植物病原性微生物的生物防治
阅读：1055发布：2020-06-19
专利汇可以提供植物病原性微生物的生物防治专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及分离的出芽短梗霉 酵母 菌株YBCA5用作 生物 防治剂的用途。还提供了使用YBCA5对 植物 病原性细菌和 真菌 进行 生物防治 的方法和组合物。，下面是植物病原性微生物的生物防治专利的具体信息内容。
1.分离的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)酵母菌株YBCA5(CBS登录号
141880)。
2.一种组合物，所述组合物包含YBCA5和农业上可接受的载体。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中YBCA5以有繁殖活力的细胞形式存在。
4.如权利要求3所述的组合物，其中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克约1×103CFU至约1×1014CFU，优选地约1×105CFU至约1×1011CFU，优选地约1×106CFU至约1×109CFU，优选地约1×107CFU至约1×108CFU，优选地约2×107CFU至约2×108CFU，优
9 10 7
选地约2×10 CFU至约2×10 CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×10 CFU至约1×
108CFU，优选地，对于固体组合物，每克约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约2×
107CFU。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种农业上可接受的佐剂。
6.一种在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.)细菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或如权利要求1至5中任一项所述的组合物接触。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述假单胞菌属菌种细菌的至少一种菌株是选自由以下各项组成的组的细菌的菌株：丁香假单胞菌(P.syringae)、扁桃假单胞菌(P.amygdalia)、榛色假单胞菌(P.avellanae)、番木瓜假单胞菌(P.caricapapayae)、菊巨假单胞菌(P.cichorii)、晕斑假单胞菌(P.coronafaciens)、天仙果假单胞菌(P.ficuserectae)、向日葵假单胞菌(P.helianthi)、苦楝假单胞菌(P.lemiae)、萨氏假单胞菌(P.savastanoi)以及浅绿黄假单胞菌(P.viridiflava)或其致病变种或其组合，优选的是，所述至少一种菌株是丁香假单胞菌或其致病变种，更优选的是，所述至少一种菌株是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(P.syringae pv.actinidiae)(Psa)。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述植物或其部分是选自由以下各项组成的组的农业上重要的植物、其栽培品种或其产品：农业上重要的藤本植物和农业上重要的果树以及其栽培品种和产品，优选地其中所述农业上重要的果树或其栽培品种选自橄榄树、苹果树、梨树、柑橘类果树、香蕉树、菠萝树、桃树、杏树、樱桃树、核桃树以及榛子树并且其产品分别是橄榄、苹果、梨、柑橘类水果、香蕉、菠萝、桃、杏、樱桃、核桃以及榛子，优选地其中所述农业上重要的藤本植物或其栽培品种选自马铃薯藤、甜菜根藤、菜豆藤、豌豆藤、番茄藤、黄瓜藤、甜瓜藤、浆果藤、葡萄藤以及猕猴桃藤并且其产品分别是马铃薯、甜菜根、菜豆、豌豆、番茄、黄瓜、甜瓜、浆果、葡萄以及猕猴桃，优选地其中所述农业上重要的藤本植物是猕猴桃藤或其栽培品种，并且所述产品是猕猴桃。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述猕猴桃藤选自由以下物种组成的组：绿色果肉的猕猴桃(中华猕猴桃美味变种(Actinidia chinensis var.deliciosa)、黄金猕猴桃(中华猕猴桃中华变种(A.chinensis var.chinensis))、中国卵形醋栗(革叶猕猴桃(A.coriacea))、小型猕猴桃(软枣猕猴桃(A.arguta))、北极猕猴桃(狗枣猕猴桃(A.kolomikta))、红猕猴桃(黑蕊猕猴桃(A.melanandra)、中华猕猴桃中华变种)、银藤猕猴桃(葛枣猕猴桃(A.polygama))以及紫猕猴桃(紫果猕猴桃(A.purpurea))或其栽培品种，优选地其中所述猕猴桃选自由中华猕猴桃美味变种和中华猕猴桃中华变种物种或其栽培品种组成的组，优选地其中所述猕猴桃是中华猕猴桃的物种，优选地其中所述猕猴桃是中华猕猴桃中华变种，优选地其中所述栽培品种是‘海沃德’、‘Hort16A’或‘红阳’品种栽培品种。
10.一种用于在猕猴桃植物或其部分上防治丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的方法，所述方法包括使所述猕猴桃植物或其部分与YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物接触，所述猕猴桃植物是物种中华猕猴桃美味变种或中华猕猴桃中华变种或其栽培品种。
11.一种用于增加受假单胞菌属菌种感染或易受假单胞菌属菌种感染，优选地受Psa感染，优选地易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的方法，所述方法包括向所述猕猴桃植物或其部分施用YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物。
12.一种在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物接触。
13.一种用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的方法，所述方法包括向所述水果或蔬菜植物或其部分施用YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物；以及使所述植物或其部分生长。
14.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物用于在植物或其部分上，优选地在猕猴桃植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的用途。
15.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物用于在水果或蔬菜植物或其部分上防治植物病原性真菌的用途。
16.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物或其部分的产量的用途。
17.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物或其部分的产量的用途。
18.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其用于或在使用时用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌。
19.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其用于或在使用时用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa。
20.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其用于或在使用时用于在猕猴桃植物或其部分上防治植物病原性真菌。
21.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其用于或在使用时用于增加受假单胞菌属菌种感染或易受假单胞菌属菌种感染的猕猴桃植物或其部分的产量。
22.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其用于或在使用时用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物或其部分的产量。
23.YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其用于或在使用时用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物或其部分的产量。
24.至少一种植物或其部分，其根据如权利要求7至13中任一项所述的方法或根据如权利要求14至17中任一项所述的用途用YBCA5或如权利要求1至6中任一项所述的组合物处理。
植物病原性微生物的生物防治
技术领域
