一种大豆生物调控基因的应用
阅读：876发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种大豆生物调控基因的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种大豆 生物 调控基因的应用，属于基因工程技术领域。为了改良大豆品种，提高其 非生物胁迫 能 力 ，本 发明 提供了一种大豆生物调控基因在大豆抗逆品种育种以及早熟品种育种中的应用，所述大豆生物调控基因为GmHIPP3基因或GmHPP4基因，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了一种提高大豆生物性能的方法，是指利用转基因技术创制大豆抗逆新材料，增加大豆GmHIPP3基因或GmHPP4基因在所述大豆中的表达量。本发明能够增强大豆在逆境环境中的适应性，为大豆优良品种的选育提供有意义的参考价值。，下面是一种大豆生物调控基因的应用专利的具体信息内容。
1.一种大豆生物调控基因在大豆抗逆品种育种中的应用，所述大豆生物调控基因为GmHIPP3基因或GmHPP4基因，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种大豆生物调控基因在大豆早熟品种育种中的应用，所述大豆生物调控基因为GmHIPP3基因或GmHPP4基因，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种提高大豆生物性能的方法，其特征在于，增加大豆GmHIPP3基因或GmHPP4基因在大豆中的表达量，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物性能包括抗旱和提前开花。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体方法如下：
1)构建含有所述GmHIPP3基因或GmHPP4基因的重组载体；
2)将步骤1)制备的重组载体转化农杆菌，获得重组菌；
3)将步骤2)获得的重组菌转化大豆，获得大豆转基因植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)所述重组载体构建所用的中间载体为myc-pBA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述农杆菌为农杆菌EHA101。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的大豆为东农50。
9.一种含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的重组载体。
10.一种含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的重组菌。
一种大豆生物调控基因的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种大豆生物调控基因的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
[0002] 大豆是世界范围内广泛种植的粮食和经济作物，大豆生产极易受到干旱等环境胁迫影响。黑龙江位于北方地区，容易受到高温、干旱等环境导致的胁迫。多方因素的影响下对国产大豆的冲击越来越大，因此提高国产大豆的产量、耐逆能力等方面的竞争力势在必行。干旱高温等非生物胁迫是植物普遍面临的不利环境因素之一。这些胁迫会使作物的产量下降，在世界范围都是影响作物产量的重要因素。因此，大豆的耐旱品质改善，是大豆品种改良的重中之重。
发明内容
[0003] 为了改良大豆品种，提高其抗非生物胁迫能力，本发明提出技术方案如下：
