用于在体内捕获转移性乳腺癌细胞的植入式支架
阅读：566发布：2024-02-17
专利汇可以提供用于在体内捕获转移性乳腺癌细胞的植入式支架专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开大体上涉及用于捕获癌细胞的技术，并且更具体地说，涉及用于在体内捕获转移性癌细胞的技术。，下面是用于在体内捕获转移性乳腺癌细胞的植入式支架专利的具体信息内容。
1.一种生物材料植入物，包含微孔支架，所述微孔支架包含聚(ε-己内酯)(PCL)或聚(乙二醇)(PEG)并且被配置成募集循环转移性细胞。
2.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述支架包含PCL(PCL支架)或PEG(PEG支架)，并且特征在于降解曲线是随时间推移的降解百分比，并且其中所述支架在90天内具有小于50％降解的降解曲线值。
3.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PCL或PEG支架在90天内具有小于
25％降解的降解曲线值。
4.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PCL或PEG支架在90天内具有小于
10％降解的降解曲线值。
5.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PCL或PEG支架在90天内具有小于
5％降解的降解曲线值。
6.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PCL或PEG支架在90天内具有小于
1％降解的降解曲线值。
7.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述支架包含PEG(PEG支架)，并且为不可生物降解的并且为不可再吸收的。
8.根据权利要求7所述的生物材料植入物，其中所述PEG支架与未被哺乳动物酶降解的肽或多糖交联。
10.根据权利要求1所述的生物材料植入物，平均网孔大小为约20纳米(nm)至约50nm。
11.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述支架用基质细胞、细胞外基质分子或细胞因子中的至少一种功能化。
12.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PEG的平均分子量为至少10,000道尔顿。
13.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PEG的平均分子量为至少15,000道尔顿。
14.根据权利要求1所述的生物材料植入物，其中所述PEG的平均分子量在约10,000道尔顿和约20,000道尔顿之间。
15.一种生物材料植入物，包含微孔支架，所述微孔支架包含不可生物降解的聚合物、被配置成募集循环转移性细胞并且被功能化以响应于外部酶的接合释放所述募集的循环转移性细胞。
16.一种生物材料植入物，包含微孔支架，所述微孔支架包含不可生物降解的聚合物、被配置成募集循环转移性细胞并且被功能化以响应于外部酶的接合而降解以释放所述募集的循环转移性细胞。
17.一种捕获转移性肿瘤细胞的方法，包含将根据权利要求1到16中任一项所述的生物材料植入物植入受试者体内。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者患有已被诊断为转移性的癌症。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者患有尚未被诊断为转移性的癌症。
20.根据权利要求17到19中任一项所述的方法，其中所述植入是皮下或肌内。
21.根据权利要求17到20中任一项所述的方法，其中所述植入发生在所述受试者体内一个部位处。
22.根据权利要求17到20中任一项所述的方法，其中所述植入发生在所述受试者体内多于一个部位处。
23.根据权利要求17到21中任一项所述的方法，其中植入一种生物材料植入物。
24.根据权利要求17到22中任一项所述的方法，其中植入多于一种生物材料植入物。
25.根据权利要求21到24中任一项所述的方法，其中所述部位为肺、肝、大脑、骨骼、腹膜、网膜脂肪、肌肉或淋巴结。
26.根据权利要求17到25中任一项所述的方法，进一步包含去除一种或多种所述生物材料植入物。
27.根据权利要求26所述的方法，进一步包含检测转移性细胞，所述检测包含逆散射光学相干层析成像(ISOCT)、荧光激活细胞分选术(FACS)、高频超声、超声、正电子发射层析成像(PET)扫描、磁共振成像(MRI)、光声成像或荧光成像中的一种或多种。
28.根据权利要求17到27中任一项所述的方法，其中所述捕获降低所述受试者的肿瘤负荷。
29.根据权利要求17到28中任一项所述的方法，进一步包含向所述受试者施用化疗剂。
30.根据权利要求18到29中任一项所述的方法，进一步包含以手术方式从所述受试者去除所述癌症。
31.根据权利要求17到30中任一项所述的方法，进一步包含向所述受试者施用放射线疗法。
32.根据权利要求26到31中任一项所述的方法，进一步包含从所述支架收回所述捕获的转移性肿瘤细胞。
33.根据权利要求26到32中任一项所述的方法，进一步包含从所述支架收回捕获的非肿瘤细胞。
34.根据权利要求17到33中任一项所述的方法，其中相对于未植入所述生物材料植入物的受试者，所述受试者的存活率增加。
35.一种分析减少受试者体内转移的治疗的有效性的方法，包含：
(i)将至少第一和第二生物材料植入物植入到所述受试者体内并且维持一段时间，其中每种植入物为根据权利要求1到16中任一项所述；
(ii)去除所述第一生物材料植入物并且测定第一转移量；
(iii)向所述受试者施用所述治疗；
(iv)去除所述第二生物材料植入物并且测定第二转移量；
(v)其中如果所述第二转移量低于所述第一转移量，那么所述治疗有效地减少转移。
36.根据权利要求35所述的方法，其中通过以下中的一种或多种测定所述第一转移量和所述第二转移量：逆散射光学相干层析成像(ISOCT)、荧光激活细胞分选术(FACS)、高频超声、超声、正电子发射层析成像(PET)扫描、磁共振成像(MRI)、光声成像或荧光成像。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述时间段为约两年。
用于在体内捕获转移性乳腺癌细胞的植入式支架
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0004] 本发明是在由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA173745下由政府支助进行的。政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
[0005] 本公开大体上涉及用于捕获癌细胞的技术，并且更具体地说，涉及用于在体内捕获转移性癌细胞的技术。
背景技术
[0006] 本文中提供的背景技术描述是为了大体上呈现本公开的上下文。当前提出的发明人的工作在此背景技术部分中描述的程度上以及在提交时并未具有作为现有技术的资格的描述的方面既不明确地也不隐含地被承认为针对本公开的现有技术。
[0007] 肿瘤细胞，尤其是癌细胞的早期检测是最佳诊断的目标。然而，早期检测可具有挑战性，即使当目标是在转移性扩散之前检测肿瘤细胞。实际上，甚至转移性扩散通常也未被检测到。以乳腺癌为实例。从原发肿瘤到远端转移性部位的乳腺癌的致癌进程是定义IV阶段疾病的关键事件。然而，目前，在起源疾病对宿主器官具有破坏性之后，通过放射性成像模式检测到转移性疾病。事实上，显著缺乏能够早期检测转移性事件的稳固技术已经极度地限制了生命保护干预的发展。
[0008] 为了解决这些限制，在实验和临床环境二者中都在追求用于检测循环肿瘤细胞(CTC)的技术。尽管有希望，但CTC捕获的广泛用途面临相当大的挑战，尤其考虑到捕获少量循环CTC所需的高生物标记敏感性和特异性。此外，CTC可能不代表能够转移的细胞群。此外，CTC可在侵入远端器官之前长时间循环，这意味着其也可能不被检测到。
发明内容
[0010] 本发明技术描述用于使用植入生物材料支架来早期检测转移性细胞的机制，所述植入生物材料支架被配置成捕获这类细胞。支架能够捕获转移性细胞，并且特别是在临床上显著的时间段内，这是先前不可获得的。已经开发了支架，其在足够长的时间范围内保持功能化以允许足够量的细胞聚集用于检测。在一些情况下，已设计支架，其保持足够长时间的功能化以在体内提供靶向治疗部位，转移性细胞不仅仅被检测到而且随时间推移被靶向的位置，并且提供用于细胞切除和可能去除所有转移性细胞的特定位置。
[0011] 这些较长寿命的支架，尤其是用作靶向治疗区位的有效性涉及佩吉特氏(Paget's)“种子和土壤”范式表，所述范式表提出，在通过转移性细胞定殖前，支持细胞(例如成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞)、可溶性因子和细胞外基质(ECM)组分建立有益于肿瘤细胞复位和定殖的微环境。这种范式表的重要性在于转移到特定器官不是无规的，而是受本地环境特性的影响。在体内使用较长寿命支架为这些支持细胞提供了足够的时间以在支架处建立微环境，转移性细胞被吸引到所述微环境中。
[0012] 在一些实例中，本发明技术提供微孔聚(ε-己内酯)(PCL)支架。这类PCL支架比微孔聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)生物材料支架具有更大的稳定性。事实上，PCL支架提供了这类意想不到的更大量的稳定性，这首次展示了受试者的动态免疫反应以及转移性细胞的募集相关的其它细胞事件的研究。在这些实例中的一些中，观察到乳腺癌细胞的细胞事件。本公开预期本文所提供的支架和方法可用于募集和/或捕获任何癌细胞，包括但不限于乳腺癌、胰脏癌、肺癌、肝癌和脑癌。
[0013] 在一些实例中，本发明提供生物材料PCL支架和由其衍生的植入物以提供用于募集和检测转移性细胞的靶标。在一些实例中，所述靶标在体外、在体内、原位等使用。在一些实例中，本发明提供了用于捕获转移性细胞并且允许那些细胞随着时间推移在转移性部位定殖的生物材料PCL支架。
[0014] 根据实例，本文提供的生物材料植入物包含微孔支架，所述微孔支架包含聚(ε-己内酯)(PCL)或聚(乙二醇)(PEG)水凝胶并配置成募集循环转移性细胞。在其它方面，本公开提供了藻酸盐支架。
[0015] 根据一些实例，支架是PCL支架，其特征在于降解曲线是随时间推移的降解百分比，并且其中支架在至少90天内具有小于50％、25％、5％或1％降解的降解曲线值。在其它实施例中，支架在至少6个月、1年、18个月、2年或更长时间内具有小于50％、25％、5％或1％降解的降解曲线值。
