抗除草剂植物
专利汇可以提供抗除草剂植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 特别提供了一种分离的多核苷酸,该多核苷酸含有编码叶绿体转运肽以及编码该肽3’的抗草甘膦的5一烯醇丙 酮 酸 莽 草酸 磷酸 酯合酶(EPSPS)的区域,上述区域处于一种 植物 可操作启动子的表达调控之下,前提为上述启动子与上述区域不是异源的,并且叶绿体转运肽与上述合酶不是异源的。，下面是抗除草剂植物专利的具体信息内容。
1.含有SEQ ID No.41.中所描述序列的一种分离的多核苷酸。
2.一种编码EPSPS的多核苷酸，不包括编码水稻和玉米EPSPS 的cDNA，上述多核苷酸与一种序列互补，该序列在含有0.1％SDS的0.1 强度的柠檬酸盐缓冲液中65-70℃之间温育，然后用含有0.1％SDS的 0.1强度的柠檬酸盐缓冲液在同样温度洗涤时，仍然与SEQ ID NO.41 中所描述的序列杂交。
3.一种编码EPSPS的多核苷酸，该多核苷酸可以通过用组成SEQ ID NO.41序列内的内含子的核苷酸筛选植物基因组DNA文库而得到。
4.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有编码叶绿体转运肽以 及编码该肽3’的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(EPSPS) 的区域，上述区域处于一种植物可操作启动子的表达调控之下，前提 为上述启动子与上述区域不是异源的，并且叶绿体转运肽与上述合酶 不是异源的。
5.根据权利要求1到4中任何一项的一种多核苷酸，在5’到3’ 的转录方向中包括以下组分：
(i)至少一个转录增强子，其增强区处于序列转录起始位点上 游，该序列为增强子从其所获得的序列，并且上述增强子自身不作为 启动子起作用，不论作为内源所含有的序列中，还是作为构建体的一 部分而异源存在时；
(ii)源自水稻EPSPS基因的启动子；
(iii)编码水稻EPSPS叶绿体转运肽的水稻基因组序列；
(iv)编码水稻EPSPS的基因组序列；
(v)转录终止子；
其中水稻EPSPS编码序列被改造，以便使一个第1位置被突变，从 而该位置的残基为Ile而不是Thr，以及使一个第2位置被突变，从而 该位置的残基为Ser而不是Pro，突变被引入到在野生型酶中含有以下 保守序列GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS基因中从而使改造后的序列为 GNAGIAMRSLTAAV。
6.根据权利要求5的多核苷酸，其中上述增强子包含一个序列， 该序列的3’末端位于增强子所来自的序列的最接近的转录起始位点上 游的至少40个核苷酸。
7.根据权利要求5或6中任何一项的一种多核苷酸，其中增强 子含有一个区域，该区域的3’末端处于上述最接近的起始位点上游至 少60个核苷酸。
8.根据权利要求5的一种多核苷酸，其中上述增强子含有一个 序列，该序列的3’末端处于增强子所来自的序列的TATA共有序列的 第一个核苷酸的上游至少10个核苷酸。
9.根据权利要求1-8中任何一项的多核苷酸，含有第一或第二 转录增强子。
10.根据权利要求9的多核苷酸，其中第一和第二增强子以串连 的方式存在于多核苷酸。
11.根据权利要求1-10中任何一项的多核苷酸，其中增强子的 3’末端，或第一个增强子的3’末端，处于相应于EPSPS转运肽转录 起始位点的密码子的上游大约100到大约1000个核苷酸，或者处于5’ 非翻译区的内含子的第一个核苷酸的上游大约100到大约1000个核苷 酸。
12.根据权利要求1-11中任何一项的多核苷酸，其中增强子的 3’末端，或第一个增强子的3’末端，处于相应于EPSPS转运肽转录 起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第一个核 苷酸的上游，大约150到大约1000个核苷酸。
13.根据权利要求1-12中任何一项的多核苷酸，其中增强子的 3’末端，或第一个增强子的3’末端，处于相应于EPSPS转运肽转录 起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第一个核 苷酸的上游，大约300到950个核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任何一项的多核苷酸，其中增强子的 3’末端，或第一个增强子的3’末端，处于相应于EPSPS转运肽转录 起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第一个核 苷酸的上游，大约70和大约790个核苷酸。
15.根据权利要求1-13中任何一项的多核苷酸，其中增强子的 3’末端，或第一个增强子的3’末端，可以处于相应于EPSPS转运肽 转录起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第一 个核苷酸的上游，大约300到大约380个核苷酸。
16.根据权利要求1-13，和15中任何一项的多核苷酸，其中增 强子的3’末端，或第一个增强子的3’末端，处于相应于EPSPS转运 肽转录起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第 一个核苷酸的上游，大约320到大约350个核苷酸。
17.根据权利要求1-16中任何一项的多核苷酸，其中水稻EPSPS 基因的启动子上游的区域含有至少一个增强子，该增强子源自从玉米 多泛素或水稻肌动蛋白启动子的转录起始位点的上游序列。
18.根据权利要求17的多核苷酸，在5’到3’的方向上含有一 个第一增强子，该第一增强子含有一个转录增强区域，该转录增强区 域源自位于水稻肌动蛋白启动子转录起始位点上游的序列，以及含有 一个第二启动子，该第二启动子含有一个转录增强区域，该转录增强 区域源自位于水稻肌动蛋白启动子转录起始位点上游的序列。
19.根据权利要求1-18中任何一项的多核苷酸，其中组成水稻 EPSPS叶绿体转运肽的转录起始位点的密码子的5’核苷酸是Kozack 优选的。
20.根据权利要求1-19中任何一项的多核苷酸，其中编码水稻 EPSPS叶绿体转运肽的水稻基因组序列的5’端具有一个非翻译区域， 该区域含有一个作为内含子的序列。
21.根据权利要求20的多核苷酸，其中非翻译区含有一个内含 子，其中该内含子是玉米ADHI内含子。
22.根据权利要求21或20中任何一项的多核苷酸，其中非翻译 区含有SEQ ID NO 48中所描述的序列。
23.根据权利要求22的多核苷酸，其中非翻译区包括一个内含 子，其中该内含子是水稻内含子1或玉米多泛素内含子。
24.根据权利要求1-23中任何一项的多核苷酸，该多核苷酸含 有一个病毒源的翻译增强子，该翻译增强子位于编码水稻EPSPS叶绿 体转运肽的水稻基因组序列的5’端的非翻译区域。
25.根据权利要求1-24中任何一项的多核苷酸，该多核苷酸进 而含有编码一些蛋白的区域，这些蛋白能够赋予含有它的植物至少一 种以下的合乎农业需要的特征：抗昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、 胁迫、干旱、和除草剂。
26.根据权利要求25的多核苷酸，其中除草剂可以是草甘膦以外 的除草剂。
27.根据权利要求25或26任何一项的多核苷酸，其中赋于昆虫 抗性的区域编码源自Bt的结晶毒素，包括分泌的Bt毒素；蛋白酶抑 制剂，植物凝集素，奇异杆状体/光杆状体毒素；赋予真菌抗性的区 域选自那些编码已知的AFPs，防御素，几丁质酶，葡聚糖酶，Avr-Cf9 的区域；赋予细菌抗性的区域选自那些编码天蚕抗菌肽和techyplesin 以及它们的类似物的区域；赋予病毒抗性的区域选自那些编码已知能 够提供病毒抗性的病毒包被蛋白，移动蛋白，病毒复制酶和反义和核 酶序列的区域；而赋予胁迫，盐和干旱抗性的区域选自那些编码谷胱 甘肽-S-转移酶和过氧化物酶的区域，组成已知的CBF1调节序列的 序列以及已知能提供海藻糖富集的基因。
28.根据权利要求27的多核苷酸，其中赋于昆虫抗性的区域选自 cryIAc，cryIAb，cry3A，VipA，Vip1B，半胱氨酸蛋白酶抑制剂和雪花 莲凝集素基因。
29.根据任何前述权利要求的多核苷酸，该多核苷酸被修饰因为 mRNA不稳定区域和/或多余的剪接区域被除去，或使用作物优选的密 码子，以便这样修饰后的多核苷酸的表达在植物中产生基本相似的蛋 白，该蛋白的活性/功能和未修饰的多核苷酸在特定生物中的表达所 获得的功能/活性基本相似，上述特定生物为未修饰的多核苷酸蛋白 编码序列在其中是内源的生物。
30.根据前述权利要求的多核苷酸，其中修饰的多核苷酸和在上 述植物中编码基本相同蛋白的，且为内源含有的多核苷酸之间的同一 性程度是，防止修饰的和内源序列之间的共抑制。
31.根据前述权利要求的多核苷酸，其中上述同一性程度约小于 70％。
32.一种含有任何前述权利要求的多核苷酸的载体。
33.一种已经用权利要求1-31中任何一项的多核苷酸，或权利 要求32的载体转化的植物材料。
34.已经用任何权利要求1-31的多核苷酸，或权利要求32的载 体转化的以及已经用或者用含有一些蛋白编码区域的多核苷酸进一步 转化的植物材料，其中上述蛋白能够赋予含有它的植物至少一种以下 的合乎农业需要的特征：抗昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、胁迫、 干旱、和除草剂。
35.已经从根据权利要求33或34的材料再生的，外观正常的，可 育的的全株植物，它们的后代种子和部分。
36.含有权利要求1-31中任何一项的多核苷酸的外观正常的，可 育的的全株植物，上述全株植物是通过将从转化了权利要求1-31中 任何一项的多核苷酸或权利要求32的载体的植物材料上再生的植物与 已经用含有一些蛋白的编码区域的多核苷酸转化的植物进行杂交而得 到的，上述蛋白能够赋予含有它的植物至少一种以下的合乎农业需要 的特征：抗昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、胁迫、干旱、和除草剂； 得到的植物的后代，它们的种子和部分。
37.根据权利要求35或36的植物，可以选自田野作物，水果和 蔬菜如canola，向日葵，烟草，甜菜，棉花，玉米，小麦，大麦，水稻， 高粱，西红柿，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉，瓜，马铃薯，胡 萝卜，莴苣，卷心菜，洋葱，大豆(soya spp)，甘蔗，豌豆，蚕豆， 白杨，葡萄，柑橘，紫花苜蓿，黑麦，燕麦，草皮和饲用牧草，亚麻和 油菜和产坚果的植物，至此它们并未被逐一指出；它们的后代，种子 和部分。
38.根据权利要求35-37中任何一项的玉米植物。
39.一种在田野中选择性地控制野草的方法，上述田野中含有野 草以及根据权利要求35-38中任何一项的植物或后代，该方法包括在 田野中使用足以控制野草而基本上不影响上述植物的量的草甘膦类除 草剂。
40.根据前述权利要求的方法，进而包括在使用草甘膦除草剂之 前或之后对田野(从而对它所包含的植物)使用一种或多种除草剂，杀虫 剂，杀真菌剂，杀线虫剂，杀菌剂和抗病毒剂。
41.一种充分耐受或充分抵抗草甘膦除草剂的植物的生产方法，该 方法包括以下步骤：
(i)用权利要求1-31中任何一项的多核苷酸或权利要求32 的载体转化植物物质；
(ii)筛选这样转化的物质；并
(iii)从这样筛选的物质中再生形态正常的可育的的全株。
42.根据前述权利要求的方法，其中转化包括通过以下方法将多 核苷酸引入到上述材料：(i)用包被了上述多核苷酸的颗粒对上述材 料进行生物弹道轰击；或(ii)用含有上述多核苷酸的溶液包被的硅 碳化物纤维(silicon carbide fiber)对上述材料进行穿刺；(iii) 通过将上述多核苷酸或载体引入到农杆菌，并将这样转化的农杆菌与 植物材料共温育，从而该植物材料被转化并随后再生。
43.根据前述权利要求的方法，其中该转化材料是通过其草甘膦 抗性筛选的。
44.根据权利要求1-31中任何一项的多核苷酸或权利要求32的 载体在对草甘膦充分耐受或充分抗性的植物组织和/或外形正常的可 育的的全株植物的生产中的应用。
45.根据权利要求1-31中任何一项的多核苷酸或权利要求32的 载体在用于体外高通量筛选潜在除草剂的除草剂靶物的生产中的应 用。
46.进行转化以表达感兴趣的基因的生物材料的生产方法，其中 上述转化材料含有根据权利要求1-31中任何一项的多核苷酸或权利 要求32的载体，其中上述筛选包括将上述转化材料暴露于草甘膦或它 的盐，并筛选存活的材料。
47.根据前述权利要求的一种方法，其中所述的生物材料是植物 来源的。
48.根据前述权利要求的一种方法，其中所述的植物是单子叶植 物。
49.根据前述权利要求的一种方法，其中所述的单子叶植物选自 大麦，小麦，玉米，水稻，燕麦，黑麦，高梁，菠萝，甘蔗，香蕉， 洋葱，芦笋和韭菜。
50.一种再生一种可繁殖的转化植物以含有外源DNA的方法，包 括以下步骤：
(a)从上述待转化的植物产生可再生的组织；
(b)用上述外源DNA转化上述可再生组织，其中上述外源DNA 含有可选样的DNA序列，其中上述序列的功能是在可再生组织中作为 选样机制，
(c)在步骤(b)之后1天到60天之间，将上述来自(b)的 可再生组织置于能够从上述组织生新芽的培养基，其中上述培养基进 而含有一种化合物用于筛选含有上述可选择DNA序列的可选择组织， 以允许对上述转化的可再生组织的鉴定或选择，
(d)从步骤(c)的筛选组织形成至少一个新芽后，将上述新 芽转移到能从上述新芽产生根以产生小植株的第二种培养基，其中上 述第二种培养基供选地含有上述化合物；并
(e)将上述小植株生长成可繁殖的转基因植物，其中上述外源 DNA被以孟德尔的方式转移到后代植物中，其中在步骤(b)和步骤(c) 之间有一个供选的步骤，该步骤为将上述转化的物质置于愈伤组织诱 导培养基，其特征在于上述外源DNA是，或者上述外源DNA所含有的 可筛选DNA序列含有，根据权利要求1-31中任何一项的多核苷酸或 权利要求32的载体，并且上述化合物是草甘膦或它的盐。
51.根据前述权利要求的一种方法，其中上述植物是选自香蕉， 小麦，水稻，玉米和大麦的单子叶植物。
52.根据权利要求50或51的一种方法，其中所述的可再生组织 选自胚源性愈伤组织，体细胞胚，不成熟胚等。
本发明涉及重组DNA技术，并且特别是涉及转基因植物的生产， 与非转基因的同样的植物相比，上述转基因植物表现出充分的除草剂 抵抗力或耐受性。本发明还涉及，特别是，涉及用于生产上述转基因 植物，或由上述转基因植物产生的核酸序列(和其表达产物)。
受到除草剂的作用时，对除草剂充分“耐受”的植物提供的剂量/ 应答曲线与同样受到除草剂作用的非转基因植物提供的曲线相比，该 曲线向右平移。这样的剂量/应答曲线在X-轴上绘制“剂量”，并在 Y-轴上绘制“杀死百分率”，“除草效果”等等。耐受植物产生除草剂 效应需要的除草剂通常为非耐受性的同样植物的至少两倍。当受到农 业界在用于商业目的农作物生长的田地中常用于杀死杂草的浓度和速 率的除草剂作用时，充分“抵抗”除草剂的植物很少表现出，如果有 的话，坏死的，裂解的，萎黄病的或其它的损伤。
充分抵抗或充分耐受以5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(5-enol pyruvyl shikimate phosphate synthetase)(在下文“EPSPS”)为作 用位点的除草剂(在下文“草甘膦”)的植物是特别优选的，其中N- 膦酰基甲基甘氨酸(和其各种盐)是上述除草剂的优秀的例子。
根据对生长有抗除草剂农作物的田地施用除草剂的常规技术，除 草剂可以在出现之前或之后施用。本发明提供了，特别是，用于生产 这样的除草剂耐受性或抗性植物的核苷酸序列。
根据本发明，提供了含有SEQ ID NO.41中所描述序列的分离的多 核苷酸。本发明也提供了一种编码EPSPS的多核苷酸，不包括编码水 稻和玉米EPSPS的cDNA，上述多核苷酸与一种序列互补，该序列在含 有0.1％SDS的0.1强度的柠檬酸盐缓冲液中65-70℃之间温育，然后 用含有0.1％SDS的0.1强度的柠檬酸盐缓冲液在同样温度洗涤时，仍 然与SEQ ID NO.41中所描述的序列杂交。但是，可以通过用组成SEQ ID NO.41序列内的内含子的核苷酸对植物基因组DNA文库进行筛选而得到 根据本发明的编码EPSPS的多核苷酸，并且本发明也包括可以从那种 筛选得到的这样的序列。
本发明包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有编码叶绿体转 运肽(chloroplast transit peptide)以及编码该肽3’的抗草甘膦的5 -烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(EPSPS)的区域，上述区域处于一种 植物可操作启动子的表达调控之下，前提为上述启动子与上述区域不 是异源的，并且叶绿体转运肽与上述合酶不是异源的。
“异源的”的意思是来自不同的来源，相应地“非异源的”的意思 是来自相同的来源-但是是在基因水平上而不是在生物或组织水平 上。例如CaMV35S启动子对于矮牵牛属植物的EPSPS编码序列显然是 异源的，因为上述启动子是源自病毒而上述序列-它所控制的表达- 是源自植物。但是，根据本发明的术语“异源的”还有更窄的意思。 例如，当涉及本发明时，“异源的”意思为矮牵牛属植物的编码EPSPS 序列对于，例如，同样源自矮牵牛属植物的-但不是调控EPSPS基因 表达的启动子是“异源的”。在这种意义上，源自矮牵牛属植物EPSPS 基因，然后用于调控同样也源自该矮牵牛属植物的EPSPS编码序列的 表达，的矮牵牛属植物启动子对于上述编码序列是“非异源的”。但是， “非异源的”并不意味着，启动子和编码序列必须从一个和同一个(起 源或祖先)多核苷酸获得。对于转运肽也是相同的情况。例如，源自 向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶叶绿体转运肽对于同样源自向日葵(相 同的植物，组织或细胞)的EPSPS基因的编码序列是“异源的”。源自 向日葵的核酮糖二磷酸羧化酶转运肽编码序列对于也源自向日葵的核 酮糖二磷酸羧化酶酶编码序列是“非异源的”，即使两序列的来源是不 同的，可以存在于不同的细胞，组织或向日葵植物的多核苷酸。
一种优选的多核苷酸形式在5’到3’的转录方向中包括以下组 分：
(i)至少一个转录增强子，其增强区域处于序列转录起始位点 的上游，上述序列为增强子从其中获得的序列，并且上述增强子自身 不作为启动子起作用，不论在内源性地被包含的序列中，还是作为构 建体的一部分而异源存在时；
(ii)源自水稻EPSPS基因的启动子；
(iii)编码水稻EPSPS叶绿体转运肽的水稻基因组序列；
(iv)编码水稻EPSPS的基因组序列；
(v)转录终止子；
其中水稻EPSPS编码序列被改造，以便使一个第1位置被突变，从 而该位置的残基为Ile而不是Thr，以及使一个第2位置被突变，从而 该位置的残基为Ser而不是Pro，突变被引入到在野生型中含有以下保 守序列GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS基因中从而使改造后的序列为 GNAGIAMRSLTAAV。
增强区域优选的包含一个序列，该序列的3’末端位于增强子所来 自的序列的最接近的转录起始位点上游的至少40个核苷酸。在上述多 核苷酸的一个进一步的实施方案中，增强区域含有一个区域，该区域 的3’末端是上述最接近的起始位点上游至少60个核苷酸，在多核苷 酸的一个进一步的实施方案中，上述增强区域含有一个序列，该序列 的3’末端位于增强子所来自的序列的TATA共有序列(TATA consensus) 的第一个核苷酸的上游至少10个核苷酸。
根据本发明的多核苷酸可以含有两个或多个转录增强子，在该多 核苷酸的一个特定实施方案中，这些转录增强子可以以头尾相接的方 式存在。
