专利汇可以提供谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及基因工程技术领域,具体为谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化 水 平的变化检测方法,该方法包括以下步骤:提取谷子基因组DNA,获得DNA提取液;对样本DNA做甲基化修饰;酶切与连接;扩增与纯化和 银 染等多个步骤,该方法具有方便、快速、无污染,非常灵敏的特点,可用于多种农业 植物 的检测,同时还包括植物 叶片 、根茎和果实中DNA;尤其可对谷子进行基因学检测;同时本方法中采用的扩增、酶切和银染等步骤所需要的 试剂 和设备的成本低,使得检测所需的 费用 降低。,下面是谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法专利的具体信息内容。
1.一种谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
S1、提取谷子基因组DNA,获得DNA提取液;
S2、对样本DNA做甲基化修饰;
S3、酶切与连接:利用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ两组限制性内切酶进行剪切,剪切后在8℃的条件下与人工双链接头连接,获得扩增的DNA模板;
S4、扩增与纯化:对DNA模板进行PCR扩增,对扩增后的产物进行电泳;
S5、银染:电泳结束后,将大小玻璃板撬开,将大板放入已预冷的10%冰醋酸中进行固定,在摇床上震荡50分钟后,将玻璃板放入双蒸水中震荡2次,每次2分钟,然后将玻璃板放入已预冷的硝酸银溶液中进行染色,在摇床上震荡20分钟后,立即将染色后的玻璃板放入双蒸水中漂洗5-10秒,迅速取出放入预冷的碳酸钠溶液中进行显影,在摇床上震荡直到条带已全部显现并且条带清晰时,则可以终止显影;终止显影是将板放入10%冰醋酸中就可以完成;
S6、记带及变异条带的回收:对引物组合进行筛选,选择条带多且清晰的条带进行最后的跑板实验,胶板上的每一条带即代表样本的一个CCGG位点,对于每一DNA样品来说,CCGG位点被切开标记为“1”,如果没有被切开,则标记为为“0”,注意的是记带时要挑选清晰明显的条带;最后将发生变异的条带进行切割回收,放入1XTE中冷冻保存;以作为连接转化的DNA模板;
S7、变异片段的连接转化和测序;
S8、将变异条带测序完成后,将测序结果放入BioEdit Sequence Alignment Editor软件进行分析,首先将载体和引物的序列找到并删除,即可得到变异条带完整序列;
S9、通过检索数据库,得到的变异序列通过blastN对其在谷子全基因组中进行探寻和定位,再将变异序列通过blastX对其进行同源性蛋白的探寻与分析。
2.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法,其特征在于:在步骤1中所采用的DNA提取方法为改良的CTAB法提取基因组DNA,在DNA提取后,用1%的琼脂糖凝胶检测提取的谷子DNA质量,再采用NanoDrop仪检测提取的DNA的浓度和纯度,剩余的DNA置于-20℃冰箱中保存。
3.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法,其特征在于:在步骤2中所述的DNA甲基化是将样本DNA中非甲基化的胞嘧啶转化为其他种类的碱基。
4.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法,其特征在于:在步骤4中所采用的电泳为5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法,其特征在于:在步骤7所述的连接转化是将DH5a感受态细胞放置于冰上融化;按连接体系和感受态细胞之比1:10进行转化反应,此过程需要用已预冷的枪头轻轻吸打感受态细胞,使其得到充分混匀,放置冰上孵育30分钟;然后将0.2ml离心管放入42C水浴锅进行水浴,其间不可摇动,精确热激90秒后,放入冰水混合物中4-5分钟;将离心管中的反应液转移到预先准备好的装有300ul不含有Amp的LB液态培养基的离心管中,在37C、150rpm的培养箱中摇动1小时,让感受态细胞得以复苏;取上步菌液150ul涂平板,此培养基为含有Amp的LB固体培养基,室温放置10分钟后再倒置培养,目的为使菌液完全被培养基吸收;在37C的条件下,进行培养12小时;最后用连接转化专用引物M13-47对培养好的单菌落进行扩增检测,通过对PCR产物大小的估测,检验载体是否连接在目的片段。
6.根据权利要求1所述的谷子在干旱胁迫下H2S处理后DNA甲基化水平的变化检测方法,其特征在于:在步骤7所述的测序是将检测成功的单菌落用牙签挑取到含有Amp的
500ulLB液态培养基中,在37C、150rpm的条件下,摇菌液12小时后送去生物公司完成变异序列的测序工作。
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