一株绿色木霉菌及其在防治甘薯软腐病中的应用
阅读：1032发布：2020-06-09
专利汇可以提供一株绿色木霉菌及其在防治甘薯软腐病中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株绿色木霉菌及其在防治甘薯软腐病中的应用。本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)特里克，是 苗圃 泥土中分离获得的，已于2009年01月08日保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2854。本发明通过大田实验证明，该菌株对甘薯软腐病具有较好的防治效果，其防治效果达到50％以上。，下面是一株绿色木霉菌及其在防治甘薯软腐病中的应用专利的具体信息内容。
一株绿色木霉菌及其在防治甘薯软腐病中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 甘薯(Ipomoea batatas Lam.)为旋花科甘薯属一年生或多年生蔓生草本，又称番薯、山芋、红薯、地瓜等，在中国有400多年的栽培历史，目前中国甘薯种植面积约占世界总面积的45％，产量约占世界总产量的76.16％，单产比世界平均单产高67％，我国甘薯种植面积和总产量均居世界首位。甘薯已成为我国仅次于水稻、小麦、玉米和大豆的第五大农作物，是重要的粮食、饲料和工业加工原料，具有良好的营养保健功能，在国民经济中发挥日益重要的作用。在甘薯的生产、利用过程中，安全贮藏是稳产、增效的关键，据统计，15％的甘薯因保藏不当而霉烂变质，造成巨大的经济损失。由于甘薯含水量高，贮藏期间极易引起各种病害的发生，其中，甘薯软腐病(Sweet potato soft rot)是甘薯采收和贮藏期的重要病害。甘薯软腐病由黑根霉菌(Rhizopus nigricans Ehvb.)引起，该病分布广泛且在全国各甘薯生产区均有发生，发病后，病原菌分泌果胶酶，溶解细胞壁中的果胶质，使组织软腐，且蔓延迅速，常使全窖腐烂，造成严重的经济损失。
[0003] 目前，化学防治和抗病品种的选育与推广是控制甘薯软腐病病害的主要手段。抗病品种的选育与推广需要一定的时限，其周期较长，无法在短期内实现。生产实践证明，长期使用化学农药可使甘薯软腐病病原菌产生抗药性，最终导致防治效果不理想，再加上化学药剂的大量使用对甘薯质量安全与环境造成许多负面影响，而生物防治具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式，而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。
[0004] 木霉(Trichoderma)属于半知菌类、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，其对植物病原菌有多种拮抗作用机制，包括竞争作用、重寄生作用、溶菌作用及产生抗菌素类物质，其中2种或3种机制可协同相互增强了对病原菌的拮抗作用。木霉菌拥有防治植物病原菌的特性，使其在世界范围被成功地用作生防制剂。现已知道许多木霉种类能产生具有抗菌素活性的次生代谢物，大量的抗菌化合物已被鉴定。因此，木霉菌成为目前较为具有研究价值和应用前景的生物防治剂。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一株用于高效防治甘薯软腐病的新的木霉菌株——绿色木霉菌(Trichoderma viride)特里克。本发明的绿色木霉菌株生长速度快、产孢量大，能够在甘薯表面能够快速大量定殖，因此在防治甘薯软腐病方面具有良好的应用前景。
[0006] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为绿色木霉(Trichoderma viride)特里克，是从山东省林业科学研究院试验苗圃泥土中分离获得的，已于2009年01月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2854。
[0007] 本发明绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克的培养方法或繁殖方法包括：
[0009] (2)实验室液体培养采用PDB(Potato Dextrose Broth)培养基，配方为：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
[0010] (3)固体培养基由固料和无机盐溶液组成，固料和无机盐溶液的质量比为1∶1.7。其中所述固料由质量比为65∶35的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液为
3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
[0011] (4)发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
[0012] 本发明还提供一种用于防治甘薯软腐病的生物防治制剂，所述生物防治制剂以绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克为主要有效成分。
[0013] 并且，本发明还提供了一种防治甘薯软腐病的方法，包括向具有软腐病的甘薯上施用上述绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克或者上述生物防治制剂。
[0014] 本发明也提供了上述绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克或者上述生物防治制剂在防治甘薯软腐病中的用途。
[0015] 本发明所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，将绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克经种子液培养、固体生产菌种培养后，再接种至发酵培养基(如上所述)，于温度28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d，得到固体发酵产物，进一步制成生物防治制剂。
[0016] 本发明的绿色木霉菌株特里克生长速度快、产孢量大，并且能够在甘薯表面快速大量定殖。由该绿色木霉菌制备的生物防治制剂，能够高效的防治甘薯软腐病害(防效50％以上)，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治甘薯软腐病。
具体实施方式
[0017] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。
[0018] 实施例1
[0019] 1、绿色木霉菌(T.viride)特里克的分离与纯化
[0020] 本发明的绿色木霉菌(T.viride)特里克是于2008年9月自山东省林业科学研究院试验苗圃(位于济南市工业北路)泥土中采用平板划线法分离获得的，分离方法为：
[0021] (1)木霉菌株的分离
[0022] 从山东省林业科学研究院试验苗圃的土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛。称取1g样品于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于PDA培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养7d后挑取PDA培养基上的不同形态的微生物菌落于PDA培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌菌株，并编号保存。
[0023] (2)甘薯软腐病高效拮抗木霉菌株的筛选