[0016] 根据一些实例，生物材料植入物包含包含PEG的支架并且为不可生物降解的并且是不可再吸收的。在一些实例中，PEG支架与未被哺乳动物酶降解的肽或多糖交联。在其它实例中，当支架与原核细胞中存在的酶接触时，PEG支架降解，并且所述降解释放募集和/或捕获的细胞。
[0017] 因此，本公开提供了包含微孔支架的生物材料植入物，所述微孔支架包含聚(ε-己内酯)(PCL)或聚(乙二醇)(PEG)并且被配置成募集循环转移性细胞。在一些实施例中，支架包含PCL(PCL支架)或PEG(PEG支架)，并且特征在于降解曲线是随时间推移的降解百分比，并且其中支架在90天内具有小于50％降解的降解曲线值。
[0018] 根据一些实例，PCL或PEG支架在90天内具有小于25％降解的降解曲线值。在一些实例中，PCL或PEG支架在90天内具有小于10％降解的降解曲线值。在其它实例中，PCL或PEG支架在90天内具有小于5％降解的降解曲线值。在一些实例中，PCL或PEG支架在90天内具有小于1％降解的降解曲线值。
[0019] 在各种实例中，支架包含PEG(PEG支架)并且为不可生物降解的并且为不可再吸收的。
[0020] 在一些实例中，PEG支架与未被哺乳动物细胞降解的肽或多糖交联以释放募集的循环转移性细胞。在其它实例中，植入物的平均网孔大小为约20纳米(nm)至约50nm。在一些实例中，支架用基质细胞、细胞外基质分子或细胞因子中的至少一种功能化。
[0021] 在一些实例中，PEG的平均分子量为至少10,000道尔顿。在其它实例中，PEG的平均分子量为至少15,000道尔顿。在又其它实例中，PEG的平均分子量在约10,000道尔顿和约20,000道尔顿之间。
[0022] 在一些方面，本公开提供包含微孔支架的生物材料植入物，所述微孔支架包含不可生物降解的聚合物、被配置成募集循环转移性细胞并且被功能化以响应于与外部酶接触而释放募集的循环转移性细胞。
[0023] 在一些方面，提供包含微孔支架的生物材料植入物，所述微孔支架包含不可生物降解的聚合物、被配置成募集循环转移性细胞并且被功能化以响应于与外部酶接触而降解以释放募集的循环转移性细胞。
[0024] 根据一些实例，提供捕获转移性肿瘤细胞的方法，包含将本公开的生物材料植入物植入受试者体内。在一些实例中，受试者患有已被诊断为转移性的癌症。在其它实例中，受试者患有尚未被诊断为转移性的癌症。在又其它实例中，植入是皮下或肌内。在一些实例中，植入发生在受试者体内一个部位处。在一些实例中，捕获降低受试者的肿瘤负荷。
[0025] 在一些实例中，植入发生在受试者体内多于一个部位处。在其它实例中，植入一种生物材料植入物，而在又其它实例中，植入多于一种生物材料植入物。根据一些实例，部位为肺、肝、大脑、骨骼、腹膜、网膜脂肪、肌肉或淋巴结。
[0026] 根据一些实例，本公开的方法进一步包含去除一种或多种生物材料植入物。在一些实例中，本公开的方法进一步包含检测转移性细胞，所述检测包含逆散射光学相干层析成像(ISOCT)、荧光激活细胞分选术(FACS)、高频超声、超声、正电子发射层析成像(PET)扫描、磁共振成像(MRI)、光声成像或荧光成像中的一种或多种。
[0027] 根据一些实例，本公开的方法进一步包含向受试者施用化疗剂。在其它实例中，本公开的方法进一步包含以手术方式从受试者去除癌症。在一些实例中，本公开的方法进一步包含向受试者施用放射线疗法。在又其它实例中，本公开的方法进一步包含从支架收回捕获的转移性肿瘤细胞。在一些实例中，本公开的方法进一步包含从支架收回捕获的非肿瘤细胞。
[0028] 在一些实例中，相对于未植入生物材料植入物的受试者，受试者的存活率增加。
[0029] 根据一些实例，提供分析减少受试者体内转移的治疗的有效性的方法，包含(i)将至少第一生物材料植入物和第二生物材料植入物植入受试者体内并且维持一段时间，其中每个植入物根据本文所述的植入物；(ii)去除第一生物材料植入物并且测定第一转移量；(iii)向受试者施用治疗；(iv)去除第二生物材料植入物并且测定第二转移量；(v)其中如果第二转移量低于第一转移量，那么治疗有效地减少转移。在一些实例中，通过逆散射光学相干层析成像(ISOCT)、荧光激活细胞分选术(FACS)、高频超声、超声、正电子发射层析成像(PET)扫描、磁共振成像(MRI)、光声成像或荧光成像中的一种或多种测定第一转移量和第二转移量。
附图说明
附图说明
[0030] 下面描述的附图描绘了本文所公开的系统和方法的各个方面。应当理解，每个附图描述了所公开的系统和方法的特定方面的实施例，并且附图中的每个旨在符合其可能的实施例。另外，在可能的情况下，以下描述涉及包括在以下附图中的参考标号，其中在多个附图中描绘的特征以相同的参考标号指示。
[0031] 图1：在将微孔PCL支架植入BALB/c小鼠的背侧皮下空间后的生理特征和动态免疫细胞反应。微孔PCL支架的显微照片(A)和扫描电子显微照片(B)。SEM图像显示互连多孔结构。(C)CD45+白细胞数量和(D)CD11b+F4/80+、CD11c+F4/80-、CD11b+Gr-1hiLy6C-、Ly6C+F4/80-、CD4+、CD8+、CD19+和CD49b+免疫细胞群的动态，以PCL支架植入后第3、7、14、30和60天活CD45+白细胞的百分比表示(对于每个检查时间点，N≥6，相比于第3天，*p<0.05，如通过Tukey-HSD检验后方差分析所测定)。误差条指代标准误差。
[0032] 图2：在肿瘤接种前植入30天的微孔支架募集转移性细胞。经由流式细胞测量术分析肿瘤接种后第15天从微孔PLG和PCL支架分离的(A)总细胞和(B)肿瘤细胞(tdTomato+细胞)的数量(N＝10，*p<0.01，如通过用于分析总细胞数量的t检验和用于肿瘤细胞数量的威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验所测定)。PCL支架部分的荧光图像显示存在肿瘤细胞(由白色箭头指示)，如使用tdTomato(C)和DAPI(D)荧光及其共定位(E)所识别。比例条指示20μm。误差条指代标准误差。
[0033] 图3：肿瘤进展影响PCL支架处白细胞群的动态。在肿瘤接种后第0天、3天、7天、14+ + + + - hi + -天和21天，总活CD45白细胞群中的(A)CD11bF4/80 (B)CD11c F4/80(C)Gr-1 CD11bLy6C(D)Ly6C+F4/80-先天性免疫细胞群的百分比和(E)CD4+(F)CD8+(G)CD19+和(H)CD49b+适应性免疫细胞群的百分比(对于每个检查时间点，N≥8，相较于第0天*p<0.05，并且相较于3天#p<0.05，如通过Tukey-HSD检验后方差分析所测定)。误差条指代标准误差。
[0034] 图4：微孔PCL支架能够在支架植入的慢性模型中早期检测转移性细胞。(A)在肿瘤接种后第5天，在5只小鼠为一组的肺、肝和大脑中通过流式细胞测量术分析具有可检测的肿瘤细胞的小鼠的数量(对于肺、大脑和肝，N＝5；对于PCL支架，N＝10，*p<0.05，如使用费舍尔(Fisher)精确检验所测定)。(B)经由流式细胞测量术分析在肿瘤接种后第5天从PCL支架分离的tdTomato+肿瘤细胞的百分比。(C)从无肿瘤和携带肿瘤的小鼠分离的PCL支架的平均D值。在肿瘤接种后第5天从携带肿瘤的小鼠分离支架。(对于无肿瘤小鼠，N＝14个支架并且对于携带肿瘤的小鼠，N＝16个支架，*p<0.05，如使用威尔科克森秩和检验所测定)。经由无肿瘤小鼠(D)和携带肿瘤的小鼠(E)的PCL支架的ISOCT分析生成代表性三维图D。比例条指示200μm。误差条指代标准误差。
[0035] 图5：在BALB/c小鼠中的支架植入的慢性模型中，向PCL支架部位募集4T1肿瘤细胞减少转移性部位如肝和大脑的肿瘤负荷。支架组和模拟外科手术组的(A)肝、(B)大脑和(C)肺中的归一化平均肿瘤负荷。模拟组中的平均负荷设定为1(对于每个组N≥6，相较于模拟外科手术，*p<0.05，如通过威尔科克森秩和检验所测定)。在两个组中，肺中肿瘤负荷相同。误差条指代标准误差。
[0036] 图6：微孔PCL支架提高乳腺癌转移的术后模型的存活率。(A)用于检查支架植入物对存活率的影响的实验设计的示意图(B)对于模拟组和支架组，平均切除肿瘤重量是相同的，(p＝0.93，t检验)(C)进行模拟外科手术的小鼠与接受支架植入物的小鼠的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活率曲线(对于每个组N＝7，*p<0.05，如使用对数秩检验所测定)。误差条指代标准误差。
[0037] 图7：微孔PCL支架减少BALB/c小鼠中(A)原发肿瘤和(B)脾中的CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的负荷。在肿瘤接种后第10天，经由流式细胞测量术检查CD45+白细胞群中CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的百分比，并且报告为归一化的负荷。(对于模拟外科手术N＝7；对于支架植入物N＝8，*p<0.05，如使用t检验所测定)。误差条指代标准误差。
[0038] 图8：微孔PCL支架在体内存留并维持延长倍数的空间。(A)在支架植入后第98天，从无肿瘤BALB/c小鼠收回的微孔PLG和PCL支架的代表性显微照片。当在BALB/c(B)和NSG(C)小鼠模型中测试时，PLG支架和PCL支架在第0天和第98天的平均支架面积。N＝4；相较于BALB/c和NSG小鼠中的PLG支架的第0天，*p<0.0001；相较于BALB/c小鼠中的PCL支架的第0天，p＝0.22，并且相较于NSG小鼠中的PCL支架的第0天，p＝0.7，如通过t检验所测定。使用图像J软件(http://imagej.nih.gov/ij/)，使用从在植入后第0天和第98天拍摄的支架图像获得的尺寸计算支架面积。误差条指代标准误差。
[0039] 图9：在体内NSG小鼠背侧皮下空间中植入微孔PCL支架后的宿主反应。(A)CD45+白+ + + - + hi - + -细胞数量和(B)CD11bF4/80、CD11cF4/80、CD11bGr-1 Ly6C 和Ly6CF4/80群的动态，表示为在PCL支架植入后第30天和第60天活CD45+白细胞的百分比(对于每个检查时间点N≥
8，相较于第30天，*p<0.05，如通过t检验所测定)。在支架植入后第30天和第60天之间，免疫细胞群的相对分布几乎相同。误差条指代标准误差。
8，相较于第30天，*p<0.05，如通过t检验所测定)。在支架植入后第30天和第60天之间，免疫细胞群的相对分布几乎相同。误差条指代标准误差。
