技术领域
[0001] 本
发明涉及农业科学技术领域，具体涉及降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段及其用途。
背景技术
[0002] 灰飞虱作为我国粮食地区的主要
害虫，除了直接取食危害粮食作物，还能传播多种作物病毒间接地危害作物，每年造成粮食作物减产30-50％甚至绝收。在我国，化学
农药是灰飞虱防治的重要以及主要手段。但是，长期以来连续单一地使用
化学农药已造成灰飞虱对多种农药产生不同程度的抗药性。为了达到满意的防治效果，农户不断加大农药使用量，但是防治效果不理想且加重环境污染，形成恶性循环。因此，在农业生产实践中，开发绿色、安全、持续的灰飞虱
生物防治方法以及手段已为必要。
[0003] 害虫防治的主要目的是控制害虫种群数量使其低于经济
阈值(防止
有害生物发生量超过经济受害
水平应采取防治措施时的有害生物发生量)。近些年发展起来的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术已被广泛运用于探索基因功能和害虫防治研究。从理论上而言，如果利用RNAi技术将农业害虫中重要生殖基因的表达进行干扰，则会降低害虫的繁殖
力，减少种群数量，从而达到控制害虫的目的。
[0004] 中国发明
专利CN106191003B公开了一种灰飞虱抗药性
羧酸酯酶基因LSCE12、降低灰飞虱抗药性的基因片段及其应用，提供一种灰飞虱抗药性羧酸酯酶基因LSCE12，利用该基因可获得降低灰飞虱抗药性的基因片段(即dsRNA)，并进行喂食RNAi，进而降低灰飞虱抗药，使灰飞虱更容易被
杀虫剂杀灭，减少了化学农药的使用量。虽然这种方法有效地减少了化学农药的使用量，但还是需要使用化学农药，而且抗药性高的灰飞虱其后代也具有较高的抗药性，不利于对其的长期防治。
[0005] 有鉴于此，急需对现有的防治灰飞虱的方法进行改进，减少使用化学农药并且有助于长期防治。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是现有的防治灰飞虱的方法必须使用化学农药的问题。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段，基因序列如SEQ ID NO.1所示，
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008] 在上述方案中，降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段的克隆方法，包括步骤如下：
[0009] 步骤一，提取雌性成虫灰飞虱总RNA，以灰飞虱总RNA为模板合成cDNA第一条链；
[0010] 步骤二，以步骤一中合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，通过序列为SEQ ID NO.3的上游引物P1，序列为SEQ ID NO.4的下游引物P2进行PCR扩增目标基因；
[0011] 步骤三，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶
电泳分离，产物纯化后用全自动序列仪进行测序，所获得的序列即为细胞凋亡基因；
[0012] 步骤四，对步骤三种测序获得的细胞凋亡基因序列设计含有T7启动子的引物，体外合成细胞凋亡基因片段的dsRNA并保存备用。
[0013] 在上述方案中，降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段的合成方法，以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.6的上游引物P3、序列为SEQ ID NO.7的下游引物P4，PCR扩增得到灰飞虱细胞凋亡基因的dsRNA。
[0014] 在上述方案中，降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段的合成方法，具体步骤如下：
[0015] 步骤一，提取雌性成虫灰飞虱总RNA，以灰飞虱总RNA为模板合成cDNA第一条链；
[0016] 步骤二，以步骤一中合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，通过含有T7启动子的上游引物P3序列为SEQ ID NO.6，含有T7启动子的下游引物P4序列为SEQ ID NO.7进行PCR扩增；
[0017] 步骤三，步骤二中PCR获得的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA条带；
[0018] 步骤四，运用T4连接酶将步骤三中回收的目标DNA片段连接至pEASY-T1载体，并通过转化将其导入至大肠杆菌DH5α，涂于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃，培养过夜；
[0019] 步骤五，挑取步骤四中菌落，菌落PCR进行鉴定并测序；
[0020] 步骤六，用含氨苄青霉素的LB液体培养基将阳性重组子进行扩增培养，并提取克隆质粒；
[0021] 步骤七，步骤六中质粒作为模板，通过含有T7启动子的上游引物P3序列为SEQ ID NO.6，含有T7启动子的下游引物P4序列为SEQ ID NO.7进行PCR扩增目的基因；
