发明目的

本发明涉及使用Myb家族的特定基因生产能够耐受某些生物和非生物胁迫的植 物，尤其使用R2R3种类的某些Myb基因以及与其有关的蛋白质，这意味着可使植 物抵抗各种不利的环境条件。本发明还涉及使用含有所述基因序列的产品，如用于 制备转基因植物的表达盒和生物载体。

技术现状

植物经常受到大量微生物如真菌、细菌、病毒和大量高等病原生物的攻击，植 物通过它们自身所具有的防御机制来抵抗这些攻击进行自我保护。这种防御过程通 常不足以有效地抵抗病原体，从而会对遭受侵害的植物带来有害影响。

除了生物胁迫，植物还会遭受各种类型的环境攻击，这就会对植物生长的环境 造成改变—有时是相对改变。因此，例如，寒冷、高盐或脱水土壤会对植物造成胁 迫和损害。

生物和非生物胁迫是植物生长和发育非常强的限制因素，并且会对感兴趣种类 的生产率、农业产品的品质和营养价值造成严重损害，因此，获得耐受性更强的植 物是许多国家的公共研究计划的一个重要的目标。

近年来，所述研究是要发现对环境胁迫(包括生物和非生物胁迫)产生应答的基因 并将其分为两大类，尤其是编码调节蛋白的一类基因，所述蛋白参与胁迫信号的感 知、转导和放大，激活并调节与获得耐性直接相关的基因的表达(Zhu，J.K.，Hasegawa， P.M.和Bressan，R.1997，Critical Review in Plant Sci. 16：253；Gu，Y.Q.，Wildermuth， M.C.，Chakravarthy，S.，Lho，Y.T.，Yang，C.，He，X.，Han，Y.和Martin，G.B.2002， Plant Cell.14,817)，以及对基础生物过程进行直接保护/掩蔽作用的一类基因，其表达 基于生化和生理反应，随后是对胁迫的耐性(Thomashow，M.F.1999，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.， 50：571；Schenk，P.M.，Kazan，K.，Wilson，I.，Anderson， J.P.，Richmond，T.，Somerville，S.C.和Manners，J.M.2000 Proc.Natil.Acad.Sci.USA， 97，11655)。

此最后一类过度表达基因的转基因植物倍受关注，该类中的一单基因对于获得 环境胁迫耐性的贡献非常有限，然而，与非转化的“野生型”植物相比，过度表达 编码第一类转录因子的基因的植物显示了较好的诱导情况，所述因子能够控制并调 节与耐性获得有关的一些下游基因的同时协同表达，因为仅被单转录因子转化的植 物的表现如同被一组受它调节的基因转化的植物(Jaglo-Ottosen，K.R.，Gilmour，S.J.， Zarka，D.G.，Schbenberger，O.和Thomashow，M.F.1998，Science， 28：104；Liu， Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，AbeH.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki， K.1998，Plant Cell， 10：1391；Schenk，P.M.，Kazan，K.，Wilson，I.，Anderson，J.P.， Richmond，T.，Somerville，S.C.和Manners，J.M.2000 Proc.Natil.Acad.Sci.USA， 97， 11655)。

本发明的发明者最近分离了编码Myb类型转录因子的稻(Oryza sativa)cDNA克 隆，并证实了其中一些在对胁迫应答中的功能。在植物体中，转录因子Myb样家族 特别有趣，因为它参与一些植物细胞过程(如细胞增殖和形态发生)、细胞代谢和对胁 迫应答的控制和调节。

已知Myb基因序列的特征在于存在N-末端保守区域，其后是一个可变长度的区 域和序列。保守区有识别和结合靶基因启动子中特定序列的功能并由一个含有约56 个氨基酸的序列模块构成，该模块的特征在于色氨酸在固定的位置(色氨酸结构域 (triptophan domain))。根据所存在的色氨酸结构域的数量和类型，Myb基因被叫做 R1R2R3、R1/R2、R2R3类型。可变的C-末端区域通常具有转录活性、细胞定位、 转录后调控和与其它蛋白质相互作用。不同生物的Myb基因这一区域内的序列同源 性是功能同源性的一个证据。

特别地，发明者从稻中分离了一种特定的编码R2R3类Myb因子的cDNA，其 序列以登录号N.Y11414(EMBL)被保藏。最佳温度条件下，Y11414基因在稻胚芽鞘 中以低水平组成型表达，其表达受低温处理(10℃，这是稻的亚致死温度)强烈诱导。 在此条件下被诱导的基因被认为对最极低温度下的胁迫保护是重要的。在异源系统 (烟草原生质体)和同源系统(稻愈伤组织)中，Y11414能够反式激活：1)冷可诱导的大 豆PAL基因的启动子，2)马铃薯去饱和酶D9的启动子，该酶是冷可诱导的并催化膜 脂肪酸中双键的形成，这是对低温产生的主要反应之一。与“野生型”植株相比， 组成型过表达Y11414基因的转基因的拟南芥植株(纯合植株和单插入植株)例外的耐 受低至-10℃的处理，这证明赋予转基因的拟南芥植株耐寒冷和冷冻胁迫的能力是真 实和有效的(Osnato M.等，Proceedings of the XLV Italian Society of Agricultural Genetics-SIGA Annual Congress Salsomaggiore Terme，Italy-26/29 2001.09；Pandolfi 等，Plant Physiology 114，第747页，PGR97-079)。