[0040] 图10：在肿瘤接种后第0天、5天、10天和15天，具有PCL支架植入物的BALB/c小鼠的脾中的免疫细胞群的动态。在总活CD45+白细胞群中，(A)CD11b+F4/80+(B)CD11c+F4/80-(C)CD11b+Gr-1hiLy6C-(D)Ly6C+F4/80-先天性免疫细胞群的百分比和(E)CD4+(F)CD8+(G)CD19+和(H)CD49b+适应性免疫细胞群的百分比。(对于每个检查时间点N≥5，相较于第0天，*p<0.05，并且相较于第5天，#p<0.05，如通过Tukey-HSD检验后方差分析所测定)。误差条指代标准误差。
[0041] 图11：微孔PCL支架能够在支架植入的慢性模型中募集人类DMA-MD-231BR细胞。PLG和PCL微孔支架中的(A)总细胞浸润和(B)肿瘤细胞浸润。在肿瘤接种后第15天收回支架，在支架植入后1个月进行所述肿瘤接种(对于每个组N＝10，*p<0.05，如通过用于分析总细胞数量的t检验和用于肿瘤细胞数量的威尔科克森秩和检验所测定)。误差条指代标准误差。
具体实施方式
[0042] 提供了使用植入的生物材料支架来早期检测转移性细胞的技术，所述植入的生物材料支架被配置成捕获这类细胞。这里描述的支架不同于以往方案，其特征在于更大的稳定性，这在至少一些实例中产生足以提供临床上显著的捕获时间范围的稳定性。支架可由缓慢降解的结构或基质形成，从而允许在数月而不是数天内的转移性细胞收集。这为捕获更多数量的细胞、在捕获点处更大的细胞聚集以及更好的体内成像创造了条件，从而允许更精确的疾病识别、诊断和治疗。
[0043] 在一些实施例中，支架为多孔和/或可渗透的。在一些实施例中，支架中的聚合基质充当可准许用于转移、定殖、细胞生长等的底物。在一些实施例中，支架为在支架内创建转移性捕获部位的试剂(例如，DNA、蛋白质、细胞等)的附着、结合、粘附、包封等提供环境。在一些实施例中，释放(例如，控制或持续释放)试剂以吸引循环肿瘤细胞、转移性细胞或转移前细胞。关于试剂(例如治疗剂)和持续释放，对于长期疗法(例如数天、数周或数月)和/或在体内特定位置维持最高可能的药物浓度，本公开在某些实施例中提供具有以下非限制性特征的持续释放贮存制剂：(1)用于制备基质的方法不会化学上或物理上破坏试剂；(2)通过在基质内保护直到释放，基质维持试剂的稳定性，防止变性或其它代谢转化，这对于非常长的持续释放是重要的；(3)截留的试剂按照动力学曲线，以基本均匀的速率从水凝胶组合物中释放，并且此外，可制备具有两种或多种动力学曲线的特定试剂，例如，在某些实施例中，提供负载剂量，并且接着提供持续释放剂量；(4)可通过改变组分和制备基质的方法来选择所需的释放曲线；和(5)基质为无毒的和可降解的。如本文所公开的PEG支架也预期用作实现治疗活性剂的持续释放的支架。因此，在一些实施例中，试剂被配置用于特定释放速率。在其它实施例中，多种不同的试剂被配置用于不同的释放速率。举例来说，第一试剂可在数小时的时间段内释放，而第二试剂可在较长时间段内释放(例如，数天、数周、数月等)。在一些实施例中，并且如上所述，支架或其一部分被配置用于持续释放药剂。在一些实施例中，持续释放提供在至少30天(例如，40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、180天等)时间段内释放生物活性量的试剂。在一些实施例中，支架或其一部分被配置成充分多孔的，以允许细胞转移到孔中。孔的大小可针对感兴趣的特定细胞类型和/或期望的向内生长量来选择，并且为，例如但不限于，至少约20μm、30μm、40μm、50μm、100μm、200μm、500μm、700μm或1000μm。在一些实施例中，PEG凝胶不是多孔的，而是由例如10纳米(nm)、15nm、20nm、
25nm、30nm、40nm或50nm的网孔大小表征。
25nm、30nm、40nm或50nm的网孔大小表征。
[0044] 在本文中较长寿命的支架(尤其是用作靶向治疗部位)的有效性涉及佩吉特氏“种子和土壤”范式表，所述范式表提出，在通过转移性细胞定殖前，支持细胞(例如成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞)、可溶性因子和细胞外基质(ECM)组分建立有益于肿瘤细胞复位和定殖的微环境。这种范式表的重要性在于转移到特定器官不是无规的，而是受本地环境特性的影响。在体内使用较长寿命支架为这些支持细胞提供了足够的时间以在支架处建立微环境，转移性细胞被吸引到所述微环境中。这些原理的初始转换导致了微孔聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)生物材料支架的开发和实施方式，如美国申请第13/838,800号中所述，所述申请以全文引用的方式并入本文中。在那里，证明在体内通过局部免疫反应来募集转移性乳腺癌细胞。然而，PLG支架在被认为对于临床转换来说太短的时间尺度内是可降解的。
[0045] 利用目前的支架和技术，展示了在临床意义的时间范围内良好的寿命。举例来说，如本文所论述，预期大于90天的稳定性寿命，其中百分比降解曲线分别小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％和1％，其中百分比降解是指支架维持其结构用于充分细胞捕获的能力，作为其最大捕获能力的比较。这类能力测量为例如多孔支架体积随时间推移的变化、支架质量随时间推移的变化和/或支架聚合物分子量随时间推移的变化。这些长寿命意味着支架现在可在患者友好的条件下应用，所述患者友好的条件允许受试者在正常的日常生活条件下，在临床环境内部和外部佩戴支架。
[0046] 更进一步，利用本发明技术，提供支架，所述支架保持足够长时间的功能化以在体内提供靶向治疗部位，即转移性细胞不仅被检测到而且随着时间推移靶向的位置，以提供用于细胞切除和可能去除所有转移性细胞的特定位置。
[0047] 在一些实例中，本发明支架在更长时间段内保持功能化的能力提供了持续或可控释放支架的形成。这些支架例如可包含当植入和募集转移性细胞时不可降解的蛋白质响应材料。然而，当暴露于活化蛋白(例如酶)时，这些支架降解，然后释放捕获的转移性细胞。在一些实例中，这种特性预期用于体外以促进捕获细胞的回收。举例来说但不限于，在一些实例中，支架是藻酸盐支架，并且活化蛋白是藻酸盐裂解酶。
[0048] 在一些实例中，本发明技术提供了部分或专门由微孔聚(ε-己内酯)(PCL)形成的支架，从而形成PCL支架。如我们示出，这类PCL支架比微孔聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)生物材料支架具有更高的稳定性。事实上，PCL支架提供了这类意想不到的更大量的稳定性，我们首次能够研究受试者的动态免疫反应以及转移性细胞的募集相关的其它细胞事件。在这些实例中的一些中，我们已特别观察到乳腺癌细胞的细胞事件。
[0049] 在一些实例中，本发明提供生物材料PCL和/或PEG和/或藻酸盐支架和由其衍生的植入物，以提供用于募集和检测转移性细胞的靶标。在一些实例中，所述靶标在体外、在体内、原位等使用。在一些实例中，本发明提供用于捕获转移性细胞并允许那些细胞随时间推移在转移性部位定殖的生物材料PCL和/或PEG和/或藻酸盐支架。在其它实例中，将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个支架植入受试者体内。
[0050] 在一些实例中，本发明技术提供部分或专门由水凝胶(例如聚(乙二醇)(PEG)水凝胶)形成的受控释放支架，以形成PEG支架。预期任何PEG均可用于本公开的组合物和方法中。一般来说，PEG的平均分子量为至少约5,000道尔顿。在其它实施例中，PEG的平均分子量为至少10,000道尔顿、15,000道尔顿，并且优选地在5,000道尔顿和20,000道尔顿之间，或在15,000道尔顿和20,000道尔顿之间。另外优选的是平均分子量为5,000道尔顿、6,000道尔顿、7,000道尔顿、8,000道尔顿、9,000道尔顿、10,000道尔顿、11,000道尔顿、12,000道尔顿、13,000道尔顿、14,000道尔顿或25,000道尔顿的PEG。在其它实施例中，PEG为四臂PEG。在优选的实施例中，四臂PEG的每个臂终止于丙烯酸酯、乙烯基砜或马来酰亚胺。预期在PEG支架中使用乙烯基砜或马来酰亚胺使得支架抗降解。进一步预期在PEG支架中使用丙烯酸酯使得支架易于降解。
[0051] 在一些实施例中，一种或多种试剂与支架缔合以建立转移的适宜环境和/或向受试者提供治疗益处。试剂可通过共价或非共价相互作用、粘附、包封等与支架缔合。在一些实施例中，支架包含粘附到支架、吸附在支架上、包封在支架内和/或包含在整个支架中的一种或多种试剂。本发明不受试剂性质的限制。这类试剂包括但不限于蛋白质、核酸分子、小分子药物、脂质、碳水化合物、细胞、细胞组分等。在各种实施例中，试剂是治疗剂。在一些实施例中，两种或更多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10……20……30……40……50种，其中的量或更多)不同的试剂包括在支架上或支架内。在一些实施例中，与支架缔合的试剂包括转移性标记，如：CD133(其通常定义所有祖细胞)、VEGFR-1(造血祖细胞(HPC))、VEGFR-2(内皮祖细胞(EPC))、CD11b和GR1(髓源抑制细胞)、F4/80和CD11b(巨噬细胞)以及CD11b+CD115+Ly6c+(炎性单核细胞)。
[0052] 在其它实施例中，预期本公开的支架相对于包含例如PLG的支架募集更多和/或不同的细胞。举例来说，在一些实施例中，本公开的支架比包含例如PLG的支架募集更多的肿瘤细胞。在各种实施例中，本公开的支架相对于包含例如PLG的支架募集和/或捕获约5、10、20、50、100、200、500、1000或更多个细胞。在一些实施例中，与本公开的支架缔合的细胞类型不同于包含例如PLG的支架。举例来说但不限于，发现相对于PCL支架，与PCL支架缔合的CD49b细胞的较高百分比；另外，与PLG支架缔合的F4/80和CD11c细胞的量约相等，而与PCL支架缔合的CD11c细胞的数量是F4/80细胞的三倍。
[0053] 本公开还涵盖包含治疗剂的支架。如本文所用，“治疗剂”意指可用于治疗目的的任何化合物。如本文所使用的所述术语应理解成意指施用到受试者用于治疗病症的任何化合物。
[0054] 本公开适用于需要递送的任何治疗剂。这类试剂以及疏水性药物的非限制性实例可在美国专利7,611,728中找到，所述专利以全文引用的方式并入本文中。预期供使用的其它治疗剂在PCT/US2010/55018中找到，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
[0055] 在各种实施例中，提供本文公开的支架和方法，其中支架包含多种治疗剂。在一些方面，提供组合物和方法，其中多种治疗剂与一种支架特异性缔合。在其它方面，多种治疗剂与多于一种支架缔合。
[0056] 治疗剂包括但不限于亲水性和疏水性化合物。
