒸馏水定容到12.5mL，在540nm下测定吸光值，用灭活的稀释粗酶液做空白对照。根据DNS测定的葡萄糖标准曲线，计算出羧甲基纤维素酶降解羧甲基纤维素钠所得到的葡萄糖含量，酶活定义为一分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，U=1μmol/（min.mL酶）*稀释倍数。
V：反应体系总体积；
ε=3.6*10^4(mol/L)-1cm-1;
L：比色皿直径；
t：反应时间；
v：样品体积；
1.4. 2 羧甲基纤维素酶活力测定
取1%羧甲基纤维素钠溶液加入试管将粗酶液稀释，再取1mL稀释后的粗酶液于试管中，打开水浴锅，调节温度到40℃，水浴30min，取1.5mL3.5-二硝基水杨酸试剂加入试管中，调节水浴锅温度为100℃，水浴5min，冷却到室温后，加蒸馏水定容到12.5mL，在540nm下测定吸光值，用灭活的稀释粗酶液做空白对照。根据DNS测定的葡萄糖标准曲线，计算出羧甲基纤维素酶降解羧甲基纤维素钠所得到的葡萄糖含量，酶活定义为一分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，U=1μmol/（min.mL酶）*稀释倍数。
[0034] 1.4. 3 半纤维素酶活力测定将粗酶液稀释适当倍数，在试管中加入0.25mL粗酶液，取0.75mL木聚糖（10mg/mL）放入试管中，打开水浴锅调节温度50℃，水浴酶解30min，后取1.5mL 3.5-二硝基水杨酸试剂加入，调节水浴锅温度在100℃，沸水浴5-10min，冷却降至室温，后定容到12.5mL， 在540nm下测定A值，将粗酶液灭活的做作对照。酶活定义为一分钟生成1μmol木糖所需的酶量，U=1μmol/（min.mL酶）*稀释倍数。酶活公式为：U=S*D*1000/150/30/L。
[0035] S：测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量，mg;D：酶液的稀释倍数；
1000：mg和μg之间的换算系数；
150：木糖分子量，g/mol；
30：酶解时间；
L：吸收的酶液体积。
1000：mg和μg之间的换算系数；
150：木糖分子量，g/mol；
30：酶解时间；
L：吸收的酶液体积。
[0036] 1.4. 4 淀粉酶活性的测定用移液管取950μL 1%可溶性淀粉和粗酶液50uL加入试管中，调节水浴锅温度为50℃，将试管放在水浴锅中水浴保温30min后，立即加入3.5-二硝基水杨酸试剂1.5mL，调节水浴锅温度为100℃，沸水水浴5min，取出试管冷却至室温，用蒸馏水稀释定容到12.5mL，在
540nm下测量吸光值。用3.5-二硝基水杨酸测还原糖标准曲线，计算可溶性淀粉被淀粉酶分解的葡萄糖含量。1个酶活单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。每个样品3个重复，用沸水浴灭活的粗酶液作对照。酶活定义为一分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，U=1μmol/（min.mL酶）*稀释倍数。酶活计算公式：U=S*D*1000/180/30/L（S为标准曲线上葡萄糖含量，D为稀释倍数，180为葡萄糖分子量，30为酶解时间，L为样品体积）。