在本发明的多核苷酸的增强子的3’末端，或第一个增强子的3’ 末端，如果存在一个以上增强子的话，可以处于相应于EPSPS转运肽 转录起始位点的密码子的上游大约100到大约1000个核苷酸，或者处 于5’非翻译区的内含子的第一个核苷酸的上游大约100到大约1000 个核苷酸，如果上述区域含有内含子的话。在本上述多核苷酸的一个 更优选的实施方案中，增强子的3’末端，或第一个增强子的3’末端， 可以处于相应于EPSPS转运肽转录起始位点的密码子的上游，或者处 于5’非翻译区的内含子的第一个核苷酸的上游，大约150到大约1000 个核苷酸；在一个更进一步优选的实施方案中，增强子的3’末端，或 第一个增强子的3’末端，可以处于相应于EPSPS转运肽转录起始位点 的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第一个核苷酸的上 游，大约300到950个核苷酸。在仍然更优选的实施方案中，增强子 的3’末端，或第一个增强子的3’末端，可以处于相应于EPSPS转运 肽转录起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第 一个核苷酸的上游，大约770和大约790个核苷酸。
在一个替代的发明多核苷酸中，增强子的3’末端，或第一个增强 子的3’末端，可以处于相应于EPSPS转运肽转录起始位点的密码子的 上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第一个核苷酸的上游，大约300 到大约380个核苷酸；在该替代的多核苷酸的一个优选实施方案中，增 强子的3’末端，或第一个增强子的3’末端，处于相应于EPSPS转运 肽转录起始位点的密码子的上游，或者处于5’非翻译区的内含子的第 一个核苷酸的上游，大约320到大约350个核苷酸。
在根据本发明的多核苷酸中，水稻EPSPS基因的启动子上游的区 域可以含有至少一个增强子，该增强子源自位于玉米多泛素 (polyubiquitin)或水稻肌动蛋白启动子的转录起始位点上游的序列。
因此上述多核苷酸可以在5’到3’的方向上含有一个第一增强子， 该第一增强子含有一个转录增强区域，该转录增强区域源自位于水稻 肌动蛋白启动子转录起始位点上游的序列，以及含有一个第二增强子， 该第二增强子含有一个转录增强区域，该转录增强区域源自水稻肌动 蛋白启动子转录起始位点上游序列。
不论该多核苷酸中存在的各个增强子的身份(identity)和排列 (juxtaposition)如何，组成水稻EPSPS叶绿体转运肽的转录起始位点 的密码子的5’核苷酸都应该是Kozack优选的。技术人员将知道这意 味着什么-无论如何这在下文的实施例中将进而显而易见。
本发明多核苷酸特别优选的实施方案具有一个非翻译区域，该区 域含有一个作为内含子的序列，该序列位于编码水稻EPSPS叶绿体转 运肽的水稻基因组序列的5’端。上述非翻译区可以含有SEQ ID NO 48 中所描述的序列。
本发明多核苷酸可以含有一个病毒源的翻译增强子，该翻译增强 子位于编码水稻EPSPS叶绿体转运肽的水稻基因组序列的5’端非翻译 区。本领域的技术人员明白这样的适当翻译增强子的身份-例如源自TMV 的Omega和Omega prime序列，以及源自烟草蚀刻(etch)病毒的增强 子，还明白这样的翻译增强子如何能被引入到上述多核苷酸，以便提 高合乎需要的结果。
根据本发明的多核苷酸可以进而含有编码一些蛋白的序列，这些 蛋白能够赋予含有该序列的植物至少一种以下的合乎农业需要的特 征：抗昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、胁迫、干旱、和除草剂。当 考虑到这样的多核苷酸中赋予除草剂抗性的基因为EPSPS以外的基因， 如草甘膦氧化还原酶时，除草剂可以是草甘膦以外的除草剂，在这种 情况下抗性赋予基因可以选自编码以下蛋白的基因：膦丝菌素乙酰转 移酶(PAT)，羟苯基丙酮酸酯加双氧酶(HPPD)谷胱甘肽S转移酶(GST)， 细胞色素P450，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，乙酰乳酸合酶(ALS)， 原卟啉原氧化酶(PPO)，二氢蝶酸(dihydropteroate)合酶，多胺转运 蛋白，过氧化物歧化酶(SOD)，溴苯腈腈水解酶(bromoxynil nitrilase)， 八氢番茄红素脱氢酶(PDS)，可以从Alcaligenes eutrophus得到的 tfdA基因的产物，以及上述蛋白的突变的或经其它改造的变体。在上 述多核苷酸提供多除草剂抗性的情况下，这样的除草剂可以选自二硝 基苯胺除草剂，三唑-嘧啶，尿嘧啶，苯脲，三酮，异噁唑，退热冰 (acetanilide)，
噁二唑，triazinone，磺苯胺(slfonanilide)，酰胺，苯胺， RP201772，flurochloridone，norflurazone和triazolinone类的除 草剂，并且出苗后除草剂(post emergence herbicide)选自草甘膦 和它的盐，glufosinate，黄草灵，噻草平，bialaphos，除草定， sethoxydim或其它环己二酮，麦草畏，fosamine，flupoxam，苯氧基 丙酸，quizalofop或其它芳氧基苯氧基丙酸盐，毒莠定fluometron， atrazine或其它三嗪，metribuzin，chlorimuron，chlorsulfuron， 氟唑啶草(flumetsulam)，halosulfuron，sulfometron，灭草喹 (imazaquin)，咪草烟(imazethapyr)，isoxaben，imazamox， metosulam，pyrithrobac，rimsulfuron，bensulfuron，nicosulfuron， 氟黄胺草醚(fomesafen)，fluroglycofen，KIH 9201，ET751， carfentrazone，ZA1296，sulcotrione，对草快，敌草快，溴苯腈和 fenoxaprop。
在上述多核苷酸含有编码杀虫蛋白的情况下，这种蛋白可以选自 源自Bt的结晶毒素，包括分泌的Bt毒素；蛋白酶抑制剂，植物凝集 素，奇异杆状体(xenhorabdus)/光杆状体(photorhabdus)毒素； 赋予真菌抗性的基因可以选自那些编码已知的AFPs，防御素 (defensin)，几丁质酶，葡聚糖酶，Avr-Cf9的基因。特别优选的杀 虫蛋白为cryIAc，cryIAb，cry3A，Vip1A，Vip1B，半胱氨酸(cystein) 蛋白酶抑制剂，和雪花莲(snowdrop)凝集素。在上述多核苷酸含有赋 予细菌抗性的基因的情况下，这些基因可以选自那些编码天蚕抗菌肽 (cecropin)和techyplesin以及它们的类似物的基因。赋予病毒抗 性的基因可以选自那些编码已知能够提供病毒抗性的病毒外壳蛋白， 移动蛋白(movement protein)，病毒复制酶和反义和核酶序列的基因； 而赋予胁迫(stress)，盐和干旱抗性的基因可以选自那些编码谷胱甘 肽-S-转移酶和过氧化物酶的基因，组成已知的CBF1调节序列的序 列以及已知能提供海藻糖富集的基因。
根据本发明的多核苷酸序列可以被修饰，以增强它所含有的蛋白 编码序列的表达，因为mRNA不稳定区域和/或多余的剪接区域可以被 除去，或可以使用作物优选的密码子，以便这样修饰后的多核苷酸的 表达在植物中产生基本相似的蛋白，该蛋白的活性/功能和那些由未 修饰的多核苷酸在特定生物中的表达所获得蛋白的功能/活性基本相 似，上述特定生物为未修饰的多核苷酸的蛋白编码序列在其中是内源 的生物。修饰的多核苷酸和在上述植物中编码基本相同蛋白的内源含 有的多核苷酸之间的同一性程度可以是，例如，为了防止修饰的和内 源序列之间的共抑制(co-suppression)。在这种情况下，序列间的同 一性程度应该优选地小于70％。
本发明还进而包括了含有本发明核苷酸的生物学或转化载体。因 此，“载体”的意思为，特别是，以下之一：质粒，病毒，粘粒或转化 或转染后以含有上述多核苷酸的细菌。
本发明还进而包括了已经用上述多核苷酸或载体转化的植物材 料，以及已经用或者用含有一些蛋白编码区域的多核苷酸进一步转化 的上述转化的植物材料，其中上述蛋白能够赋予含有它的植物至少一 种以下的合乎农业需要的特征：抗昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、 胁迫、干旱、和除草剂。
本发明进而包括从上一段描述的植物材料再生的，外观正常的，可 育的的全株植物(whole plant)，其子代及部分，其子代包含稳定地整 合到其染色体上并以孟德尔方式遗传的本发明的多核苷酸或载体。
本发明进而包括含有本发明的多核苷酸的，外观正常的，可育的的 全株植物(whole plant)，上述全株植物是通过将从转化了本发明的多 核苷酸或载体的植物材料再生的植物与已经用含有一些蛋白的编码区 域的多核苷酸转化的植物进行杂交而得到的，上述蛋白能够赋予含有 它的植物至少一种以下的合乎农业需要的特征：抗昆虫、真菌、病毒、 细菌、线虫、胁迫、干旱、和除草剂；本发明还包括了得到的植物的 后代，它们的种子和部分。
本发明的植物可以选自田野作物，水果和蔬菜如canola，向日葵， 烟草，甜菜，棉花、玉米，小麦，大麦，水稻，高梁，西红柿，芒果， 桃，苹果，梨，草莓，香蕉，瓜，马铃薯，胡萝卜，莴苣，卷心菜， 洋葱，大豆(soya spp)，甘蔗，豌豆，蚕豆，白杨，葡萄，柑橘，紫 花苜蓿，黑麦，燕麦，草皮和饲用牧草，亚麻和油菜和产坚果的植物， 至此它们并未被逐一指出；它们的后代，种子和部分。
这样的植物中特别优选的包括玉米，大豆，棉花甜菜和canola。
本发明进而包括在田野中选择性地控制野草的方法，上述田野中 含有本发明的植物或它们的除草剂抗性后代和野草，该方法包括在田 野中使用足以控制野草而基本上不影响上述植物的量的草甘膦类除草 剂。根据该方法可以在使用草甘膦除草剂之前或之后对田野(从而对它 所包含的植物)使用一种或多种除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀线虫剂，杀 菌剂和抗病毒剂。
本发明还进而提供了充分耐受或充分抵抗草甘膦除草剂的植物的 生产方法，该方法包括以下步骤：
(i)用本发明的多核苷酸或载体转化植物物质；
(ii)筛选这样转化的材料；并
(iii)从这样筛选的材料中再生形态正常的可育的的全株植物。
上述转化可能包括通过任何已知的方法将上述多核苷酸引入到上 述材料，但特别通过(i)用包被了上述多核苷酸的颗粒对上述材料进 行生物弹道轰击(boilistic bombardment)；(ii)用含有上述多核苷 酸的溶液包被的硅碳化物纤维(silicon carbide fiber)对上述材料 进行穿刺；(iii)通过将上述多核苷酸或载体引入到Agrobacterium(农 杆菌)，并将这样转化的Agrobacterium与植物材料共温育，从而该植 物材料被转化并随后再生。植物的转化，筛选和再生技术对于具体的 植物种类可能需要进行常规的改造，这对于技术人员是众所周知的。 可以根据其草甘膦抗性对这样转化的植物材料进行筛选。
本发明进而提供了本发明的多核苷酸或载体在生产充分耐受或充 分抵抗草甘膦除草剂的植物组织和/或形态正常的可育的的全株植物 的生产中的应用。
本发明还进而包括了进行转化以表达感兴趣的基因的生物材料的 筛选方法，其中上述转化的材料含有本发明的多核苷酸或载体，并且 其中上述筛选包括将上述转化的材料暴露于草甘膦或它的盐，并筛选 纯活的材料。上述材料可能是植物来源的，并特别可能是源自单子叶 植物，上述单子叶植物选自大麦，小麦，玉米，水稻，燕麦，黑麦， 高梁，菠萝，甘蔗，香蕉，洋葱，芦笋和韭菜。
本发明还包括了再生可育的的转化植物以含有外源DNA的方法， 该方法包括以下步骤：
(a)从上述待转化的植物产生可再生的组织；
(b)用上述DNA转化上述可再生组织，其中上述外源DNA含有 可筛选的序列，其中上述序列的功能是在可再生组织中作为筛选机制。
(c)在步骤(b)之后1天到60天之间，将上述来自(b)的 可再生组织置于能够从上述组织生新芽(producing shoot)的培养基， 其中上述培养基进而含有一种化合物用于筛选含有上述可筛选DNA序 列的可筛选组织，以允许对上述转化的可再生组织的鉴定或筛选。
(d)从步骤(c)的筛选组织形成至少一个新芽后，将上述新芽 转移到能从上述新芽产生根以产生小植株的第二种培养基，其中上述 第二种培养基供选地含有上述化合物；并
(e)将上述幼苗培育成可繁殖的转基因植物，其中上述外源DNA 以孟德尔的方式被遗传到后代植物中，其特征在于外源DNA是，或者 包含于外源DNA的可筛选DNA序列含有，根据权利要求1到34中任何 一项的多核苷酸，并且上述化合物是草甘膦或它的盐。如上文所指出， 上述植物可以是单子叶植物，更优选地选自香蕉，小麦，水稻，玉米 和大麦，并且上述可再生组织可能由胚源性愈伤组织，体细胞胚，未 成熟胚等等组成。
序列表
SEQ ID NO.1-40 PCR引物。
SEQ ID NO.41水稻基因组EPSPS序列(从ATG开始)。
SEQ ID NO.42含有双突变的水稻基因组EPSPS序列。
SEQ ID NO.43玉米多泛素(polyubiquitine)增强子。
SEQ ID NO.44水稻肌动蛋白增强子1
SEQ ID NO.45水稻基因组G1 EPSPS(到ATG)
SEQ ID NO.46水稻基因组G3 EPSPS(到ATG)
SEQ ID NO.47水稻基因组G2 EPSPS+玉米Adh1内含子
SEQ ID NO.48玉米Adh1内含子
附图
图1水稻EPSPS基因组示意图。
图2载体pCR4-OEPSPS(在载体pCR4-Blunt中的水稻dmEPSPS基 因)。
图3用于引入双突变的策略的示意。
图4载体pTCV 1001
图5载体pTCV 1001 OSEPSPS(在载体pTCV 1001中含有水稻dmEPSPS 基因)
图6载体pTCV 1001 EPSPSPAC(在载体pTCV 1001中含有水稻 dmEPSPS基因)
图7载体pBluSK+EPSPS(在载体pBluescript SK+中含有水稻 dmEPSPS基因)
图8载体pPAC1
图9载体pTCVEPSPSPH
图10载体pTCVEPSPSADH
图11载体pBluSKEPSPSADH(含有包含Adh1内含子的水稻dmEPSPS 基因)
图12载体pIGPD9
图13关于使用“极小EPSPS启动子(minimal EPSPS promotor)” 的示意图
图14载体Zen8
图15载体Zen19
图16载体Zen21
图17将Zen载体引入超二元载体
通过在非异源启动子控制下过量表达突变的EPSPS产生对草甘膦处 理耐受的植物。
在本说明书全文中所使用的术语“增强子”指处于启动子上游的， 不包括启动子自身，但增强和调节从启动子开始的转录的序列。在本 说明书全文中所使用的术语“EPSPS启动子缺失”指EPSPS启动子以及 构成EPSPS的天然增强子至少一部分的核苷酸，即，处于EPSPS启动 子上游的(5’)的源自EPSPS的序列。
关于植物材料的转化，那些本领域的技术人员将认识到尽管在下 文的实施例中具体指出了特定类型的目标材料(例如，胚发生细胞悬 浮培养物或脱分化的未成熟胚)和特定的转化方法(例如，用 Agrobacterium或颗粒轰击)，本发明并不限于这些具体的实施方案， 并且这样的目标材料和方法可以互换使用。进而，在本发明的本说明 书全文使用的术语“植物细胞”可以指分离的细胞，包括悬浮培养物 以及完整的或部分完整的组织，如胚，子叶盘(scutella)，花粉粒， 源自花粉粒的胚的细胞或源自植物器官的体细胞。类似地，尽管具体 的实施例限于玉米，小麦和水稻，本发明同样可以应用于广泛的可以 用适当的植物细胞转化方法转化的农业作物和观赏植物(amenity plant)。
常规的分子生物学方法是根据Sambrook et al(1989)“Molecular cloning：A laboratory Manual，2nd Edn.Cold Spring Harbour Lab. Press进行的。
实施例I产生水稻EPSPS的cDNA探针
用反转录酶PCR(RT-PCR)得到编码水稻EPSPS的部分长度的 cDNA。用TRI-ZOLTM方法(Life Technologies)从两个星期大的水稻 植物(Oryza sativa L.indica var Koshihikari)分离总RNA。第 一条链cDNA的合成是通过SuperscriptII反转录酶(Life Technologies)用200ng的EPSPS简并反向10引物(EPSPS degenerate reverse 10 primer)(SEQ ID NO.1)和2μg总RNA根据所提供的步骤 进行的。通过PCR合成第二条链和cDNA的扩增是利用EPSPS简并引物 10和4(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和PCR小珠(Pharmacia)根 据制造商的指示进行的。所有的字母代码都是标准缩写(Eur.J. Biochem.(1985)150：15)。 SEQ ID NO.1 EPSPS简并反向引物10 5′GCACARGCIGCAAGIGARAAIGCCATIGCCAT 3′ SEQ ID NO.2 EPSPS简并正向引物4 5′GCWGGAACWGCKATGCGICCRYTIACIGC 3′
用TA Cloning kitTM根据供货商的建议将上述产物克隆到载体 pCR2.1(Invitrogen)中。从所筛选的菌落中回收质粒，并通过基于 计算机的同源性搜索方法(BLAST)对序列进行分析，以确认克隆得到 的RT-PCR产物表现出和已知的植物EPSPS序列具有高同源性。
实施例2水稻EPSPS基因组序列的分离和水稻EPSPS基因的克隆
含有全长水稻EPSPS基因和5’上游区域的基因组DNA区域是从 λEMBLSP6/T7基因组文库分离得到的，其中上述基因组文库构建自5 天的黄化水稻幼苗(Oryza sativa L.Indica var.IR36)(Clontech)。 用32P标记的水稻EPSPS cDNA探针(实施例1)通过制造商提供的步 骤对1×106个斑块形成单位(pfu)进行筛选。将阳性斑块进行随后的 杂交筛选循环，直至得到交叉杂交纯度的斑块。根据Sambrook et al.， 1989描述的方法，从噬菌体纯的储存物制备λ-DNA。用同样的32P标 记的水稻EPSPS cDNA作为探针，对得到的DNA进行限制性水解和 Southern印迹分析。用诸如Perfectly BluntTM(Novagen)的方法， 在可应用的情况下，对交叉杂交的限制性片段进行平端化，并克隆到 适当的载体如pSTBlue(Novaen)中。然后用ABI377PRISM自动化DNA 测序仪对上述DNA进行测序。图1示标记了一些限制性位点的水稻EPSPS 基因的示意图。
通过PCR得到了含有编码区，EPSPS启动子，部分5’上游区域和 其终止子的EPSPS基因的一个3.86kb的片段。联合使用寡聚核苷酸引 物OSGRA1(SEQ ID NO 3)和OSEPSPS3(SEQ ID NO 4)扩增所需要的 区域。OSEPSPS3含有另加的Sac1和Sma1限制性酶位点以便于该基因 在后期的载体构建中的亚克隆。这些引物的示意位置在图1中给出。 SEQ ID NO.3 OSGRA1 5′ATTTCTTCTTCTTCCTCCCTTCTCCGCCTC 3′ SEQ ID NO.4 OSEPSPS3 5′GAGCTCCCCGGGCGAGTGTTGTTGTGTTCTGTCTAATG 3′
用高保真的Pfu TurboTM聚合酶(Stratagen)以从λ制备物(上文 所述)得到的DNA作为扩增模板进行PCR反应。将预期大小的PCR产 物克隆到pCRblunt 4-TOPOTM(Invitrogen)并测序以验证完整性。
实施例3在水稻EPSPS中将T突变成I和将P突变成S。
T到I和P到S的突变是通过引入两个点突变进行的。这些点突变 是通过PCR利用含有所需要的突变的寡聚核苷酸引物被引入到水稻基 因组EPSPS基因的。图3示标明所使用的引物的结合位点的示意图。 进行了两次独立的PCR反应(都用λDNA作为模板)。
1)EcoRVEnd(SEQ ID NO.5)+OSMutBot(SEQ ID NO.6)
2)OsMutTop(SEQ ID NO.7)+SalIEnd(SEQ ID NO.8)
SEQ ID NO.5
EcoRVEnd 5′GCTTACGAAGGTATGATATCCTCCTACATGTCAGGC 3′
SEQ ID NO.6
OSMutBot 5′GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3′
SEQ ID NO.7
OsMutTop 5′GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3′
SEQ ID NO.8
SalIEnd 5′GGTGGGCATTCAGTGCCAAGGAAACAGTCGACATCCGCACCAAGTTGTTTCAACC 3′