[0057] 蛋白质治疗剂包括但不限于肽、酶、结构蛋白、受体和其它细胞或循环蛋白以及其片段和其衍生物，其异常表达引起一种或多种病症。作为一个具体实施例，治疗剂还包括化疗剂。在各种实施例中，治疗剂还包括放射性材料。如本文所用的术语“肽”通常是指短多肽/蛋白质。
[0058] 在各个方面，蛋白质治疗剂包括细胞因子、趋化因子和/或造血因子。在各种实施例中，递送细胞因子和趋化因子以增强或限制细胞向支架的募集。这类试剂的实例包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、趋化因子(C-C基序)配体22(CCL22)、趋化因子(C-C基序)配体21(CCL21)、趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干扰素-α(IFN-α)、复合干扰素、IFN-β、IFN-γ、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、红血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、血管生成素，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y，人类血管生成素样多肽、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、骨形态生成蛋白-1、骨形态生成蛋白-2、骨形态生成蛋白-3、骨形态生成蛋白-4、骨形态生成蛋白-5、骨形态生成蛋白-6、骨形态生成蛋白-7、骨形态生成蛋白-8、骨形态生成蛋白-9、骨形态生成蛋白-10、骨形态生成蛋白-11、骨形态生成蛋白-12、骨形态生成蛋白-13、骨形态生成蛋白-14、骨形态生成蛋白-15、骨形态生成蛋白受体IA、骨形态生成蛋白受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的中性粒细胞、趋化因子2α、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、上皮源性中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胶质细胞系源性中性粒细胞因子受体α1、胶质细胞系源性中性粒细胞因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合性表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子神经生长因子受体、神经营养因子-3、神经营养素-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、血小板源性生长因子A链、血小板源性生长因子AA、血小板源性生长因子AB、血小板源性生长因子B链、血小板源性生长因子BB、血小板源性生长因子受体α、血小板源性生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子受体、TNF，包括TNFO、TNF1、TNF2，转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜伏转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白Ⅲ、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体Ⅱ型、尿激酶型纤溶酶原激活子受体、血管内皮生长因子和嵌合蛋白及其生物学或免疫活性片段。生物剂的实例包括但不限于免疫调节蛋白，如细胞因子、针对肿瘤抗原的单克隆抗体、肿瘤抑制基因和癌症疫苗。可与本发明的组合物和方法结合使用的白细胞介素的实例包括但不限于白细胞介素2(IL-2)和白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素12(IL-12)。细胞因子以外的其它免疫调节剂包括但不限于卡介苗(Calmette-Guerin)、左旋咪唑(levamisole)和奥曲肽(octreotide)。
[0059] 如通过本公开所预期的，在一些方面，治疗剂包括小分子。如本文所用，术语“小分子”是指化合物，例如可任选衍生的肽类，或任何其它天然或合成的低分子量有机化合物。这类小分子可是治疗上可递送的物质，或者可进一步衍生以促进递送。
[0060] “低分子量”是指分子量小于1000道尔顿，通常在300道尔顿和700道尔顿之间的化合物。在各个方面，低分子量化合物为约100道尔顿、约150道尔顿、约200道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约350道尔顿、约400道尔顿、约450道尔顿、约500道尔顿、约550道尔顿、约600道尔顿、约650道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约850道尔顿、约900道尔顿或约1000道尔顿。
[0062] 烷基化剂的实例包括但不限于双氯乙胺(氮芥，例如，氯胺布西(chlorambucil)、环磷酰胺、异环磷酰胺、二氯甲二乙胺、美法仑(melphalan)、尿嘧啶芥)、氮杂环丁烷((例如，硫替帕(thiotepa))、烷基烷烃磺酸盐(例如，白消安(busulfan))、亚硝基脲((例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、链脲霉素(streptozocin))、非经典烷基化剂(六甲蜜胺(altretamine)、达卡巴嗪(dacarbazine)和丙卡巴肼(rocarbazine))、铂化合物(例如，碳质体、顺铂和铂(IV)(Pt(IV)))。
[0063] 抗生素剂的实例包括但不限于蒽环霉素(anthracycline)(例如阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、艾达霉素
(idarubicin)和蒽二酮)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博莱霉素(bleomycin)、达卡霉素(dactinomycin)、普卡霉素(plicatomycin)。
(idarubicin)和蒽二酮)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博莱霉素(bleomycin)、达卡霉素(dactinomycin)、普卡霉素(plicatomycin)。
[0064] 抗代谢剂的实例包括但不限于氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(methotrexate)、醛氢叶酸(leucovorin)、羟基脲、硫鸟嘌呤(6-TG)、巯基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷(cytarabine)、喷司他汀(pentostatin)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、克拉屈滨(cladribine)(2-CDA)、天冬酰胺酶、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(或)和吉西他滨(gemcitabine)。
[0065] 激素剂的实例包括但不限于合成雌激素(例如已烯雌酚)、抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、fluoxymesterol和雷洛昔芬(raloxifene))、抗雄激素(比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁胺(nilutamide)、氟他胺(flutamide))、芳香酶抑制剂(例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)和四唑)、酮康唑(ketoconazole)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙立德(leuprolide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)和米非司酮(mifepristone)。
[0066] 植物衍生剂的实例包括但不限于长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春唑胺(vinzolidine)和长春瑞滨(vinorelbine))、足叶草毒素(例如依托泊苷(etoposide)(VP-16)和替尼泊苷
(teniposide)(VM-26))、喜树碱化合物(例如20(S)喜树碱、拓扑替康(topotecan)、鲁比替康(rubitecan)和伊立替康(irinotecan))、紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)。
(teniposide)(VM-26))、喜树碱化合物(例如20(S)喜树碱、拓扑替康(topotecan)、鲁比替康(rubitecan)和伊立替康(irinotecan))、紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)。
[0067] 预期供使用的化疗剂包括但不限于烷基化剂，包括：氮芥，如甲氯乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和氯胺布西；亚硝基脲，如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU)；乙烯亚胺/甲基三聚氰胺，如三亚乙基三聚氰胺(TEM)、三亚乙基、硫磷酰胺(硫代替帕(thiotepa))、六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺)；烷基磺酸酯，如白消安；三嗪类，如达卡巴嗪(DTIC)；抗氧代谢产物，包括叶酸类似物，如甲氨蝶呤和三甲曲沙(trimetrexate)、嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)(AraC，阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物如6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2'-脱氧柯福霉素(2'-deoxycoformycin)(喷司他汀)、红羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉宾和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；天然产品包括抗有丝分裂的药物如紫杉醇、包括长春碱(VLB)、长春新碱和长春瑞宾的长春花生物碱、克癌易(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)和磷酸雌莫司汀；表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素如放线菌素D