[0004] 第一、本发明提供了一种大豆生物调控基因在大豆抗逆品种育种中的应用，所述大豆生物调控基因为GmHIPP3基因或GmHPP4基因，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0005] 第二，本发明提供了一种大豆生物调控基因在大豆早熟品种育种中的应用，所述大豆生物调控基因为GmHIPP3基因或GmHPP4基因，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0006] 第三、本发明提供一种提高大豆生物性能的方法，是指增加大豆GmHIPP3基因或GmHPP4基因在大豆中的表达量，所述GmHIPP3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述GmHPP4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007] 进一步地限定，所述生物性能包括抗旱和提前开花。
[0008] 更进一步地限定，具体方法如下：
[0009] 1)构建含有所述GmHIPP3基因或GmHPP4基因的重组载体；
[0010] 2)将步骤1)制备的重组载体转化农杆菌，获得重组菌；
[0011] 3)将步骤2)获得的重组菌转化大豆，获得大豆转基因植株。
[0012] 更进一步地限定，步骤1)所述重组载体构建所用的中间载体为myc-pBA。
[0013] 更进一步地限定，步骤2)所述农杆菌为农杆菌EHA101。
[0014] 更进一步地限定，步骤3)所述的大豆为东农50。
[0015] 第四、本发明还提供了一种含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的重组载体。
[0016] 第五、本发明还提供了一种含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的重组菌。
[0017] 有益效果
[0018] 本研究提供了两个具有明显的抗旱和早花性状的基因，利用转基因技术创制大豆抗逆新材料，能够增强大豆在逆境环境中的适应性，来保证大豆的稳产、高产，为大豆优良品种的选育提供有意义的参考价值。附图说明
[0019] 图1GmHIPP3基因在非生物胁迫下表达量分析(20％PEG6000干旱处理)，其中a为对叶子进行干旱胁迫处理；b为对根进行干旱胁迫处理；
[0020] 图2GmHPP4基因在非生物胁迫下表达量分析(20％PEG6000干旱处理)，其中a、为对叶子进行干旱胁迫处理；b为对根进行干旱胁迫处理；
[0021] 图3植物表达载体pBA-myc-GmHIPP3示意图，图中带有BamHI以及SacI限制性内切酶的元件为GmHIPP3基因；
[0022] 图4植物表达载体pBA-myc-GmHPP4示意图，图中带有BamHI以及SacI限制性内切酶的元件为GmHPP4基因；
[0023] 图5转基因大豆GmHIPP3的PCR检测，M：DL2000marker；W：水对照；质粒：GmHIPP3质粒，其中OV#1、OV#5、OV#7、OV#8、OV#13、OV#16、OV#18代表T1代GmHIPP3转基因植株不同株系；
[0024] 图6转基因大豆GmHPP4的PCR检测，M：DL2000marker；W：水对照；质粒：GmHPP4质粒，其中OV#2、OV#7、OV#8、OV#13、OV#19代表T1代GmHPP4转基因植株不同株系；
[0025] 图7转基因大豆的GmHIPP3 RT-PCR检测，其中，TUA5为内参基因，OV#L1、OV#L5、OV#L7、OV#L8、OV#L13、OV#L16、OV#L18分别代表7个不同转基因株系GmHIPP3-1、GmHIPP3-5、GmHIPP3-7、GmHIPP3-8、GmHIPP3-13、GmHIPP3-16和GmHIPP3-18；
[0026] 图8转基因大豆的GmHPP4 RT-PCR检测，其中，TUA5为内参基因，OV#2、OV#7、OV#8、OV#13、OV#9分别代表5个不同转基因株系GmHPP4-2、GmHPP4-7、GmHPP4-8、GmHPP4-13、GmHPP4-9；
[0027] 图9始花期及盛花期考察结果，其中“*”表示显著性差异(p＜0.05)，“**”表示极显著差异(p＜0.01)，“***”表示极显著差异(p＜0.001)；其中3#L5、3#L7、3#L8、3#L13、3#L16代表T1代GmHIPP3转基因植株不同株系；其中4#L7、4#L8、4#L9、4#L13代表T1代GmHPP4转基因植株不同株系；
[0028] 图10GmHIPP3转基因植株和野生型植株花期表型，其中3#L7、3#L8、3#L13分别代表T1代GmHIPP3转基因植株不同株系；