在新的PCR反应中用两个寡聚核苷酸SalIEnd和EcoRVEnd以等摩 尔浓度的各个PCR产物作为模板将得到的PCR产物连接起来。通过琼 脂糖凝胶电泳对一小份反应产物进行分析，并克隆到pCR-Blunt IITM(Invitrogen)中。回收质粒DNA并测序以检测双突变的成功掺入。
含有双突变的DNA片段被如下整合到水稻EPSPS基因组克隆(图1) 中。用Eco RV和Sal I消化含有双突变的克隆。对含有水稻EPSPS DNA PCR产物的质粒进行类似的消化，并通过Sambrook et al.，1989中 描述的常规克隆方法将含有双突变的Eco RV/Sal I片段连接到 pCR4Blunt-TOPOTM中的EPSPS基因中，并转化入感受态的E.coli中。 从得到的菌落中回收质粒并测序以确认双突变的存在，并且无进一步 的改变。这种质粒，pCR4-OSEPSPS，在图2中显示。
用Pst1和Not1从pCR4-Blunt-TOPOTM上切除含有双突变的基 因组水稻EPSPS基因(图2)并连接到载体pTCV1001(图4)，以得到 pTCV10010SEPSPS(图5)，并且该质粒被转化到E.coli中进行扩增。 随后，从λDNA(图1)上切除Pac1/EcoRV限制性片段并插入到 pTCV1001OSEPSPS(图5)以得到pTCV1001EPSPSPAC(图6)。水稻dmEPSPS 基因，现在含有从Pac1到Sac1(图6)的序列，从pTCV1001EPSPSPAC (图6)上作为Eag1/Sac1片段被切除下来，并被连接到类似消化的 pBluescript SK+以制备pBlueSK+EPSPS(图7)。进而用Xba1/Pac1将 水稻EPSPS上游区域和所需要的增强子装配(如下文所述)和连接到 pBluescript SK+载体。
实施例4单一增强的生成：水稻EPSPS启动子融合
图1示出了用于在水稻EPSPS基因的5’端生成一系列缺失的引物 G1和G2的结合位点。用水稻EPSPSλDNA模板和Pfu TurboTM聚合酶 (Stratagen)用供货商提供的步骤，G1和G2引物(SEQ ID NO.9和 10)与RQCR10引物(SEQ ID NO.11)联合使用。
SEQ ID NO.9
G1 5′CGCCTGCAGCTCGAGGTTGGTTGGTGAGAGTGAGACACC 3′
SEQ ID NO.10
G2 5′CGCCTGCAGCTCGAGGCCACACCAATCCAGCTGGTGTGG 3′
SEQ ID NO.11
RQCR10 5′GAACCTCAGTTATATCTCATCG 3′
通过琼脂糖凝胶电泳分析得到的产物，并克隆到pCR-Blunt II- TOPOTM载体(Invitrogen)。测定得到的产物的序列以确认在水稻基因 组EPSPS克隆的序列中并无改变。基于在载体中的定向筛选进一步实 验的克隆，上述筛选是通过证实XhoI消化是否仅仅从载体中除去多连 接位点区域，而不是除去全部插入序列而进行的。
玉米多泛素和水稻肌动蛋白基因以及它们相关的5’上游区域的序 列发表在EMBL数据库中(U29159和X16865)。设计引物以便仅仅扩 增上述基因的上游增强子区域。这样通过引物SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13联合Pfu TurboTM聚合酶，以玉米基因组DNA作为模板得到了玉 米多泛素增强子(SEQ ID NO.43)。这两种引物都含有Spe1限制性位 点以便于该增强子的进一步操作(但是，注意存在于玉米多泛素增强 子中的XhoI位点被用作3’限制性位点)。水稻肌动蛋白增强子(SEQ ID NO.44)是以类似的方式用引物(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)以 水稻基因组DNA为模板得到的。这些引物分别含有Xba I和Pst 1限 制性位点以便于该增强子的进一步操作。
使用了以下寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO.12
MPU5 - 5′GCGGCCGCACTAGTGGCCGGCCATCAGCGGCCAGCTTTTGTTC 3′
SEQ ID NO.13
MPU3 5′TTAACTAGTGAGGAGGCCGCCTGCCGTGC 3′
SEQ ID NO.14
RA5 5′CGCCTCTAGAGGCCGGCCGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3′
SEQ ID NO.15
RA3 5′CGCTGCAGTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3′
在克隆到PCR Blunt-II-TOPO载体(Invitrogen)后对扩增和克 隆的序列进行确认。用Not1/Xho1(MPU)或Xba1/Pst1(RA)消 化含有EPSPS 5’UTR缺失的pCR Blunt-II-TOPO载体。同样用所需要 的限制性酶将增强子从它相应的pCR Blunt-II-TOPO载体上切除并连 接到含有5’UTR EPSPS缺失的第一载体上。
实施例5双增强的生成：水稻EPSPS启动子融合
为了进一步增强从水稻EPSPS启动子开始的表达，在水稻肌动蛋 白：EPSPS融合物中整合了一个第二水稻肌动蛋白增强子。在为了达到 此目的，首先制备了(如实施例4所描述)含有单一(第一)增强子 的增强子/EPSPS融合物。用引物RAPST(SEQ ID NO 16)和RAPAC(SEQ ID NO 17)扩增了第二个水稻肌动蛋白增强子。这些引物便于在增强 子的5’末端引入PST1位点和在3’末端引入Pac1位点。
SEQ ID NO.16
RAPST 5′gcgctgcagGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3′
SEQ ID NO.17
RAPAC 5′gcgttaattaaTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3′
经过测序后，PCR产物(为Xho1∶Xho1)被引入到含有第一水稻肌 动蛋白增强子∶G1 EPSPS基因融合物(实施例4)的构建体。
实施例6将Adh1内含子插入到水稻EPSPS基因的5’UTR
将玉米Adh1内含子1插入到所需要的EPSPS启动子缺失(例如， 按照实施例4中的描述制备)是在生成具有所需要的增强子的融合构 建体之前进行的。在这个特定的实施例中Adh1内含子被引入到G2 EPSPS 启动子缺失中。技术人员将认识到可以采用类似的方法将Adh1内含子 整合到其它EPSPS启动子缺失。通过PCR玉米Adh1内含子被插入到上 述构建体中。上述Adh1内含子是利用引物Adh5(SEQ ID NO.18)和Adh3 (SEQ ID NO.19)从合适的来源，如玉米基因组DNA或一种载体如pPAC1 (图8)，扩增得到的。 SEQ ID NO.18 Adh5 cccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctg SEQ ID NO.19 Adh3 gacgccatggtcgccgccatccgcagctgcacgggtccaggaaagcaatc
将得到的PCR产物变性，并和Adh5Pac(SEQ ID NO.20)一起用作 引物，以载体pTCV1001EPSPSPAC(图2)作为模板扩增所需要的产物。 SEQ ID NO.20 Adh5Pac cgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaac
得到的PCR产物被克隆到PCR-BluntII(Invitrogen)中。从水 稻基因组克隆(图1)上切除Pac1∶HindIII片段并插入到pTCV1001 以生成pTCVEPSPSPH(图9)。接着，如示意图中所示(图9)，含有Adh1 内含子的PacI/Nco1 PCR产物被插入到pTCVEPSPSPH中。在克隆的 EPSPS基因中含有双突变)的Pac1∶EcoRV片段被切除下来，并用源自 pTCVEPSPSPH的含有Adh1内含子序列(图9)的Pac1/EcoRV片段替换。 最后，将含有Adh1序列的完整EPSPS基因从pTCVEPSPSPH上作为 Eag1/Sac1片段切除下来，并克隆到pBluescript SK+以得到 pBluSKEPSPSADH(图11)。
实施例7.通过定点突变在含有玉米adh1内含子的构建体中引入 优化的前ATG共有序列(Kozak)
供选地，用QuickChange Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene)在含有Adh1内含子的构建体上进行定点突变。这是在与 增强子：EPSPS启动子融合序列融合之前，在pBluescript SK+(图 1)中的Pac1/Sac1 EPSPS片段上进行的。根据提供的方法用下面的 寡聚核苷酸对KOZAK序列进行优化。
SEQ ID NO.21
Oskozak 5′GGACCCGTGCAGCTGCGGTACCATGGCGGCGACCATGGC 3′
SEQ ID NO.22
OSkozakrev 5′GCCATGGTCGCCGCCATGGTACCGCAGCTGCACGGGTCC 3′
在回收的质粒上用KpnI对克隆子进行限制性分析。正确改变的DNA 的特征为比未改变的DNA增加了一个Kpn1限制位点。然后通过自动化 DNA测序鉴定上述序列。可以用对各个载体适当的单一限制性酶位点： 5’端的Sph1或Pac1和3’端的AvrII或EcoRV将改变后的DNA序列 转移到初始的构建体中。
实施例8 EPSPS表达盒的完成，在5’到3’的方向上含有增强子区 域，水稻EPSPS启动子上游区EPSPS启动子，EPSPS 5’UTR+(供 选)玉米Adh1内会子1，水稻EPSPS质体转运肽编码区域，水稻成 熟EPSPS编码区域和水稻EPSPS基因终止子区域。
用Xba1和Pac1(RA)或Not和Pac1(MPU)切除pCRBlunt-II-TOPO 载体中所包含的单或双增强的水稻EPSPS启动子融合序列(实施例4 和5)，并插入到进行类似消化的含有其余水稻EPSPS序列(图7/11) 的pBluescript SK+克隆中。这一最终克隆步骤得到了所需要的基因构 建体。可以通过以上策略得到的构建物(EPSPS表达盒)的实施例在以 下的表1中给出。示意图在图14-16中给出。
EPSPS 克隆 第一增 第二增 EPSPS启动 5′UTL 基因组编 EPSPS
强子 强子 子缺失 内含子 码区 终止子 ZEN6 RA 无 G1 否 是 是 ZEN10 MPU 无 G1 否 是 是 ZEN13 RA RA G3 否 是 是 ZEN26 RA 无 最小 RA 是 是
DNA构建体的供选的进一步装配
最小EPSPS启动子的应用
水稻肌动蛋白启动子和玉米多泛素启动子的启动子区域都得到了很 好的定义。在这些实施例中这些基因的含有“TATA”盒的天然启动子 被EPSPS启动子的那些序列取代。在本实施例中EPSPS启动子被用于 取代水稻肌动蛋白基因的启动子区域。技术人员将认识到类似的方法 可以用于许多基因。通过PCR EPSPS启动子被引入到水稻肌动蛋白基 因。最初进行了四次独立的PCR反应。以水稻基因组DNA为模板，引 物RA5E(SEQ ID NO.23)和RA3E(SEQ ID NO.24)被用于扩增水稻肌 动蛋白增强子元件；以水稻基因组DNA为模板引物RA5I(SEQ ID NO.25) 和RA3I(SEQ ID NO.26)被用于扩增水稻肌动蛋白内含子；引物EPROM53 (SEQ ID NO.27)和EPROM3(SEQ ID NO.28)被用于扩增含有启动子 的EPSPS区域；引物REPSPS5(SEQ ID NO.29)和REPSPS3(SEQ ID NO.30) 被用于扩增翻译起始位点和EcoRV位点之间的水稻EPSPS基因(参见 图1)。每个独立的PCR产物通过相继的PCR被依次连接，因为用于扩 增一个区域的各个引物含有与下一区域的连接序列。此过程的图解在 图13中给出。 (SEQ ID NO.23) RA5E 5’tctctagactcagccgcctttcactac 3’ (SEQ ID NO.24) RA3E 5’aaacccgggtttggaagcggagggagGAAGGAGGAGATAAAG 3’ (SEQ ID NO.25) RA5I 5’ACCCTCCCCTCTCtaaatcgattggtgggaggggagag 3’ (SEQ ID NO.26) RA3I 5’ggtctacctacaaaaaagctccgcacgagGGTACCGCCGCTGGTAC 3’ (SEQ ID NO.27) EPROM53 5’CCTTCGCCTCCCCTCcttcctcctctatttcttc 3’ (SEQ ID NO.28) EPROM3 5’gttggtgggaggggagagATTTAGCTAACCACC (SEQ ID NO.29) REPSPS5 5’GTTTTTTCGAGGCGTGCTCccatggcggcgaccatggcgtcc 3’ (SEQ ID NO.30) REPSPS3 5’ggaggatatcataccttcgtaagc 3’
最终得到的DNA片段，含有水稻肌动蛋白增强子，EPSPS启动子， 水稻肌动蛋白内含子，到Eco RV位点的水稻EPSPS基因，作为 Xba1/EcoRV片段被引入到pBluSK+EPSPS(图7)以得到，例如，ZEN26。 然后，完整的表达盒可以作为Xma1片段被切除以进一步亚克隆。
本领域的技术人员将认识到可以使用不同长度的EPSPS启动子， 并且不同的组分，如玉米多泛素增强子和内含子可以以类似的方式使 用。
实施例10.用于植物转化的DNA的制备
上述方法描述了“EPSPS表达盒”的装配，该表达盒在5’到3’的方 向上含有增强子序列，水稻的EPSPS启动子，编码水稻EPSPS转运肽 的区域，通过在特定区域的T到I和P到S改变而具有对草甘膦的抗 性的编码水稻成熟EPSPS酶的区域和水稻EPSPS基因终止子。
供选地，所需要的表达盒还含有药物筛选标记基因(例如氨苄青 霉素抗性，卡那霉素抗性等等)，T-DNA左或右边界区域和(供选地) 和添加5’和/或3’到上述构建体的脚手架附接区域(scaffold attachment region)。技术人员将认识到与以上描述类似的方法可以 被用来得到这些另加的组分，并将它们克隆到所需要的位置。
实施例11.用含有超二元载体的Agrobacterium菌株转化玉米品 系，上述超二元载体在T-DNA的右和左边界之间包含有EPSPS表达盒； 对草甘膦抗性的植物细胞的筛选和再生
Agrobacterium菌株的构建
用Xam1或Xba1/Sac1消化Bluescript质粒DNA(例如ZEN7，8， 17，19，21和22)，并将这样得到的(～5.5-7kb)编码EPSPS的片段 连接到进行类似限制性消化的pSB1的T-DNA右和左边界之间的克隆 位点。在，例如，使用pZEN 8的Xma1片段的情况下，上述连接产生 质粒pZEN8SB11(图16)。Komari et al(1996，Plant J.10：165-174) 描述了质粒pSB11的构建和其亲本，pSB21，的构建。通过同源重组的 方法(图17)将pZEN8的T-DNA区域整合到超二元pSB1载体中(Saito et al EP 672 752 A1)以产生质粒pSB1ZEN8。为了获得上述质粒 pSB1ZEN8，将质粒pZEN8SB11转化到E.coli菌株HB101中，然后，根 据Ditta et al(1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7347-7351) 的三重杂交方法，与带有pSB1的Agrobacterium LBA4404交配，以产 生转化的Agrobacterium菌株，LBA4404(pSB1ZEN8)，根据对壮观霉 素的抗性对共转化的质粒pSB1ZEN8的存在进行筛选。根据Sal1限制 性分析(图17)也确认了pSB1ZEN8。类似地，从pZEN7，ZEN17，ZEN19， ZEN21和ZEN22的Xam1片段开始构建含有完全类似的构建体 pSB1ZEN7，pSB1ZEN17，pSB1ZEN19，pSB1ZEN21和pSB1ZEN22的LBA4404 菌株。
替代地，利用与上面的描述类似的那些方法，将pZEN7，ZEN8等 类似的片段同源重组到超二元载体pTOK162(图1 US 5591616中)的 右和左边界之间的位点，以产生类似的共整合质粒，在Agrobacteriumi 中是根据对卡那霉素和壮观霉素的共同抗性对上述共整合质粒进行筛 选。
含有辅助质粒PAL4404(含有完全的vir区域)的Agrobacterium 菌株可以从美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC 37349)得到。可以使用的一种替代菌株是含有辅 助质粒的Agrobacterium EHA101(1986，Hood et al，J.Bacteriol.， 168(3)：1283-1290)，上述辅助质粒含有源自强毒性菌株 Agrobacterium tumefaciens A281的vir区域。
Agrobacterium悬浮液的制备
Agrobacterium菌株LBA4404(pSB1ZEN7)，LBA4404(pSB1ZEN8) 等分别在含有‘PHI-L’的固体培养基的板上划线，并在28℃黑暗培 养3到10天。
PHI-L培养基如WO 98/32326的第26页(实施例4)中所描述。 用双蒸水配制的PHI-L培养基含有25ml/l的储存液A，25ml/l的储 存液B，450.9ml/l的储存液C和50mg/l的壮观霉素。储存液是通过 高压蒸汽消毒或过滤而除菌的。储存液A为60g/l K2HPO4和20g/l NaH2PO4，用KOH调节到pH7.0；储存液B为6g/l MgSO4.7H2O，3g/l KCl， 20g/l NH4Cl，0.2g/l CaCl2和50mg/l FeSO4.7H2O；储存液C为5.56 g/l的葡萄糖和16.67g/l的琼脂(A-7049，Sigma Chemicals，St Louis， Mo，USA)。
替代地，Agrobacterium在含有如Ishida et al(1996，Nature Biotechnology，14，745-750)所描述的YP培养基(5g/l酵母提取 物，10g/l蛋白胨，5g/l NaCl，15g/l琼脂pH6.8)，或，替代地， 如Hei et al在US 5591616中所描述的培养基(AB培养基(Drlica and Kado，1974；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71：3677-3681))的平板 上培养3-10天。但是，在各种情况下，应该对培养基进行改造以提 供合适的抗生素筛选(例如在使用Agrobacterium菌株LB4404 (pSB1ZEN7)等的情况下，含有50mg/ml壮观霉素，或在使用含有pTOK 162衍生的超二元载体的Agrobacterium的情况下，含有50mg/ml壮 观霉素和50mg/ml卡那霉素)。
如上文所述制备的Agrobacterium平板在4℃储存，并在制备后 一个月内使用。为了制备悬浮液将主平板上的一个单一菌落在一个平 板上划线，上述平板含有，pH6.8，5g/l酵母提取物(Difco)，10g/l 蛋白胨(Difco)，5g/l NaCl，15g/l琼脂(Difco)和50mg/l壮观霉 素(或者为对具体的Agrobacterium菌株合适的筛选条件)。将平板在 28℃黑暗培养2天。
用于转化植物材料的Agrobacterium悬浮液的制备与US 5591616 中描述的方式类似。(用良好的微生物学实践来避免对无菌培养基的污 染)从平板上取出3×5mm全环的Agrobacterium，转移到并悬浮于 14mlFalcon试管中的5ml无菌AA液体培养基。在此处使用时，pH5.2 的AA液体培养基含有Toriyama和Hinata(1985)在Plant Science 41， 179-183中所定义的主要无机盐，氨基酸和维生素，Murashige和Skoog 培养基的次要无机盐(Murashige and Skoog，1962 in Physiol.Plant 15，473-497)，0.5g/l酪蛋白氨基酸(酪蛋白水解物)，1mg/l的2， 4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.2mg/l的激动素，0.1mg/l赤霉素， 0.2M葡萄糖，0.2M蔗糖和0.1mM乙酰丁香酮。