(actinomycin D)、柔红霉素(红比霉素(rubidomycin))、阿霉素、米托蒽醌
(mitoxantrone)、艾达霉素、博来霉素、普卡霉素(米拉霉素(mithramycin))、丝裂霉素C(mitomycinC)和放线菌素(actinomycin)；酶如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂如干扰素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；杂类药剂，包括铂配合物，如顺铂、Pt(IV)和卡铂、蒽二酮如米托蒽醌、经取代的脲如羟基脲、甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼、肾上腺皮质抑制剂如米托坦(mitotane)(o,p'-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质激素拮抗剂，如强的松(prednisone)和等效物、地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特；孕激素如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟羟甲睾酮/等效物；抗雄激素如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙立德；以及非甾体类抗雄激素，如氟他胺。
(actinomycin D)、柔红霉素(红比霉素(rubidomycin))、阿霉素、米托蒽醌
(mitoxantrone)、艾达霉素、博来霉素、普卡霉素(米拉霉素(mithramycin))、丝裂霉素C(mitomycinC)和放线菌素(actinomycin)；酶如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂如干扰素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；杂类药剂，包括铂配合物，如顺铂、Pt(IV)和卡铂、蒽二酮如米托蒽醌、经取代的脲如羟基脲、甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼、肾上腺皮质抑制剂如米托坦(mitotane)(o,p'-DDD)和氨鲁米特；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质激素拮抗剂，如强的松(prednisone)和等效物、地塞米松(dexamethasone)和氨鲁米特；孕激素如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟羟甲睾酮/等效物；抗雄激素如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙立德；以及非甾体类抗雄激素，如氟他胺。
[0068] 我们现在描述根据本文实例的微孔支架的实例制造、表征和植入。
[0069] 在某些实施例中，支架包括聚合基质。在一些实施例中，基质通过气体发泡/颗粒沥滤程序制备，并且包括气体发泡前的湿式造粒步骤，所述步骤允许致孔剂和聚合物的均匀混合并且允许将支架塑形成所期望的形状。
[0070] 因此，在一些方面，支架可由可生物降解的聚合物例如PCL形成，所述可生物降解的聚合物通过乳化和均匀化聚合物溶液以形成微球来制造。微球制备的其它方法在本领域中是已知的，并且由本公开内容涵盖。参见例如美国专利申请公开第2015/0190485号和第2015/0283218号，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。然后收集微球并与致孔剂(例如盐颗粒)混合，并且然后在压力下压制混合物。加热所得盘状物，任选地随后进行气体发泡。最后，去除盐颗粒。制造提供了在体内植入之后不会压缩或破裂的机械稳定的支架，从而为细胞生长提供了适当的条件。
[0071] 在一些方面，支架由基本上不可降解的聚合物例如PEG形成。包封明胶微球的可降解水凝胶可基于先前描述的具有改变的迈克尔型加成PEG水凝胶体系形成[Shepard等人，《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng.)》，109(3):830-9(2012)]。简单来说，将四臂聚(乙二醇)乙烯砜(PEG-VS)(20kDa)溶解在pH 8.0的0.3M三乙醇胺(TEA)中，浓度为0.5mg/pL，得到最终PEG浓度为10％。纤维蛋白溶酶可降解的三官能(3个半胱氨酸基团)肽交联剂(Ac-GCYKNRCGYKNRCG)溶解在pH 10.0的0.3M TEA中，以维持游离硫醇的还原，其浓度维持VS:SH的化学计量平衡摩尔比。在凝胶化前，明胶微球与10μL无菌Millipore或慢病毒溶液水合。随后，将PEG和肽交联溶液充分混合，并且立即添加到水合明胶微球中进行包封。在一些实施例中，并且如上所述，盐被用作致孔剂而不是明胶微球。在这种情况下，PEG溶液是在饱和盐溶液中制得的，因此致孔剂不显著地溶解。
[0072] 在一些实施例中，使用UV交联代替肽交联。紫外线交联预期与PEG-马来酰亚胺、PEG-VS和PEG-丙烯酸酯一起使用。
[0073] 在制备PCL支架后但在使用PCL支架前，称量支架以确保盐消失。PCL支架的完整性也通过其操作来评估；在显微镜下查看支架以检查孔结构。类似地，在制备PEG支架后但在使用PEG支架前，通过在显微镜下处理和查看支架以看到孔结构来评估其完整性。
[0074] 本公开的支架可包含包括但不限于以下的多种结构中的任何一种：颗粒、珠粒、聚合物、表面、植入物、基质等。支架可是任何合适的形状，例如球形、大致球形(例如，所有尺寸在球形的25％内)、椭圆形、棒状、球状、多面体等。支架也还可是不规则或分支的形状。
[0075] 在一些实施例中，支架包含纳米颗粒或微粒(例如，压缩或以其它方式制成支架)。在各种实施例中，支架内颗粒的最大横截面直径小于约1,000μm、500μm、200μm、100μm、50μm、20μm、10μm、5μm、2μm、1μm、500nm、400nm、300nm、200nm或100nm。在一些实施例中，颗粒群体的平均直径为：200-1000nm、300-900nm、400-800nm、500-700nm等。在一些实施例中，颗粒的总重量小于约10,000kDa、小于约5,000kDa，或小于约1,000kDa、500kDa、400kDa、300kDa、
200kDa、100kDa、50kDa、20kDa、10kDa。
200kDa、100kDa、50kDa、20kDa、10kDa。
[0076] 在一些实施例中，支架包含PCL。在其它实施例中，支架包含PEG。在某些实施例中，PCL和/或PEG聚合物和/或藻酸盐聚合物通过化学部分的官能团封端(例如酯封端、酸封端等)。
[0077] 在一些实施例中，选择基质材料的电荷(例如，正、负、中性)以赋予应用特定的益处(例如，生理相容性、与化学试剂和/或生物试剂的有益相互作用等)。在某些实施例中，支架能够直接或间接缀合到化学试剂或生物试剂)。在一些情况下，载体具有多个结合位点(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10……20……50……100、200、500、1000、2000、5000、10,000或更多个)。
[0078] 在一些实施例中，本公开提供用于检测植入的支架上的转移性癌细胞的方法。一般来说，可使用可用于检测支架中的转移性细胞的任何方法。在一些实施例中，提供非侵入式转移检测方法。在一些实施例中，提供适配逆散射光学相干层析成像(ISOCT)用于非侵入式支架成像。在某些实施例中，ISOCT能够对组织微血管和超微结构进行三维(3D)成像，其细节使得能够检测到支架、支架上或支架内的转移性细胞。在其它实施例中，高频超声、超声或光声成像用于支架成像。
[0079] 在一些实施例中，并且如本文所述，本公开的组合物和方法提供受试者(例如，疑似患有癌症的受试者、患有癌症的受试者、缓解中的受试者、不一定处于升高的癌症或转移风险的受试者)体内转移传感器。在一些实施例中，将组合物植入受试者体内，并且监测到其的转移以检测受试者体内的转移。在一些实施例中，植入支架并且以规律间隔(例如，每天、每半天、每周等)或周期性间隔(例如，每月、每年等)检查转移的迹象。在一些实施例中，随时间推移监测单个支架的转移状态的变化。在一些实施例中，植入支架，并且在检测转移的程序后去除支架。在各种实施例中，在约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、3周、4周、5周、6周、7周、两个月、三个月、六个月、八个月、1年、
2年、3年、4年、5年或更长时间之后，进行支架的去除。在其它实施例中，去除支架之后，测定支架中转移性细胞的数量，然后去除支架的相同或不同位置中替换受试者体内的支架。
2年、3年、4年、5年或更长时间之后，进行支架的去除。在其它实施例中，去除支架之后，测定支架中转移性细胞的数量，然后去除支架的相同或不同位置中替换受试者体内的支架。
[0080] 在一些实施例中，去除支架之后，收回捕获的细胞。在各种实施例中，这类捕获的细胞是癌细胞和/或非癌细胞。收回细胞如本文所公开的那样实现，并且通常涉及将支架暴露于活化蛋白如酶。在收回后，可研究捕获的细胞以开发癌症疫苗。在其它实施例中，对捕获的细胞的分析指示受试者正遭受的癌症类型。预期阐明受试者正遭受的癌症类型将告知受试者应接受的疗法类型(例如外科手术、靶向化疗、放射线疗法和/或个人化/精确疗法)。
[0081] 实例实施方案
[0082] 为了证明我们提出的支架能够吸引转移性细胞的功效，开发了在雌性NSG小鼠中的人类乳腺癌转移的原位异种移植模型。用于在本发明实施例的开发期间进行的研究的转移性人类细胞系为MDA-MB-231-BR(231BR)，这是三阴性MDA-MB-231乳腺癌细胞系的自发转移变型，其先前对于其转移到大脑的能力进行了选择。然后231BR细胞系稳定地转染以表达荧光素酶和tdTomato，以生成MDA-MB-231BR-tdTomato-lu2细胞系。