[0029] 图11GmHPP4转基因植株和野生型植株花期表型，其中4#L7、4#L9、4#L13分别代表T1代GmHPP4转基因植株不同株系；
[0030] 图12干旱胁迫下转基因植株和野生型植株表型，其中3#L7、3#L8、3#L13、代表T1代GmHIPP3转基因植株不同株系，4#L7、4#L8、4#L13代表T1代GmHPP4转基因植株不同株系。
具体实施方式
[0032] 所用的大豆材料东农50(简称DN50)，为本领域公知的大豆品种，本发明通过赠送方式获得。
[0033] myc-pBA载体在：王昕奕.大豆GmANKTM21基因调控抗旱和开花功能研究[D].东北农业大学,2019.中，公众可通过东北农业大学获得，该载体包含Bar基因筛选标记，启动子和终止子分别为Nos和E9；包含MYC标签，启动子和终止子分别为35s和Nos，如图3和图4所示，详见该文中记载。
[0034] 本发明中大豆遗传转化涉及的母液及配制方法如下：
[0035] (1)B5有机：11.2g B5有机加入100mL超纯水中，溶解。
[0036] (2)AS(乙酰丁香酮)：0.04g的AS加入150μLDMSO中，配成1L CCM所需用量，现用现配。
[0037] (3)AS+DTT(乙酰丁香酮+二硫苏糖醇)：AS 0.04g、DTT 150mg，于150μLDMSO中溶解，配成1L固体CCM所需用量，现用现配。
[0038] (4)6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)(1.67mg/mL)：83.5mg 6-BA加入到约10mL 1M NaOH中，溶解，定容至50mL。
[0039] (5)Cys(半胱氨酸)(100mg/mL)：5g Cys加入到约10mL 1M NaOH中，溶解，定容至50mL。
[0040] (6)GA3(赤霉素)(1mg/mL)：50mg GA3加入约30mL无水乙醇中，溶解，定容至50mL。
[0041] (7)Asp(天冬氨酸)(50mg/mL)：2.5gAsp加入约10mL 1M NaOH中，溶解，定容至50mL。
[0042] (8)Glu(谷氨酸)(50mg/mL)：2.5g Glu加入约10mL 1M NaOH中，溶解，定容至50mL。
[0043] (9)Zeatin-R(玉米素)(1mg/mL)：50mg Zeatin-R加入约10mL 1M NaOH中，溶解，定容至50mL。
[0044] (10)Tim(特美汀)(100mg/mL)：5g Tim加入50mL超纯水中，溶解(Cef和Cb配方同Tim)。
[0045] (11)Glufosinate(草铵膦)(10mg/mL)：0.5g Glufosinate加入50mL超纯水中，溶解。
[0046] (12)IAA(吲哚乙酸)(1mg/mL)：50mg IAA加入适量无水乙醇中，溶解，定容至50mL。
[0047] (13)IBA(吲哚丁酸)(1mg/mL)：50mg IBA加入适量无水乙醇中，溶解，定容至50mL。
[0048] 以上试剂均用超纯水定容，并需要过滤除菌，-20℃中保存。
[0049] 涉及的培养基及配制方法如下：
[0050] (1)1L液体LB：10g蛋白胨、5g酵母粉、10gNaCl溶于1L蒸馏水中。
[0051] (2)1L萌发培养基：20g蔗糖、3.1g B5盐、6.9g琼脂、1mLB5有机溶于1L蒸馏水中，pH 5.8。
[0052] (3)共培养培养基
[0053] 1)1L液态共培养培养基：30g蔗糖、0.31g B5盐、4g MES、6.9g琼脂、1mLB5有机、0.04gAS+150mgDTT(150μLDMSO溶解)、250μL GA3、1mL 6-BA、400mL Cys，pH 5.4。
[0054] 2)1L固态共培养培养基：30g蔗糖、0.31g B5盐、4g MES、1mL B5有机、0.04gAS(150μLDMSO溶解)、250μL GA3、1mL 6-BA，pH 5.4。
[0055] (4)芽诱导培养基
[0056] 1)1L恢复培养基SI：30g蔗糖、3.1g B5盐、0.6g MES、6.9g琼脂、1mLB5有机、1mL 6-BA、1.5mLTim、1.5mLCef、1mL Cb，pH 5.7。