[0001] 本发明大体上涉及使用酵母对植物病原性细菌和真菌进行生物防治的方法。具体来说，本发明涉及一种具有生物防治活性的新型酵母菌株以及使用这种菌株抑制植物病原性细菌和真菌在水果或蔬菜植物上存活、生长和/或增殖的方法。
背景技术
[0003] 在传统上，已经使用化学农药来进行致病性植物病原体，如细菌和真菌的防治。然而，化学品的使用存在许多缺点。随着时间推移，病原体可以并且已经对化学品产生耐受性，从而产生越来越具农药抗性的群体。化学残留物也可能造成环境危害以及引起健康关注。特别是，消费者已经变得越来越关注植物上以及食品和葡萄酒中的化学残留物以及它们对人类健康和环境的影响。
[0004] 生物防治代表了一种减少对化学品的依赖的防治植物疾病的替代手段。这样的“自然”方法享有更大的公众接受度，并且可能比化学防治方法更有效和可持续。
[0005] 假单胞菌属(Pseudomonas)是革兰氏阴性需氧γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)的属，属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)。该属含有191种有效描述的菌种，其中一些是植物病原体。在假单胞菌属菌种内，丁香假单胞菌(P.syringae)是作为超过50种不同的致病变种(pv.)存在的大量繁殖的植物病原体，其中有许多表现出高度的寄主植物特异性。许多其它假单胞菌属菌种也可以用作植物病原体，最值得注意的是丁香假单胞菌亚群的所有其它成员。举例来说，由丁香假单胞菌致病变种所引起的商业上重要的疾病包括核果类的细菌性瘟病、番茄的细菌性斑点病以及豌豆中的疫病。
[0006] 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa)是影响猕猴桃的严重细菌性疾病。Psa最初在2010年11月初在新西兰被记录，并且截至2013年7月18日，75％公顷的猕猴桃长在有一定的Psa感染的果树上。从2013年到2018年，Psa对新西兰猕猴桃行业造成的直接成本估计在31000万美元与41000万美元之间，并且是长期失去发展的超过两倍。
[0007] 如同许多细菌性植物疾病一样，防治选择方案是有限的。目前使用中的主要解决方案是作物卫生；基于化学的处理，如基于铜的产品；和/或植物防御激发子(elicitor)，如阿拉酸式苯-S-甲基(acibenzolar-S-methyl)(Actigard/Bion，先正达公司(Syngenta))；以及抗生素，如硫酸链霉素(streptomycin sulphate)和春雷霉素(kasugamycin)。然而，对这些产品的使用和可以使用它们的生长季节的时间有严格的限制(例如在新西兰)。此外，这些产品中的一些的使用在一些关键的出口地区是禁止的，例如链霉素在欧洲不容许用于园艺。
[0008] 据估计，在新西兰在2012年生长季，在喷雾剂上花费了1300万美元来保护猕猴桃对抗Psa。这仅仅是化学成本。其它管理成本没有计入该估计中。除了新西兰以外，Psa在欧洲(意大利/法国)、南美洲以及潜在地在中国和南韩也是一个至关重要的问题。
[0009] 灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和最近鉴定的假灰葡萄孢(B.pseudocinerea)是植物病原性真菌(有性型：富克葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana))并且是灰霉病(葡萄孢疫病)的致病因子。由葡萄孢属菌种造成的全球作物损失的一些估计是每年约100亿-1000亿欧元(http://www.genoscope.cns.fr)。葡萄孢属菌种也是葡萄串腐病的致病因子，并且据估计，每年仅对新西兰葡萄酒行业就造成1800万美元的损失。葡萄孢属菌种防治一直经由杀真菌剂来进行。如同使用化学处理来防治病原性细菌一样，这种做法是不可持续的，这是因为杀真菌剂抗性在许多葡萄园中很普遍并且存在减少农药残留物的消费者压力。
[0010] 水果上的褐腐病是由链核盘菌属菌种(Monilinia spp.)真菌所引起的。链核盘菌属菌种是蔷薇科(Rosaceae)中的许多经济上重要的作物的病原体，包括樱桃、李子、桃、杏、草莓、覆盆子、苹果以及梨。链核盘菌属菌种也是杜鹃花科(Ericaceae)内的许多开花植物的病原体。由链核盘菌属菌种所造成的损伤常常会对作物和珍贵的观赏花卉造成重大损失。链核盘菌属含有约三十种描述的菌种。
[0011] 重要的是，由于植物病原性真菌的影响而损失的收入仅占这些病原体在全世界范围内的总经济影响的一小部分。如同葡萄孢属一样，对经济上重要的作物上链核盘菌属菌种和核盘菌属菌种(Sclerotinia spp.)的防治在传统上一直经由杀真菌剂来进行。一些估计认为仅对葡萄孢属菌种的化学防治的成本就可以达到78000万美元而经过处理的植物上仅有一个作物患病仍然会造成显著的生产损失(Genescope,2002)；(Laluk,Kristin以及Tesfaye Mengiste；2010,Arabidopsis Book(《拟南芥书》),2010,第8卷)。
[0012] 因此，出于如上文所述的许多经济、健康以及环境可持续性原因，基于化学的处理、植物防御激发子以及抗生素的使用具有局限性。因此，需要新的生物防治解决方案，其没有与基于化学的处理相似的成本、健康或环境问题以提供对这些疾病的可持续的管理。
[0013] 本发明的目的在于提供至少一种酵母生物防治剂和/或包含至少一种酵母生物防治剂的组合物和/或使用这样的药剂和/或这样的组合物在至少一种植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌，优选的是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的方法；和/或至少向公众提供有用的选择。
发明内容
[0014] 在一个方面，本发明涉及分离的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)酵母菌株YBCA5(CBS登录号141880)。
[0015] 在另一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含分离的出芽短梗霉酵母菌株YBCA5(CBS登录号141880)和农业上可接受的载体。
[0016] 在另一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物基本上由分离的出芽短梗霉酵母菌株YBCA5(CBS登录号141880)和农业上可接受的载体组成。
[0017] 在另一个方面，本发明涉及一种在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0018] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的用途。
[0019] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0020] 在另一个方面，本发明涉及一种用于在猕猴桃植物或其部分上防治丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的方法，所述方法包括使所述猕猴桃植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0021] 在另一个方面，本发明涉及一种用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的方法，所述方法包括向所述猕猴桃植物或其部分施用YBCA5或包含YBCA5的组合物；以及使所述猕猴桃植物或其部分生长。
[0022] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa的用途。
[0023] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的用途。
[0024] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0025] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0026] 在另一个方面，本发明涉及一种在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0027] 在另一个方面，本发明涉及一种用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的方法，所述方法包括向所述水果或蔬菜植物或其部分施用YBCA5或包含YBCA5的组合物；以及使所述植物或其部分生长。
[0028] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于在水果或蔬菜植物或其部分上防治植物病原性真菌的用途。
[0029] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物或其部分的产量的用途。