[0083] 支架制造：为了制备微孔PCL支架，首先通过在10％聚(乙烯醇)溶液中乳化于二氯甲烷中的6％(w/w)PCL溶液(亚拉巴马州伯明翰的兰特可吸收聚合物((Lactel Absorbable Polymers,Birmingham,AL)；固有粘度＝0.65-0.85dL/g)，随后在10,000rpm下均匀化约1分钟来制备PCL微球。然后将溶液搅拌至少3小时。通过离心收集微球，并且在去离子水中洗涤至少5次，随后冻干48小时。为了制备微孔PCL支架，将PCL微球和盐颗粒(大小范围250-425μm)以1:30(w/w)的比率混合，并且在钢模中以1500psi的压力压制大约45秒。聚合物-盐盘状物在60℃下加热，每侧大约5分钟，随后在800psi高压CO2中发泡大约24小时。通过将盘状物浸入水中来去除盐颗粒。支架储存于-80℃下。对于实验研究，支架使用70％乙醇灭菌，用无菌水冲洗，并且在无菌网垫上干燥。
[0084] 用于比较的微孔PLG支架使用如美国申请第13/838,800号中所述的气体发泡和粒状沥滤技术制备。
[0085] 支架表征：支架的机械测试在Sintech Instron 20/G(马萨诸塞州诺伍德的英斯特朗公司(Instron Corp,Norwood MA))上用200g荷重计以1毫米/分钟的十字头速率执行。样品被压缩至50％应变，并且支架的杨氏模量由如通过TestWorks 4(明尼苏达州伊登普雷里的MTS系统公司(MTS Systems Corp.，Eden Prairie，MN))软件测定的应力/应变的线性区域计算。为了检查支架的微观结构，用15nm金涂覆支架并且在2kV的加速电压下使用扫描电子显微镜(日立S4800-II cFEG SEM；日立高新技术公司(Hitachi S4800-II cFEG SEM；
Hitachi High-Technologies))进行成像。支架孔隙率使用以下公式计算：孔隙率＝1-(ρ/ρ*)；其中ρ是聚合物的密度，并且ρ*是支架的表观密度(支架重量/支架体积)。孔体积使用以下公式计算：孔体积＝支架体积×孔隙率。
Hitachi High-Technologies))进行成像。支架孔隙率使用以下公式计算：孔隙率＝1-(ρ/ρ*)；其中ρ是聚合物的密度，并且ρ*是支架的表观密度(支架重量/支架体积)。孔体积使用以下公式计算：孔体积＝支架体积×孔隙率。
[0086] 支架植入：将微孔支架植入BALB/c小鼠或NOD/SCID-il2Rγ-/-(NSG)小鼠的皮下空间中。对于植入程序，借助腹膜内注射氯胺酮(10mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)来麻醉小鼠。使用必妥碘拭子，随后乙醇拭子(3×)刮削和准备上背部。在上背部开一个切口，并且在每侧形成皮下袋，将支架插入其中(每只小鼠2个支架)。使用伤口夹(Reflex 7mm，Roboz手术器械公司(Roboz Surgical Instrument Co.))和手术胶(3M Vetbond组织粘合剂)闭合皮肤。
[0087] 支架植入之后一个月执行原位肿瘤接种。对于接种肿瘤，沿着背侧皮肤的下半部的右侧开一个切口。随后，形成皮下袋，并且暴露右侧第四乳房脂肪垫。然后将于50μL无菌6
磷酸盐缓冲盐水(PBS)(生命技术公司(Life Technologies))中的2×10 4Tl-luc2-
tdTomato(珀金埃尔默(Perkin Elmer))或MDA-MB-231BR-tdTomato-luc2细胞注入到雌性BALB/c或NSG小鼠的第四个右侧乳房脂肪垫中。然后用手术胶(3M Vetbond组织粘合剂)闭合皮肤。
磷酸盐缓冲盐水(PBS)(生命技术公司(Life Technologies))中的2×10 4Tl-luc2-
tdTomato(珀金埃尔默(Perkin Elmer))或MDA-MB-231BR-tdTomato-luc2细胞注入到雌性BALB/c或NSG小鼠的第四个右侧乳房脂肪垫中。然后用手术胶(3M Vetbond组织粘合剂)闭合皮肤。
[0088] 流式细胞测量术：小鼠在指示时间被安乐死，并且收回的支架和器官在汉克平衡盐溶液(生命技术公司)中洗涤。样品在Liberase TL或TM(0.38mg/mL)(罗氏(Roche))中用微型剪刀切碎，并且在37℃下放置20分钟。在此之后，添加0.5M EDTA(生命技术公司)，并且通过沥滤通过FACS缓冲液[具有0.5％牛血清白蛋白(西格玛阿尔德里奇(Sigma Aldrich))和2mM EDTA的PBS(生命技术公司)]中的70μm过滤器而从组织或支架中收回细胞。对于分析肿瘤细胞(tdTomato+细胞)，将各个支架或器官样品悬浮在FACS缓冲液中，并且使用BD LSR Fortessa流式细胞仪(BD生物科学(BD Biosciences))进行分析。经由流式细胞测量术癌细胞的检测灵敏度为0.002％(即总共250,000个细胞中的5个癌细胞)。为了分析各种白细胞群，将各个支架样品均等分割，用于分析先天性免疫细胞和适应性免疫细胞。在每组中，使用抗CD16/32(1:50，电子生物科学(eBioscience))阻断细胞，并且使用 可固定的蓝死细胞染色试剂盒(1:200，生命技术公司)进行染色。在第一组中，用Alexa
700抗CD45(1:125，博莱德(Biolegend))、V500缀合的抗CD11b(1:100，BD生物科学)、FITC缀合的抗Ly6C(1:100，博莱德)、PE-Cy7缀合的抗F4/80(1:80博莱德)、APC缀合的抗CD11c(1:
80，博莱德)和Pacific BlueTM抗Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)(1:70，博莱德)对细胞进行染色。在第二组中，用Alexa 700抗CD45(1:125，博莱德)、V500缀合的抗CD4(1:100，博莱德)、
Pacific BlueTM抗CD19(1:100，博莱德)、FITC缀合的抗CD8(1:25，博莱德)和PE-Cy7缀合的抗CD49b(1:30，博莱德)对细胞进行染色。然后使用BD LSR Fortessa流式细胞仪(BD生物科学)分析样品。单色对照用于设定用于分析白细胞群的选通方案，如先前所描述。
700抗CD45(1:125，博莱德(Biolegend))、V500缀合的抗CD11b(1:100，BD生物科学)、FITC缀合的抗Ly6C(1:100，博莱德)、PE-Cy7缀合的抗F4/80(1:80博莱德)、APC缀合的抗CD11c(1:
80，博莱德)和Pacific BlueTM抗Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)(1:70，博莱德)对细胞进行染色。在第二组中，用Alexa 700抗CD45(1:125，博莱德)、V500缀合的抗CD4(1:100，博莱德)、
Pacific BlueTM抗CD19(1:100，博莱德)、FITC缀合的抗CD8(1:25，博莱德)和PE-Cy7缀合的抗CD49b(1:30，博莱德)对细胞进行染色。然后使用BD LSR Fortessa流式细胞仪(BD生物科学)分析样品。单色对照用于设定用于分析白细胞群的选通方案，如先前所描述。
[0089] 为了检查支架靶向能力，最初和随时间推移，执行了一系列支架切片和荧光成像。
[0090] 将从小鼠收回的支架在PBS中冲洗，并且然后立即在预冷的异戊烷中快速冷冻。然后将冷冻支架用30％蔗糖嵌入最佳切割温度(OCT；卡地纳健康(Cardinal Health))化合物中并且使用低温恒温器(Microm HM 525；Microm International)以14μm进行切片。支架切片储存在-20℃下直到成像。冷冻切片在室温下风干30分钟，用10％中性缓冲福尔马林固定，用自来水洗涤5分钟，用Dl水洗涤10分钟(2×)，并且用含有DAPI(纽约州格兰德岛的分子探针公司(Molecular Probes,Grand Island,NY))的ProLong Gold抗荧光衰减水性封固介质作滑盖。使用358nm的激发波长观测DAPI荧光，并且使用532nm的激发波长观测来自癌细胞中tdTomato的荧光。使用用于图像捕获和共定位的具有CellSens Entry软件(奥林巴斯(Olympus))的奥林巴斯BX43显微镜和奥林巴斯DP72数码相机来查看图像。
[0091] 各种技术可用于体内和体外分析所捕获的细胞。这些包括逆散射光学相干层析成像(ISOCT)成像和超声成像，后者特别适用于支架的亚表面成像，即植入皮肤下。我们描述使用ISOCT成像的非侵入式支架成像的实例。ISOCT能够对组织微血管和超微结构进行三维(3D)成像，其细节远低于衍射受限的分辨率极限(对长度尺度的灵敏度小至40nm)。在体外对定殖之后提取的支架和对照支架执行ISOCT和扫描透射电子显微镜检查(STEM)，以便识别支架对细胞迁移的反应的ISOCT可检测的内源性超微结构和微血管标记。此外，进行实验以确定诱导可由ISOCT检测的微环境变化的恶性细胞的最小数量。ISOCT提供了一种无标记方法从而以亚衍射灵敏度量化组织的统计质量密度相关函数。
[0092] 在本文的ISOCT成像和分析中，使用具有650-800nm照明波长的光谱域OCT系统来测量来自每个具有8×8×4μm尺寸的三维分辨率体素的背散射强度。由背散射强度谱计算折射率相关函数形状因子D。为了原位无标记成像PCL支架，小鼠在肿瘤接种后第5天被安乐死。进行切割以将植入的PCL支架表面暴露于扫描OCT激光下，并且对每个支架获得两次2×2mm扫描。为了最小化随机表面反射，将PBS添加到支架上。为了从每次测量中确定平均D值，从扫描样品表面下方8至48μm处对每次扫描的无反射和过度肥胖的横向区域取平均。为了从无肿瘤小鼠和携带肿瘤的小鼠生成支架的代表性三维呈现，常规的OCT背散射强度用D值的彩色图谱覆层以灰度绘制。用24×24μm水平过滤器和32μm垂直过滤器处理D图谱以平滑图像。
[0093] 使用乳腺癌转移的术后模型研究支架植入物对存活率的影响。在此模型中，肿瘤接种后10天切除原发肿瘤。简单来说，使用必妥碘拭子，随后使用乙醇拭子(3×)制备原发肿瘤区域。沿背侧皮肤的下半部的右侧开切口，暴露原发肿瘤。然后使用针鼻钳拾取肿瘤，并且使用弯曲的尖剪刀切开肿瘤底部周围的皮肤。使用 (poliglecapenne 25)缝合线(爱惜康公司(Ethicon,Inc.))和手术胶(3M Vetbond组织粘合剂)闭合皮肤。在所述程序之后每天监测动物健康的活动和反应，包括姿势、活动能力、体重、清整行为和呼吸状况。如果发现动物处于垂死状态，作为实验终点，则对动物实施安乐死。证明原发肿瘤再生长的小鼠被排除在分析之外，以避免原发肿瘤引起的混淆效应。