[0057] 2)1L筛选培养基SII：30g蔗糖、3.1g B5盐、0.6g MES、7.0g琼脂、1mLB5有机、1mL 6-BA、1.5mLTim、1.5mL Cef、1mL Cb、1mL G，pH 5.7。
[0058] (5)1L芽伸长培养基：30g蔗糖、4.33g MS盐、0.6g MES、6.9g琼脂、1mLB5有机、1mLAsp、1mL Glu、1mL Z-R、1.5mL Tim、1.5mL Cef、1mL Cb、500μL G、500μL GA3、100μL IAA，pH 5.8。
[0059] (6)1L生根培养基：20g蔗糖、4.33g MS盐、0.6g MES、6.9g琼脂、100μL B5有机，pH 5.7。
[0060] 本发明中涉及的RNA提取，方法如下：
[0061] 取幼嫩大豆叶片约100mg于含有钢珠的2mL离心管中，迅速置于液氮中，剧烈震荡使叶片成粉末状。提取RNA采用UItrapure RNAKit超纯RNA提取试剂盒按照说明书进行提取。产物取出1μL进行电泳检测RNA完整性，再取1μL用超微量分光光度计测定RNA纯度和浓度，便于进行后续实验。
[0062] cDNA的制备方法如下：采用TranScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis试剂盒，按照试剂盒说明书进行。总体系中加入总RNA总量为1.75μg，根据提取样品总RNA浓度，计算对应所需RNA体积。
[0063] 反应体系如下：
[0064]
[0066] 反应程序为：42℃，30min；85℃，5s。所得样品保存于-80℃冰箱中。
[0067] 实施例1.目的基因克隆和植物表达载体构建。
[0068] 1.大豆GmHIPP3基因和GmHPP4基因在干旱胁迫下表达特性分析。
[0069] 配制浓度为20％(v/v)的PEG6000对处于V2期的大豆品种东农50进行PEG6000处理，具体方法为：将已萌发好的DN50种入穴盘中，穴盘中放入3:1的土与蛭石。待到大豆的V1期(第一片三出复叶)叶片全部展开时，将其移入25％霍格兰培养液中进行水培培养，当长至V2期时，干旱(20％PEG)处理3h、6h、12h后，分别对叶片和根部进行取材，提取RNA并反转成cDNA，进行qPCR实验。
[0070] 荧光定量特异引物序列如下：
[0071] GmHIPP3-F(P1)：5'—GGTGGATTTACATGACGATAGG—3'
[0072] GmHIPP3-R(P1)：5'—TCTTGTTGTCCACTGTTGCTG—3'
[0073] 预计产物大小206bp。
[0074] GmHPP4-F(P2)：5'—TCCAGTGAGTGCAGTGTCAAA—3'
[0075] GmHPP4-R(P2)：5'—AAGGGGATAGGCTTCGTAGAG—3'
[0076] 预计产物大小121bp。
[0077] 结果表明，干旱逆境胁迫都可诱导GmHIPP3基因和GmHPP4基因的表达(见图1和图2所示)。
[0078] 2.大豆GmHIPP3基因和GmHPP4基因的扩增。
[0079] 使用东农50品种植株叶片提取大豆RNA，并进行反转录获得cDNA，反转录获得cDNA作为扩增模板。
[0081] GmHIPP3-F：5'-ACCAAACAATTATTCCTTGGCTCT-3'
[0082] GmHIPP3-R：5'-GCAGTAAATTAAGCATATTCACTCCCT-3'，预期产物大小629bp。
[0083] GmHPP4-F：5'-CTTGACTATGTCTCCCACG-3'
[0084] GmHPP4-R：5'-AAGAAGCATGTTTACTCCCT-3'，预期产物大小610bp。
[0085] PCR反应体系如下：灭菌ddH2O：11.5μL，10×Buffer：4μL，dNTPs：2μL，F(10μM)：0.5μL，R(10μM)：0.5μL，模板：1μL，EasyTaq：0.5μL，总体积：20μL。
[0086] 反应条件如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，Tm退火30s，72℃复性1min，72℃延伸10min，30个循环，4℃终止反应。