[0030] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0031] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在水果或蔬菜植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0032] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于增加易受至少一种植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0033] 在另一个方面，本发明涉及经过YBCA5或包含YBCA5的组合物处理的至少一种植物或其部分。
[0034] 在另一个方面，本发明涉及经过YBCA5或包含YBCA5的组合物处理的至少一种水果或蔬菜植物或其部分。
[0035] 在另一个方面，本发明涉及经过YBCA5或包含YBCA5的组合物处理的至少一种植物或其部分。在一些实施方案中，所述植物是水果或蔬菜植物或其部分。在一个实施方案中，所述植物是猕猴桃藤、樱桃树或葡萄藤。
[0038] 意图在提到本文所公开的数值范围(例如1至10)时，也包括提到该范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9以及10)以及该范围内有理数的任何范围(例如2至8、1.5至5.5以及3.1至4.7)，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围在此被明确公开。这些只是具体意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间数值的所有可能的组合均被认为在本申请中以类似方式明确陈述。
附图说明
[0039] 现在将仅以举例方式并且参考附图来描述本发明，在所述附图中：
[0040] 图1：与水溶性颗粒制剂(YBCA5颗粒)相比，用不同浓度的新鲜发酵的YBCA5处理并且用两个剂量(每滴5×106个和每10μl液滴2×105个)的Psa接种的盆栽‘海沃德(Hayward)’幼苗上的Psa严重程度(平均叶片坏死面积)。每侧叶片使用每一个剂量的Psa的三个10μl液滴。在2014年9月18日用Psa接种之前8天和1天(1d)施用处理并且在28天之后评估。
[0041] 图2：在2016年4月，与未处理(无处理)相比，出芽短梗霉的不同分离株对盆栽猕猴桃植物(‘海沃德’)上Psa叶斑病变的严重程度的影响。
[0042] 图3：在蒂普基研究果园(Te Puke Research Orchard)暴露于天然Psa接种物并且在30天时间内施用处理四次的情况下盆栽‘海沃德’植物上具有Psa坏死的叶片的发病率。在首次处理施用之后44天进行叶片坏死评估。
[0043] 图4：田间测试YBCA5的功效。无处理是在未处理的对照植物上观测到的叶斑病的发病率。种植者标准是在经过Actigard(苯并噻二唑)和铜处理的植物上观测到的Psa叶斑病的发病率。低和高分别指的是施用于植物的YBCA4和YBCA5的量。田间试验点是马凯图(Maketu)。猕猴桃品种是‘海沃德’。在发芽与开花前之间施用所有处理。相隔6天至12天进行总共5次喷雾处理。对于图4-图8中的每一个，高施用量是2×107个细胞/毫升并且低施用量是1×107个细胞/毫升。
[0044] 图5：田间测试YBCA5的功效。无处理是在未处理的对照植物上观测到的缺陷的发病率。种植者标准是在经过Actigard和铜处理的植物上观测到的Psa叶斑病的发病率。低和高分别指的是施用于植物的YBCA4和YBCA5的量。田间试验点是马凯图。猕猴桃品种是‘海沃德’。在发芽与开花前之间施用所有处理。相隔6天至12天进行总共5次喷雾处理。
[0045] 图6：田间测试YBCA5的功效，显示了叶片坏死的平均严重程度。猕猴桃品种是‘海沃德’。种植者标准是铜+抗生素。在马凯图的两个试验点从发芽到第一次开花施用处理。总共施用6次处理(喷雾)，每一次相隔7天-14天。
[0046] 图7：田间测试YBCA5的功效，显示了芽褐变的平均严重程度。猕猴桃品种是‘海沃德’。种植者标准是铜+抗生素。在马凯图的两个试验点从发芽到第一次开花施用处理。总共施用6次处理(喷雾)，每一次相隔7天-14天。
[0047] 图8：田间测试YBCA5的功效，显示了产量的平均增加(鲜重/干物质/果实/m2)。猕猴桃品种是‘海沃德’。种植者标准是铜+抗生素。从发芽到第一次开花施用处理，在开花期间施用一次并且在果实形成后施用一次。总共施用7次处理(喷雾)，每一次相隔7天-14天。在每一个类别中：鲜重、干物质、果实/m2(金三(Gold3))以及果实/m2(‘海沃德’)，图表上从左到右的条柱描绘了无处理、种植者标准处理(铜和抗生素)以及YBCA5。
[0048] 图9：在2016年1月-2月，在基于实验室的测定(测定1)中，与杀真菌剂异菌脲(iprodione)( Aquaflo)相比，YBCA5对樱桃(‘Sweet Valentine’)的链核盘菌果腐病的发病率的影响。
[0049] 图10：在2016年1月-2月，在基于实验室的测定(测定2)中，与杀真菌剂异菌脲相比，YBCA5对樱桃(‘Sweet Valentine’)的葡萄孢属菌种果腐病的发病率的影响。
[0050] 图11：在2016年2月-3月，在基于实验室的测定(测定3)中，与杀真菌剂克菌丹(captan)相比，YBCA5对樱桃(‘Sweet Valentine’)的链核盘菌果腐病的发病率的影响。
[0051] 图12：在2016年2月-3月，在基于实验室的测定(测定2)中，与杀真菌剂克菌丹相比，YBCA5对樱桃(‘Sweet Valentine’)的葡萄孢属菌种果腐病的发病率的影响。
[0052] 图13：在2015年10月-11月，在基于实验室的测定(测定5)中，与杀真菌剂克菌丹相比，YBCA5对鲜食葡萄(‘秋日国王(Autumn King)’)的葡萄孢属菌种腐病的严重程度的影响。数据是两种葡萄孢属菌种分离株的平均值。
[0053] 图14：YBCA5对收获后由植物病原性真菌感染所引起的猕猴桃腐病的严重程度的影响。在用链格孢属菌种(Alternaria spp)、葡萄孢属菌种、刺盘孢属菌种(Colletotrichum spp.)、青霉属菌种(Penicillium spp.)或拟茎点霉属菌种(Phomopsis spp.)接种并且孵育6天之后受伤的‘红阳(Hongyang)’猕猴桃的病变尺寸(mm)。LSD(5％)＝
3.482，P fr＝<0.001。
3.482，P fr＝<0.001。
[0054] 图15：YBCA5对收获后由植物病原性真菌感染所引起的猕猴桃腐病的严重程度的影响。在用拟隐孢壳属菌种(Cryptosporiopsis spp.)接种并且孵育7天之后受伤的‘红阳’猕猴桃的病变尺寸(mm)。LSD(5％)＝1.945，P fr＝<0.001。
具体实施方式
[0055] 定义
[0056] 呈现以下定义以更好地限定本发明并且作为本领域的普通技术人员在实施本发明时的指导。
[0057] 除非另外说明，否则本文所用的所有技术和科学术语应当被理解为具有与本公开所属的相关领域的普通技术人员所了解的含义相同的含义。
[0058] 植物学、微生物学、分子生物学以及生物化学中的常见术语的定义的实例可以见于Biology of Plants(《植物生物学》),Raven等(编著),W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company),(2005)；Plant Physiology(《植物生理学》),Taiz等(编著),Sinauer Associates股份有限公司,(2010)；Botany:An Introduction to Plant Biology(《植物学：植物生物学导论》),J.D.Mauseth,Jones&Bartlett Learning公司,(2003)；Methods for General and Molecular Microbiology(《通用和分子微生物学方法》),第3版,C.A.Reddy等(编著),ASM出版社(ASM Press),(2008)；Encyclopedia of Microbiology(《微生物学百科全书》),第2版,Joshua Lederburg(编著),学术出版社(Academic Press),(2000)；Microbiology(《微生物学》),Cliffs Notes,I.Edward Alcamo,威立公司(Wiley),(1996)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology《( 微生物学和分子生物学词典》),Singleton等(第2版)(1994)；Biology of Microorganisms(《微生物生物学》),第11版,Brock等,Pearson Prentice Hall公司,(2006)；Biodiversity of Fungi:Inventory and Monitoring Methods(《真菌的生物多样性：清单和监测方法》),Mueller等,学术出版社,(2004)；Genes IX(《基因IX》),Benjamin Lewin,Jones&Bartlett Publishing公司,(2007)；The Encyclopedia of Molecular Biology(《分子生物学百科全书》),Kendrew等(编著),布莱克威尔科技有限公司(Blackwell Science Ltd.),(1994)；以及Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(《分子生物学和生物技术：综合案头参考》),Robert A.Meyers(编著),VCH出版公司(VCH Publishers,Inc.),(1995)中。
