技术领域：

本发明涉及一种海藻糖的生产方法，特别是涉及一种以葡萄糖为基 质采用两步发酵法生产酵母胞外海藻糖的方法。

背景技术：

众所周知酵母菌在干燥、高温休克、低温冻结和高渗胁迫等极端条 件下生成应激代谢产物海藻糖，它的存在可使酵母细胞在脱水状态下保持 数年而不失活。海藻糖研究的重要意义在于它对生物大分子具有良好的非 特异性保护作用，使其在分子生物学、医药生物制品、食品及化妆品等领 域得到广泛的应用。在分子生物学方面，随着生物技术的发展，各种工具 酶、探针、抗体、细胞器和生物试剂的应用越来越广泛，应用海藻糖可以 使生物制品在常温下保存，使生命科学研究变得方便、简单、有效。在医 药生物制品方面，减毒疫苗、单克隆抗体、激素、重组人蛋白、血液制品、 载药脂质体和活菌制剂等目前多采用真空冷冻干燥法制备和低温下保存， 如用海藻糖干燥医用生物制品，就能在常温下保存，将为其保存、运输和 使用带来极大方便。在食品方面，海藻糖是一种能改善干燥加工食品质量 和保持原有风味不变的天然食品添加剂，可广泛应用于奶类、肉类、果汁 饮料、蔬菜汁、风味调料等的保存。

海藻糖虽然有难以估量的应用前景，但其较高的价格是海藻糖广泛 应用的主要限制因素。目前海藻糖的生产方法有以下三种：  

1.酵母提取法：采用特殊的培养工艺使酵母细胞内积累较高的海藻 糖，然后收集细胞用酒精抽提法提取。它为胞内产品，发酵水平低，成本 高。

2.细菌发酵法：它主要以细菌(包括基因工程菌)为菌种生产胞外 海藻糖，如以正烷烃为基质培养Arthrobacter的发酵生产，以蔗糖、葡 萄糖为基质培养Brevibacterium、Corynebacterium等发酵生产，还有利 用Nocardia、Micrococcaceae等微生物的培养来生产海藻糖的。但转化 率低，糖类副产物多，产品分离困难。

3.细菌酶合成法：即利用酶制剂所具有的转糖基作用，在离体条件 下作用于底物，合成海藻糖，细菌酶法的合成路线有多种；如由麦芽糖 经麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶催化转化为海藻糖；由麦芽糖经分 子内转糖基酶一步转化为海藻糖；由淀粉或寡糖经新型葡糖基转移酶和 新型α-淀粉酶联合作用合成海藻糖等。细菌酶合成法虽具有特异性好、 转化率高等特点，但所用酶需要精制，制酶的费用很高，且产品分离过 程较复杂，因而生产成本较高。

在上述三种生产方法中，细菌酶合成法是目前世界上生产海藻糖的 主要方法，其产品的国际市场价格为10～12美元/kg。如用作食品保护剂， 其有效的保护作用应添加15％左右，每公斤食品所需的保护剂成本将高达 1.5～1.8美元。

发明内容：

本发明的主要目的在于克服上述不足，而提供一种经济可行、简化 生产工艺、投资少、生产成本低、产量高的以葡萄糖为基质采用两步发酵 法生产酵母胞外海藻糖的方法。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：通 常它包括菌体培养、海藻糖的合成、海藻糖的提取、分离、纯化、浓缩、 结晶、干燥，其特征在于：采用两步发酵法利用酵母细胞中的海藻糖合成 酶系合成胞外海藻糖，同时钝化酵母的海藻糖分解酶活性，并用混合床离 子交换系统分离纯化海藻糖，其具体方法如下：

(1)应激态酵母细胞培养：同时采用氮饥饿、热休克和渗透胁迫三 种方法，诱导酵母细胞产生较多的应激酶——海藻糖合成酶系，胁迫生长 型酵母细胞向应激态酵母细胞的转变；