替代地，通过与WO 98/32326中描述的方式类似的方法制备用于 转化植物材料的Agrobacterium悬浮液。从平板上取出3×5mm全环的 Agrobacterium，并转移到并悬浮于5ml的如WO 98/32326第26页的 实施例4所描述的无菌PHI-A基础培养基中，或替代地悬浮于5ml的 同样在WO 98/32326第26页的实施例4中描述的无菌PHI-I复合培 养基中。在任一情况下加入5ml的100mM 3’-5’-二甲氧基-4’羟基乙 酰苯酮。PHI-A基础培养基，pH5.2含有4g/l的CHU(N6)基础盐(Sigma C-1416)，1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000×，Sigma E-1511)， 0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，68.5g/l 蔗糖和68.5g/l葡萄糖。PHI-I复合培养基，也用KOH调到pH5.2， 并过滤除菌，含有4.3g/l MS盐(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml烟酸，0.5mg/ml 维生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，1g/l维生素 检测酪蛋白氨基酸(Difco)，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨 酸，68.5g/l蔗糖和36g/l葡萄糖。
替代地，通过与Ishida et al(1996)Nature Biotechnology，14， 745-750中描述的方式类似的方法制备用于转化植物材料的 Agrobacterium悬浮液。从平板上取出3×5mm全环的Agrobacterium， 并转移到和悬浮于5ml的LS-inf培养基中。LS-inf培养基(Linsmaier and Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)用KOH调到pH5.2， 含有LS主要和次要无机盐，0.5mg/ml烟酸，0.5mg/ml维生素B6.HCl， 1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，1g/l维生素检测酪蛋白氨基 酸(Difco)，1.5mg/ml 2，4-D，68.5g/l蔗糖和36g/l葡萄糖。
产生后，将农杆菌悬浮液用旋涡混合器混合以得到均匀的悬浮液， 将细胞数调到0.5×109到2×109cfu/ml之间(优选地较低)。1×109cfu/ml 相应于在550nm的OD(1厘米)为～0.72。
在无菌的2ml微量离心管中将Agrobacterium悬浮液等分成1ml 的许多份并尽快使用。
用于转化的玉米品系
适于转化的玉米品系包括但不限于A188，F1 P3732， F1(A188×B73Ht)，F1(B73Ht×A188)，F1(A188×BMS)。各种A188，BMS (黑墨西哥甜玉米)和B73Ht是从农业，林业和渔业部(Ministry of Agriculture，Forestry and Fisheries)得到的。P3732是从IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI得到的。合适的玉米品系也包括各种A188×近亲 繁殖系(例如在WO 98/32326的表8中的PHJ90×A188，PHN46×A188， PHPP×A188)以及源自不同的杂合体的优良近亲繁殖系(例如在WO 98 /32326的表9中PHN46，PHP28和PHJ90)。
例如，不成熟胚是从“Hi-II”玉米产生的。“Hi-II”是近亲繁 殖系之间的杂交系(A188×B73)，上述近亲繁殖系是通过Hi-II亲本 A和Hi-II亲本B之间相互杂交得到的，Hi-II亲本A和Hi-II亲 本B可以从Maize Genetic Cooperation Stock Center(玉米遗传合 作储存中心)，University of Illinois at Champaign，Urbana， Illinois)。种子，从这些杂交得到的名为“Hi-II”的种子在温室中 或在田野中种植。得到的Hi-II植物自身授粉或与姊妹植物异花授粉。
不成熟胚的制备，感染和共培育
玉米不成熟胚的转化是通过将不成熟胚与上文所描述的合适的 Agrobacterium重组菌株接触而进行的。不成熟胚是指不成熟种子的胚， 上述种子处于授粉后正在成熟的阶段，不成熟胚是完整的能够进行细 胞分裂以产生愈伤组织细胞的组织，上述愈伤组织细胞可以分化以产 生全株植物的组织和器官。用于转化的优选材料也包括胚的子叶盘， 它也能诱导产生脱分化的愈伤组织，上述愈伤组织具有再生成已转化 的正常可育的植物的能力。用于转化的优选材料因此也包括源自这样 脱分化不成熟合子胚或子叶盘的愈伤组织。
如Green and Phillips(1976，Crop.Sci.15：417-421)所 描述，从正在发育的穗中无菌分离不成熟的玉米胚，或替代地通过 Neuffer et al(1982，“Growing Maize for genetic purposes”in Maize for biological research，W.F.Sheridan ed.University Press， University of North Dakota，Grand Forks，North Dakota，USA) 的方法。用无菌的镊子在授粉后9-12天(优选地11天)从雌穗穗上 无菌分离1-2mm(优选地1-1.2mm)长的不成熟玉米胚。通常在用无 菌去离子水洗涤并无菌取出不成熟胚之前用2.63％的次氯酸钠对穗的表 面灭菌。不成熟胚(优选地为～100个)被直接置入含有大约2ml用于 制备农杆菌悬浮液的同样的培养基(其替代物在上文描述)的2ml微 量离心管中。合上管帽并对其内容物旋涡混合几秒钟。倒去培养基， 加入2ml新鲜培养基并重复进行旋涡混合。倒出所有的培养基，将洗 涤后的不成熟胚留在管底。
制备了玉米的不成熟胚后，该方法的下一阶段，感染步骤，是将 它们与转化的Agrobacterium菌株接触。
在本方法的一个实施例中，感染步骤在含有N6培养基(1987，Chu C.C.Proc.Symp.Plant Tissue Culture，Science Ptess，Peking. Pp43-50)的主要无机盐和维生素的液体培养基中进行，如WO 98/32326 的实施例4中所描述。如上文所描述，在PHI-A培养基中制备的1.0ml 的Agrobacterium悬浮液被加入到微量离心管的胚中，并旋涡混合约30 秒。替代地，加入在PHI-I培养基或在LS-inf培养基中制备的 1.0ml Agrobacterium悬浮液，也如上文所述。
放置5分钟后，根据最初的Agrobacterium悬浮液是否在PHI-B 培养基，或PHI-J培养基，或LS-AS培养基中制备，将Agrobacterium 和胚的悬浮液分别倒出到含有1)PHI-B培养基或2)PHI-J培养基 或3)LS-AS培养基中任何一种的Petri平板。用巴斯德吸管吸干农 杆菌悬浮液，移动胚，使得它们的轴侧朝向培养基，用封口膜密封平 板并在23-25℃黑暗中共培育3天。PHI-B培养基，pH5.8，含有4g/l 的CHU(N6)基础盐(Sigma C-1416)，1.0ml/l Eriksson维生素混 合物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D， 0.69g/l L-脯氨酸，0.85mg/l硝酸银，30g/l蔗糖，100mM乙酰丁香 酮和3g/l脱乙酰吉兰糖胶。PHI-J培养基，也调到pH 5.8，含有4.3g/l MS盐(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml烟酸，0.5mg/ml维生素B6.HCl，1.0mg/ml 硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨 酸，20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，0.5g/l MES(Sigma)，10mM乙酰丁 香酮和8g/l纯琼脂(Sigma A-7049)。LS-AS培养基(Linsmaier and Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)，用KOH调到pH5.8， 含有LS主要和次要无机盐，0.5mg/ml烟酸，0.5mg/ml维生素B6.HCl， 1.0mg/ml硫胺.HCl，700mg/l L-脯氨酸，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4-D，20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，0.5g/l MES(Sigma)，100mM 乙酰丁香酮和8g/l纯琼脂(Sigma A-7049)。
制备不成熟胚之后，如上文所述，达到感染的一种替代方法是在 脱分化的过程中或脱分化后感染它们，如US 5591616中所述。不成熟 胚被置于LSD1.5固体培养基上，上述固体培养基含有LS无机盐和维 生素以及100mg/ml酪蛋白氨基酸，100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4 -D，20g/l蔗糖和2.3g/l脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)。在25℃ 3星 期后，将从子叶盘生出的愈伤组织收集到2ml的微量离心管中，并浸 泡于如上文所述在AA培养基中制备的1ml Agrobacterium悬浮液中。 静置5分钟后，将得到的愈伤组织转移到含有100μM乙酰丁香酮的2N6 固体培养基上，并在黑暗中25℃共培育3天。2N6固体培养基含有N6 培养基的无机盐和维生素(1 Chu C.C.Proc.Symp.Plant Tissue Culture，Science Press，Peking.pp43-50)，含有1g/l酪蛋白氨基 酸，2mg/l 2，4-D，30g/l蔗糖和2g/l脱乙酰吉兰糖胶。
“转化子的休眠和筛选”
共培育后，胚被，供选地，转移到含有PHI-C培养基的平板上， 其上用封口膜覆盖并在黑暗中培养3天，进行筛选前的“休眠步骤”。 PHI-C培养基，pH5.8，含有4g/l的CHU(N6)基础盐(Sigma C-1416)， 1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml 硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D，0.69g/l L-脯氨酸，0.85mg/l硝酸银， 30g/l蔗糖，0.5g/l MES，100mg/l羧苄青霉素和8g/l纯琼脂(Sigma A-7049)。如WO 98/32326中所描述，在整个转化方法中包括这一休 眠步骤是否合乎需要随着玉米品系而有所不同，是实验的事情。
对于筛选步骤，大约20个胚被转移到许多含有PHI-D筛选培养 基或LSD1.5筛选培养基的新鲜平板的各个平板，用封口膜密封并在28℃ 黑暗中温育。PHI-D筛选培养基，用KOH调节到pH5.8，含有4g/l的 CHU(N6)基础盐(Sigma C-1416)，1.0ml/l Eriksson维生素混合 物(1000×，Sigma E-1511)，0.5mg/ml硫胺.HCl，1.5mg/ml 2，4-D， 0.69g/l L-脯氨酸，0.85mg/l硝酸银，30g/l蔗糖，0.5g/l MES，100mg/l 羧苄青霉素和8g/l纯琼脂(Sigma A-7049)以及在0.1mM到20mM之 间的组织培养级的N-(膦酰基甲基)-甘氨酸(Sigma P-9556)。LSD1.5 筛选培养基，用KOH调到pH5.8，含有LS主要和次要无机盐(Linsmaier and Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)，0.5mg/ml烟酸， 0.5mg/ml维生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，700mg/l L-脯氨酸， 100mg/l 1肌醇，1.5mg/ml 2，4-D，20g/l蔗糖，0.5g/l MES(Sigma)， 250mg/l氨中噻肟头孢菌素(cefotaxime)和8g/l纯琼脂(Sigma A- 7049)，以及在0.1mM到20mM之间的组织培养级的N-(膦酰基甲基) -甘氨酸(Sigma P-9556)。
替代地，在筛选的起始材料是源自不成熟胚的愈伤组织的情况下， 如WO 5591616中所描述，在LSD 1.5筛选培养基上培养之前这样的愈 伤组织被用含有250mg/ml氨中噻肟头孢菌素的无菌水洗涤。
在大约2个月的时期内，以2个星期的间隔，上述胚或从上述不 成熟胚增殖的细胞簇被转移到(如果需要的话用无菌镊子)含有新鲜 筛选培养基的平板上。除草剂抗性的愈伤组织通过在同一培养基上持 续生长而增大，直至所选出的愈伤组织的直径超过约1.5cm。
适当地选择筛选培养基中N-(膦酰基甲基)-甘氨酸的浓度，以 便筛选出合乎需要数量的真正转化子，并且优选地其浓度在0.5-5mM 之间。优选地，用于筛选培养基的N-(膦酰基甲基)-甘氨酸的浓度 为头两个星期1mM，此后3mM。
转化子的再生/转化植物材料的增殖和分析
根据，例如，Duncan et al(1985，Planta，165，322-332)，Kamo et al(1985，Bot.Gaz.146(3)，327-334)和/或West et al(1993，The Plant Cell，5，1361-1369)和/或Shillito et al(1989，Bio/Technol. 7，581-587)所描述的方法将筛选出的愈伤组织再生成正常的可繁殖植 物。例如，选择直径1.5-2cm的愈伤组织并转移到再生/成熟培养基， 并在黑暗中温育约1-3星期以允许体细胞胚成熟。适当的再生培养基， PHI-E培养基(WO 98/32326)，用KOH调到pH5.6，含有4.3g/l MS 盐(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml烟酸，0.5mg/ml维生素B6.HCl，0.1mg/ml 硫胺.HCl，100mg/l肌醇，2mg/l甘氨酸，0.5mg/ml玉米素，1.0mg/ml 吲哚乙酸，0.1mM脱落酸，100mg/l羧苄青霉素，60g/l蔗糖，8g/l纯 琼脂(Sigma A-7049)和，供选地，0.02mM到1mM之间的组织培养 级的N-(膦酰基甲基)-甘氨酸(Sigma P-9556)。
然后愈伤组织被转移到生根/再生培养基中，并在25℃生长，生 长时的光照为16小时光照(270mE m-2s-1)和8小时黑暗，或连续光照 (~250mE m-2s-1)直至长出芽和根。适当的生根/再生培养基为下段所 描述的LSZ培养基(供选地含有膦酰基甲基甘氨酸)或pH5.6的PHI -F培养基，其含有4.3g/l MS盐(GIBCO-BRL)，0.5mg/ml烟酸， 0.5mg/ml维生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌醇，2mg/l 甘氨酸，40g/l蔗糖和1.5g/l脱酰基吉兰糖胶。
替代地，筛选出的愈伤组织被直接转移到LSZ培养基，用KOH调 到pH5.8，含有LS主要和次要的无机盐(Linsmaier and Skoog，1965， Physiol.Plant 18，100-127)0.5mg/ml烟酸，0.5mg/ml维生素 B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l脯氨酸，100mg/l 1肌醇，，5mg/ml 玉米素，20g/l蔗糖，0.5mg/l MES，250mg/l羧苄青霉素，8g/l纯琼 脂(Sigma A-7049)和，供选地，0.02mM到1mM之间的组织培养级 的N-(膦酰基甲基)-甘氨酸(Sigma P-9556)。在黑暗中培养一段 时间后对平板进行光照(连续的或光/天如上文所述)并再生小植株。
将小植株转移到单独的玻璃试管中，玻璃试管中含有PHI-F培养 基或半强度的LSF培养基，ph5.8，含有半强度的LS主要盐(Linsmaier and Skoog，1965，Physiol.Plant 18，100-127)，LS次要盐，0.5mg/ml 烟酸，0.5mg/ml维生素B6.HCl，1.0mg/ml硫胺.HCl，100mg/l 1肌 醇，20g/l蔗糖，0.5mg/l MES，8g/l纯琼脂(Sigma A-7049)并再 生长大约一个星期。然后将小植株转移到一盆土壤中，在生长室里(85 ％相对湿度，600ppmCO2和250mE m-2s-1)使其变得强壮，并在温室的 土壤混合物中生长至成熟。
如上述得到的第一代(T0)自身繁殖得到第二代(T1)种子。替 代地(并优选地)第一代植物与另一种非转基因的玉米近亲繁殖系彼 此相互杂交以得到第二代种子。预期这些杂交的后代(T1)1∶1分离出 抗除草剂特性。播种T1种子，在温室中或田野中生长，通过观察不同 植株的存活，可繁殖性，以及在V2和V8生长期之间，包括V2和V8 期，(或替代地在发芽后7-21天)喷洒25/2000g/ha草甘膦(适当配 制并，供选地，作为盐)处理后组织坏死的症状，对这一代以及其后 的世代的抗性水平，草甘膦抗性的遗传和分离进行评估。这些评估是 相对于易受影响的分离子或相对于类似的未转化的玉米品系进行的， 上述玉米品系不含有本发明或类似发明的，能够赋于草甘膦抗性的基 因。选择表现出草甘膦抗性的基因并重新自交或者与未转基因的近亲 繁殖系回交。
在上述过程的所有阶段，供选地将转化愈伤组织，小植株，T0和 T1植物物质的组织样品取样并进行以下分析1)Southern和PCR分析， 以显示转基因的存在，拷贝数和完整性；2)Northern(或类似的)分 析，以测量转基因的mRNA的表达；3)SDS凝胶的定量Western分析， 以测量EPSPS的表达水平；以及4)在有和无草甘膦存在时测量EPSPSP 酶的活性水平，以更精确地评估多少EPSPS的表达是源自上述转基因 的。
这样的分析方法在本领域中是众所周知的。在以下的实施例17-20 中描述了通过PCR测定转基因的存在，完整性和表达，进行Southern 分析，在E.coli中克隆和表达成熟的水稻EPSPS，水稻EPSPS的纯化， 产生多克隆抗体以纯化EPSPS，在愈伤组织和植物组织中对EPSPS水平 的Western分析，以及在能够区分对草甘膦敏感的内源EPSPS和编码 EPSPS的转基因的草甘膦抗性产物的草甘膦浓度下测量源自植物的抽提 物的EPSPS水平的适当方法。
实施例12通过用包被了含有EPSPS表达盒的DNA的颗粒轰击转化 玉米品系；对草甘膦抗性的植物和植物细胞的筛选和再生
在进一步的实施例中，源自不成熟玉米胚的松散的胚源性愈伤组 织在固体培养基上发生，并通过生物弹道法(biolistically)转化。 与实施例11中描述的方法类似，然后根据在含有一定浓度的草甘膦培 养基上的生长速率对转化的愈伤组织进行筛选。筛选抗性的愈伤组织 并再生以提供T0小植株，T0小植株转移到盆中，生长至成熟，并在温 室中自交或杂交繁殖。然后生长后代种子以提供下一代的植株，并如 实施例11所述评估草甘膦抗性，分析转基因的存在，完整性和表达。
从不成熟胚发生愈伤组织
适于转化的II型松散胚源性愈伤组织是源自，例如，A188×B73玉 米。也可以使用替代的近亲繁殖系如B73源的，以及玉米杂交系，包 括，例如，在实施例11列出的那些。通常在授粉后11天，使用实施 例11中所述的方法从雌穗上无菌分离1-2mm长的不成熟玉米胚。
不成熟胚被置于平板，例如，基于N6培养基(Chu et al，1975 Scientia Sinica，18，659-668)的平板，用KOH调到pH5.8，含有1mg/l 2，4-D，2.9g/l L-脯氨酸，2mg/l L-赖氨酸，100mg/l酪蛋白水解物， N6主要盐，N6次要盐，N6维生素，2.6g/l脱羧基吉兰糖胶(或2g/l “Gelgro”)和20g/l蔗糖。适当的替代培养基包括，例如，类似的培 养基但含有MS盐(Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant，15， 473-497)代替N6盐。替代地，该培养基可以含有～10mg/l麦草畏以 代替2，4-D。