[0087] 根据GmHIPP3和GmHPP4序列信息，利用Primer5.0软件查询基因的限制性内切酶位点，并根据植物表达载体pBA-myc上的多克隆位点选择BamHI和Sac I酶切位点，在基因上下游的5'端分别加入BamHI和Sac I酶切位点，上一步的PCR产物为模板，引物序列如下：
[0088] GmHIPP3-F(P7)：5'-CGGGATCCATGACGATAGGATGAAG-3'(下划线部分为BamHI酶切位点)；
[0089] GmHIPP3-R(P7)：5'-TTCGAGCTCTTAGCAGATGACACAGC-3'(下划线部分为Sac I酶切位点)。预期产物大小388bp。
[0090] GmHPP4-F(P8)：5'-CGGGATCCCTATGTCTCCCACG-3'(下划线部分为BamHI酶切位点)；GmHPP4-R(P8)：5'-AACCGAGCTCCTAGTAATTTGAACCATAC-3'(下划线部分为Sac I酶切位点)。
预期产物大小449bp。
预期产物大小449bp。
[0091] 反应体系如表1：
[0092] 表1 PCR反应体系
[0093]
[0094] PCR反应条件如下：
[0095]
[0096] PCR获得目的基因片段，胶回收试剂盒回收纯化。
[0097] 3.植物表达载体构建。
[0098] 将myc-pBA载体和步骤2中纯化的PCR产物分别用BamHI和Sac I进行双酶切。myc-pBA载体酶切产物和目的基因的酶切产物纯化回收。通过超微量分光光度计分别检测载体和目的基因的浓度，便于连接实验的计算，分别将回收的目的片段与载体进行连接。
[0099] 1)酶切体系如下：
[0100]
[0101] 目的基因酶切反应体系：
[0102]
[0103] 反应条件：37℃，过夜酶切。
[0104] 2)myc-pBA载体酶切产物与目的基因进行连接。
[0105] 连接反应体系：
[0106]
[0107] 连接条件：16℃水浴16h。
[0108] 分别获得连接产物记为：pBA-myc-GmHIPP3和pBA-myc-GmHPP4
[0109] 3)连接产物的转化与鉴定
[0110] pBA-myc-GmHIPP3和pBA-myc-GmHPP4连接产物经冻融法转化大肠杆菌DH5α，方法为：取大肠杆菌DH5α感受态100uL于冰浴中融解，加入2μL连接产物并混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴静置2min，42℃热击20s，加入800μL LB液体培养基，37℃，100rpm震荡培养1h。5000rpm离心7min，弃大部分上清，留50-100μL上清悬浮菌体，取适量涂布于LB琼脂平板(含100mg/L Spe)上，于37℃黑暗过夜培养。待长出菌落后，选取单菌落进行编号并挑取单菌落进行PCR鉴定，引物为(同上步骤2扩增引物)：
[0111] GmHIPP3-F(P7)：5'-CGGGATCCATGACGATAGGATGAAG-3'(下划线部分为BamHI酶切位点)；
[0112] GmHIPP3-R(P7)：5'-TTCGAGCTCTTAGCAGATGACACAGC-3'(下划线部分为Sac I酶切位点)。预期产物大小388bp。
[0113] GmHPP4-F(P8)：5'-CGGGATCCCTATGTCTCCCACG-3'(下划线部分为BamHI酶切位点)；GmHPP4-R(P8)：5'-AACCGAGCTCCTAGTAATTTGAACCATAC-3'(下划线部分为Sac I酶切位点)。
预期产物大小449bp。
预期产物大小449bp。
[0114] 反应体系及条件如表2所示：
[0115] 表2PCR反应体系
[0116]
[0117] PCR产物经过2％琼脂糖胶电泳检测，将鉴定正确的阳性菌落挑入含Spe(100mg/mL)的LB培养基中，200rpm，37℃震荡过夜。取适量的菌液进行测序，测序结果与Phytozome中公布的目的基因序列一致，采用Pure PlasmidMini Kit质粒提取试剂盒提取质粒。
[0118] 实施例2.大豆遗传转化。
[0119] 1.分别构建含有所述大豆GmHIPP3基因、GmHPP4基因的重组载体，具体方法参照实施例1中步骤2及步骤3。