(2)胞外海藻糖的合成：首先采用物理或化学的方法，其中物理方 法为加热处理法，化学的方法为甲苯处理法，对应激态酵母细胞进行休克 处理；然后采用海藻糖合成培养基进行胞外海藻糖的合成；摇瓶试验为 500mL三角瓶，装液量60～120mL，转速100～180r/min；发酵罐试验采 用5L自控罐以流加葡萄糖的方式进行胞外海藻糖合成，其生产工艺是： 初始装液量2.5L，初始糖浓度为1～2％，pH4.0～7.0，溶氧10％～40％， 合成温度40～48℃；反应过程中用10％ Na2CO3调节pH，并可根据消耗的 糖量补加葡萄糖液，最终反应液量为3L，上述的加热处理法是：在35～ 43℃振荡培养1h后，升温至45～65℃处理1h，甲苯处理法是：按每克 酵母泥加入2～10％甲苯5mL，30～40℃处理1h；

(3)海藻糖的分离与纯化：将反应液离心除酵母细胞，取上清液高 温灭菌，用截留分子量为10000的中空纤维超滤装置过滤除大分子物质； 随后采用混合床离子交换柱分离海藻糖和葡萄糖。

本发明还可以采用如下技术措施：

所述的海藻糖合成培养基配方为：葡萄糖2～3g、NaCl 2～3g、 MgSO4·7H2O 60～70mg、FeSO4·7H2O 6～8mg、CaCl2·2H2O 8～10mg、CoCl2 0.4～0.5mg、CuSO4·5H2O 0.8～1.0mg、核黄素0.08～0.10mg、VB60.8～ 1.0mg、对氨基苯甲酸0.16～0.20mg、肌醇0.8～1.0mg、烟酰胺0.8～1.0 mg，溶于100mL 80～160mmol/L，pH＝5.0～7.0的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液 中；

所述的混合床离子交换柱分离的条件为：阴阳树脂用量体积比为2∶ 0.8～1.6，整个分离环境维持在pH中性，温度30～40℃，流速0.6～ 1.6mL/min时，用无离子水作洗脱剂。

本发明具有的优点和积极效果是：本发明是以葡萄糖为基质的两步发 酵法生产酵母胞外海藻糖，该方法简化了生产工艺、设备简单、投资少， 海藻糖转化率高、易于产品分离、无糖类副产物、降低了生产成本、价格 便宜，而生产成本的降低，有可能使海藻糖获得广泛的应用，特别是在食 品工业方面，海藻糖是一种能改善干燥加工食品质量和保持原有风味不变 的天然食品添加剂，其甜度低、易代谢和消化，廉价的海藻糖还可以广泛 应用于奶类、肉类、果汁饮料、蔬菜汁、风味调料等的保存。

附图说明：

图1是本发明两步发酵法生产酵母胞外海藻糖实施例1的工艺流程图。

图2是本发明两步发酵法生产酵母胞外海藻糖实施例2的工艺流程图。

具体实施方式：

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效、兹例举以下实施 例，并配合附图详细说明如下，请参阅图1、图2。在以下例举的两个实 施例中提到的复合培养基、限氮培养基和胞外海藻糖合成培养基的配方 如下：

复合培养基配方：葡萄糖4％，蛋白胨1％，酵母粉1％，MgSO40.2％， KH2PO40.5％，pH5.0～6.0。

限氮培养基配方：葡萄糖4％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，MgSO40.2％， KH2PO40.5％，pH5.0～6.0。

胞外海藻糖合成培养基配方：葡萄糖2～3g、NaCl 2～3g、MgSO4·7H2O60～70mg/100mL、FeSO4·7 H2O 6～8mg/100mL、CaCl2·2H2O 8～10mg/100mL、 CoCl20.4～0.5mg/100mL、CuSO4·5H2O 0.8～1.0mg/100mL、核黄素0.08～ 0.10mg/100mL、VB6 0.8～1.0mg/100mL、对氨基苯甲酸0.16～ 0.20mg/100mL、肌醇0.8～1.0mg/100mL、烟酰胺0.8～1.0mg/100mL，溶 于浓度为80～160mmol/L Na2HPO4-KH2PO4(pH5.0～7.0)的缓冲液中。