[0022] 步骤八，步骤七中所扩增目的基因的PCR产物进行纯化，以PCR产物为模板扩增得到降低灰飞虱产卵量基因的dsRNA。
[0023] 在上述方案中，降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段的用途，所述dsRNA通过与
饲料均匀混合后饲喂灰飞虱。
[0024] 在上述方案中，降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段，所述dsRNA的浓度为3000-5000ng/μL。
[0025] 与
现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0026] 1.通过分子生物学技术合成灰飞虱细胞凋亡基因片段的dsRNA，利用饲喂法可以显著地降低灰飞虱产卵量，找到了能够作为灰飞虱
生物防治的有效靶点的基因；
[0027] 2.合成灰飞虱细胞凋亡基因片段的dsRNA能有效沉默基因，很好地抵抗RNA酶的降解；同时合成成本低，便于大规模推广应用；
[0028] 3.灰飞虱细胞凋亡基因的dsRNA，通过RNAi技术对灰飞虱产卵量具有显著地降低作用，为建立利用RNAi技术控制害虫提供了新途径，避免使用化学农药。
附图说明
[0029] 图1为细胞凋亡基因Lsbcl-2片段的DNA条带；
[0030] 图2为细胞凋亡基因Lsbcl-2片段的dsRNA条带。
具体实施方式
[0031] 本发明提供了一种降低灰飞虱产卵量的细胞凋亡基因片段及其用途，通过降低灰飞虱产卵量使其得到有效防治。下面结合
说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。
[0032]
实施例1，灰飞虱细胞凋亡基因Lsbcl-2片段克隆方法。
[0033] 具体步骤如下：
[0034] 步骤一，取雌性成虫灰飞虱卵巢40-50个，用TRizoL法提取总RNA；
[0035] 步骤二，以总RNA为模板，反转录合成cDNA第一条链；
[0036] 步骤三，从灰飞虱基因组中获取基因片段序列，在NCBI
数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行同源性比对之后，预测为灰飞虱细胞凋亡基因Lsbcl-2，利用NCBI数据库中Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计上游引物P1(SEQ ID NO.3)和下游引物P2(SEQ ID NO.4)，进行PCR扩增；
[0037] 上游引物P1(SEQ ID NO.3)：5′-CGTCTGCTGAAGTGGTGGAT-3′
[0038] 下游引物P2(SEQ ID NO.4)：5′-TCAGGAAACACCTCTCGCAC-3′
[0039] PCR扩增体系如下：4μL 5×反应缓冲液Buffer，2μL dNTP，1μL步骤(1)中cDNA模板，2μL序列为SEQ ID NO.3的上游引物P1，2μL序列为SEQ ID NO.4的下游引物P2，0.5μL Taq酶，8.5μL dd H2O，共20μL；PCR扩增反应程序如下：95℃变性2min；95℃20sec，55℃20sec，72℃1min，35个循环；72℃10min延伸；10℃保存；
[0040] 步骤四，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，产物纯化后用全自动序列仪进行测序，所获得的序列即为细胞凋亡基因，即SEQ ID NO.1所示的基因片段。
[0041] 实施例2，灰飞虱细胞凋亡基因Lsbcl-2的dsRNA合成及回收。
[0042] 具体步骤如下：
[0043] 步骤一，根据已经验证的基因序列，利用NCBI数据库中Primer-Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计上游引物P3(SEQ ID NO.6)和下游引物P4(SEQ ID NO.7)
[0044] 上游引物P3(SEQ ID NO.6)：
[0045] 5′-taatacgactcactatagggGTGAGCGATTTGCCTTTGGG-3′
[0046] 下游引物P4(SEQ ID NO.7)：
[0047] 5′-taatacgactcactatagggGTAGACCGCCATCCGATTGT-3′
[0048] 对照GFP基因设计上游引物P5(SEQ ID NO.8)和下游引物P6(SEQ ID NO.9)[0049] 上游引物P5(SEQ ID NO.8)：
[0050] 5′-taatacgactcactatagggAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3′
[0051] 下游引物P6(SEQ ID NO.9)：
[0052] 5′-taatacgactcactatagggAGATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGT-3′
[0053] PCR扩增体系如下：10μL 2×反应缓冲液Buffer，2μL上游引物P3(SEQ ID NO.8)，2μL下游引物P4(SEQ ID NO.9)，2μL cDNA模板，4μL dd H2O，共20μL；PCR扩增反应程序如下：95℃变性3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃7min延伸；