[0120] 2.将步骤1制备的重组载体通过电转化方法转化农杆菌，获得重组菌，方法如下：
[0121] (1)将保存于-80℃的农杆菌EHA101感受态取出，置于冰盒中融解。
[0122] (2)加入1μL重组载体,将混合物移入电转杯中(将电转杯外部擦干净，电转杯外部不能有水分)。
[0124] (4)根据电击声音来取适量的菌液涂布于含有利福平(Rif)、壮观霉素(Spe)、卡那霉素(Kana)的固体平板中，置于28℃培养箱中培养2-3天。
[0125] (5)长出菌落后，选取单菌落进行编号并挑取单菌落进行PCR鉴定。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定正确的菌落进行摇菌，于-80℃冰箱中保存。
[0126] 3.分别将步骤2获得的重组菌通过根癌农杆菌介导的大豆子叶节侵染转化法转化大豆，获得大豆转基因植株。具体方法如下：
[0128] 挑选大豆种子时，要求大豆无菌斑、种皮完整、饱满的受试品种DN50(东农50)种子。
[0129] (2)大豆种子的消毒
[0131] (3)种子萌发
[0132] 灭菌16小时后取出种子移至超净工作台中，开风吹至少15min，将残余的Cl2清除，避免降低种子活性。吹风结束后将种子接种于萌发培养基上，封口后放入光照培养箱进行培养1天。
[0133] (4)工程菌液的准备
[0134] 首先进行一次活化，取2mL-80℃保存的菌液加至50mL含有Km、Spe、Rif抗生素的液体LB培养基中，28℃，200rpm过夜培养。活化好的菌液加入100mL含有三种抗生素的LB液体培养基中进行二次活化，28℃，200rpm摇菌2-4h。菌液4℃离心，5000rpm，7min。收集的菌体用液体共培养培养基重悬，调整OD值为1左右。
[0135] (5)侵染与共培养
[0136] 1)从萌发培养基中取出萌发好的种子，用灭菌的刀片斜切外植体，沿下胚轴将两片子叶分开。浸于菌液中，取出浸泡在75％酒精中的刷子，待酒精挥发后用刷子沿子叶节处平行轻划6-10次(避免将胚轴划掉)。
[0137] 2)将所有外植体移入装有新菌液的锥形瓶中，22℃，过夜暗培养。
[0138] 3)倒净锥形瓶中的菌液，用灭菌的滤纸吸除外植体上的菌液。将子叶近轴面朝下平铺在铺有一张灭菌滤纸的共培养培养基中，装入保鲜袋，移入22℃培养箱中，暗培养5天。
[0139] (6)芽诱导阶段
[0140] 1)取出共培养后的外植体分别用蒸馏水(灭菌)和SI液态培养基清洗2-3次。
[0141] 2)清洗完毕后，用滤纸吸除残余液体，将过长的胚轴切去，插入SI恢复培养基中并封口，在24℃光照培养箱中(16h光照/8h黑暗)培养7天。
[0142] 2)取出SI培养基中的外植体，去除腋芽和一半子叶，插入SII筛选培养基中，在光照培养箱中培养14天。
[0143] (7)芽伸长阶段
[0144] 取出SII培养基中的外植体，去除全部子叶，将外植体插入芽伸长培养基中，移入光照培养箱中培养，每隔14天进行一次继代，继代6次左右。有伸长迹象的外植体，及时移入瓶装芽伸长培养基中，继续观察。
[0145] (8)生根阶段
[0146] 当芽长5cm时，选择幼嫩的部位将伸长芽切下，在IBA中侵泡1-2min，插入生根培养基中，在光照培养箱中生长。
[0147] (9)再生苗移栽
[0148] 生根状态良好的再生苗，当根长达2cm时，将根部洗净，将其种植到花盆中(蛭石与土壤的混合比例为3：1)，用透明的塑料杯将苗扣住，待苗逐渐茁壮后，可在塑料杯上扎孔直至完全摘除。
[0149] (10)抗性苗的筛选
[0150] 当移至土壤后的再生苗长出第一片三出复叶并展开时，用浓度为160ng/μL草铵膦进行涂抹，涂抹2天后观察所涂叶片状态，若叶片未变黄，则初步认为该株苗为阳性苗，两周后，观察涂抹的叶子是否死亡。如果叶子生长良好，则是T0代阳性幼苗，进行转基因大豆阳性植株的鉴定：
[0151] 1.T0代植株DNA提取。
[0152] 采用植物基因组DNA提取试剂盒的说明书操作，同时提取大豆DN50的DNA为对照。
[0153] 2.PCR检测。
[0154] PCR扩增Bar基因的检测引物为：
[0155] F(P9)：5'—TGCCAGTTCCCGTGCTTGAA—3'
[0156] R(P9)：5'—CTGCACCATCGTCAACCACTA—3'