[0059] 还认为本发明的实施可以使用如本领域已知的和如例如以下文献中所述的标准植物学、微生物学、分子生物学以及生物化学方案和程序来进行：Environmental Microbiology:Methods and Protocols(《环境微生物学：方法和方案》),J.F.T.Spencer编著,胡马纳出版社(Humana Press),(2004)；Environmental Microbiology(《环境微生物学》),P.D.Sharma,阿尔法科学国际公司(Alpha Science International),(2005)；Environmental Microbiology(《环境微生物学》),J.R.Leadbetter,海湾专业出版公司(Gulf Professional Publishing),(2005)以及本公开所属领域相关的其它常用的参考材料，并且这些参考材料都以引用的方式整体并入本文。
[0060] 如本文所用的术语“植物”包括来自植物生命周期的所有阶段的完整植物和植物的所有部分，包括但不限于营养和繁殖细胞和组织、繁殖体、种子、胚芽、果实、枝条、茎、叶、叶鞘和叶片、花序、根、花粉囊、叶舌、栅栏、叶肉、表皮、叶耳、托苞、外稃以及分蘖。
[0061] 术语“猕猴桃”在本文用作来自猕猴桃属(Actinidia)的所有商业种植的水果的通用名。最常见的猕猴桃是绿色果肉的猕猴桃，来自物种中华猕猴桃美味变种(Actinidia chinensis var.deliciosa)。通常食用的其它物种包括黄金猕猴桃(中华猕猴桃中华变种(A.chinensis var.chinensis))、中国卵形醋栗(革叶猕猴桃(A.coriacea))、小型猕猴桃(软枣猕猴桃(A.arguta))、北极猕猴桃(狗枣猕猴桃(A.kolomikta))、红猕猴桃(黑蕊猕猴桃(A.melanandra)；中华猕猴桃中华变种)、银藤猕猴桃(葛枣猕猴桃(A.polygama))以及紫猕猴桃(紫果猕猴桃(A.purpurea))。
[0062] 如本文所用的术语“生物防治剂”指的是用作一种或多种植物病原体的拮抗剂的药剂。拮抗剂可以采用许多形式。在一种形式中，生物防治剂可以与病原体竞争寄主植物的可用营养素和/或空间。在另一种形式中，生物防治剂可以使环境对病原体不利。因此，拮抗剂机制包括但不限于抗生作用、真菌寄生作用、营养素竞争以及物理驱逐。
[0063] 术语“防治(control)”、“防治(controlling)”、“生物防治(biocontrol)”或“生物防治(biological control)”在本文可互换使用以指通过或经由一种或多种微生物实现的病原体的接种量或致病活性的降低。一般理解的是预防或减少植物病原性细菌或真菌的感染，特别是植物病原性假单胞菌属菌种、葡萄孢属菌种、链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种、链核盘菌属菌种以及核盘菌属菌种，特别是或抑制这样的感染的速率或程度，包括细菌或真菌的存活、生长和/或增殖的任何减少。还考虑了治愈性处理。
[0064] 如本文所用的术语“统计显著性”指的是结果或关系由除随机机会以外的事物所引起的似然性。可以使用本领域已知和使用的统计假设检验发现结果具有统计显著性。统计假设检验提供了如本领域已知的“P值”，其代表了所测量的结果仅归因于随机机会的概率。认为在本领域中普遍接受的是，5％(0.05)或更低的显著性水平被认为具有统计显著性。
[0065] 如本文所用的术语“有效量”意指有效地在植物中和/或在植物上防止、延迟、减少、稳定、改善或处理植物病原性细菌或真菌感染的量。
[0066] 如本文所用的术语“增加水果或蔬菜植物的产量”和“增加猕猴桃植物的产量”一般被理解为增加可收获的果实和/或猕猴桃的生产速率、可收获的果实和/或猕猴桃的总数(包括由于果实和/或猕猴桃数量的绝对增加或疾病症状减少引起可销售的果实数量增加)以及根据本发明处理的水果或蔬菜植物或猕猴桃植物上产生的单个果实和/或猕猴桃的尺寸的任何增加。增加一般是与未经过本发明的菌株或组合物处理的等同植物相比较来确定的。
[0067] 如本文所用的“农业上可接受的佐剂”指的是如下化合物或材料，其在农业领域中一般被理解为是农业制剂中的有用添加剂或用农业处理实施。
[0068] 如本文所用的“另外的活性剂”意指任何化合物或材料，其能够促进可用于本发明中的酵母对植物病原性假单胞菌属菌种细菌或植物病原性真菌葡萄孢属菌种、链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种、链核盘菌属菌种以及核盘菌属菌种的防治(如本文所定义)，或能够增强可用于本发明中的酵母防治由植物病原性细菌和真菌所引起的植物疾病的作用。
[0069] 如本文所用的“配制剂”指的是任何化合物或材料，其促进或优化本发明的组合物或在本发明中用于植物上(如本文所定义)的组合物的生产、处理、储存、运输、施用和/或持久性，但不限于此。
[0070] “农业上可接受的载体”在本文如本领域一般所理解的那样使用。优选的农业上可接受的载体是水，但不限于此。
[0071] 如本说明书中所用的术语“包含”意指“至少部分由……组成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的每一个语句时，除该术语之后的那个或那些特征以外的特征也可能存在。相关术语，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”将以相同方式解释。
[0072] 具体实施方式
[0073] 本发明大体上涉及一种新型出芽短梗霉酵母菌株YBCA5以及包含YBCA5和农业上可接受的载体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含农业上可接受的佐剂。本发明的新型菌株和组合物可用于对由植物病原性细菌和植物病原性真菌所引起的植物疾病进行生物防治，特别是假单胞菌属菌种细菌和葡萄孢属菌种、核盘菌属菌种、链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种以及链核盘菌属菌种真菌。本发明还涉及在植物或其部分上防治选自由以下各项组成的组的植物病原性细菌和/或真菌的方法：假单胞菌属菌种细菌、葡萄孢属菌种、核盘菌属菌种、青霉属菌种、刺盘孢属菌种、链格孢属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种以及链核盘菌属菌种真菌，所述方法是通过使所述植物或其部分与YBCA5接触而实现的。
[0074] 本发明的申请人首先提供了分离的酵母菌株YBCA5以及包含YBCA5和农业上可接受的载体的组合物，其有效地在植物上防治假单胞菌属菌种细菌和植物病原性真菌。在一些实施方案中，YBCA5或包含YBCA5的组合物还可以与农业上可接受的佐剂一起配制。本发明的申请人还首先提供了使用酵母出芽短梗霉对假单胞菌属菌种细菌进行生物防治的方法。具体来说，本发明的申请人首先证实出芽短梗霉酵母菌株或包含出芽短梗霉酵母菌株的组合物有效地在水果或蔬菜植物，特别是水果或蔬菜藤，特别是猕猴桃藤上抑制丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的存活、生长和/或增殖。
[0075] 不希望受理论所束缚，本发明的申请人认为本发明的酵母菌株和组合物的功效与所述酵母菌株竞争性排除Psa和/或植物病原性真菌、分泌一种或多种抗微生物化合物或引发植物防御机制或上述组合的能力有关。不论具体的作用方式如何，本申请的发明人已经惊人地发现YBCA5有效处理猕猴桃藤上的Psa疾病、有效处理樱桃和葡萄上的葡萄孢属菌种和链核盘菌属菌种感染以及有效处理苹果和猕猴桃上的链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种。
[0076] YBCA5是针对假单胞菌属菌种细菌和植物病原性真菌特别有效的生物防治剂。YBCA5表现出能够在配制和施用方案中存活，在经过处理的植物上快速定殖并且抑制经过处理的植物和其部分上假单胞菌属菌种细菌和植物病原性真菌的生长的能力。已经发现YBCA5特别有效地在猕猴桃藤上防治丁香假单胞菌细菌，特别是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)细菌，以及在不同程度上减轻和/或防治由葡萄孢属菌种、核盘菌属菌种、青霉属菌种、刺盘孢属菌种、链格孢属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种以及链核盘菌属菌种引起的收获后的果腐病。
[0077] YBCA5和组合物
[0078] 因此，在一个方面，本发明涉及分离的出芽短梗霉酵母菌株YBCA5(CBS登录号141880)。
[0079] 本发明的特定的分离的出芽短梗霉菌株YBCA5在2016年9月26日出于专利程序的目的依照布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏在荷兰真菌菌种保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS)(荷兰乌得勒支的乌普萨拉兰路8号(邮编：3584CT)(Uppsalalaan 8,3584,CT Utrecht,The Netherlands))。这种分离株已经被给予保藏号CBS登录号141880。