其具体生产步骤如下：

(1)海藻糖高产菌株的选育：首先采用诱变育种的方法选育出应激 反应敏感的菌株，以积累较高的海藻糖；随后采用基因重组技术选育海藻 糖分解酶(基因ATH1和NTH1)活性缺失的菌株，从而获得高产海藻糖的 生产菌株，其胞内海藻糖含量达23～25％。

(2)应激态酵母细胞培养：首先按正常的培养方法培养一定浓度的 酵母细胞，然后采用现有技术的氮饥饿、热休克、渗透胁迫等方法，诱 导酵母细胞产生较多的应激酶——海藻糖合成酶系，胁迫生长型酵母细 胞向应激态酵母细胞的转变，其方法包括：

氮饥饿培养：三角瓶实验采用控制培养基碳、氮比来实现；发酵罐 培养则采用流加培养的方法来控制，在发酵初期流加较多的氮以积累较多 的细胞，在流加培养中、后期停止流加氮源，以获得含氮量低的酵母细胞。

热休克：即酵母的温度休克培养，在发酵培养后期提高培养温度至 35～43℃，终止酵母细胞的繁殖能力，诱导酵母海藻糖合成酶系的形成。

渗透胁迫：在酵母培养的后期，向培养基中添加1.5～3.0％的NaCl， 提高其培养系统的渗透压，胁迫生长型酵母细胞向应激态酵母细胞的转 变。

(3)胞外海藻糖的合成：首先采用物理或化学的方法对应激态酵母 细胞进行休克处理，打破酵母细胞膜对海藻糖渗透性的限制，使应激态酵 母细胞转化为海藻糖合成态细胞；然后采用海藻糖合成培养基进行胞外海 藻糖的合成。摇瓶试验为500mL三角瓶，装液量60～120mL，转速100～1 80r/min。发酵罐试验采用5L自控罐以流加葡萄糖的方式进行胞外海藻 糖合成，其生产工艺是：初始装液量2.5L，初始葡萄糖浓度为1～2％，pH 4.0～7.0，溶氧10％～40％，合成温度40～48℃。反应过程中用10％ Na2CO3 调节pH，并可根据消耗的糖量补加葡萄糖液，最终反应液量为3L左右， 反应液海藻糖含量可达10～16g/L。

(4)海藻糖的分离与纯化：将反应液离心除去酵母细胞，取上清液 高温灭菌，用截留分子量为10000的中空纤维超滤装置过滤除大分子物 质；随后采用混合床离子交换柱分离海藻糖和葡萄糖，在收集液不含葡萄 糖的情况下海藻糖收率达到80％以上。

本发明的其它有关技术措施：

(1)所述使应激态酵母细胞转化为海藻糖合成态细胞的具体方法有 物理方法和化学方法：

加热处理法：35～43℃振荡培养1h后，升温至45～65℃处理1h。 4～6h后胞外海藻糖含量达100％。

甲苯处理法：按每克酵母泥加入2～10％甲苯5mL，30～40℃处理1h， 3h后胞外海藻糖含量为100％。

(2)所述混合床离子交换柱分离的条件为：阴阳树脂用量体积比为 2∶0.8~1.6，整个分离环境维持在pH中性，温度30～40℃，流速0.6～ 1.6mL/min时，用无离子水作洗脱剂，可实现海藻糖与葡萄糖完全分离， 海藻糖收率达到80％以上。

实施例1：500mL三角瓶海藻糖合成试验  如图1所示：

1、应激态酵母细胞培养：250mL三角瓶中装有50mL复合培养基，接 种斜面保藏菌种1～2环，30℃恒温静置培养24～36h，作为一级种子。 然后在500mL三角瓶内装入100mL限氮培养基，以5％的接种量接入一级 种子液，30℃，150r/min振荡培养16～24h。培养后期提高温度至36～ 38℃，启动酵母海藻糖合成酶系基因的表达，再向培养基中添加2.5％的 NaCl，刺激酵母海藻糖合成酶系的形成，使酵母中海藻糖积累量增加。培 养结束后，离心并用无菌水洗涤2次后备用。