540nm下测量吸光值。用3.5-二硝基水杨酸测还原糖标准曲线，计算可溶性淀粉被淀粉酶分解的葡萄糖含量。1个酶活单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。每个样品3个重复，用沸水浴灭活的粗酶液作对照。酶活定义为一分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量，U=1μmol/（min.mL酶）*稀释倍数。酶活计算公式：U=S*D*1000/180/30/L（S为标准曲线上葡萄糖含量，D为稀释倍数，180为葡萄糖分子量，30为酶解时间，L为样品体积）。
[0037] 1.5 DNS测还原糖标准曲线制作1.5.1 葡萄糖标准曲线
配置1mg/mL的标准葡萄糖溶液250mL。用移液管准确取不同梯度的葡萄糖标准溶液加入试管中，用蒸馏水定容至1mL，打开水浴锅，调节温度至100℃，加入1.5mL 提前一周配置好的DNS试剂水浴10min，取出试管降温，待温度降至室温，加入蒸馏水将试管内溶液准确定容到12.5mL，混匀，调节分光光度计波长为540nm，并提前打开预热分光光度计30min，以蒸馏水作空白对照测定各个梯度的吸光值，横坐标葡萄糖浓度（mg/mL），纵坐标为吸光值，绘制葡萄糖标准曲线，（图1）并获得线性公式。
配置1mg/mL的标准葡萄糖溶液250mL。用移液管准确取不同梯度的葡萄糖标准溶液加入试管中，用蒸馏水定容至1mL，打开水浴锅，调节温度至100℃，加入1.5mL 提前一周配置好的DNS试剂水浴10min，取出试管降温，待温度降至室温，加入蒸馏水将试管内溶液准确定容到12.5mL，混匀，调节分光光度计波长为540nm，并提前打开预热分光光度计30min，以蒸馏水作空白对照测定各个梯度的吸光值，横坐标葡萄糖浓度（mg/mL），纵坐标为吸光值，绘制葡萄糖标准曲线，（图1）并获得线性公式。
[0038] 1.5.2 木糖标准曲线配置10mg/mL的标准木糖溶液250ml。在4mL离心管加入不同梯度的葡萄糖标准溶液 ，用蒸馏水定容到2.5mL，混合均匀，接着在各支试管中加入0.25mL木糖溶液，取配置好的pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸0.75mL加入试管中，向试管中加入1.5mL DNS试剂提前打开水浴锅，调节温度至100℃，水浴5min， 取出试管后降温，待温度降至室温，加入蒸馏水将试管内溶液准确定容至到12.5mL，混合均匀，，调节分光光度计波长为540nm，并提前打开预热分光光度计30min， 用蒸馏水作为空白对照，横坐标木糖浓度（10mg/mL），纵坐标吸光值，绘制木糖标准曲线（图2）并获得线性公式。
[0039] 2. 结果与分析2.1不同栽培种配方花脸香蘑菌丝生长状况比较
本实验通过将花脸香蘑液体菌种接入五种培养基质中，放置到22-25℃，空气湿度控制在60%左右的培养室中培养，观察不同培养基质中菌丝的生长情况最后如表5所示，通过表3可以得出：在5种不同培养基质中，培养基质C中花脸香蘑菌株生长状况最好，菌丝稠密颜色呈粉紫色，从接种开始到第53d即可长满菌袋。其次是培养基质D和E，菌落稠密颜色呈淡紫色，从接种开始第56d即可长满菌袋。再其次是培养基质A，虽然从接种后54d长满菌袋，但菌丝较密颜色较白。效果最差的是培养基质B，菌丝生长最弱，菌丝较稀颜色较白，接种后需要
60d才能长满菌袋。
本实验通过将花脸香蘑液体菌种接入五种培养基质中，放置到22-25℃，空气湿度控制在60%左右的培养室中培养，观察不同培养基质中菌丝的生长情况最后如表5所示，通过表3可以得出：在5种不同培养基质中，培养基质C中花脸香蘑菌株生长状况最好，菌丝稠密颜色呈粉紫色，从接种开始到第53d即可长满菌袋。其次是培养基质D和E，菌落稠密颜色呈淡紫色，从接种开始第56d即可长满菌袋。再其次是培养基质A，虽然从接种后54d长满菌袋，但菌丝较密颜色较白。效果最差的是培养基质B，菌丝生长最弱，菌丝较稀颜色较白，接种后需要