[0157] PCR反应体系如下：
[0158]
[0159] 反应条件如下：
[0160]
[0161] 3凝胶电泳。
[0162] 分别以所得PCR产物为样品，野生型为阴性对照，含有基因的质粒为阳性对照。点样至2.0％浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳，在150V电压下电泳20min，通过凝胶成像系统观察，实验结果，涂抹阳性植株和阳性对照扩增出条带大小均414bp，而阴性对照野生型植株东农50和水对照无条带，初步证明GmHIPP3基因和GmHPP4基因成功转入东农50大豆基因组中。
[0163] 一、转基因后代大豆材料的分子检测
[0164] 1.目的基因过量表达T1代植株PCR及RT-PCR检测。
[0165] 以提取的GmHIPP3 T1代涂抹阳性苗DNA为模板进行Bar基因PCR检测，
[0166] PCR扩增Bar基因的检测引物为：
[0167] F(P9)：5'—TGCCAGTTCCCGTGCTTGAA—3'
[0168] R(P9)：5'—CTGCACCATCGTCAACCACTA—3'
[0169] 预计产物大小414bp。
[0170] 转基因植株中均扩增出大小约414bp的目的条带(图5)；进一步对T1代涂抹阳性苗进行RT-PCR检测(图7)，RT-PCR检测引物如下：
[0171] 以TUA5作为内参基因，进行RT-PCR检测。
[0172] TUA5基因特异引物序列：
[0173] F(P10)：5'—TGCCACCATCAAGACTAAGAGG—3'
[0174] R(P10)：5'—ACCACCAGGAACAACAGAAGG—3'
[0175] 预计产物大小103bp。
[0176] GmHIPP3基因特异引物序列：
[0177] F(P1)：5'—GGTGGATTTACATGACGATAGG—3'
[0178] R(P1)：5'—TCTTGTTGTCCACTGTTGCTG—3'，预计产物大小206bp。
[0179] GmHPP4基因特异引物序列：
[0180] F(P11)：5'—CCAAAAAATTCTTGCTTAGCTCTC—3'
[0181] R(P11)：5'—GGATAGGCTTCGTAGAGAGGAATAG—3'，预计产物大小303bp。
[0182] 证明了在植株(7个不同转化事件)GmHIPP3-1、GmHIPP3-5、GmHIPP3-7、GmHIPP3-8、GmHIPP3-13、GmHIPP3-16和GmHIPP3-18中目的基因已经成功转入。
[0183] 同理证明了GmHPP4在植株(5个不同转化事件)GmHPP4-2、GmHPP4-7、GmHPP4-8、GmHPP4-9、GmHPP4-13中目的基因已成功转入，如图6，RT-PCR结果见图8所示。
[0184] 2.目的基因调控大豆始花期。
[0185] 对T2代转基因植株进行花期统计，每个株系选取8株转基因阳性植株种入盆中，从VE期调查到R2期，并记录VE期到R2期所需天数即为单株始花天数，始花期变化率＝改变的天数/野生型开花天数×100％，经数据统计，GmHIPP3、GmHPP4过表达植株始花期较早花品种DN-50始花期及盛花期提前，如图9-图11所示，与野生型东农50相比，转基因植株表现出明显的提前开花现象。
[0186] 3.基因的抗旱功能研究
[0187] 为了考察GmHIPP3基因和GmHPP4基因对干旱胁迫的抵御能力，土培大豆采用黑土与蛭石比例为3:1混合栽种，首先将大豆在平板中萌发，然后栽入穴盘，待大豆植株长至第一片三出复叶进行移植，将其移入大盆。设置培养温度22℃，环境相对湿度控制在50％。对所有植株采用控水处理对植株进行干旱胁迫。当控水0d时，超表达植株和野生型植株生长状态没有差异；当控水30d后，过表达GmHIPP3基因和过表达GmHPP4基因的转基因的叶片比野生型植株更充分展开且呈现深绿色，此时野生型植株叶片有变黄趋势，但所有植株整体形态未出现明显变化。干旱处理30d后野生型植株的生长速度减慢。在干旱条件下GmHIPP3、GmHPP4基因过表达植株与野生型植株相比有更好的耐受性,表现出明显表型(图12)。
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