不成熟胚在上述培养基上在黑暗中～25℃培养，以发生愈伤组织。 利用本领域已知的方法，以及如WO 98/44140得实施例中所描述，通 过对快速生长的松散胚源性细胞的目测筛选而选择II型愈伤组织材 料。例如，通过选择可能处于细胞簇表面的优选细胞对合适的受体细 胞进行手工筛选，合适的受体细胞可以进而通过它们的缺少分化，个 体小和高细胞核/细胞质体积比进行鉴别。悬浮培养物是从愈伤组织 内表现得最少分化，最柔软和最松散的组织发生的。在不成熟胚的最 初平板培养大约8-16天后，具有上述形态的组织被转移到新鲜培养 基的平板。然后每14-21天取出上述组织的～10％，约达到1克的小 块进行常规继代培养(subculture)。在每个步骤只将含有所需要的II 型或III型形态的材料进行继代培养。
细胞悬浮培养物的制备
优选地在上述愈伤组织发生后的6个月内，在含有合适激素例如2， 4-D和NAA的液体培养基中开始分散悬浮培养，上述激素供选地以缓 慢释放胶囊处理的形式如，例如US 5550318的实施例1和实施例2所 描述。供选地，通过不时地掺入新鲜激素补充以维持培养物中的激素 水平。通过，例如，将约0.5g愈伤组织加入到含有10ml悬浮培养基 的100ml的烧瓶中开始悬浮培养。每7天，用无菌大头移液管将1ml 沉降细胞和4ml条件培养基转移到含有新鲜培养基的新烧瓶中进行继 代培养。不能通过移液管的末端的大的细胞聚集物在每次继代培养步 骤被排除在外。供选地，在每次继代培养步骤悬浮培养物被通过合适 的筛子(例如，~0.5-1mm的网孔)。6-12星期后培养物变得分散。 适当的细胞悬浮培养基包括，例如，调到pH6.0的，含有Murashige 和Skoog(1962)主要和次要盐(供选地进行修正以含有较低水平的， 1.55g/l的硝酸氨)，30g/l蔗糖，0.25g/l硫胺，10mg/l麦草畏，25mM L-脯氨酸，200mg/l酪蛋白水解物，100mg/l肌醇，500mg/l硫酸钾 和400mg/l磷酸氢钾的培养基。替代地，细胞悬浮培养基含有2，4-D 和/或NAA代替麦草畏。
细胞悬浮培养物的冷冻保存
供选地，用防冻剂和，例如，US 5550318的实施例2中所描述的 方法将上文所描述得到的悬浮培养物进行冷冻保存。冷冻保存需要在1 到两个小时的时间内将冰冷的防冻剂逐步添加到同样冰冷的预冷细胞 中。将混合物保持冰的温度，直到防冻剂的最终浓度等于细胞悬浮液 的体积。防冻剂的最终浓度为，例如，10％的二甲亚砜，10％聚乙二 醇(6000Mw)，0.23M L-脯氨酸和0.23M蔗糖。在冰冷的条件下平衡 30分钟后，将混合物分成～0.5ml的等分，转移到2ml的微量离心管， 并以0.5℃/min的速度缓慢冷却到-8℃。经过一段时间的冰核形成后， 将样品进一步缓慢冷却到-35℃，然后投入到液氮中。在需要使用时将 冷冻的样品融化如下：首先将它们和它们的容器在～40℃水浴约2min， 然后让它们慢慢融化至完全。细胞和防冻剂的混合物被用移液器取出 到铺在BMS“进料器”小室(BMS“feeder”cells)上的滤纸上，并置 于25℃。一旦融化的组织开始生长，它就被转移回到新鲜的固体培养 基上，并且一旦形成后(established)(在1到2个星期内)被进一 步转移到细胞悬浮培养基中。一旦重新建立在液体悬浮培养基中的生 长，上述细胞被用于转化。
颗粒介导的转化
含有XmaI EPSPS表达盒的质粒pIGPD 9衍生的DNA(即，pZEN6i， ZEN10i等等)被纯化，大量生产(例如，合适的HisB-，RecA-E.coli 宿主菌株(例如，DH5α：hisB)在基本5×A培养基(minimal 5×A medium) (每升中含有K2HPO4 52.5g，KH2PO4 22.5g，(NH4)2SO4 5g和柠檬酸 钠.2H2O 2.5g)中生长到稳态期后，利用上述细胞中的质粒DNA进行 适当的离子交换层析或CsCl2梯度密度分离)并以无菌水中的浓缩溶液 的形式提供(优选地～1mg/ml)。DNA是以环状质粒DNA的形式提供的， 或替代地，用XmaI限制性水解以提供含有EPSPS表达盒的线性片段， 在琼脂糖凝胶电泳纯化和电洗脱后使用。
合适的轰击装置为，例如，Biorad PDS 1000 Helium gun。小盘 被放在用于阻挡Kapton弹射弹(Kapton macroprojectile)的阻挡屏之 下5-6cm。以与Klein et al 1987，Nature，327，70-73中的描述 类似的方式，DNA构建体被沉淀到平均直径～1.0μm的钨或者金颗粒 上。例如，1.25mg的钨或者金颗粒相继与~20-30mgDNA，1.1M CaCl2和8.7mM精胺混合，终体积为~0.6ml。混合物在0-4℃旋涡混合10min， 进行低速离心(～500g)5min，并将大部分上清倒去。将钨颗粒悬浮于 终体积～30ml。将1-10μl的一小份取到上述颗粒枪的弹射弹上。
源自II型和/或III型愈伤组织的悬浮培养物在培养基中保持3 -5个月(或，替代地，从冷冻保存物复苏)，然后将新鲜的继代培养 物过滤通过~0.5-1mm的不锈钢网孔。然后将从上述过滤回收的约0.5ml 压缩细胞体积的细胞移到5cm滤纸上，真空干燥，然后转移到含有3 层用悬浮培养基润湿的7cm滤纸的培养皿。每平板的悬浮细胞被集中 到样品盘中心，移去培养皿盖并在28英寸汞柱的真空中轰击两次。0.1 或1.0mm的挡板被供选地被置于阻挡板下面2.5cm以便减轻对被轰击 组织的损伤。轰击后，从滤纸上移去植物细胞，将植物细胞重新悬浮 到细胞悬浮培养基中并培养2-21天。替代地，将轰击的愈伤组织从 一个平板转移到另一平板，转移到含有同样固体培养基(例如含有8g/l 的纯化的琼脂)的平板上，并同样在～25C黑暗培养。
转化子的筛选
转化后，在液体或固体培养基中的未筛选的生长细胞被转移到滤 纸上并覆盖在含有一定筛选浓度的(0.1-20mM)组织培养等级的N- (膦酰基甲基)甘氨酸(Sigma)的固体培养基上。合适的固体筛选培 养基包括，用KOH调节到pH5.8或6.0，含有MS或N6盐(例如上述用 于愈伤组织发生的盐或，含有适当的琼脂添加物，上述在液体悬浮中 用于细胞生长的盐)和N-(膦酰基甲基)甘氨酸的培养基。合适的筛 选培养基也包括，例如，实施例11中所描述的筛选培养基，但在此情 况下，该培养基被改造以便不含有抗生素。表达抗性的EPSP合酶的转 化愈伤组织的筛选是基于它们在对类似制备的未转化细胞具有抑制作 用的浓度下能够生长。生长团块在新鲜的筛选培养基上进行继代培养。 优选地，用于筛选培养基中的N-(膦酰基甲基)甘氨酸的浓度在筛选 的前两周为约1mM，并其后为约3mM。在6-18周后，假定的抗性愈伤 组织被鉴定并筛选出来。
转化子的再生/转化植物材料的繁殖和分析
根据，例如，Duncan et al(1985，Planta，165，322-332)，Kamo et al(1985，Bot.Gaz.146(3)，327-334)和/或West et al(1993， The Plant Cell，5，1361-1369)和/或Shillito et al(1989) Bio/Technol.7，581-587所描述的方法，将筛选的愈伤组织再生成正 常可育的的植物。
例如，通过将胚源性愈伤组织转移到含有0.25mg/l 2，4-D，10mg/l 6-苯甲基-氨基嘌呤和，供选地，0.02-1mM N-(膦酰基甲基)甘 氨酸，调节到pH6.0的Murashige和Skoog培养基，对植物进行有效 的再生。~2周后，将组织转移到类似的但缺少激素的培养基。供选地， 通过更多次的转移以及经过更长的达6-8周的时间逐步降低激素水 平。在2-4周后发生的新芽被转移到含有1％蔗糖并用2g/l Gelgro 固化的MS培养基，它们在固化的培养基生根。
用于再生的替代方法和培养基如在实施例11中，除了所用的培养 基不含抗生素。
将植物生长至成熟的方法，植物通过传代进一步繁殖的方法，对 草甘膦抗性的遗传的分析以及对EPSPS转基因的存在，完整性和表达 的分析，如实施例11所描述。
实施例13.用包被在碳化硅须状物上的含有EPSPS表达盒的DNA 转化玉米品系；对草甘膦抗性的植物和植物细胞的筛选和再生
在一个进一步的实施例中，玉米品系包括，例如，具有基因型 A188×B73的杂交系被制备为细胞悬浮物，并基本上利用如Frame et al (1994，Plant J.6，941-948)所描述的方法，通过将细胞与包被了 DNA的碳化硅须状物接触而转化玉米品系。如前面的实施例所描述，根 据这样产生的转化愈伤组织在含有一系列浓度草甘膦的培养基中的不 同生长率进行筛选，上述愈伤组织被再生成小植株(T0)，该小植株生 长至成熟并自交或杂交繁殖以提供用于进一步繁殖的后代种子(T1)。 如前面的实施例所描述，评估植物和植物材料的草甘膦抗性并分析其 转基因的存在，完整性和表达。
从不成熟胚发生愈伤组织，细胞悬浮物的制备
适于转化的玉米细胞悬浮液供选地被冷冻保存并以以如实施例2 所描述的同样的方式提供。
转化
含有Xma1 EPSPS表达盒(例如，pZEN7i，ZEN8I等等)的源自pIGPD9 的DNA质粒被纯化，被收集成堆(例如，通过阴离子交换层析或CsCl2) 并在无菌水中以浓缩溶液(优选地～1mg/ml)提供。
含有XmaI EPSPS表达盒的质粒pIGPD 9衍生的DNA(即，pZEN7i， ZEN8i等等)被纯化，大量生产(例如，合适的HisB-，Rec A-E.coli 宿主菌株(例如，DH5α：hisB)在极限5×A培养基(minimal 5×A medium) (每升中含有K2HPO4 52.5g，KH2PO4 22.5g，(NH4)2SO4 5g和柠檬酸 钠.2H2O 2.5g)中生长到稳态期后，利用上述细胞中的质粒DNA进行 适当的离子交换层析或CsCl2梯度密度分离)并以无菌水中的浓缩溶液 的形式提供(优选地～1mg/ml)。DNA是以环状质粒DNA的形式提供的， 或替代地，用XmaI限制性水解以提供含有EPSPS表达盒的线性片段， 在琼脂糖凝胶电泳纯化和电洗脱后使用。
转化完全如Frame et al 1994的描述进行。替代地，对该方法进 行某些改造，如下文所述。
继代培养培养后一天，允许细胞悬浮培养基的液体培养物中生长 的细胞在摇瓶中沉降出来。倒出用过的培养基并沥干，每4ml浓缩细 胞体积加入12ml pH6.0的改造后含有6mM L-脯氨酸，20g/l蔗糖，2mg/l 2，4-D，0.25M山梨醇和0.25M甘露醇的N6培养基(Chu et al 1975)。 将烧瓶放回振荡器(在125rpm旋转振荡并在26-28℃温育)45min。 此后用大开口的移液器将1ml等分的细胞悬浮液取出到一系列的无菌 微量离心管中。允许每管的细胞沉降后，除去0.6ml的用过的培养基， 使得剩下的大部分内容物为沉降的细胞。通过在1ml的如上文所述的 改良N6培养基中旋涡混合悬浮50mg的碳化硅须状物(Silar SC-9 whiskers，Advanced Composite Materials Corp.Greer，SC.USA)。 然后将40μl的这些悬浮的须状物和25mg含有EPSPS表达盒的线性DNA 或质粒加入到各管沉降细胞。将上述管用手指振荡2-3次，自动混合 机混合(mixomated)(在Mixomat dental amalgem mixer(Degussa， Ontario，Canada)上)1秒，然后往每个微量离心管中加入0.3ml N6 培养基(如上文所述进行改造)。然后悬浮细胞被涂布到(200μl/平板) 覆盖在固体N6培养基(和上文所述的N6培养基相同，但不含有山梨 醇，甘露醇，并含有30g/l蔗糖和3g/l脱乙酰吉兰糖胶)上的滤盘上。 每个平板用Urgopore胶带(Stelrico，Brussels)包裹并在26-28℃ 黑暗培养1个星期。
转化子的筛选
如实施例12中所描述筛选转化子，或替代地，如Frame et al 1994 中所描述，但用浓度在1到5mM之间的N-(膦酰基甲基)甘氨酸代替 Frame et al的出版物中所指定的bialaphos。
转化子的再生/转化植物材料的繁殖和分析
如实施例12所描述对植物进行再生，增殖和繁殖。如实施例12 所描述分析植物的草甘膦抗性和分析植物材料转基因的存在，完整性 和表达。
表2用碳化硅须状物转化后EPSPS转基因在可再生愈伤组织中的 表达
本表出示了EPSPS酶测试(在100μM PEP中+/-100μM草甘膦) 的结果；上述结果是基于对可再生A188×B73可再生玉米的稳定转化愈 伤组织抽提物的酶学分析，上述转化是用ZEN13DNA通过须状物法进行 的。每个愈伤组织品系代表两次重复测试的单一结果。计算了真正耐 受(允许～8％的抑制)的酶活性的比率，上述比率表示为转基因活性 比内源敏感活性(＞98％抑制+草甘膦)。在一些品系中突变体EPSPS 的表达相对较强，值得注意的品系是90921sw3-1，在这些品系中，考 虑到耐受酶的Vmax相对于野生型降低了(约三分之一)，可以估计耐 受酶的表达是3-10×正常水平的内源EPSPS(由于以下事实使得这一 计算更为复杂：EPSPS活性的内源性敏感水平非同寻常地低)。通过 Western分析了同样的抽提物(在这种情况下使用抗纯化的Brassica napsus EPSPS的多克隆抗体)，并且根据与纯化的水稻EPSPS反应的 标准曲线对EPSPS的量进行定量。Western数据表达为相对于未转化的 玉米愈伤组织总EPSPS增加的倍数。与酶的数据非常一致，Western数 据表明在，例如，品系90928sw3-1中EPSPS的高水平表达。 结果 DNA 测量的活性+ 无草甘磷时 真正耐 Western 品系# 构建体 100μM草甘膦 的总活性 受/敏感 分析(相对
(nmol/min/mg) (nmole/min/ EPSPS活 于对照的
(真正耐受活性＝ mg) 性的比 X倍)
测量的×1.08) 率 90921s15-1 ZEN13 2.87 17.04 1∶4 4
3.14 11.84 90921ti1-1 ZEN13 1.66 10.89 1∶6 3
2.03 15.88 90928tI2-1 ZEN13 2.61 20.04 1∶4.5 3
4.3 15.86 90921sw3- ZEN13 11 13.22 1∶0.3 7
1
8.88 14.96
实施例14用含有超二元载体的Agrobacterium菌株转化水稻品 系，上述超二元载体在T-DNA得到左和右边界之间包含有EPSPS表达 盒；草甘膦抗性的植物细胞和植物的筛选和再生
在进一步的实施例中，从合适的水稻品系(包括，例如，品种 Koshihikari，Tsukinohikari和Asanohikari)的成熟种子上分离子 叶盘，脱分化，并通过农杆菌感染转化这样得到的愈伤组织。在筛选 和再生后，得到转基因的小植株(T0)，这些小植株长到成熟并自交或 杂交繁殖以提供进一步繁殖的后代种子(T1)。如先前的实施例中所描 述，评估植物和植物材料的草甘膦抗性并分析转基因的存在，完整性 和表达。作为下文描述的方法的替代使用了US5591616实施例1中的 方法，适当地改变以便用草甘膦代替潮霉素用于筛选。
Agrobacterium菌株的构建：Agrobacterium悬浮液的制备
如实施例11所描述，构建了含有超二元载体的Agrobacterium菌 株(用质粒DNA通过电穿孔转化Agrobacterium)，其中上述超二元载 体在左和右边界之间含有所需要的EPSPS表达盒。根据实施例11中描 述的方法制备悬浮液。替代地，转化后的农杆菌菌株在含有适当的筛 选抗生素(例如，在LBA4404(pSB1ZEN13等)的情况下为50mg/l壮 观霉素)的AB培养基(Chilton et al，1974，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.71，3672-3676)上生长3天，并用接种环从平板上刮取细菌以 在AAN培养基(Hiei et al，1994，The Plant Journal，6(2)，271-282) 中形成密度为1-5×109细胞/ml的悬浮液。
水稻栽培品种，从子叶盘制备愈伤组织
水稻栽培品种为，例如Oryza sativa L.Tsukinohikari， Asanohikari和Koshihikari。
成熟种子被去壳，在70％乙醇中洗涤，然后在1.5％NaOCl中浸泡 30min以表面灭菌。无菌水漂洗后，它们在pH5.8的2N6培养基上30℃ 黑暗培养3个星期，上述2N6培养基含有N6培养基的主要盐，次要盐 和维生素(Chu 1978 in Proc，.Symp.Plant Tissue Culture.，Peking： Science Press，pp43-50)，30g/l蔗糖，1g/l酪蛋白水解物，2mg/l 2， 4-D和2g/l脱乙酰吉兰糖胶。从种子子叶盘增生的愈伤组织在新鲜的 2N6培养基上继代培养3-7天。筛选生长的愈伤组织(直径1-2mm)， 悬浮于2N6液体培养基中(无脱乙酰吉兰糖胶)，并在烧瓶中培养，培 养条件为在黑暗中在旋转振荡器上125rpm，25C。每7天换一次培养基。 换3-4次培养基后的对数生长期的细胞被用于转化。
感染，转化和筛选
允许悬浮的水稻愈伤组织细胞从悬浮液中沉降下来，然后重悬浮 于Agrobacterium悬浮液中，让它们接触几分钟后，再一次让其沉降， 不漂洗，涂布于2N6-AS培养基(调节到pH5.2并含有10g/l D-葡萄 糖和100μM乙酰丁香酮的2N6培养基)，并在黑暗中25℃培养3-5天。 生长的材料用溶于无菌水的250mg/l的氨中噻肟头孢菌素充分漂洗， 然后转移到2N6-CH培养基(用KOH调节到pH5.8，并含有250mg/l氨 中噻肟头孢菌素和0.5-6mM组织培养级的N-(膦酰基甲基)甘氨酸的 2N6培养基)，或替代地，2N6K-CH培养基(如Hiei et al 1994的描 述改造后的2N6培养基，但含有0.5-6mM组织培养级的N-(膦酰基甲 基)甘氨酸代替潮霉素)，并在黑暗中25℃培养3星期。增殖的集落 在第二块筛选培养基上进一步继代培养7-14天。
植物的再生和分析
生长的集落被涂布到pH5.8的再生培养基上，上述再生培养基含 有半强度的N6主要盐，N6次要盐，N6氨基酸，AA培养基的维生素 (Chilton et al 1974)1g/l的酪蛋白水解物，20g/l蔗糖，0.2mg/l 萘乙酸，1mg/l激动素，3g/l脱乙酰吉兰糖胶和，供选地，0.04-0.1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸。这些平板在25℃温育，并保持连续光照(～ 2000lux)。如实施例1中所描述，再生的植物最终被转移到盆中并在 温室中成熟。
基本上如实施例11所描述植物增殖并育种(例如，转基因植物自 交)。基本上如实施例11所描述，分析植物的草甘膦抗性，并分析植 物材料转基因的存在，完整性和表达。
实施例15通过微粒轰击用含有EPSPS表达盒的DNA转化小麦品系； 草甘膦抗性的植物和植物细胞的筛选和再生
在一个进一步的实施方案中，从在含有激素(2，4-D)的培养基 中温育2天的合适的小麦品系(包括，例如，春小麦cv BobWhite，和 Jagger)分离不成熟胚，并用DNA包被的颗粒通过轰击转化上述小麦 品系。在一段时间的复苏和愈伤组织的持续生长后，通过含有固定水 平的草甘膦和(系列稀释的)递减水平的2，4-D的一系列培养基对 形成愈伤组织的胚进行继代培养，以便诱导体细胞胚形成。再生筛选 的材料，以便在同样含有草甘膦的培养基上形成新芽。上述材料被转 移到生根的培养基，并如前面关于玉米的实施例中所描述，被再生成 小植株(T0)，该小植株生长至成熟并自交或杂交繁殖以提供用于进一 步繁殖的后代种子(T1)。如前面的实施例所描述，评估植物和植物材 料的草甘膦抗性并分析其转基因的存在，完整性和表达。作为下文所 描述方法的替代，使用了US 5631152的实施例1中所描述的方法。
不成熟胚的制备