60d才能长满菌袋。
[0040] 表3不同栽培种配方花脸香蘑菌丝生长性状比较2.2 不同栽培种配方花脸香蘑菌丝生长速率比较
表4不同栽培种配方花脸香蘑菌丝生长速率方差分析
由图3结果显示不同培养时间花脸香蘑栽培种生长速率存在差异。培养的前10d，花脸香蘑五种配方的栽培种生长速率差异不显著；继续培养的10-40d中，采用C配方培养的花脸香蘑栽培种生长速率最快，明显优于其他四个配方所培养的花脸香蘑，且差异显著。培养的
50-60d中，花脸香蘑栽培种五种配方的生长速率差异不显著。
表4不同栽培种配方花脸香蘑菌丝生长速率方差分析
由图3结果显示不同培养时间花脸香蘑栽培种生长速率存在差异。培养的前10d，花脸香蘑五种配方的栽培种生长速率差异不显著；继续培养的10-40d中，采用C配方培养的花脸香蘑栽培种生长速率最快，明显优于其他四个配方所培养的花脸香蘑，且差异显著。培养的
50-60d中，花脸香蘑栽培种五种配方的生长速率差异不显著。
[0041] 培养至第10d，五种配方中栽培种生长速率均在0.27cm/d左右。继续培养至10d至第20d时，B配方中花脸香蘑栽培种生长速率最低为0.23 cm/d，C配方时花脸香蘑栽培种生长速率最高为0.40cm/d。培养至30d时B配方中花脸香蘑栽培种生长速率最低为0.20 cm/d，C配方中花脸香蘑栽培种生长速率最高0.30cm/d。培养至40d时，B配方中花脸香蘑栽培种生长速率最低为0.12 cm/d，C配方中花脸香蘑栽培种生长速率最低为0.20 cm/d。培养至50d时，生长速率均在0.12 cm/d左右，养到第60d时，栽培种生长速率均在0.11cm/d左右。
[0042] 图4的结果显示，在A、B、C、D、E栽培配方中，时间不同时，花脸香蘑栽培种生长速率差异显著，其中选用A、B配方时，测得花脸香蘑栽培种中生长速率随时间变化呈下降趋势。A配方中由最初培养前10d的0.28cm/d下降到培养第50d与第60d时的0.12cm/d。B配方中由最初培养前10d的0.25cm/d下降到培养第50d与第60d时的0.10cm/d。选用C、D、E配方时测得花脸香蘑栽培种的生长速率随时间变化呈先升高后降低的趋势。C配方由最初培养前10d的0.30cm/d升高到10-20d时的生长速率最高值0.40 cm/d，然后逐渐下降到培养第50-60d时的0.12cm/d。D配方中由最初培养前10d的0.25cm/d升高到10-20d时的生长速率最高值0.26 cm/d，然后逐渐下降到培养第50-60d时的0.11cm/d。E配方由最初培养前10d的0.27cm/d在培养10d至20d中小幅上升后显著下降到培养第50-60d时的0.09cm/d。
[0043] 2.3不同配方花脸香蘑栽培种胞外酶活测定2.3.1 不同配方花脸香蘑栽培种CMC酶酶活力比较
表5不同配方花脸香蘑栽培种CMC酶活方差分析
由图5分析可知，供试五种培养料配方生产的花脸香蘑栽培种的CMC酶酶活力差异显著。其中，选用C配方时，花脸香蘑栽培种CMC酶酶活力最强，酶活达到1.00U，与其他4种配方的处理差异显著。其次是选用A、D、E配方的处理，CMC酶酶活均在0.69U左右；选用B配方的花脸香蘑栽培种CMC酶酶活力最弱，仅有0.47U。
表5不同配方花脸香蘑栽培种CMC酶活方差分析
由图5分析可知，供试五种培养料配方生产的花脸香蘑栽培种的CMC酶酶活力差异显著。其中，选用C配方时，花脸香蘑栽培种CMC酶酶活力最强，酶活达到1.00U，与其他4种配方的处理差异显著。其次是选用A、D、E配方的处理，CMC酶酶活均在0.69U左右；选用B配方的花脸香蘑栽培种CMC酶酶活力最弱，仅有0.47U。