[0094] 统计分析：数据呈现为平均±标准误差(s.e.m)。使用单向方差分析进行多重比较。使用Tukey-HSD检验执行方差分析后的比较。对于不遵循正态分布的数据，使用非参数威尔科克森秩和检验对两个样品执行比较。为了比较器官中含有可检测肿瘤细胞的小鼠与支架的相对数量，使用费舍尔精确检验来测定p值。使用JMP软件(JMP Pro 11)执行统计分析。对于存活率分析，生成卡普兰-迈耶曲线，并且使用对数秩检验使用Sigma曲线(版本13)执行统计分析。
[0095] 开发微孔PCL支架(图1A，直径5mm，高度2mm)以在体内创建微环境，并且随后检查它们募集转移性肿瘤细胞的能力。使用SEM成像证实支架的多孔互连结构(图1B)。对于PCL和先前报道的PLG支架的微观结构特征如孔隙率、孔体积和机械特性(即弹性模量)类似(表1)。
[0096]
[0097] 表1.微孔PLG和PCL支架的表征(N＝10)。
[0098] 通过将PCL支架植入BALB/c和NSG小鼠的皮下背侧空间，研究PCL支架在体内存留并创建限定空间的能力。出于非侵入式成像的可接近性和可解决性，选择皮下部位。此外，无论是4T1还是MDA-MB-231BR乳腺癌细胞通常都不会转移到皮下空间，因此在转移性部位中癌细胞的存在可能与支架的存在相关联。当相比于第0天时，在3个月之后收回的PCL支架经历了最小程度的降解，这与先前用于体内肿瘤细胞募集的PLG支架相反。PLG支架在这段时间内显示出显著降解，如通过支架面积定量(即，在NSG中为66％，并且在BALB/c小鼠中为77％；图8)。
[0099] 研究了在整个急性阶段和慢性阶段中对生物材料植入物的动态免疫反应。将PCL支架植入健康BALB/c小鼠中引起到第3天CD45+白细胞的浸润。CD45+白细胞的数量在支架植入后第14天之后保持相对不变(图1C)。然而，检查的白细胞群的相对分布，包括先天性免疫细胞和适应性免疫细胞，在支架植入后动态地变化。识别为Ly6C+F4/80-细胞的炎性单核细胞的百分比在第3天之后下降，并且在后续时间点保持相对稳定，而识别为CD11c+F4/80-的树突细胞的百分比在第3天之后增加，并且在后续时间点保持稳定(图1D)。这两种细胞群构成了在后续时间点在PCL支架上观察到的大部分细胞(即>65％)。识别为CD11b+F4/80+细胞的巨噬细胞百分比在第14天显著增加(例如，第14天为8.8％对比第3天为1.7％，图1D，p<0.05)，并且然后返回到第3天观察到的水平(例如，第60天为1.4％，图1D，p＝0.99，相比于第3天)。相反，通过CD11b+Gr-1hiLy6C-染色识别的髓源抑制细胞(MDSC)水平所有检查时间点保持低水平，在0.15％(图1D)。在适应性免疫细胞群中，CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T+
细胞的百分比随时间推移显著增加(例如，分别对于CD4 ，在第3天的1％至第60天的9％，并且对于CD8+，在第3天的1.2％至第60天的3％，图1D，p<0.05)。识别为CD19+的B细胞和识别为CD49b+的自然杀伤(NK)细胞的百分比在第3天后增加，并且在后续时间点(即第30天和第60天)返回到第3天的水平；图1D)。重要的是，在BALB/c小鼠中，在支架植入后第30天和第60天之间白细胞亚群的相对百分比类似(图1D)。在NSG小鼠中也观察到这种趋势(图9)。基于第
30天之后细胞群的稳定，我们利用第30天作为在所有后续实验中表示对支架植入物的慢性反应的时间点。
细胞的百分比随时间推移显著增加(例如，分别对于CD4 ，在第3天的1％至第60天的9％，并且对于CD8+，在第3天的1.2％至第60天的3％，图1D，p<0.05)。识别为CD19+的B细胞和识别为CD49b+的自然杀伤(NK)细胞的百分比在第3天后增加，并且在后续时间点(即第30天和第60天)返回到第3天的水平；图1D)。重要的是，在BALB/c小鼠中，在支架植入后第30天和第60天之间白细胞亚群的相对百分比类似(图1D)。在NSG小鼠中也观察到这种趋势(图9)。基于第
30天之后细胞群的稳定，我们利用第30天作为在所有后续实验中表示对支架植入物的慢性反应的时间点。
[0100] 随后检查转移性细胞向长期植入的微孔支架(即在肿瘤接种前已植入30天的支架，对应于免疫反应的慢性阶段的时间)的募集。对在肿瘤接种后第15天收回的支架执行的流式细胞测量术和荧光成像(图2)证明支架中存在小鼠4T1肿瘤细胞，指示局部微环境使得能够募集肿瘤细胞。相比于PLG支架，PCL支架内的总细胞浸润显著更大(即PCL支架中的约6×105个细胞对比PLG支架中的约1×105个细胞，p<0.0001，图2A)，并且观察到肿瘤细胞募集的类似趋势(图2B，p<0.01)。在NSG小鼠中支架还能够募集人类MDA-MB-231BR细胞(图11)，指示这类系统能够在免疫感受态和免疫受损小鼠模型的背景下分别募集小鼠和人类乳腺癌细胞。
[0101] 在肿瘤接种后，随后表征PCL支架处免疫细胞群的动态，因为已知肿瘤细胞会影响从骨髓募集免疫细胞。流式细胞测量术分析指示PCL支架部位处的Ly6C+F4/80-和CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞增加(图3C和图3D，p<0.0005)。举例来说，CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的数量从肿瘤接种后第0天的0.1％增加到第21天的17％(p<0.05)，相对于无肿瘤BALB/c小鼠中PCL支架部位的数量增加了两个数量级(图1D，图3C)。这两种细胞类型都与转移前生态位有关。相反，在PCL支架部位，CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+F4/80-树突状细胞和CD8+细胞毒性T细胞的百分比降低(图3A、图3C、图3F，例如，对于树突状细胞，第0天的30％对比第21天的14％，p+ + +
<0.05)。CD19 B细胞、CD49bNK细胞和CD4辅助T细胞的百分比在第3天增加，并且然后在后续时间点降低(图3G、图3H、图3E)。具体地说，NK细胞从第0天的4％增加到第3天的8％，随后在肿瘤接种后第21天降低到2.5％(图3H，p<0.05)。引起关注的是，PCL支架部位的免疫细胞动态反映了肿瘤接种后脾中观察到的动态(图3对比图10)。综上所述，肿瘤接种后PCL支架部位处的免疫微环境的变化与4T1肿瘤细胞的募集有关，并且与关于免疫细胞在转移前生态位中的作用的以往文献报告一致。
<0.05)。CD19 B细胞、CD49bNK细胞和CD4辅助T细胞的百分比在第3天增加，并且然后在后续时间点降低(图3G、图3H、图3E)。具体地说，NK细胞从第0天的4％增加到第3天的8％，随后在肿瘤接种后第21天降低到2.5％(图3H，p<0.05)。引起关注的是，PCL支架部位的免疫细胞动态反映了肿瘤接种后脾中观察到的动态(图3对比图10)。综上所述，肿瘤接种后PCL支架部位处的免疫微环境的变化与4T1肿瘤细胞的募集有关，并且与关于免疫细胞在转移前生态位中的作用的以往文献报告一致。
[0102] 所公开技术的优点之一是支架可用于PCL支架处的转移性细胞的早期检测，从而允许支架用于转移的早期阶段识别。此外，PCL和PEG支架的稳定性意味着它们可从这些早期阶段到认为发生转移的临床上显著的时间范围保持功能化。
[0103] 在肿瘤接种后第5天，通过评估PCL支架中肿瘤细胞相对于在典型转移部位如肺脏、肝和大脑中检测到的癌细胞的百分比，检查在早期阶段检测转移性疾病存在的能力。流式细胞测量术分析揭示相比于肺、肝和大脑，PCL支架具有可检测的肿瘤细胞百分比(即0.005±0.002％)，所述肺、肝和大脑中没有一个具有可检测的肿瘤细胞(图4A和图4B；对于肺、肝和大脑N＝5，对于PCL支架N＝10，p<0.05，费舍尔精确检验)。相比于其它器官部位，在PCL支架部位观察到的更大的肿瘤细胞密度支持使用这种工具在初期阶段用于检测转移性疾病。
[0104] 随后研究了使用无标记成像技术，逆光谱光学相干层析成像(ISOCT)，对于在支架植入慢性模型中早期检测转移性疾病的可行性。用ISOCT和类似的光谱技术、低相干增强背散射光谱(LEBS)对早期癌症发生进行的以往研究揭示，从组织测量的D随着癌症进展而增加。因此，在转移前生态位中发生的类似超结构组织改变可能对D有类似的影响。先前已有报告，D反映长度尺度为35-350nm的质量密度分布特征。此外，来自组织的D值已被证明是早期癌症发生的鲁棒生物标记。与这些观察结果和经由流式细胞测量术分析获得的数据相一致(图4A和图4B)，相比于无肿瘤小鼠(N＝8；p<0.05，图4C)，从携带肿瘤的小鼠(N＝7)中的PCL支架部位处的ISOCT测量中获得的平均D值中观察到显著增加，证实支架的超结构改变，并且进一步指示肿瘤细胞的存在。D值的彩色图谱覆层(图4D和图4E)展示在整个支架中的分布。这些结果表明，ISOCT可用于PCL支架处的转移性疾病的早期检测。
[0105] 相比于PLG支架，本发明的PCL支架引起降低肿瘤负荷并且提高疾病特异性存活率的植入。
[0106] 接下来研究转移性细胞到长期植入的PCL支架的募集是否可在肿瘤接种后第15天降低典型转移性部位如肝、大脑和肺处的肿瘤负荷。流式细胞测量术分析指示，对比经受模拟外科手术的小鼠，在接受PCL支架的小鼠中，肝和大脑中肿瘤细胞的百分比降低。如所述，对于肝，肿瘤负荷降低了64％(图5A，N＝15，p<0.05)，并且对于大脑降低了75％(图5B，对于模拟外科手术N＝8，对于支架植入物N＝6，p<0.05，在两种情况下如使用威尔科克森秩和检验所测定)。然而，在这种免疫活性小鼠模型中，没有观察到肺中肿瘤负荷的降低(图5C，N＝11，p＝0.7)，这不同于我们先前在接种人类MDA-MB-231BR细胞的免疫受损NSG小鼠中的观察结果。
[0107] 然后应用乳腺癌转移的术后模型，以研究PCL支架植入物影响存活率的潜力。在此模型中，在肿瘤接种后第10天切除原发肿瘤(图6A)，这对应于通过无标记成像在支架中可检测到癌细胞的时间(即第5天，图4)。两组切除的肿瘤重量相当，其中来自模拟外科手术组的肿瘤重量为0.423±0.035g，而来自支架植入小鼠的肿瘤重量为0.419±0.029g(p＝0.93，t检验，图6B)。卡普兰-迈耶存活率分析证明，相比于接受模拟外科手术的小鼠，接受PCL支架植入的小鼠的存活率显著提高(图6C，每组N＝7，p<0.05，对数秩检验)。用于两组小鼠的处死终点在表2中描述。
[0108]
[0109]
[0110] 表2.在模拟和支架组术后模型中观察到的处死终点。