小麦植物品系(例如春小麦Triticum aestivum cv BobWhite)在 温室中生长至成熟并在开花后期11-15分离颖果。颖果在5％NaOCl中处理15分钟以进行表面杀菌，然后用无菌水反复清洗。无菌分离不 成熟胚，将其置于覆盖在A2培养基上的3平方cm的尼龙网(网孔大 小为1.5mm)上。调节至pH5.8的A2培养基为4.32g/l Murashige和 Skoog盐，20g/l蔗糖，0.5g/l L-谷氨酰胺，2mg/l 2，4-D，100mg/l 酪蛋白水解产物，2mg/l甘氨酸，100mg/l肌醇，0.5mg/l烟酸，0.1mg/l 硫胺.HCl和2.5g/l脱乙酰吉兰糖胶。胚被排列在2.5cm的小盘上， 数量大约为50个。平板用lukepore胶带密封并在25℃黑暗培养2天。 在轰击前4个小时，胚被转移到含有新鲜的、补充了36.44g/l D-山 梨糖醇和36.44g/l D-甘露糖醇的A2培养基的平板上。胚在平板间的 转移是通过它们所放置的尼龙网进行的。在轰击前，胚在这种渗透压 强度增加的培养基上25℃黑暗放置4小时。
颗粒介导的转化
含有XmaI EPSPS表达盒的质粒pIGPD 9衍生的DNA(即，pZEN6i， ZEN10i等等)被纯化，大量生产(例如，合适的HisB-，RecA-E.coli 宿主菌株(例如，DH5α：hisB)在极限5×A培养基(minimal 5×A medium) (每升中含有K2HPO4 52.5g，KH2PO4 22.5g，(NH4)2SO4 5g和柠檬酸 钠.2H2O 2.5g)中生长到稳态期后，利用上述细胞中的质粒DNA进行 适当的离子交换层析或CsCl2梯度密度分离)并以无菌水中的浓缩溶液 的形式提供(优选地～1mg/ml)。DNA是以环转质粒DNA的形式提供的， 或替代地，用XmaI限制性水解以提供含有EPSPS表达盒的线性片段， 在琼脂糖凝胶电泳纯化和电洗脱后使用。
以与Klein et al 1987，Nature，327，70-73中的描述类似的方 式制备颗粒并用DNA包被。DNA的颗粒的制备和颗粒枪的操作如实施例 12所描述。替代地，具体操作如下。例如，微量离心管中的60mg的钨 或者金颗粒(1.0μM)用HPLC级的乙醇反复清洗，然后在无菌水中反 复清洗。将颗粒重悬浮于1ml无菌水中并以50μl的等分分装到微量离 心管中。金颗粒储存于4℃，钨颗粒储存于-20℃。往每个等分的颗粒 (化冻后)中加入3mg DNA并将离心管在最高速旋涡混合。在维持近于 持续混合的同时，加入50μl的2.5M CaCl2和20μl 0.1M精胺。进而 旋涡混合10分钟后，在Eppendorf微量离心机上将样品离心5秒，倒 去上清并通过相继添加HPLC级的乙醇洗涤颗粒。颗粒充分悬浮于60μl 乙醇中，并将10μl的等分分装到每个kapton膜宏载体(kapton membraen macrocarrier)上，以用于PDS1000颗粒枪。
通过在70％乙醇中浸泡并在空气中干燥对PDS1000颗粒枪部件的表 面进行灭菌。如上文所述制备的，含有排列在～2.5cm小盘上的～50 个胚的靶平板被放置在距离阻挡屏6cm的地方。用1100psi的击穿小 盘(rupture disc)进行轰击。每个平板轰击一次或两次。
用有孔胶带(pore tape)密封轰击后的平板，并在25℃黑暗中 维持16h。用氦冲击波将胚从培养基的表面上脱离下来，回收并在新鲜 的补充有同样的甘露醇和山梨醇的A2培养基平板上培养过夜。然后轰 击后的胚被转移到新鲜的A2培养基平板上并在筛选前25℃黑暗培养1 个星期。
转化子的筛选和再生
经过此复苏期后，形成愈伤组织的胚被从网上取下，并以20个外 植体/平板的密度被转移到A2 2P培养基(A2培养基，调到pH5.8， 含有2mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸)上。在A2 2P培养基上一星期后，将 愈伤组织移到A1 2P(A2培养基，含有1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸) 培养基上2星期，然后移到A0.5 2P(A2培养基，含有0.5mM N-(膦 酰基甲基)甘氨酸)培养基上进而2星期。供选地，将2星期的培养时 间减少到1星期，和/或省略中间的在A1 2P培养基上培养的步骤。 供选地，N-膦酰基甲基甘氨酸的筛选浓度在0.5mM到10mM之间，尽管 2mM是优选的。通过培养基中递减水平的2，4-D诱导上述愈伤组织的 全部时间为2-10个星期，优选地为3-6个星期并且最优选地为~4星 期。
为了促进最大限度的新芽生长以及为了阻止根的发展，上述愈伤 组织被转移到Z培养基。Z培养基是含有10mg/l玉米素(zeatin)代替 2，4-D，并同样含有0.1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸的A2培养基。 供选地，N-(膦酰基甲基)甘氨酸在0.04-0.25mM的范围内。在进行继 代培养之前再生的愈伤组织被保持在上述培养基中3星期，继代培养 时发育良好的新芽被切除。由于单一的愈伤组织(代表一个单一的胚) 可能只产生一个结果，整个愈伤组织被移开到新鲜的平板并保留切除 的新芽，以保证从同一个愈伤组织产生的多个克隆不会被当作分别的 结果。带有仅部分发育的新芽或无可再生部分的愈伤组织被放回Z培 养基继续培养3星期。在此时期后不能再生的愈伤组织被抛弃。
新芽维持在Z培养基上直到形成4个或更多个良好发育的叶片(长 度延伸到～2cm)。然后将再生植物材料小心地转移到含有0.5MS培养 基的塑料盆中。0.5MS培养基，pH5.8，为2.16g/l Murashige和Skoog 盐，15g/l蔗糖，2.5g/l活性碳，2.5g/l吉兰糖胶，1mg/l甘氨酸，50mg/l 肌醇，0.25mg/l烟酸，0.25mg/l维生素B6.HCl，0.05mg/l硫胺.HCl和0.1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸(供选地0.0-0.25mM)。一旦植物 生根后，它们被转移到盆中的土壤并断绝培养基供应(weaned)，或转 移到含有0.5MS(无N-(膦酰基甲基)甘氨酸)和2.5g/l活性碳的玻 璃沸腾管。优选地在生根培养基中含有活性碳以吸附任何随着小植株 转移的残留的PGRs或筛选化学试剂，并创造一个黑暗的生根环境，从 而避免生理上异常的绿色根。
愈伤组织诱导和再生的第一个星期在25℃黑暗中进行。再生的第 二个星期在25℃弱光下，随后的星期为大约2500lux，16小时光照时 间。
转化植物材料的增殖、育种和分析
产生T1和进一步的后代的方法在本领域中是众所周知的，并基本 上如先前的实施例中所描述。对草甘膦抗性的遗传以及转基因的存在， 完整性和表达的分析如先前的实施例所描述。
实施例16通过原生质体的电穿孔用含有EPSPS表达盒的DNA转化 小麦品系；草甘膦抗性的植物和植物细胞的筛选和再生
在进一步的实施例中，含有EPSPS表达盒的以及与实施例12，13， 15中所使用的质粒或线性DNA相同的质粒或线性DNA被用于直接转化 能够再生成可繁殖植株的小麦品系的原生质体(参见US 5231019)。分 离的小麦原生质体，优选地源自叶片组织或培养细胞(参见Gamborg，O. L.and Wetter，L.R.Plant Tissue Culture Methods，1975，11-21)， 在0.4M甘露醇中，pH5.8，被制备成～ca 2×106原生质体/ml。往这 种悬浮液中首先加入0.5ml溶于pH5.8的改造F培养基(Nature (1982)，296，72-74)的40％w/v分子量6000的聚乙二醇(PEG)， 然后加入含有15mg所需要的质粒或线性DNA以及50mg小牛胸腺DNA 的65ml的水。上述混合物在一起26℃温育30min，不时混合并随后用 F培养基稀释(Nature(1982)，296，72-74)。通过低速离心机分 离原生质体，将原生质体加入到4ml的CC培养基(Potrykus，Harms， Lorz，(1979)Theor.Appl.Genet.，54，209-214)中并在黑暗中24C 温育。
替代地，除了用PEG处理之外，谷类原生质体的转化是通过进一 步的热激和/或电穿孔(Neumann，E.et al(1982)，the EMBO J.，7， 841-845)步骤进行的。因此，例如，小麦原生质体在DNA和甘露醇的 水溶液中温育，加热到45℃ 5min，然后冷却到0℃超过10秒。然后 加入聚乙烯乙二醇到终浓度~8％w/v。在温和但彻底混合后，在电穿孔 器中进行处理。通过70％乙醇清洗并在无菌空气中干燥对Dialog ‘Porator’(Dialog，Dusseldorf，Germany)的小室进行灭菌。用氯 化锰将原生质体(在0.4M甘露醇中~ca 2×106原生质体/ml+DNA)悬 浮液调节至测量电阻为~1.4k ohm。体积～0.4ml的样品受到，以10 秒的间隔，应用电压在1000和2000V之间的三次脉冲的作用。收集这 样转化的原生质体并稀释回CC培养基。
那些本领域的技术人员将认识到这些转化方法的许多置换和变化 是可能的，并且，例如，通过将执行转化时的溶液的pH值提高到9.5 和/或增加钙离子浓度可以改善转化。
3-14天后，正在生长的细胞培养物被转移到含有在1到5mM之间 (优选地为2mM)的任一筛选浓度的组织培养级N-(膦酰基甲基)甘 氨酸(Sigma)的培养基。这样鉴定的细胞集落(表现为能够在至少2 倍于未转化的对照所能够耐受的草甘膦浓度下生长)被转移到同样含 有一定筛选浓度范围的草甘膦的新鲜琼脂培养基并且，如实施例15所 描述，平板之间的继代培养含有相继降低浓度的2，4-D。可以分析生 长抗性的集落中重组DNA的存在(例如通过PCR等等)。可能在也可能 不在愈伤组织步骤实现很大程度的筛选。在任何一种情况下生长的愈 伤组织将用于进行下一步。
然后生长的愈伤组织被转移到含有玉米素和N-(膦酰基甲基)甘 氨酸的新芽再生培养基，然后转移到生根培养基，完全如实施例15所 描述。如本领域中所已知和如实施例15所描述，并使用了实施例11 中所描述的分析方法，表达草甘膦抗性的EPSP合酶的可育的的植物被 再生，筛选测试。
实施例17.检测EPSPS活性和测定动力学常数的方法。在粗植物 材料中检测EPSPS活性的方法以及区分总EPSPS中对草甘膦抗性的部 分的方法
EPSPS酶检测
检测通常是根据Padgette et al 1987(Arichiyes of Biochemistry and Biophysics，258(2)564-573)的放射化学方法以K+离子作为 主要的阳离子平衡离子进行的。检测体系的总体积为50μl，在 50mMHepes(KOH)pH7.0中，在25℃，含有纯化的酶或在Hepes pH 7.0 中适当稀释的植物提取物(参见下文)，上述Hepes pH7.0含有10％ 甘油，和5mM DTT，14C PEP或者作为可变底物(对于动力学测定)或 固定在100或250μM，以及含有2或0.75mM的莽草酸3磷酸(K+盐)， 如所指出的那样。供选地，为了粗植物抽提物的检测，检测体系还含 有5mM KF和/或0.1M钼酸铵。检测随着14C膦酰基烯醇基丙酮酸(环 己胺+盐)的加入而开始，并在2-10分钟后(2分钟为优选的)随着 加入50μl的一份1M乙酸和九份乙醇溶液而终止。终止后，20μl被负 载到synchropak AX100(25cm×4.6mm)层析柱，并用0.28M磷酸钾pH6.5 的流动相，以0.5ml/min的流速进行35分钟的平台洗脱(isocratic elution)。在这种条件下PEP和EPSP的持留时间分别为～19和25分 钟。一个CP 525TR闪烁计数器被连接到AX 100层析柱的末端。与其 配合的是0.5ml的流动池，闪烁剂(Ultima Flo AP)的流速被设定为 1ml min。PEP和EPSP的相对峰面积被积分，并测定标记的PEP转化 为EPSP的转化百分比。利用Erithacus Sofware Ltd.的Grafit 3.09b， 以简单加权通过对双曲线的最小方差拟合确定了表观Km和Vmax值。 通常用从Km/2-10Km的8-9个浓度的可变底物以及三次重复点确认了 Km值。除非特地注明，在分析中仅仅包括了＜30％的底物转化为EPSP 的数据点。
莽草酸-3-磷酸(S3P)的制备如下：往含有0.05M莽草酸，0.0665 M ATP(Na盐)，10mM KF，5mM DTT，和0.05M MgCl2·6H2O的7ml 0.3M TAPS，pH8.5中加入75μl的77单位(μmol min-1)ml-1的莽草酸激 酶溶液。在室温24小时后，通过在95℃短时间加热终止反应。反应 溶液用0.01M Tris Hcl pH9稀释50倍，并在Dowex 1×8-400上用0 -0.34M LiCl2梯度进行离子交换层析。将S3P级分混合到一起，冻干， 溶后溶解于7ml蒸馏水中。加入28ml 0.1M Ba(CH3COOH)和189ml无水 乙醇。该溶液在4℃搅拌过夜收集得到的三钡S3P，并在30ml的67％ 乙醇中洗涤。洗涤后的沉淀溶于～30ml蒸馏水中。通过加入K2SO4得到 所需要的S3P的K+或TMA+盐。应当非常小心，以便加入的过量的硫酸 盐为最少。除去BaSO4沉淀，将含有所需要的S3P盐的上清冻干。称重 每种盐，并通过质子NMR分析。根据质子NMR，这样制备的S3P制备物 纯度＞90％(根据它们的重量以及31P NMR的积分)，仅含有痕量的硫 酸钾。
适用于EPSPS检测的植物材料抽提物的制备
用液氮冷冻的臼和杵将愈伤组织或小植株材料(0.5-1.0g)研磨 成细微的冰冻粉末。将上述粉末加入到等体积的适当的预冷抽提缓冲 液中(例如，pH7.5的50mM Hepes/KOH缓冲液，含有1mM EDTA，3mM DTT， 1.7mM“Pefabloc”(丝氨酸蛋白酶抑制剂)，1.5mM亮肽素，1.5mM抑 肽素，10％v/v甘油和1％聚乙烯吡咯烷酮)，重悬浮，混合并在低温 离心机离心沉淀。上清用Sephadex G25的PD10层析柱置换成pH 7.5 的含有1mM EDTA，3mM DTT，和10％v/v甘油的25mM Hepes/KOH缓冲 液。用Bradford方法以牛血清白蛋白为标准估计蛋白含量。抽提物的 一部分被冷冻在液氮中；一部分立即检测。
植物抽提物的EPSPS检测通常与，如上文所述，0.1mM 14C-PEP 和0.75mM莽草酸-3-磷酸在有或无0.1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸的 情况下进行。在这样的检测条件下，抗性形式的EPSPS(见下文)估计 能被抑制＜8.5％，而敏感的w/t形式基本上被完全抑制(＞98％)。因此， 在存在草甘膦的情况下观察到的活性水平(A)被认为是代表了源自转 基因表达的抗性酶水平的～92％，而敏感w/t EPSPS的水平被认为是 在无草甘膦的条件下观察到的总EPSPS活性水平减去A×～1.08的值。 因为突变体酶的Vmax估计仅仅为w/t酶的Vmax的大约三分之一(并 因为w/t和突变体形式的Km值估计都为20μM或更小)，突变体酶多肽 的表达水平与内源w/t EPSPS表达水平相比的比率被认为是比根据它 们相对观察活性比率计算得到的比率高3倍。还利用Westerns(参见 下文)估计了EPSPS多肽表达的总水平。
实施例18.编码成熟水稻EPSPS的w/t和突变cDNA在E.coli中 的克隆和表达。w/t和突变体水稻EPSPS的纯化和特征鉴定
w/t成熟水稻EPSPS的表达，纯化和特征鉴定
根据厂商的建议，利用BRL的Superscript RT，通过RT-PCR从 分离自水稻品种Koshihikari的RNA扩增水稻EPSPS cDNA。根据厂商 提供的方法，利用Stratagene的Pfu turbo聚合酶进行PCR。下面的 寡聚核苷酸是用在扩增反应和反转录步骤中。 SEQ.ID.NO.31 Rice 3′oligo 5′GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3′ SEQ.ID.NO.32 Rice 5′oligo 5′GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC 3′
利用Invitrogens Zero Blunt TOPO试剂盒将PCR产物克隆到pCR Blunt II。通过测序确认了插入序列，并确认了除了起始的Met外， 预期的开放阅读框相应于预期的成熟叶绿体水稻EPSPS蛋白的开放阅 读框。用Nde1和Xho1切除克隆和确认的水稻epsps序列，并将该纯 化的片段克隆到类似消化的pET24a(Novagen)中。将重组克隆引入到 BL21(DE3)，一种由Stratagene提供的密码子优化的E.coli的RP菌 株。在将1mM IPTG添加到发酵培养基(补充了100μg/ml卡那霉素的 LB)后，EPSPS蛋白在上述菌株中表达。正确预期分子量的重组蛋白的 鉴定是通过：i)根据细胞提取物考马斯亮蓝染色的SDS凝胶与pET24a 空载体转化的类似E.coli细胞提取物考马斯亮蓝染色的凝胶并排比 较，以及ii)利用预先纯化的植物EPSPS蛋白制备的多克隆抗体进行 Western分析。成熟水稻EPSPS蛋白的纯化在～4C如下进行。用含有5mM DTT，2mM EDTA和20％v/v甘油的50ml 0.1M Hepes/KOH缓冲液， pH7.5，洗涤25g净重的细胞。低速离心后，细胞沉淀重悬浮于50ml 同样的缓冲液中，但上述缓冲液同时还含有2mM‘Pefabloc’，一种丝 氨酸蛋白酶抑制剂。细胞用玻璃匀浆器重悬浮至均匀，然后用Constant Systems(Budbrooke Rd，Warwick，U.K.)Basic Z cell disrupter 在10000psi破细胞。粗提取物在～30,000g离心1小时并抛弃沉淀。 加入硫酸鱼精蛋白(鲑精蛋白)至终浓度0.2％，混合并将溶液放置 30min。在～30,000g离心30min除去沉淀的物质。加入Aristar级的 硫酸铵至终浓度40％饱和度，搅拌30min然后在27,000g离心30min。 沉淀重悬浮于～10ml的用于细胞破裂的相同缓冲液。进一步加入硫酸 铵使得溶液达到～70％饱和度，将溶液搅拌30min并再次离心以得到 沉淀，沉淀重悬浮于～15mlS200缓冲液(含有1mM DTT，1mM EDTA和 20％v/v甘油的10mM Hepes/KOH(pH7.8))。将该产物过滤(0.45微 米)，负载到预先用S200缓冲液平衡的含有Superdex 200的K26/60 层析柱并层析。将根据EPSPS酶活性检测的含EPSPS的级分被混合并 负载到预先用S200缓冲液平衡的含有20mlHP Q-Sepharose的xk16 层析柱，用S200缓冲液洗上述层析柱，并在同样缓冲液中的0.0M到0.2M KCl线性梯度内洗脱EPSPS。EPSPS在相应于或低于0.1M的盐浓度以 一个单一峰洗脱下来。混合根据EPSPS酶活性检测到的含EPSPS的级 分并负载到用Superdex 75缓冲液(25mM Hepes/KOH(pH7.5)，含有2mM DTT，1mM EDTA和10％v/v甘油)平衡的Superdex 75的HiLoad xk26/60 层析柱。从层析柱上洗脱下来的EPSPS比根据推测的二体的分子量预 期的要迟一些，这可能是由于在低离子强度下蛋白与凝胶基质的相互 作用。根据酶活性鉴定的含EPSPS的级分被混合并负载到同样用 Superdex 75缓冲液平衡的1ml的MonoQ层析柱上。该层析柱用起始 缓冲液洗涤，并且EPSPS在0.0到0.2M之间的15ml线性梯度以单一 峰被洗脱下来。在这一纯化步骤得到将近(＞90％纯度)的EPSPS。供选 地，EPSPS被置换到含有1.0M(Aristar)硫酸铵的Superdex75缓冲液， 并负载到在同一缓冲液平衡的10ml苯基Sepharose层析柱。EPSPS在 1.0到0.0M之间的硫酸铵线性递减梯度的早期以单一峰被洗脱下来。
米稻EPSPS的草甘膦抗性突变体的克隆，表达，纯化和特征鉴定
用下面的设计来引入特定突变的引物对，以pCRBlunt中的水稻 EPSPS cDNA为模板，进一步进行两次PCR。 SEQ ID NO 33 rice 5′oligo 5′GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC 3′ SEQ ID NO 34 对RV反向的水稻突变体 5′GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3′ SEQ ID NO 35 Rice 3′oligo 5′GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3′ SEQ ID NO 36 对sal正向的水稻突变体5′GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3′