特别地，已经证实，虽然Y11414基因的表达受冷胁迫诱导，但它实际上不受其 它环境胁迫如缺氧、高盐、脱水的诱导，且不受ABA激素处理的诱导(Pandolfi等， 同上)。

发明概述

发明者惊奇地发现，Y11414基因以及其在其它种类中的功能同系物可赋予对生 物和非生物胁迫，如高盐、脱水、渗透胁迫、氧化胁迫的耐性，即便这种基因在自 然状态下不被这些胁迫直接诱导。

此外，还发现被这种基因转化的植物可组成型表达各种与对病原体的耐性有关 的基因。

发明详述

因此，根据其一个方面，本发明涉及使用Y11414基因或其在其它种类中的功能 同系物来生产对生物胁迫具有耐性的转基因植物。

根据其一个方面，本发明涉及使用Y11414基因或其在其它种类中的功能同系物 来生产对盐胁迫、脱水胁迫、氧化胁迫和渗透胁迫具有耐性的转基因植物。

如上所述，如果考虑Y11414基因及其功能同系物在自然状态下不被这种胁迫诱 导，则对上述非生物胁迫较大的耐性特别令人吃惊。

术语“基因”在本发明中是指一种分离的多核苷酸序列或分离的多核苷酸序列 的片段(DNA)。

“分离的多核苷酸序列”是指基本没有通常与天然产物有关的生物材料。

本发明所述的基因可分离自天然存在的植物，其中包括单子叶植物或双子叶植 物。

术语“生物胁迫”在本发明中是指由病原生物如真菌、细菌、病毒和其它高等 病原体的攻击造成的不利的环境条件。

术语“对生物和非生物胁迫具有耐性的转基因植物”在本发明中是指与相应的 “野生型”植物相比已被遗传修饰，且在生物和非生物胁迫前具有较大适应性和存 活能力的植物。

术语“功能同系物”在本发明中是指基因和多核苷酸序列，它们在植物中发挥 的功能与Y11414基因在稻植物中发挥的功能类似。优选地，所述同系物是与Y11414 基因的可变区有至少70％，优选至少80％，如90％序列同源性的多核苷酸序列。

根据本发明的另一个方面，本发明的目的是使用与Y11414基因的可变区有至少 70％，优选至少80％，如90％序列同源性的多核苷酸序列生产对上述胁迫具有耐性 的转基因植物。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及使用Y11414基因或其在其它种类中的功 能同系物在植物中预防和/或处理生物胁迫和高盐、脱水、氧化胁迫和渗透胁迫造成 的损害。

本发明还涉及使用Y11414基因的功能变体、互补序列和转录产物，或其功能同 系物生产对生物胁迫以及高盐、脱水、氧化胁迫和渗透胁迫造成的胁迫具有耐性的 转基因植物。

可用于本发明的一种有利的基因是Y11414基因本身。

本发明还包括由Y11414基因、其在其它种类中的功能同系物、其功能变体或与 Y11414基因的可变区有至少70％，优选至少80％或90％序列同源性的多核苷酸序列 编码的多肽，以及根据本发明使用所述多肽。

Y11414基因的其它种类的功能同系物，优选与Y11414基因的可变区有至少 70％，优选至少80％，如90％序列同源性的多核苷酸序列，不包括Y11414基因本身， 是本发明的一部分。

此外，包含Y11414基因的所述功能同系物，优选包含与Y11414基因具有至少 70％序列同源性的多核苷酸序列的表达盒、生物载体、宿主细胞和转基因植物，不包 括Y11414基因本身。

至于本发明所述的应用，所选基因通过常规的基因技术操作被插入“野生型” 植物(或任选是已经转化的植物)。

作为可用本发明所述的应用转化农艺学感兴趣的植物的例证是可列举的谷类 (如稻、玉米和硬粒小麦)、水果和蔬菜(如西红柿、土豆、苹果或其它果树)、豆科植 物(如大豆和豌豆)、观赏植物，但还有可按照本发明所述方法转化的其它植物，以赋 予它们较大的对胁迫的耐性。

例如，出于此目的，所选基因的cDNA被操作性连接到合适的启动子，所得表 达盒被插入生物载体，然后将其插入待转化植物的细胞。

合适的启动子的例子描述在，例如Osnato等(同上)，其中描述了用于双子叶植 物的CaMV35S的组成型启动子。

其它合适的启动子是例如用于单子叶植物的组成型启动子Ubil(Christen和 Quail，Transgenic Research，5，213-218，1996)或Cor15(Baker等，1994 Plant Mol.Biol024：701-713)。