[0111] 考虑到在肿瘤接种后PCL支架部位处CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞丰度的最大增加(2个+ hi -数量级的变化)，我们假设在支架植入的情况下增加的存活率可反映CD11bGr-1 Ly6C 细胞在原发肿瘤(局部)和脾(全身)中的差异分布。流式细胞测量术分析指示，对比接受肿瘤接种后第10天检查的模拟外科手术的小鼠，接受支架植入物的小鼠的CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的丰度降低。CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的负荷在原发肿瘤中降低了39％(图7A)，并且在脾中降低了30％(图7B，N>7，p<0.05，在两种情况下如通过t检验所测定)。这一结果表明，支架的存在部分有助于局部(即原发肿瘤部位)和全身性(即脾)降低支持转移的关键生态位细胞的丰度。综上所述，这些结果强调了PCL支架在改善疾病特异性存活率结果方面的潜力。
[0112] 如本文所述，已经开发了微孔PCL支架，在肿瘤开始前植入，并且在疾病进展的早期时间点募集转移性细胞。这项工作的方法是基于对转移前生态位的免疫学方面的一些概述，而以往报告集中在模拟靶标器官(例如，骨骼、骨髓)的特性的材料上。转移前生态位的先前研究已经识别了一些与癌细胞募集有关的生物学线索，如细胞组分(例如造血和内皮祖细胞、免疫细胞)、可溶性因子(例如细胞因子、趋化因子)和细胞外基质蛋白。重要的是，如Lyden所指出，转移前生态位的存在意味着转移到特定部位不是随机的，而是预定的，这支持了部位可被设计成吸引转移性细胞的想法。本文的合成支架提供了创建限定环境的机会，利用所述环境来研究参与转移性细胞定殖的特定组分的作用。支架可用特定的生态位组分修饰，如基质细胞、VEGFR1+细胞、髓源抑制细胞(MDSC)、ECM分子(例如纤连蛋白、髓过氧化物酶、胶原IV)、细胞质蛋白(例如S100A8和S100A9)和细胞因子(例如IL-10、MCP-1、触珠蛋白)，以识别转移性环境中的关键信号，从而提供了用于推进转移前生态位和肿瘤转移的基础研究的工具。在本文中，支架限定免疫细胞浸润的部位，并且我们表征与癌细胞募集相关联的动态免疫反应。
[0113] 在肿瘤接种前已经稳定的PCL支架处的免疫细胞群在肿瘤接种后显著改变，这表明改变的对植入物的外来体反应可有助于转移性细胞募集。免疫细胞被认为是对转移前生态位至关重要的。因而，趋化因子CCL-2将炎性单核细胞(Ly6C+F4/80-细胞)募集到转移前生+ hi -态位，从而能够转移乳腺癌细胞。类似地，CD11bGr-1 Ly6C 细胞经由炎性化学诱导剂(例如S100A8和S100A9)被募集到转移前生态位。另外，已知CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞下调浸润并且抑制T细胞(CD4+和CD8+T细胞)和NK细胞的功能。与这些观察结果一致，在肿瘤接种后在支架部位处发现单核细胞和CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的水平增加，和CD4+T细胞、CD8+T细胞和+ + hi -
CD49bNK细胞的丰度的相关降低，其中CD11bGr-1 Ly6C细胞观察到的变化最大(即大于两个数量级)。重要的是，脾中观察到的由于疾病进展而导致的免疫组合物变化很大程度上反映了支架部位处的动态。综上所述，这些结果表明，设计局部微环境可用于识别和调节转移前生态位中癌症相关联的免疫原性的关键组分。
CD49bNK细胞的丰度的相关降低，其中CD11bGr-1 Ly6C细胞观察到的变化最大(即大于两个数量级)。重要的是，脾中观察到的由于疾病进展而导致的免疫组合物变化很大程度上反映了支架部位处的动态。综上所述，这些结果表明，设计局部微环境可用于识别和调节转移前生态位中癌症相关联的免疫原性的关键组分。
[0114] PCL支架的植入增强疾病特异性存活率。PCL支架植入皮下空间中降低免疫活性小鼠模型中主要器官部位(即肝和大脑)的肿瘤负荷。如美国申请第13/838,800号中所述，在免疫受损小鼠模型中，使用在肿瘤接种之后植入腹膜内脂肪垫中的PLG支架，发生肺中的负荷降低。然而，本发明技术超越了这些现有技术，并且重要的是展示一种基于支架的方法，所述方法在免疫活性和受损小鼠模型中以及当植入不同部位时，可有助于降低实体器官中的疾病负荷。使用ISOCT成像，可在肿瘤接种后例如到第5天在长期植入的PCL支架中检测到转移性细胞，这允许通过组织超微结构(例如，基质组织)的变化无标记地检测转移和相对于正常细胞具有明显纳米尺度特征的癌细胞的存在。
[0115] 本发明技术的高度稳定性使受试者的存活时间在临床上显著增加。
[0116] 在接种肿瘤后第10天后续切除原发肿瘤引起接受支架的小鼠存活率增加。当相比于接受模拟外科手术的小鼠，存活率的增加可是由于在携带支架的小鼠的局部原发肿瘤和全身性脾中观察到的CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞的负荷降低。如所述，CD11b+Gr-1hiLy6C-细胞与转移前生态位有关，并且这些细胞的丰度降低可能有助于降低实体器官中的负荷。最后，在转移性疾病患者中发现了大量的MDSC，这些MDSC与临床分期和转移性疾病负荷相关，并且它们的水平可预测总存活率。因此，降低MDSC丰度的基于支架的方法可部分阐明在我们研究中观察到的存活率益处。综上所述，早期检测转移性疾病的能力，结合支架提供的存活率益处，强调了这项技术在转换转移性疾病的当前检测和管理方面的潜力。
[0117] 将转移性细胞募集到支架，结合用于检测初生阶段转移性细胞的无标记成像，以及降低实体器官(即肝和大脑)中的疾病负荷，最终允许在疾病负荷低时进行干预，这可转换为改善的疾病特异性结果。本文公开的结果显示，用于捕获和检测早期转移性细胞的支架，结合在检测到早期转移之后不久的干预(即，原发肿瘤切除)，实际上可提高受试者的存活率。这种生物材料方法基于宿主对植入支架的反应，从而避免潜在有害细胞或生物组分的存在。
[0118] PCL被FDA批准用于如药物递送、缝合材料和伤口敷料等应用，这可有助于通过现有可植入结构转换到临床环境。此外，这种材料是可生物降解的，并且除非检测到癌细胞，否则不需要收回；并且降解速率相对较慢，允许在患者体内监测植入物长达两年。最后，支架可通过潜在地充当用于疾病复发的前哨部位而被整合到当前的乳腺癌疾病管理规划中，或者可预防性植入以检测高危患者的转移，并且有望降低乳腺癌死亡率。
[0119] PEG支架
[0120] 按照本文所述制备PEG凝胶，并且在第0天将其植入八周龄BALB/c小鼠的背侧皮下空间中。在支架植入后第28天，将2E6 4Tl-tdtom-luc2细胞注入到第四个右侧乳房脂肪垫中。在第42天收回支架，并经由流式细胞测量术分析肿瘤细胞的存在。
[0121] 表3示出在从五个不同小鼠收回的支架中识别的癌细胞的数量。
[0122]小鼠数量 支架 癌细胞数量
M4L PEG 38
M4R PEG 29
M5L PEG 23
M6L PEG 73
M6R PEG 38
M4L PEG 38
M4R PEG 29
M5L PEG 23
M6L PEG 73
M6R PEG 38
[0123] 表3.
[0124] 实验结果显示，PEG支架能够在体内成功捕获癌细胞。
[0125] 如本文所用，术语“受试者”是指任何人类或动物(例如，非人类灵长类、啮齿动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物、猪科动物、马科动物等)。
[0126] 如本文所用，术语“疑似患有癌症的受试者”是指呈现指示癌症的一种或多种症状或正在进行癌症筛查(例如，在常规身体检查期间)的受试者。疑似患有癌症的受试者还可具有一种或多种风险因素。疑似患有癌症的受试者一般没有进行针对癌症的测试。然而，“疑似患有癌症的受试者”涵盖已经接受初始诊断但是癌症的分期尚未知的个人。所述术语进一步包括曾经患有癌症的人(例如，缓解期中的个人)。
[0127] 如本文所用，术语“初始诊断”是指初始癌症诊断的结果(例如，存在或不存在癌细胞)。初始诊断不包括关于癌症分期或转移存在的信息。
[0128] 如本文所用，“癌症风险受试者”是指具有发展特定癌症的一种或多种风险因素的受试者。风险因素可包括但不限于性别、年龄、遗传倾向、环境暴露、先前癌症事件、先前存在的非癌症疾病和生活方式。
[0129] 如本文所用，术语“表征受试者的癌症”是指鉴定受试者癌症样品的一种或多种特性，包括但不限于良性组织、癌前组织或癌变组织的存在、癌症的分期、癌症的转移和受试者的预后。
[0130] 如本文所用，术语“诊断患有癌症的受试者”是指已经被测试并发现具有癌细胞的受试者。癌症可使用任何合适的方法诊断，包括但不限于活检、x射线、血液测试和本发明的诊断方法。
[0131] 如本文所用，术语“可生物降解的”是指当放置(例如植入或注入)到生物环境中(例如，进入受试者体内)时，在一段时间(例如，通常数小时至数月至数年)内分解成较小或组成部分(例如，寡聚和/或单体单元)的材料(例如，聚合物)。
[0132] 如本文所用，术语“可再吸收的”是指材料(例如聚合物)，其降解产物在生物环境内代谢或从其中排出(例如进入受试者体内)，所述降解产物经由自然途径放置在生物环境内。
[0133] 如本文所用，对“一个实施例”或“一实施例”的任何参考表示结合实施例所描述的特定元件、特性、结构或特征包括在至少一个实施例中。短语“在一个实施例中”在说明书中的各处的出现不一定都指代相同实施例。
[0134] 如本文所用，术语“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化意图涵盖非排它性的包含。举例来说，包括一系列元件的过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元件，但可包括没有明确列出或这类过程、方法、制品或设备所固有的其它元件。另外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排它性的或。举例来说，条件A或B通过以下中的任一种来得到满足：A是真的(或存在的)并且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)并且B是真的(或存在的)以及A和B都是真的(或存在的)。
[0135] 另外，“一(a/an)”的使用用于描述本文中的实施例的元件和组件。这样做仅是为方便起见并且给出描述的一般性意义。本说明书和随后的所附权利要求书应解读为包括一个或至少一个并且单数还包括复数个，除非明显指单数。
[0136] 虽然已经参考特定实例描述本发明，但是其仅意图是说明性的且并非作为本发明的限制，对于本领域普通技术人员而言将显而易见的是在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的实施例进行变化、添加和/或删除。
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