2、海藻糖的合成：称取应激态酵母泥2g，用4％甲苯10mL，36℃～ 38℃振荡处理1h，酵母转变为海藻糖合成态细胞，解除细胞壁膜对海藻 糖渗透性的限制。离心、洗涤分离甲苯后将酵母泥转入装有100mL海藻糖 合成培养基的500mL三角瓶中，46～48℃振荡反应6h，合成胞外海藻糖。 在合成过程中，初始葡萄糖糖浓度为2％、pH5.0，当葡萄糖浓度下降至 0.5％以下时，再补加一定的糖，使糖浓度维持在1.0％左右。在此条件下 反应液中海藻糖含量可达7.3g/L。

3、反应液预处理：将反应液离心除去酵母细胞，取上清液高温灭菌， 用截留分子量为10000的中空纤维超滤装置过滤除大分子物质。

4、海藻糖的分离与纯化：层析柱为Φ16×600mm，阴阳树脂用量体 积比为2∶1，用蒸馏水洗至中性。样液上柱体积6mL，用蒸馏水作洗脱剂， 流速0.8～1.0mL/min。当收集液体积为100mL时，海藻糖收率为83.29％， 此时葡萄糖尚未流出层析柱；当流出液体积为110mL时，海藻糖收率为 84.34％，葡萄糖收率为0.17％。

5、海藻糖样品制备：纯化后的海藻糖液在常压下煮沸浓缩至浓度为 40％。在150mL的三角瓶中，加入4mL浓缩海藻糖液、16mL无水乙醇和0.01g 海藻糖晶种，置于40℃摇床，在转速150r/mim下结晶1h后，停止振荡， 养晶20h；将析出的晶体经滤纸过滤后，用少量乙醇洗涤。常压下，60℃ 干燥15h至恒重，得到海藻糖二水合晶体。用此法制得的海藻糖纯度在 99％以上，结晶收率为89％。

实施例2：5L自控发酵罐合成海藻糖  如图2所示：

1、应激态酵母细胞流加培养：按2％的接种量将酵母泥接入已灭菌的 5L自控发酵罐中，培养温度28℃～30℃，培养过程中用10％ Na2CO3调节 pH，流加糖蜜和营养盐，使整个过程中培养基内可发酵性糖一直保持在 0.1～1％，最终液体体积为3L左右；培养开始时，控制pH＝3.8～4.5， 10h后逐渐提高，当培养一段时间后，提高发酵液pH至5.0～7.0；培养 后期加入2.5％的NaCl，提高发酵液温度至36～38℃，直至培养结束。离 心得酵母泥并用无菌水洗涤两次后保藏。此时，酵母细胞积累了较多的应 激酶——海藻糖合成酶系，其胞内海藻糖含量为23～25％。

2、胞外海藻糖的合成：称取酵母泥150g加入5L自控发酵罐中， 采用加热法进行细胞休克处理，先36～38℃培养1h，随后升温至50℃～ 55℃处理1h，使酵母转变为海藻糖合成态细胞。

在发酵罐中加入初始葡萄糖浓度为2％、pH＝5.0的合成培养基，通 过控制搅拌转速和通风量使溶氧饱和度为30～40％，在45～48℃反应5～ 7h结束，反应过程中用10％ Na2CO3调节pH，并可根据消耗的糖量补加葡 萄糖液，最终反应液量为3L左右。在此条件下反应液中海藻糖含量为 14.5g/L，单位细胞的海藻糖合成量为131.8％。而在酵母提取法中，酵母 细胞的海藻糖含量一般不超过20％。

3、反应液预处理：同实施例1。

4、海藻糖的分离与纯化：同实施例1。

5、海藻糖样品制备：同实施例1。