[0024] ①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在绿色木霉菌、甘薯软腐病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察绿色木霉菌对病原菌的抑制作用。
[0025] ②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的绿色木霉菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的绿色木霉菌菌株，进行窖藏试验。
[0026] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治甘薯软腐病的绿色木霉菌(T.viride)特里克。实验证明，该绿色木霉菌原粉在防治甘薯软腐病中显示出非常高效的防治效果。因而，本发明的绿色木霉菌是具有广泛应用前景的绿色木霉菌新菌株，可以用于制备防治甘薯软腐病的生物防治制剂。
[0027] 2、菌株鉴定
[0028] (1)微生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长正常，接种在培养皿上，温箱28℃条件下培养3d，菌落直径平均4.4cm。24h菌落呈现雪花状，白色稀疏，72h后形成黄绿色产孢区，120h菌落充满整个培养皿，呈现大量绿色孢子。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.4-10×2.6-3.3μm。分生孢子椭球形、单个，淡黄色近无色，由于凝集素作用，水中聚集时呈淡绿色，平板上呈现深绿色，壁稍粗糙，3.4-5×3-4μm。该菌株最佳生长温度28-34℃，最佳产孢时间5-7d，孢子活力最强为
12天，此后逐渐下降。
12天，此后逐渐下降。
[0029] (2)分子生物学特性
[0030] 该菌株的rRNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-ITS2区)如SEQ-1所示。
[0031] 该菌株鉴定为绿色木霉菌(Trichoderma viride)，已于2009年01月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2854。
[0032] 实施例2
[0033] 1、绿色木霉菌菌种发酵过程
[0034] PDB培养基配方为：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
[0035] 固体培养基配方(质量百分含量)：固料为玉米芯∶麸皮＝65∶35；无机盐溶液为磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水；固液比为1:1.7(质量比)。将无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。
[0036] 发酵培养基同固体培养基。
[0037] 绿色木霉(T.viride)特里克大量固体发酵过程：
[0038] ①菌种种子液培养
[0039] 将绿色木霉菌(T.viride)特里克从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
[0040] ②固体生产菌种的培养
[0041] 将种子液按10％的质量比接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
[0042] ③大量固体发酵
[0043] 将②中固体培养的培养物用无菌水按体积比1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按体积比1∶6接种于发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，得到固体发酵产物，干燥后过90目筛，得到孢子粉，菌活为70-130亿/克。
[0044] 为了明确绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克对甘薯软腐病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年10月～2017年2月在临沂市进行试验，现将试验结果报告如下：
[0045] 1供试材料及方法
[0046] 1.1供试药剂
[0047] 按本发明实施例1发酵方法生产的绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克孢子粉；50％多菌灵可湿性粉剂(江苏省新沂市中港农药化工有限公司生产，市售)。
[0048] 1.2试验材料与防治对象
[0049] 试验材料为甘薯；防治对象为甘薯软腐病(Sweet potato soft rot)。
[0050] 1.3试验地情况
[0051] 试验窖设在山东省临沂市临沭县。所有试验处理管理措施一致。
[0052] 1.4试验设计及安排
[0053] 本试验共3个处理，分别为绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克孢子粉加入1.5％的葡萄糖溶液稀释成5亿/ml的孢子粉悬液、50％多菌灵可湿性粉剂1500倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个重复60个甘薯。于2016年10月10日分别用三种处理液体浸泡5min。
[0054] 1.5试验调查及计算方法
[0055] 1.5.1药效调查
[0056] 施药后140d进行调查。每个处理调查50个甘薯，调查甘薯腐烂斑面积，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
[0057] 甘薯软腐病分级标准：
[0058] 0级：表面无腐烂；
[0059] 1级：腐烂斑面积小于表面积的2.5％；
[0060] 2级：腐烂斑面积占表面积的2.6％-5.0％；
[0061] 3级：腐烂斑面积占表面积的5.1％-7.5％；
[0062] 4级：腐烂斑面积占表面积的7.6％-10.0％；
[0063] 5级：腐烂斑面积占表面积的10.1％-12.5％；
[0064] 6级：腐烂斑面积大于表面积的12.5％。
[0065] 1.5.2药效计算方法
[0066] 防治效果按式(1)、(2)计算：
[0067]
[0068]
[0069] 式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
[0070] CK1——空白对照区施药后病情指数；
[0071] PT0————药剂处理前施药前病情指数；
[0072] PT1————药剂处理后施药后病情指数。
[0073] 2结果
[0074] 2.1供试药剂对甘薯软腐病的防治效果
[0075] 表1结果显示，绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克孢子粉悬液和50％多菌灵可湿性粉剂对甘薯软腐病均具有较好的防治效果，二者的防治效果达到50％以上。
[0076] 从甘薯软腐病的病情指数来看(表1)，绿色木霉菌(T.viride)特里克孢子粉悬液防治效果为50.15％，与50％多菌灵可湿性粉剂的防治效果相当，且其具有防止污染、避免杀害天敌、保护生态环境等优点。
[0077] 表1三种药剂处理对甘薯软腐病的防治效果
[0078]
[0079] 3小结
[0080] 从病情指数和防治效果来看，绿色木霉菌(T.viride)菌株特里克(保藏号CGMCC No.2854)对甘薯软腐病具有较好的防治效果，其防治效果达到50％以上，与50％多菌灵可湿性粉剂的防治效果相当。
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