[0080] 分离的出芽短梗霉酵母菌株YBCA5是座囊菌目(Dothideales)、短梗霉科(Aureobasidiaceae)以及短梗霉属(Aureobasidum)的单细胞真菌。细胞显示出广泛的形态变异性。在马铃薯右旋糖琼脂上培养的出芽短梗霉产生光滑的淡粉红色的酵母样菌落。由于产生厚垣孢子，因此较老的菌落可能略微更暗。出芽短梗霉的初生分生孢子是单细胞的、透明的、光滑的、椭圆形的并且具有可变的形状和尺寸。出芽短梗霉分生孢子梗是未分化的、居间的或末端的，或作为短侧枝产生。内分生孢子由出芽短梗霉居间细胞产生。菌丝是薄壁的、透明的和光滑的，具有横隔膜。在10℃-35℃进行生长，最佳生长是22℃-25℃。
[0081] 在另一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含YBCA5(CBS登录号141880)和农业上可接受的载体。
[0082] 在另一个方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物基本上由YBCA5(CBS登录号141880)和农业上可接受的载体组成。
[0083] 在一个实施方案中，所述农业上可接受的载体是水。
[0084] 再次，不希望受理论所束缚，本申请的发明人认为当用作生物防治剂时，YBCA5必须呈有繁殖活力的形式。出于大多数的目的，YBCA5理想地以有繁殖活力的细胞的形式并入到组合物中。优选的是，YBCA5作为干燥细胞并入组合物中。
[0085] 本发明的组合物中细胞的浓度将取决于所述组合物的用途。认为针对特定应用优化细胞的浓度在本领域的技术范围内。
[0086] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克约1×103CFU至约1×1014CFU，优选地约1×105CFU至约1×1011CFU，优选地约16 9 7 8 7
×10 CFU至约1×10 CFU，优选地约1×10 CFU至约1×10CFU，优选地约2×10CFU至约2×
108CFU，优选地约2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至约
1×108CFU。
×10 CFU至约1×10 CFU，优选地约1×10 CFU至约1×10CFU，优选地约2×10CFU至约2×
108CFU，优选地约2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至约
1×108CFU。
[0087] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体3 14 5 11
组合物，每克1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地1×
106CFU至约1×109CFU，优选地1×107CFU至约1×108CFU，优选地2×107CFU至约2×108CFU，优选地2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升1×107CFU至约1×108CFU。
组合物，每克1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地1×
106CFU至约1×109CFU，优选地1×107CFU至约1×108CFU，优选地2×107CFU至约2×108CFU，优选地2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升1×107CFU至约1×108CFU。
[0088] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体3 14 5 11
组合物，每克约1×10CFU至1×10 CFU，优选地约1×10 CFU至1×10 CFU，优选地约1×
106CFU至1×109CFU，优选地约1×107CFU至1×108CFU，优选地约2×107CFU至2×108CFU，优选地约2×109CFU至2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至1×108CFU。
组合物，每克约1×10CFU至1×10 CFU，优选地约1×10 CFU至1×10 CFU，优选地约1×
106CFU至1×109CFU，优选地约1×107CFU至1×108CFU，优选地约2×107CFU至2×108CFU，优选地约2×109CFU至2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至1×108CFU。
[0089] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克1×103CFU至1×1014CFU，优选地1×105CFU至1×1011CFU，优选地1×106CFU至1×109CFU，优选地1×107CFU至1×108CFU，优选地2×107CFU至2×108CFU，优选地2×109CFU至2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升1×107CFU至1×108CFU。
[0090] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度对于固体组合物是每克约2×1010CFU，并且对于液体组合物是每毫升约2×107CFU。
[0091] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度对于固体组合物是每克至少2×1010CFU，并且对于液体组合物是每毫升至少2×107CFU，优选的是，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度对于固体组合物是每克2×1010CFU，并且对于液体组合物是每毫升2×107CFU。
[0092] 本发明的组合物可以包含YBCA5或基本上由YBCA5组成。
[0093] 在本发明的组合物中作为生物防治剂有效的YBCA5的浓度可以根据酵母的使用形式、植物的生理条件；病原体感染的类型、浓度和程度；温度；季节；湿度；土壤类型；生长季节中的阶段；植物的年龄；正施用的常规农药和杀真菌剂的数量和类型以及植物处理(如修剪，但不限于此)而变化。在将YBCA5配制成本发明的组合物或用于本发明的方法中的组合物时可以考虑所有因素。
[0094] 可以使用本领域已知的和如本文的实施例中所述的标准液体发酵技术制备YBCA5用于本发明中。通常在生物反应器中在对于生长来说合适的温度和pH值下在需氧条件下实现生长。典型的生长温度是10℃至30℃，优选地是15℃至28℃，优选地是25℃。不优选使用具有约36℃-38℃范围的最佳生长温度的酵母，这是因为可能存在人类健康风险。生长培养基的pH值通常是弱酸性至中性，在pH 4.0至7.0，优选地6.0。
[0095] 生长培养基可以是适用于培养短梗霉属菌种的任何本领域已知的培养基。在一个实施方案中，生长培养基是马铃薯右旋糖琼脂糖(PDA)。其它合适的生长培养基包括麦芽酵母提取物琼脂；包含糖蜜和尿素的专有液体肉汤培养基；以及包含糖、尿素、酵母提取物以及磷酸二氢铵(MAP)的专有液体生长培养基。
[0096] YBCA5的细胞可以使用常规的过滤或沉淀技术，如离心来收获或可以使用连续离心以干燥形式收获。细胞可以立即使用或储存在冷藏条件(1℃至7℃，优选地是2℃)下，或可以干燥。优选的是，将细胞干燥并且配制成干酵母颗粒。举例来说，可以使用流化床干燥器将细胞干燥，但不限于此。优选的是，干酵母颗粒包含至少90％的固体，优选地至少95％的固体，优选地约96％的固体。优选的是，细胞具有至少两年的保质期。在一个实施方案中，保质期是至少六个月，优选地是至少一年，优选地是至少两年，其中将细胞维持在冷藏条件下。优选的是，冷藏条件是10℃或更低，但是大于0℃。优选的是，冷藏条件选自由以下各项组成的组：1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃和10℃或在这样的温度范围内变化约1℃至约10℃。
[0097] 在一个实施方案中，所述组合物包含农业上可接受的佐剂。在一个实施方案中，农业上可接受的佐剂选自由另外的活性剂和配制剂组成的组。
[0098] 在一个实施方案中，所述农业上可接受的佐剂是一种或多种另外的活性剂。在一个实施方案中，所述农业上可接受的佐剂是一种或多种配制剂。
[0099] 在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种另外的活性剂和一种或多种配制剂的组合。在一些实施方案中，所述组合物被配制成预制组合物或浓缩形式。在一些实施方案中，所述组合物包括固体制剂或液体制剂。
[0100] 在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种农业上可接受的佐剂。在一个实施方案中，所述农业上可接受的佐剂选自另外的活性剂和配制剂的组。优选的是，所述一种或多种农业上可接受的佐剂是另外的活性剂。优选的是，所述一种或多种农业上可接受的佐剂是配制剂。