[0044] 2.3.2 不同配方花脸香蘑栽培种半纤维素酶活力比较表6不同配方花脸香蘑栽培种半纤维素酶酶活方差分析
由图6分析可知，供试五种培养料配方生产的花脸香蘑栽培种的半纤维素酶酶活力差异显著。其中，C配方的花脸香蘑栽培种半纤维素酶酶活力最强，酶活达到1.78U；其次是E配方，半纤维素酶酶活为1.70 U；再其次是配方D和配方A的处理；B配方的花脸香蘑栽培种半纤维素酶酶活力最弱，酶活仅有0.17U。
由图6分析可知，供试五种培养料配方生产的花脸香蘑栽培种的半纤维素酶酶活力差异显著。其中，C配方的花脸香蘑栽培种半纤维素酶酶活力最强，酶活达到1.78U；其次是E配方，半纤维素酶酶活为1.70 U；再其次是配方D和配方A的处理；B配方的花脸香蘑栽培种半纤维素酶酶活力最弱，酶活仅有0.17U。
[0045] 2.3.3 不同配方花脸香蘑栽培种淀粉酶酶活力比较表7不同配方花脸香蘑栽培种淀粉酶酶活方差分析
由图7分析可知，供试五种配方生产的花脸香蘑栽培种的淀粉酶酶活力差异显著。其中，C配方的花脸香蘑栽培种淀粉酶酶活力最强，酶活达到1.58U；其次是D和E配方，淀粉酶酶活在0.98U左右；配方A和B的淀粉酶活最低，仅有0.46U和0.51U。
由图7分析可知，供试五种配方生产的花脸香蘑栽培种的淀粉酶酶活力差异显著。其中，C配方的花脸香蘑栽培种淀粉酶酶活力最强，酶活达到1.58U；其次是D和E配方，淀粉酶酶活在0.98U左右；配方A和B的淀粉酶活最低，仅有0.46U和0.51U。
[0046] 2.3.4 不同配方花脸香蘑栽培种漆酶活力比较表8不同配方花脸香蘑栽培种漆酶酶活方差分析
由图8分析可知，供试五种配方生产的花脸香蘑栽培种的淀粉酶酶活力差异显著。配方A、C、D、E的花脸香蘑栽培种漆酶酶活差异不显著，在0.83U左右，其中配方C的酶活最高达
0.90U。配方B的漆酶酶活力最弱，仅有0.19U。
由图8分析可知，供试五种配方生产的花脸香蘑栽培种的淀粉酶酶活力差异显著。配方A、C、D、E的花脸香蘑栽培种漆酶酶活差异不显著，在0.83U左右，其中配方C的酶活最高达
0.90U。配方B的漆酶酶活力最弱，仅有0.19U。
[0047] 花脸香蘑作为一种有待开发的野生食用菌，其生物学特性，遗传育种和高产栽培研究在我国的报道尚不多见。本实验从花脸香蘑栽培种生长性状、栽培种生长速率和栽培种胞外酶活三个角度初步探索适合花脸香蘑栽培种生长的最佳配方。通过花脸香蘑栽培种生长状况、栽培种生长速率可以直接反应适合花脸香蘑栽培种生长的最佳培养基质。花脸香蘑栽培种在不同培养基质配方中胞外酶活性可以直接反应菌丝对于营养物质的利用情况，其活性大小和生长状况密切相关。其中以C配方（鸡粪38%、麦秸25%、石膏1%、碳酸钙1％、金针菇废菌渣35%）的培养基质培养出来的花脸香蘑栽培种生长状况最好，而且栽培种生长速率总体最快，并且随时间呈先加快后减慢的趋势，在第10-20d栽培种生长速率达到最高，最高为0.40cm/d。选用加入35%金针菇废菌渣的C配方作为培养基质时，经过酶活测定得到在供试的五种花脸香蘑栽培种配方中，所测4种胞外酶的酶活均为最高。其中CMC酶活高达1.00U，半纤维素酶酶活达1.78U，淀粉酶酶活达1.58U，漆酶酶活达0.90U。因此可以从菌丝生长状况、菌丝生长速率和胞外酶活三个方面都可以佐证C配方（鸡粪38%、金针菇废菌渣
35%、麦秸25%、石膏1%、碳酸钙1％）为最优培养基质。这对未来解决花脸香蘑产量低、成本高、周期长等缺点具有重大意义。
35%、麦秸25%、石膏1%、碳酸钙1％）为最优培养基质。这对未来解决花脸香蘑产量低、成本高、周期长等缺点具有重大意义。
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