[0054] 步骤二，PCR扩增产物经浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离并在紫外灯下切胶，采用爱思进生物技术公司的AxyPrep DNA凝胶回收
试剂盒进行回收；
[0055] 其具体操作为：
[0056] 1.对紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，放入称量过重量1.5mL微量离心管中，再次称量，获得所切胶重量；
[0057] 2.根据获得凝胶的重量，加入3个凝胶体积的Buffer DE-A(100mg＝100μL体积)，混合均匀后于75℃水浴，间断混匀至凝胶完全
熔化；
[0058] 3.加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B后混合均匀；
[0059] 4.将
混合液转移至DNA制备管，于12,000×g离心1min，弃滤液；
[0060] 5.加500μL Buffer W1于DNA制备管，于12,000×g离心30s，弃滤液；
[0061] 6.加700μL Buffer W2于DNA制备管，于12,000×g离心30s，弃滤液；
[0062] 7.再次加700μL Buffer W2于DNA制备管，于12,000×g离心1min，弃滤液；
[0063] 8.不加液体，将DNA制备管置于离心管中，12,000×g离心1min；
[0064] 9.将DNA制备管转移至新的1.5mL微量离心管中，加入30μL Nuclease-Free Water，室温放置1min，12,000×g离心1min；
[0065] 10.收集目的DNA产物保存于-20℃。
[0066] 步骤三，回收的PCR扩增产物在T4连接酶作用下连接至pEASY-T1载体，重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，涂于含有50ng/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃，培养过夜；
[0067] 步骤四，从氨苄青霉素的LB固体培养基上挑取菌落，至含氨苄青霉素的LB液体培养基进行扩增培养，并提取克隆质粒；
[0068] 步骤五，以质粒为DNA模板，再次进行PCR扩增，体系如下：50μL 2×反应缓冲液Buffer，4μL上游引物P3(SEQ ID NO.8)，4μL下游引物P4(SEQ ID NO.9)，8μL cDNA模板，34μL dd H2O，共100μL；PCR扩增反应程序如下：95℃变性3min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃7min延伸。PCR扩增产物用回收试剂盒进行纯化；
[0069] 步骤六，以PCR产物为模板扩增得到灰飞虱细胞凋亡基因Lsbcl-2的dsRNA。扩增体系如下：2μL 10×反应缓冲液buffer，2μL ATP，2μL GTP，2μL UTP，2μL CTP，1μg纯化的PCR产物为模板，2μL T7 RNA Polymerase Mix，加dd H2O，共20μL；所述的反应程序如下：37℃，6h；获得基因的dsRNA。
[0070] 实施例3，灰飞虱饲喂dsRNA实验。
[0071] 具体步骤如下：
[0072] 步骤一，将灰飞虱饲料与细胞凋亡基因的dsRNA(浓度为4000ng/μL)均匀混合；
[0073] 步骤二，准备多个双通玻璃管，将双通玻璃管的一端用纱布和皮筋封好，用电动吸虫器吸取2-3龄的灰飞虱若虫加入双通玻璃管；
[0074] 步骤三，用Parafilm
封口膜将双通玻璃管另一端封好，用移液枪吸取100μL灰飞虱饲料与细胞凋亡基因的dsRNA混合液(处理组)或者100μL灰飞虱饲料与对照GFP基因的dsGFP混合液(对照组)滴在封口膜的中央，用另一封口膜，将灰飞虱饲料与细胞凋亡dsRNA混合液封在两层封口膜之间；
[0075] 步骤四，将加好灰飞虱饲料与细胞凋亡dsRNA混合液的双通玻璃管置于
温度为25±1℃，
相对湿度60％，光照周期16L-8D。利用飞虱的趋光习性使其趋食饲料，每24h换灰飞虱饲料与细胞凋亡dsRNA的混合液或者灰飞虱饲料与对照GFP基因的dsGFP混合液；
[0076] 步骤五，持续喂食灰飞虱
羽化至成虫。将雌成虫单独挑出置于带水稻苗的试管中，并
配对，每24h查一次产卵量，直至雌成虫死亡。期间若雄成虫死亡，则重新加入雄成虫。结果见表1，由表1可见饲喂灰飞虱饲料与细胞凋亡基因Lsbcl-2的dsRNA混合液对灰飞虱产卵量具有显著的降低作用。
[0077] 表1
[0078]
[0079] 本发明具有以下优点：
[0080] 1.通过分子生物学技术合成灰飞虱细胞凋亡基因Lsbcl-2的dsRNA，利用饲喂法可以显著地降低灰飞虱产卵量，找到了能够作为灰飞虱生物防治的有效靶点的基因；
[0081] 2.合成灰飞虱细胞凋亡基因Lsbcl-2的dsRNA能有效沉默基因，很好地抵抗RNA酶的降解；同时合成成本低，便于大规模推广应用；
[0082] 3.灰飞虱细胞凋亡基因的dsRNA，通过RNAi技术对灰飞虱产卵量具有显著地降低作用，为建立利用RNAi技术控制害虫提供了新途径，减少使用化学农药。
[0083] 本发明并不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