得到的产物进行凝胶纯化，并将产物以等摩尔浓度置于管中，以 作为另一次用rice 5’oligo和rice 3’oligo进行的PCR循环的模 板。用Invitrogens Zero Blunt TOPO试剂盒将合成的产物克隆到 pCRBlunt II。确认了插入的DNA序列，并确认了预期的开放阅读框相 应于预期的成熟叶绿体水稻EPSPS蛋白的开放阅读框(除了起始的Met 外)，还确认了所需要的突变(EPSPS序列中特定位置的T到I和P到 S的特定突变)被编码。用Nde1和Xho1切除上述克隆和确认的水稻epsps 序列，并将该纯化的片段克隆到类似消化的pET24a(Novagen)中。将 重组克隆引入到BL21(DE3)，一种由Stratagene提供的密码子优化 的E.coli的RP菌株。在将1mM IPTG添加到发酵培养基(补充了100μg/ml 卡那霉素的LB)后，EPSPS蛋白在上述菌株中表达。正确预期分子量 的重组蛋白的鉴定是通过：i)根据细胞提取物考马斯亮蓝染色的SDS 凝胶与pET24a空载体转化的类似E.coli细胞提取物考马斯亮蓝染色 的凝胶并排比较，以及ii)利用预先纯化的植物EPSPS蛋白制备的多克 隆抗体进行Western分析。上述突变体形式的水稻EPSPS蛋白的纯化 和特征鉴定以上述用于w/t水稻EPSPS的方法类似的方式进行。
如上文所述，在存在2mM莽草酸-3-磷酸时进行检测，这样得到 的突变体形式的水稻EPSPS的表观Vmax为～10mol/min/mg，Km为22μM PEP。在40μM PEP时，草甘膦钾盐的IC50值为～0.6mM。突变体EPSPS 的草甘膦钾盐的估计Ki值为～0.2mM。
实施例19.纯化的水稻EPSPS的抗体的制备和Western分析的方法
使用了在兔中产生多克隆抗血清的常规方法。兔为年轻的雌性新 西兰白(New Zealand Whites)。免疫过程包括施用4次剂量，每次～ 100mg，以一个月的间隔给药。在磷酸盐缓冲液中的每次剂量以乳浊液 的形式与Freund’s完全佐剂(剂量1)或不完全佐剂(剂量2-4)一 起给药，并被注射到4个皮下位置。在剂量1给药之前取前血(pre- bleed)。在第2次剂量后的14天取待测血(test bleed)以确认免疫 应答。在第4次剂量后的14天取终血(term bleed)并用于实验。 在第4次剂量后至少经过6星期进行第5次最后剂量注射，并且14天 后进行最后取血(也用于实验)。
同时制备针对以下蛋白的抗体：(i)纯化的天然成熟w/t水稻EPSPS (实施例8)和(ii)SDS变性的水稻EPSPS多肽，该多肽是从12％SDS 凝胶带(考马斯亮蓝染色的并排条带精确标记的蛋白的正确位置)切 除并洗脱而来的。
用12％的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS凝胶电泳和Western印迹。电 泳在100V的恒定电流下进行90分钟。凝胶在4℃以恒定30V的电压 被过夜印迹到硝酸纤维素膜。薄膜用含有0.1％Tween的5％Marvel磷 酸盐缓冲液(PBS-吐温)封闭1或2小时，在PBS-吐温中洗涤薄膜 3次并将薄膜与1.3mg IgG/ml(通常相当于为1∶4000到1∶20,000 终血稀释液)的水稻EPSPS-Rb1一抗温育。上述抗体稀释液在含有1 ％Marvel和0.05％Tween20的PBS(磷酸盐缓冲液)中作用2小时。 二抗，羊抗兔HRP(Sigma A6154)在含有0.05％Tween和1％Marvel 的PBS中以1∶10,000或1∶20,000使用。与二抗的温育持续1小 时，然后将上述印迹在PBS(0.05％吐温)中洗涤3次，通常将ECL底 物施用1分钟并将底片曝光10-60秒。阴性对照印迹用的是：(1)预 先免疫的血清稀释液，根据计算该稀释液的[IgG]的量与待测免疫血 清的相同(IgG是从各种血清小份被进行常规纯化并被定量以便上述稀 释液可以被直接计算)(2)单独抗Rreund’s佐剂的免疫血清。调整对 照免疫血清中的IgG浓度以便对照的IgG浓度是合适的。为了进行上 述计算，对IgG进行了纯化，IgG的纯化是通过将天然抗血清通过0.45μm 注射过滤器过滤并通过1ml HiTrap蛋白G层析柱(Pharmacia cat no：17-0404)。用0.1M甘氨酸HCl pH2.9洗脱结合在柱子上的IgG并 用PBS将IgG透析过夜。通过紫外检测估计IgG的浓度。(在280nm波 长，1mg ml-1纯IgG溶液在1cm光径上的吸收值为1.35)。从IgG产 量可以计算天然抗血清中IgG的浓度，并因此计算Western印迹中正 确的稀释倍数。
植物组织样品的制备如，例如，实施例17所描述。替代地，对于 Western分析使用了一种更简单的方法。100-200mg待分析的植物组 织在等体积的缓冲液(类似实施例7中的缓冲液)中被快速匀浆(例 如，用ultra turrax，小球搅拌器或玻璃匀浆器)，在低温eppendorf 离心机中离心5分钟并将上清用于：a)一小份用于用Bradford方法分 析蛋白，以及b)大部分与Laemli SDS‘样品缓冲液’以1∶1混合， 加热并储存，准备上样到凝胶上。通常SDS平板凝胶在10个加样孔中 装载10个蛋白样品。通常这些样品为1-10μg用于分析的植物材料的 粗提物和0-20ng之间的纯水稻EPSPS的标准曲线。在一些情况下， 用源自Brassica napus的纯化的w/t EPSPS(用上文所描述的类似方 法表达和纯化)制备的抗体进行Western。在这种情况下的抗体与水稻 EPSPS(或与内源植物小麦或玉米EPSPS)交叉反应的强度弱于用抗水 稻EPSPS抗体的情况，但是尽管如此，仍然提供了足够强度的反应， 以用于得到标准曲线的定量信息。
实施例20.从转基因植物材料分离基因组DNA。PCR分析。DNA探 针的制备和杂交。转基因的拷贝数和完整性
基因组DNA分离自植物，小植株和愈伤组织材料，上述分离利用， 例如，Dellporta et al(1983)in Chromosome Structure and Function： Impact of New Concepts，18’th Stadler Genetics Symposium.J.P. Gustafson and R.Appels，eds).New York：Plenum Press)pp 263-282 的方法，或替代地，可以使用DNAesy试剂盒(Qiagen)。用对水稻EPSPS 基因组序列中的突变特异的寡聚核苷酸引物SEQ ID NO.37和38通过 荧光PCR鉴定了含有突变水稻EPSPS转基因的转基因愈伤组织和植物 分离子。在PCR中包含了插入双链DNA的荧光染料SYBR绿，以便用 ABI3377机器通过样品中荧光的增强检测含有突变水稻EPSPS基因的样 品。替代地，本领域的技术人员将了解引物可以被荧光标记并且诸如 分子信标和‘Scorpions’这样的技术也是可行的。 SEQ.ID.NO.37 RiceDM Fwd2-3A 5′-gtg gaa cgc tgg aat tgc aat gca at-3′ SEQ.ID.NO.38 Univeral Reverse 5′-gtt gca ttt cca cca gca gca gt-3′
在96孔光学板(optical plate)中制备的，并用光学盖(optical lids)(PE Biosystems)密封常规PCR在25μl的总体积中包含如下成 分：
5.0μl gDNA模板(Qiagen Dneasy prep)
12.5μl 2X SYBR Green预混合物(premix)
2.5μl 5pmol/μl正向引物储存液
2.5μl 5pmol/μl反向引物储存液
2.5μl ddH2O
循环参数如下：
阶段1： 50C 2min
阶段2： 95C 10min
阶段3： 95C 15s
60C 45s
从反应的阶段3开始每7秒记录样品中的荧光变化。
对于Southern印迹，每次限制性消化大约10用μgDNA。用合适的 限制性酶(例如，Hind III)根据厂商的说明(例如Promega)，消化 基因组DNA。选择既在突变体EPSPS序列内部也在其外部切割的限制性 酶。用TAE(0.04M tris-乙酸，1mM EDTA)0.8％琼脂糖凝胶分离DNA。 根据Sambrook et al.，1989给出的方法，用HyBond N+硝酸纤维印 迹膜(Amershampharmacia)进行Southern印迹。通过暴露在紫外灯 下DNA被交联到膜上。
通过在凝胶上纯化限制性消化的质粒DNA或通过PCR得到用于产 生特异性探针的DNA片段。例如，一个700bp的含有水稻EPSPS基因 内含子1的片段，是用下面列出的引物通过PCR产生的。 SEQ.ID.NO 39 INT1/5 5’cccttcctcttgcgtgaattccatttc 3’ SEQ.ID.NO.40 INT1/3 5’gttgtgcccctaataaccagag 3’
通过随机引物方法，例如Ready-To-Go DNA标记小珠(Amersham Pharmacia)，用32P标记上述探针，并用，例如，MicroSpin G-25柱 子(Amersham Pharmacia)，纯化上述探针。
DNA凝胶的印迹在65℃在5xSSC，0.5％SDS，2xDenhardt’s溶液， 0.15mg/ml变性鲑鱼精子中预先杂交至少1小时。然后上述印迹与变性 的探针在65℃新鲜预杂交溶液中杂交16-24小时。干燥印迹的薄膜 并通过放射性自显影显示结果。
Southern印迹表明转基因在单一位点单一整合的结果，这是由探 针只与单一特异大小的限制性片段杂交而揭示的，然后通过替代的探 针与上述印迹的重新杂交确认了上述结果。对照使用的是未转化的材 料。此外，可以用对转基因构建体的其它区域(例如启动子，5’UTR 内含子或增强子序列的上游)特异的杂交探针进一步探测上述印迹， 以便确认构建体的完整性。此外，在使用农杆菌转化的情况下，使用 特定的探针以便表明是否存在任何延伸超二元载体的RB和LB以外的 DNA。 SEQ ID NO.41水稻EPSPS基因组(ATG-WT序列) atggcggcgaccatggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctc gtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcgg tggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggag atctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgaggtgagacg cggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagattttagggggtttattaggtgaggtggctgtgtttgtgaa atcctaggaattatctctcaagtcaatctaacgatgagatataactgaggttctggttttaatcacacactcatataaccaat ttattgaaacattttggtttggcataagaaactgcttacgaaggtatgatatcctcctacatgtcaggctactaaattttcac gacggtatgatccactcaaaacaagtttcttaacgagtctggtgaggtctgttatgaaatttgtgtaaactaaggcaactttg 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aaaggctgcgttacataaggtgatgagaattgaggtaaaatgagatctgtacactaaattcattcagactgttttggcataaa gaataatttggccttctgcgatttcagaagctataaattgccatctcactaaattctccttggtcctcatggcaatgcaacga cagtgtgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtg ttgtttgagtggccagcaaactggctgaccaagccacacgagagagaatactataaactcaatcatacataacaagcccaagc aacattagacagaacacaacaacactcg SEQ ID NO.42水稻EPSPS基因组(从ATG，包括双突变) atggcggcgaccatggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctc gtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcgg tggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggag atctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgaggtgagacg cggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagattttagggggtttattaggtgaggtggctgtgtttgtgaa atcctaggaattatctctcaagtcaatctaacgatgagatataactgaggttctggttttaatcacacactcatataaccaat ttattgaaacattttggtttggcataagaaactgcttacgaaggtatgatatcctcctacatgtcaggctactaaattttcac 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cctacatgttaatattacagggtgatgtcaaatttgctgaggtacttgagatgatgggagcaaaggttacatggactgacacc agtgtaaccgtaactggtccaccacgtgagccttatgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcc tgatgttgccatgacccttgccgttgttgcactcttcgctgatggtccaactgctatcagagatggtaaacattaaggcctat tatacctgttctatcatactagcaattactgcttagcattgtgacaaaacaaataaccaaactttcttcaaaataacttagaa atataagaaaggttcgttttgtgtggtaaacagtactactgtagtttcagctatgaagtttgctgctggcaattttctgaacg gtttcagctaaattgcatgtttgttcatcatacttatccattgtcttccacagtggcttcctggagagtaaaggaaaccgaaa ggatggttgcaattcggaccgagctaacaaaggtaaattcattaggtcccgtgtcctttcattcttcaagtagtttgttcata agttgaattctccttcaatgatgtttaaattcatcatcttcttttttggtgttgtgccagctgggagcatcggttgaagaagg tcctgactactgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggccatgg ccttctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttc gacgttctaagcactttcgtcaggaactgaactgagcttttaaaagagtgaggtctaggttctgttgtctgtctgtccatcat ccatgtgttgactgttgagggaactcgtttcttcttttcttcacgagatgagtttttgtgtgcctgtaatactagtttgtagc aaaggctgcgttacataaggtgatgagaattgaggtaaaatgagatctgtacactaaattcattcagactgttttggcataaa gaataatttggccttctgcgatttcagaagctataaattgccatctcactaaattctccttggtcctcatggcaatgcaacga cagtgtgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtg ttgtttgagtggccagcaaactggctgaccaagccacacgagagagaatactataaactcaatcatacataacaagcccaagc aacattagacagaacacaacaacactcg SEQ ID NO.43玉米多泛素增强子 ttcagccttcgatgtggatgcaacagcttcacaggattccattaaatcgtagccattgtgtcaaagtttgctttgccaacgtt atttatttatttatttagaaaaccagctttgaccagccgccctctttacgtttggcacaatttagctgaatccggcggcatgg caaggtagactgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaatt accacatatttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataat ataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgag tattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctccttttttttttgcaaatagcttcacctata 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gttggttggtgagagtgagacaccgacggaacggaaggagaaccacgccgcttggatttttcttttttaccttttcaaatttt aatttaaaaaataaaaccattttaaaaacttatcttcaaatacaaatcttttaaaaacactaacacgtgacacacagcgggca cgtcacccaaacgggcgtgacaatattgttttgccacaccaatccagctggtgtggacaaaatgttcatatattgaaaataaa atttaaaacaatttatattttttatctatatcattataaaaattgaagatgtttttaccggtattttgttactcatttgtgca tgagtcggtttttaagtttgttcgcttttggaaatacatatccgtatttgagtatgtttttaagttcgttcgttttttgaaat acaaaaggaatcgtaaaataaatctattttaaaaaactcgcatgctaacttgagacgatcgaactgctaattgcagctcataa ttttccaaaaaaaaatatatccaaacgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaa cgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggac gcttctaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaa ctccgtactacgtgaagcgctggatccgcaacccgttaagcagtccacacgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtag gtggcaacccttcttcctcctctatttcttcttcttcctcccttctccgcctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccg cgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaatg SEQ ID NO.46水稻基因组G3 EPSPS(到ATG) ttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaataaataaaaa tcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccat ctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaacccgttaagcagtccaca cgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaacccttcttcctcctctatttcttcttcttcctcccttctccg cctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccga cctccacgccgccggcaatg SEQ ID NO.47水稻基因组G2 EPSPS+玉米Adh1内含子 gccacaccaatccagctggtgtggacaaaatgttcatatattgaaaataaaatttaaaacaatttatattttttatctatatc attataaaaattgaagatgtttttaccggtattttgttactcatttgtgcatgagtcggtttttaagtttgttcgcttttgga aatacatatccgtatttgagtatgtttttaagttcgttcgttttttgaaatacaaaaggaatcgtaaaataaatctattttaa aaaactcgcatgctaacttgagacgatcgaactgctaattgcagctcataattttccaaaaaaaaatatatccaaacgagttc ttatagtagatttcaccttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaag tttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcgg ccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaac ccgttaagcagtccacacgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaacccttcttcctcctctatttcttct tcttcctcccttctccgcctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaacc ccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctgtctcttgatctga ctaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttcgtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgca gtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttcttttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaa tctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccatccgacagtctggctgaacacatcatacgatattg agcaaagatctatcctccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatcagtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggag gcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctcggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtcca ttcgaattttaccgtgtttagcaagagcgaaaagtttgcatcttgatgatttagcttgactatgcgattgctttcctggaccc gtgcagctgcggatg SEQ ID No.48玉米Adh1内含子 gtccgccttgtttctcctctgtctcttgatctgactaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttc gtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgcagtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttct tttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaatctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccat ccgacagtctggctgaacacatcatacgatattgagcaaagatctatcctccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatc agtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggaggcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctc ggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtccattcgaattttaccgtgtttagcaagagcgaaaagtttgcatcttgatga tttagcttgactatgcgattgctttcctggacccgtgcag
序列表 <110>Zeneca Ltd <120>抗除草剂植物 <130>ppd50450 <140> <141> <160>48 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>32 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <220> <221>modified base <222>9，15，21，27 <223>a is Inosine <400>1 gcacargcag caagagaraa agccatagcc at 32 <210>2 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <220> <221>modified_base <222>18，24，27 <223>a is Inosine <400>2 gcwggaacwg cmatgcgacc rytaacagc 29 <210>3 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>3 atttcttctt cttcctccct tctccgcctc 30 <210>4 <211>38 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>4 gagctccccg ggcgagtgtt gttgtgttct gtctaatg 38 <210>5 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>5 gcttacgaag gtatgatatc ctcctacatg tcaggc 36 <210>6 <211>46 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>6 gcagtcacgg ctgctgtcaa tgatcgcatt gcaattccag cgttcc 46 <210>7 <211>46 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>7 ggaacgctgg aattgcaatg cgatcattga cagcagccgt gactgc 46 <210>8 <211>55 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>8 ggtgggcatt cagtgccaag gaaacagtcg acatccgcac caagttgttt caacc 55 <210>9 <211>39 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>9 cgcctgcagc tcgaggttgg ttggtgagag tgagacacc 39 <210>10 <211>39 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>10 cgcctgcagc tcgaggccac accaatccag ctggtgtgg 39 <210>11 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>11 gaacctcagt tatatctcat cg 22 <210>12 <211>43 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>12 gcggccgcac tagtggccgg ccatcagcgg ccagcttttg ttc 43 <210>13 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>13 ttaactagtg aggaggccgc ctgccgtgc 29 <210>14 <211>45 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>14 cgcctctaga ggccggccga tatccctcag ccgcctttca ctatc 45 <210>15 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>15 cgctgcagtg ctcgcgatcc tcctcgcttt tcc 33 <210>16 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>16 gcgctgcagg atatccctca gccgcctttc actatc 36 <210>17 <211>36 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>17 gcgttaatta atgctcgcga tcctcctcgc ttttcc 36 <210>18 <211>66 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>18 cccatcctcc cgacctccac gccgccggca ggatcaagtg caaaggtccg ccttgtttct 60 cctctg 66 <210>19 <211>50 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>19 gacgccatgg tcgccgccat ccgcagctgc acgggtccag gaaagcaatc 50 <210>20 <211>35 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>20 cgagttctta tagtagattt caccttaatt aaaac 35 <210>21 <211>39 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>21 ggacccgtgc agctgcggta ccatggcggc gaccatggc 39 <210>22 <211>39 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>22 gccatggtcg ccgccatggt accgcagctg cacgggtcc 39 <210>23 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>23 tctctagact cagccgcctt tcactac 27 <210>24 <211>42 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>24 aaacccgggt ttggaagcgg agggaggaag gaggagataa ag 42 <210>25 <211>38 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>25 accctcccct ctctaaatcg attggtggga ggggagag 38 <210>26 <211>46 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>26 ggtctaccta caaaaaagct ccgcacgagg gtaccgccgc tggtac 46 <210>27 <211>34 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>27 ccttcgcctc ccctccttcc tcctctattt cttc 34 <210>28 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>28 gttggtggga ggggagagat ttagctaacc acc 33 <210>29 <211>42 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>29 gttttttcga ggcgtgctcc catggcggcg accatggcgt cc 42 <210>30 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>30 ggaggatatc ataccttcgt aagc 24 <210>31 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>31 gcgctcgagt cagttcctga cgaaagtgct tagaacgtcg 40 <210>32 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>32 gcgcatatga aggcggagga gatcgtgc 28 <210>33 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>33 gcgcatatga aggcggagga gatcgtgc 28 <210>34 <211>46 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>34 gcagtcacgg ctgctgtcaa tgatcgcatt gcaattccag cgttcc 46 <210>35 <211>40 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>35 gcgctcgagt cagttcctga cgaaagtgct tagaacgtcg 40 <210>36 <211>46 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>36 ggaacgctgg aattgcaatg cgatcattga cagcagccgt gactgc 46 <210>37 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>37 gtggaacgct ggaattgcaa tgcaat 26 <210>38 <2t1>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>38 gttgcatttc caccagcagc agt 23 <210>39 <211>27 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>39 cccttcctct tgcgtgaatt ccatttc 27 <210>40 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：引物 <400>40 gttgtgcccc taataaccag ag 22 <210>41 <211>3763 <212>DNA <213>Oryza sp. <400>41 atggcggcga ccatggcgtc caacgccgcg gctgcggcgg cggtgtccct ggaccaggcc 60 gtggcggcgt cggcggcgtt ctcgtcgcgg aagcagctgc ggctgcccgc cgcggcgcgc 120 ggggggatgc gggtgcgggt gcgggcgckg gggcggcggg aggcggtggt ggtggcgtcc 180 gcgtcgtcgt cgtcggtggc agcgccggcg gcgaaggcgg aggagatcgt gctccagccc 240 atcagggaga tctccggggc ggttcagctg ccagggtcca agtcgctctc caacaggatc 300 ctcctcctct ccgccctctc cgaggtgaga cgcggatccc ttcctcttgc gtgaattcca 360 tttctggaga tgagatttta 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gttgcaattc ggaccgagct aacaaaggta 2940 aattcattag gtcccgtgtc ctttcattct tcaagtagtt tgttcataag ttgaattctc 3000 cttcaatgat gtttaaattc atcatcttct tttttggtgt tgtgccagct gggagcatcg 3060 gttgaagaag gtcctgacta ctgcatcatc accccaccgg agaagctgaa catcacggca 3120 atcgacacct acgatgatca caggatggcc atggccttct ccctcgctgc ctgcgccgac 3180 gtgcccgtga cgatcaggga ccctggttgc acccgcaaga ccttccccaa ctacttcgac 3240 gttctaagca ctttcgtcag gaactgaact gagcttttaa aagagtgagg tctaggttct 3300 gttgtctgtc tgtccatcat ccatgtgttg actgttgagg gaactcgttt cttcttttct 3360 tcacgagatg agtttttgtg tgcctgtaat actagtttgt agcaaaggct gcgttacata 3420 aggtgatgag aattgaggta aaatgagatc tgtacactaa attcattcag actgttttgg 3480 cataaagaat aatttggcct tctgcgattt cagaagctat aaattgccat ctcactaaat 3540 tctccttggt cctcatggca atgcaacgac agtgtgaagc actgaagccc gtaatgctct 3600 atcaccacca tgtacgacag aaccatatat gtccatatgt acaactcgag tgttgtttga 3660 gtggccagca aactggctga ccaagccaca cgagagagaa tactataaac tcaatcatac 3720 ataacaagcc caagcaacat tagacagaac 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