[0101] 在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种另外的活性剂和一种或多种配制剂的组合。
[0102] 在一些情况下，还可能期望的是，在本发明的组合物中包括一种或多种另外的活性剂，其中这样的另外的活性剂能够促进对植物病原性假单胞菌属菌种细菌或植物病原性真菌的防治(例如处理和/或预防)，所述植物病原性真菌包括葡萄孢属菌种、核盘菌属菌种、青霉属菌种、刺盘孢属菌种、链格孢属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种以及链核盘菌属菌种，但不限于此。
[0103] 用于本发明中的合适的另外的活性剂可能能够直接防治假单胞菌属菌种，特别是Psa，或植物病原性真菌，包括葡萄孢属菌种、核盘菌属菌种、青霉属菌种、刺盘孢属菌种、链格孢属菌种、拟茎点霉属菌种、拟隐孢壳属菌种以及链核盘菌属菌种(但不限于此)，或可能能够增强YBCA5防治假单胞菌属菌种，特别是Psa的生物防治作用。另外的活性剂可以被直接包括在本发明的组合物或可用于本发明中的组合物中，或可以单独施用，根据本发明的方法在适当时同时或依次施用。
[0104] 合适的另外的活性剂包括但不限于植物防御激发子，包括阿拉酸式苯-S-甲基(Actigard/Bion，先正达公司)、壬二酸、2-哌啶酸、茉莉酸、海藻混合物(Seaweed Mix)、Lema油、Foodcoat(DOMCA公司)、Fungicover(bioDURACAL agricultura公司)和布洛芬(Ibuprofen)；拮抗微生物；无机盐，包括钙盐、钾盐或钠盐；刺激剂，包括糖醛酸、甘露聚糖以及β1-3葡聚糖；抗生素；以及其它抗细菌和抗真菌化合物，包括小有机分子和无机分子。
[0105] 作为非限制性实例，可以被包括在本发明的组合物或用于本发明中的组合物中的一种另外的活性剂是植物防御激发子阿拉酸式苯-S-甲基(Actigard/Bion，先正达公司)。Actigard是具有独特的作用方式的植物激活剂，其刺激在大多数的植物物种中发现的天然系统获得性抗性响应。经由叶面施用进行施用，Actigard对靶病原体没有直接活性，但是通过诱导寄主植物抗性有助于减轻猕猴桃中的Psa症状。Actigard是呈水分散性颗粒形式的包含500g/kg阿拉酸式苯-S-甲基的组合物。
[0106] 在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种配制剂。
[0107] 在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种另外的活性剂和一种或多种配制剂的组合。
[0108] 在一个实施方案中，本发明的组合物被配制成固体制剂或液体制剂。
[0109] 在一个实施方案中，本发明的组合物可以包含一种或多种固体或液体配制剂。任何一种或多种合适的配制剂可以如本领域已知的那样使用。认为合适的配制剂的选择在本领域技术人员的技术范围内。举例来说，合适的配制剂可以是如下化合物或其它材料，其促进或优化本发明的组合物或在本发明中用于植物或其部分上的组合物的生产、处理、储存、运输、施用和/或持久性，但不限于此。
[0110] 配制剂可以特别适用于特定用途，诸如但不限于在从生产设施运输、现场储存期间或在制备最终处理混合物期间本发明的组合物或用于本发明中的组合物中包含的酵母的生物防治活性的保持和维持。配制剂还可以用于其它目的，如促进植物上的粘附性和持久性或向植物组织中的渗透，但不限于此。合适的制剂可以是单独或呈组合形式的固体、液体。特别合适的配制剂包括单独或呈各种组合形式的表面活性剂、分散剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、保湿剂、粘着剂、铺展剂、稳定剂、渗透剂、粘合剂、pH值缓冲剂以及营养素，如可以由本领域技术人员确定的那样。
[0111] 本发明的组合物可以作为即可使用的预制组合物或以浓缩的固体或液体形式提供。
[0112] 在一个实施方案中，所述组合物是具有固体或液体制剂的预制组合物。在一个实施方案中，所述预制组合物是选自粉剂、丸剂、颗粒剂以及球粒的固体制剂。在一个实施方案中，所述预制组合物是液体制剂。
[0113] 本发明的组合物或用于本发明中的组合物可以预制形式或以浓缩形式提供。如果以干燥形式提供，那么所述预制组合物可以作为粉剂、颗粒剂、丸剂或球粒提供，但不限于此。在干燥形式的情况下，组合物中的YBCA5优选地呈脱水、干燥和/或封装形式。在一些实施方案中，所述脱水、干燥和/或封装形式包括如本领域已知的另外的保护剂；例如冻干保护剂等。
[0114] 在一个实施方案中，YBCA5可以颗粒形式提供。举例来说，YBCA5可以颗粒形式提10 10 10
供，所述颗粒具有至少0.5×10 CFU/gm，优选地1×10 CFU/gm，优选地2×10 CFU/gm。在预制组合物以液体形式，特别是含水形式提供的情况下，所述组合物可以作为分散体、悬浮液、浆液、乳膏剂、糊剂或凝胶提供，但不限于此。优选的是，预制形式是作为适用于和/或适合于喷洒的含水液体形式提供的。在一个实施方案中，预制液体形式本身可以用作例如浸渍剂以对水果、蔬菜、种子或植物进行接种，包括植物插条。
供，所述颗粒具有至少0.5×10 CFU/gm，优选地1×10 CFU/gm，优选地2×10 CFU/gm。在预制组合物以液体形式，特别是含水形式提供的情况下，所述组合物可以作为分散体、悬浮液、浆液、乳膏剂、糊剂或凝胶提供，但不限于此。优选的是，预制形式是作为适用于和/或适合于喷洒的含水液体形式提供的。在一个实施方案中，预制液体形式本身可以用作例如浸渍剂以对水果、蔬菜、种子或植物进行接种，包括植物插条。
[0115] 在本发明的预制组合物中，YBCA5被配制用于植物上，特别是猕猴桃藤上。举例来说，根据需要，将酵母与使得能够喷雾施用的农业上可接受的载体液体、肥料、激发子、佐剂、润湿剂或任何其它合适的另外的试剂混合。在根据本发明的方法使用的预制组合物中，也可以根据需要将YBCA5与使得能够喷雾施用的农业上可接受的载体液体、肥料、激发子、佐剂、润湿剂或任何其它合适的另外的试剂混合。
[0116] 将YBCA5配制成本发明的预制组合物和用于向植物或其部分施用的预制组合物的最终形式被认为在本领域的技术范围内。举例来说，组合物的最终形式是使用诸如水的农业上可接受的载体配制的以形成喷雾剂、泡沫剂、浸液、注射剂、凝胶、浸渍剂或糊剂，但不限于此。在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过喷洒、浸渍、擦刷或刷涂或其组合施用于植物或其部分。优选的是，所述组合物被配制成含水悬浮液或分散体以用于喷雾或弥雾施用于猕猴桃藤、樱桃树和/或水果和葡萄藤和/或水果和/或蔬菜。
[0117] 在一个实施方案中，本发明的组合物呈浓缩形式。在一个实施方案中，所述浓缩形式是选自饼状物、粉剂、颗粒剂、丸剂以及球粒的固体形式。在一个实施方案中，所述浓缩形式是液体制剂。
[0118] 在本发明的组合物以浓缩形式提供的情况下，可能需要使用者另外配制以产生即可施用于植物或其部分的组合物。举例来说，可以将浓缩形式与各种配制剂混合以形成用于植物施用的最终组合物。优选的配制剂是水或水溶液，其中溶解(例如颗粒剂或粉剂)或稀释(例如液体悬浮液或分散体)适量的浓缩形式的组合物以获得用于向植物施用的最终组合物。
[0119] 如果YBCA5被脱水成浓缩形式，则如果用于向植物施用的组合物意图呈液体形式，那么将需要如本领域已知的再水化。再水化可以使用如本领域已知的用于将酵母再水化的常规预防措施进行；例如再水化可以有利地在20℃至25℃的温度下实现，但不限于此。
[0120] 方法——假单胞菌属菌种
[0121] 在另一个方面，本发明涉及一种在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0122] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的用途。
[0123] 在一个实施方案中，所述方法或用途包括使所述植物或其部分与有繁殖活力的YBCA5细胞接触。
[0124] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体3 14 5 11
组合物，每克约1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地约1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地约1×106CFU至约1×109CFU，优选地约1×107CFU至约1×108CFU，优选地约2×107CFU至约2×
108CFU，优选地约2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至约
1×108CFU。
组合物，每克约1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地约1×10 CFU至约1×10 CFU，优选地约1×106CFU至约1×109CFU，优选地约1×107CFU至约1×108CFU，优选地约2×107CFU至约2×
108CFU，优选地约2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至约