本发明还涉及在植物中处理和/或预防由生物胁迫、盐胁迫、脱水胁迫、氧化胁 迫和渗透胁迫造成的损害的方法，所述方法包括：在所述植物宿主细胞中插入选自 Y11414基因、其在其它种类中的功能同系物的多核苷酸序列，以及与Y11414基因 有至少70％，优选至少80％或90％序列同源性的多核苷酸序列。

为证实根据本发明用于保护植物免受胁迫的代表性基因的表达效果，利用“微 阵列”分析评定了表型耐受效果，评估了通过稻转录因子Y11414的过表达在转基因 拟南芥植物中诱导的转录物的变异。

出于证实和说明的目的进行的实验描述在下面实验部分中，这不是要以任何方 式进行限制。

实验部分

转基因植物的制备

Y11414基因的cDNA被置于CaMV35S启动子的下面和基因Nos终止子的上游， 将如此获得的表达盒插入二元载体(大肠杆菌-农杆菌)PGA470。后者通过电穿孔引入 根瘤农杆菌GV3 101菌株，然后用“花浸渍”法来转化拟南芥(cv Wassilewskija)。

结果

对所得结果进行计算机分析显示了一些基因的组成型表达，这些基因被认为在 使植物抵抗病原体，尤其是参与称为SAR(系统获得性应答)的防御应答事件的病原体 中非常重要。特别地，它显示许多或甚至所有参与苯丙醇(Phenyl propanoids)和木质 素生物合成的基因(脱氢激酶、莽草酸脱氢酶、肉桂酸-4-羟化酶、PAL、细胞色素P450、 EPSP、咖啡酰-CoA甲基转移酶、肉桂烯醛基CoA还原酶)都被诱导。苯酚化合物苯 甲酸(BA)和水杨酸(SA)在微生物的攻击时以高浓度聚集，并被认为是防御应答的重 要介体。BA和SA以及均二苯乙烯和其它植物抗毒素都是苯丙醇的代谢衍生物。

还证实编码各种类型PR(病原相关)，如某些类型的“羟脯氨酸富集型糖蛋白” (HRGP，伸展蛋白)、蛋白酶抑制剂、过氧化物酶、谷胱甘肽S-转移酶和“脂转移蛋 白”的基因的转录也被诱导。

最后，它显示诱导乙烯诱导的基因和至少一种激活所述基因的转录因子的转录。 与茉莉酮酸甲酯结合的乙烯在植物防御应答中的作用是熟知的。

通过微阵列分析发现，编码与抗活性氧种类的解毒作用有关的酶(过氧化氢酶、 谷胱甘肽S-转移酶、过氧化物酶)的一些基因的表达也被诱导。

基于以上发现，我们认为检验Y11414基因对生物和非生物胁迫耐性的作用是合 适的。

对生物胁迫的耐性

分别通过机械化接种病毒(TNV，烟草坏死病毒)、细菌(丁香假单胞菌番茄致病 变种)和真菌(灰葡萄孢)，并使感染在此后每天发展15天，由此来评估对病原体的耐 性水平。症状发展结束时，通过计算机分析感染的叶组织表面和/或通过计数TNV损 伤的数目来评定感染程度。对于所有三种类型测试病原体，与野生型相比，表达 Y11414的植物显示了高耐性水平。

对非生物胁迫的耐性

对脱水胁迫的耐性

对已用Y11414转化的转基因植物进行撤水处理。特别地，观察到已停止灌溉 10、20和30天的“野生型”植物和转基因植物的情况。在第10天和第20天，“野 生型”植物显示出严重的萎黄病和脱水信号，而转基因植物未显示受到损伤。第30 天时，“野生型”植物完全干枯，而转基因植物尽管受到损伤但仍然存活。

对盐胁迫的耐性

已用Y11414转化的转基因植物被证明较好耐受盐胁迫，证实过程如下：用 300mM NaCl处理一周和两周，存活率分别从12(“野生型”)上升到29％(用Y11414 转化)和从10(“野生型”)上升到27％(转化的)，或者用600mM NaCl处理1小时， 存活率从20上升到60％。

对氧化胁迫的耐性

用UV光处理和臭氧熏蒸野生型植物和用Y11414转化的植物，由此评定对氧化 胁迫的耐性。在两种处理下，转化的植物显示极好耐受造成野生型植物中高细胞死 亡率的剂量。

由上可见，尤其是从所进行的实验结果来看，明确显示了上述基因对保护植物 抵抗病原体和免受高盐、渗透胁迫、氧化胁迫和脱水所起的基本作用，以及本发明 的重要性，尤其是在农艺学领域的重要性。