1×108CFU。
[0125] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克1×103CFU至约1×1014CFU，优选地1×105CFU至约1×1011CFU，优选地1×106CFU至约1×109CFU，优选地1×107CFU至约1×108CFU，优选地2×107CFU至约2×108CFU，优选地2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升1×107CFU至约1×108CFU。
[0126] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克约1×103CFU至1×1014CFU，优选地约1×105CFU至1×1011CFU，优选地约1×106CFU至1×109CFU，优选地约1×107CFU至1×108CFU，优选地约2×107CFU至2×108CFU，优选地约2×109CFU至2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至1×108CFU。
[0127] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克1×103CFU至1×1014CFU，优选地1×105CFU至1×1011CFU，优选地1×106CFU至19 7 8 7 8 9
×10CFU，优选地1×10CFU至1×10CFU，优选地2×10CFU至2×10 CFU，优选地2×10CFU至2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升1×107CFU至1×108CFU。
×10CFU，优选地1×10CFU至1×10CFU，优选地2×10CFU至2×10 CFU，优选地2×10CFU至2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升1×107CFU至1×108CFU。
[0128] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度对于固体组合物是每克约2×1010CFU，并且对于液体组合物是每毫升约2×107CFU。
[0129] 在一些实施方案中，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度对于固体组合物是每克至少2×1010CFU，并且对于液体组合物是每毫升至少2×107CFU，优选的是，本发明的组合物中YBCA5活细胞的浓度对于固体组合物是每克2×1010CFU，并且对于液体组合物是每毫升2×107CFU。
[0130] 在一个实施方案中，假单胞菌属菌种的至少一种菌株选自由以下各项组成的组：丁香假单胞菌、扁桃假单胞菌(P.amygdalia)、榛色假单胞菌(P.avellanae)、番木瓜假单胞菌(P.caricapapayae)、菊巨假单胞菌(P.cichorii)、晕斑假单胞菌(P.coronafaciens)、天仙果假单胞菌(P.ficuserectae)、向日葵假单胞菌(P.helianthi)、苦楝假单胞菌(P.lemiae)、萨氏假单胞菌(P.savastanoi)以及浅绿黄假单胞菌(P.viridiflava)或其致病变种或其组合。优选的是，所述至少一种菌株是丁香假单胞菌或其致病变种，更优选的是，所述至少一种菌株是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)。
[0131] 在一个实施方案中，所述植物或其部分选自下组：单子叶植物、双子叶植物、一年生植物、两年生植物和多年生植物、蔬菜植物或收获的蔬菜、水果植物或果树或收获的水果、开花植物或树或收获的花、谷类植物、产油植物、蛋白质植物、木本植物以及观赏植物。
[0132] 在一个实施方案中，所述植物或其部分是选自由以下各项组成的组的农业上重要的植物、其栽培品种或其产品：农业上重要的藤本植物、农业上重要的蔬菜和农业上重要的水果植物以及其栽培品种和产品。优选的是，所述农业上重要的藤本植物是猕猴桃藤或其栽培品种，并且产品是猕猴桃。
[0133] 在一个实施方案中，所述猕猴桃藤选自由以下物种组成的组：绿色果肉的猕猴桃(中华猕猴桃美味变种)、黄金猕猴桃(中华猕猴桃中华变种)、中国卵形醋栗(革叶猕猴桃)、小型猕猴桃(软枣猕猴桃)、北极猕猴桃(狗枣猕猴桃)、红猕猴桃(黑蕊猕猴桃，中华猕猴桃中华变种)、银藤猕猴桃(葛枣猕猴桃)以及紫猕猴桃(紫果猕猴桃)或其栽培品种。优选的是，所述猕猴桃选自由中华猕猴桃美味变种和中华猕猴桃中华变种物种或其栽培品种组成的组。优选的是，所述猕猴桃是物种中华猕猴桃中华变种。优选的是，所述猕猴桃是中华猕猴桃中华变种。优选的是，所述栽培品种是‘海沃德’或‘Hort16A’或‘zesy002’，非正式称为金三或‘红阳’。
[0134] 在一个实施方案中，所述栽培品种是中华猕猴桃中华变种‘Hort16A’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如USPP11066中所公开的‘Hort16A’，该USPP11066的全部内容以引用的方式并入本文。
[0135] 在一个实施方案中，所述栽培品种是中华猕猴桃美味变种‘海沃德’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如USPP6815中所公开的‘海沃德’，该USPP6815的全部内容以引用的方式并入本文。
[0136] 在一个实施方案中，栽培品种是中华猕猴桃中华变种‘红阳’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如Wang,2011和Li等,2015中所公开的‘红阳’，这些文献的全部内容以引用的方式并入本文。
[0137] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0138] YBCA5或包含YBCA5的组合物用于防治假单胞菌属菌种细菌和/或用于增加猕猴桃植物的产量的用途根据如本文所述的本发明的方法来执行。举例来说，根据如本文所述的本发明，YBCA5和其组合物可以被制备，配制并且施用于植物或其部分，特别是猕猴桃植物或其部分。
[0139] 在另一个方面，本发明涉及一种在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0140] 在另一个方面，本发明涉及一种用于增加易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的方法，所述方法包括向所述水果或蔬菜植物或其部分施用YBCA5或包含YBCA5的组合物；以及使所述植物或其部分生长。在一个实施方案中，所述组合物基本上由YBCA5组成。
[0141] 在一个实施方案中，所述至少植物病原性真菌选自由以下各项组成的组：葡萄孢属菌种、链核盘菌属菌种、核盘菌属菌种、刺盘孢属菌种、链格孢属菌种、拟隐孢壳属菌种、拟茎点霉属菌种以及青霉属菌种。
[0142] 在一个实施方案中，所述植物或其部分选自下组：单子叶植物、双子叶植物、一年生植物、两年生植物和多年生植物、蔬菜植物或收获的蔬菜、水果植物或果树或收获的水果、开花植物或树或收获的花、谷类植物、产油植物、蛋白质植物、木本植物以及观赏植物。
[0143] 在一个实施方案中，所述植物或其部分是选自由以下各项组成的组的农业上重要的植物、其栽培品种或其产品：农业上重要的藤本植物和农业上重要的果树、农业上重要的蔬菜以及其栽培品种和产品。在一个实施方案中，所述农业上重要的藤本植物是猕猴桃藤或其栽培品种，并且产品是猕猴桃。
[0144] 在一个实施方案中，所述植物或其部分是水果或蔬菜植物或其部分，所述方法包括使所述水果或蔬菜植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。在一些实施方案中，所述水果或蔬菜植物是樱桃树或葡萄藤。在一些实施方案中，所述水果植物是苹果树。
[0145] 在一个实施方案中，所述樱桃树是李属物种(Prunus spp.)或其栽培品种，优选地是欧洲甜樱桃(P.avium)或其栽培品种。优选的是，所述欧洲甜樱桃是“Sweet Valentine”品种。在一个实施方案中，其部分是花或其部分或果实或其部分。在一个实施方案中，所述水果是樱桃。
[0146] 在一个实施方案中，葡萄藤是葡萄属物种(Vinus spp.)或其栽培品种，优选地是葡萄(V.vinifera)或其栽培品种。优选的是，所述葡萄是“汤普森无籽葡萄(Thompson Seedless)”品种。在一个实施方案中，其部分是花或其部分或果实或其部分。在一个实施方案中，所述水果是葡萄。
[0147] 在一个实施方案中，苹果树是苹果属物种(Malus spp.)或其栽培品种，优选地是苹果(M.pumila)或其栽培品种。优选的是，所述苹果或其栽培品种是‘太平洋玫瑰(Pacific Rose)’品种。在一个实施方案中，其部分是花或其部分或果实或其部分。在一个实施方案中，所述水果是苹果。
[0148] Psa防治
[0149] 在另一个方面，本发明涉及一种用于在猕猴桃植物或其部分上防治丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的方法，所述方法包括使所述猕猴桃植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0150] 在另一个方面，本发明涉及一种用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的方法，所述方法包括向所述猕猴桃植物或其部分施用YBCA5或包含YBCA5的组合物；以及使所述猕猴桃植物或其部分生长。
[0151] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa的用途。
[0152] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的用途。
[0153] 在一个实施方案中，所述组合物基本上由YBCA5组成。
[0154] 在一个实施方案中，所述猕猴桃植物是物种中华猕猴桃美味变种或中华猕猴桃中华变种或其栽培品种，优选地是物种中华猕猴桃中华变种或其栽培品种。在一个实施方案中，所述猕猴桃植物是‘Hort16A’。
[0155] 在一个实施方案中，栽培品种是中华猕猴桃中华变种‘红阳’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如Wang,2011和Li等,2015中所公开的‘红阳’，这些文献的全部内容以引用的方式并入本文。
[0156] 在一个实施方案中，使植物或其部分接触足以防治Psa的时间。
[0157] 在一个实施方案中，接触包括通过施用于植物的种子、叶、茎、花、果实、树干和/或根或其部分来向所述植物或其部分施用YBCA5或包含YBCA5或基本上由YBCA5组成的组合物。优选的是，施用是通过喷洒、弥雾、浸渍、滴落、喷粉或喷淋来进行。施用可以仅进行一次或根据需要重复进行。本文还考虑了在一年中的各种时间和/或在植物生命周期的各个阶段期间施用，如由本领域技术人员确定适当的那样。
[0158] 可以在一年期间适当的时间和植物发育的适当阶段施用YBCA5，如可以由本领域技术人员确定的那样。举例来说，YBCA5可以从发芽到开花、在开花期间以及开花/果实形成期后施用，但不限于此。
[0159] 在一个实施方案中，施用是通过喷洒到叶片表面上和/或花上和/或水果上和/或蔬菜上来进行的。
[0160] 在一个实施方案中，向根施用是通过地面喷洒、机械并入或通过在以常用方式施用之前与富化剂或肥料混合来进行。
[0161] 在一个实施方案中，所述植物或其部分选自单子叶植物、双子叶植物、一年生植物、两年生植物和多年生植物、蔬菜植物或收获的蔬菜、水果植物或果树或收获的水果、开花植物或树或收获的花、谷类植物、产油植物、蛋白质植物、木本植物以及观赏植物。
[0162] 在一个实施方案中，植物或其部分是选自以下各项的农业上重要的作物植物、其栽培品种或产品：玉米植物、烟草植物、小麦植物、甘蔗植物、油菜籽植物、大麦植物、水稻植物、高粱植物、小米植物、大豆植物、莴苣植物以及卷心菜植物。
[0163] 在一个实施方案中，所述植物或其部分是选自由以下各项组成的组的农业上重要的植物、其栽培品种或其产品：农业上重要的藤本植物和农业上重要的果树以及其栽培品种和产品。优选的是，所述农业上重要的果树或其栽培品种选自橄榄树、苹果树、梨树、柑橘类果树、香蕉树、菠萝树、桃树、杏树、樱桃树、核桃树以及榛子树并且其产品分别是橄榄、苹果、梨、柑橘类水果、香蕉、菠萝、桃、杏、樱桃、核桃以及榛子。优选的是，农业上重要的藤本植物或其栽培品种选自马铃薯藤、甜菜根藤、菜豆藤、豌豆藤、番茄藤、黄瓜藤、甜瓜藤、浆果藤、葡萄藤以及猕猴桃藤并且其产品分别是马铃薯、甜菜根、菜豆、豌豆、番茄、黄瓜、甜瓜、浆果、葡萄以及猕猴桃。优选的是，所述农业上重要的藤本植物是猕猴桃藤或其栽培品种，并且产品是猕猴桃。
[0164] 猕猴桃属于植物杜鹃花目(Ericales)和猕猴桃科(Actinidiaceae)。在一个实施方案中，所述猕猴桃藤选自由以下物种组成的组：有绒毛的猕猴桃(中华猕猴桃美味变种)、黄金猕猴桃(中华猕猴桃中华变种)、中国卵形醋栗(革叶猕猴桃)、小型猕猴桃(软枣猕猴桃)、北极猕猴桃(狗枣猕猴桃)、红猕猴桃(黑蕊猕猴桃，中华猕猴桃中华变种)、银藤猕猴桃(葛枣猕猴桃)以及紫猕猴桃(紫果猕猴桃)或其栽培品种。优选的是，所述猕猴桃选自由中华猕猴桃美味变种、中华猕猴桃中华变种物种或其栽培品种组成的组。优选的是，所述猕猴桃是物种中华猕猴桃中华变种。优选的是，所述猕猴桃是中华猕猴桃中华变种。优选的是，所述栽培品种是‘海沃德’或‘Hort 16A’或‘Zesy002’或‘Zesy004’或‘红阳’品种栽培品种。
[0165] 在一个实施方案中，所述栽培品种是中华猕猴桃中华变种‘Hort 16A’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如USPP11066中所公开的‘Hort 16A’，该USPP11066的全部内容以引用的方式并入本文。
[0166] 在一个实施方案中，栽培品种是中华猕猴桃美味变种‘海沃德’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如USPP6815中所公开的‘海沃德’，该USPP6815的全部内容以引用的方式并入本文。
[0167] 在一个实施方案中，栽培品种是中华猕猴桃中华变种‘红阳’。在一个实施方案中，所述栽培品种是如Wang,2011和Li等,2015中所公开的‘红阳’，这些文献的全部内容以引用的方式并入本文。
[0168] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0169] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0170] YBCA5或包含YBCA5的组合物用于防治Psa和/或用于增加猕猴桃植物的产量的用途根据如本文所述的本发明的方法来执行。举例来说，根据如本文所述的本发明，YBCA5和其组合物可以被制备，配制并且施用于植物或其部分，特别是猕猴桃植物或其部分。
[0171] 在另一个方面，本发明涉及经过YBCA5或包含YBCA5的组合物处理的至少一种植物或其部分。在一些实施方案中，所述植物是水果或蔬菜植物或其部分。在一个实施方案中，所述植物是猕猴桃藤、樱桃树或葡萄藤。
[0172] 植物病原性真菌防治
[0173] 在另一个方面，本发明涉及一种在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。
[0174] 在另一个方面，本发明涉及一种用于增加易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的方法，所述方法包括向所述水果或蔬菜植物或其部分施用YBCA5或包含YBCA5的组合物；以及使所述植物或其部分生长。
[0175] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于在水果或蔬菜植物或其部分上防治植物病原性真菌的用途。
[0176] 在另一个方面，本发明涉及YBCA5或包含YBCA5的组合物用于增加易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物或其部分的产量的用途。
[0177] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0178] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于在水果或蔬菜植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0179] 在另一个方面，本发明涉及用于或在使用时用于增加易受至少一种植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的YBCA5或包含YBCA5的组合物。
[0180] 以下实施方案也特别被考虑用于本发明的那些方面，所述方面涉及YBCA5或包含YBCA5或基本上由YBCA5组成的组合物用于防治植物病原性真菌和/或用于增加易受植物病原性真菌感染的植物或其部分或水果或蔬菜植物或其部分的产量的用途。
[0181] 在一个实施方案中，所述植物病原性真菌选自由以下各项组成的组：葡萄孢属菌种、链核盘菌属菌种、核盘菌属菌种、刺盘孢属菌种、链格孢属菌种、拟隐孢壳属菌种、拟茎点霉属菌种以及青霉属菌种。
[0182] 在一个实施方案中，所述植物或其部分选自下组：单子叶植物、双子叶植物、一年生植物、两年生植物和多年生植物、蔬菜植物或收获的蔬菜、水果植物或果树或收获的水果、开花植物或树或收获的花、谷类植物、产油植物、蛋白质植物、木本植物以及观赏植物。
[0183] 在一个实施方案中，所述植物或其部分是选自由以下各项组成的组的农业上重要的植物、其栽培品种或其产品：农业上重要的藤本植物和农业上重要的果树、农业上重要的蔬菜以及其栽培品种和产品。在一个实施方案中，所述农业上重要的藤本植物是猕猴桃藤或其栽培品种，并且产品是猕猴桃。
[0184] 在一个实施方案中，所述植物或其部分是水果或蔬菜植物或其部分，所述方法包括使所述水果或蔬菜植物或其部分与YBCA5或包含YBCA5的组合物接触。在一些实施方案中，所述水果或蔬菜植物是樱桃树或葡萄藤。在一些实施方案中，所述水果植物是苹果树。
[0185] 在一个实施方案中，所述樱桃树是李属物种或其栽培品种，优选地是欧洲甜樱桃或其栽培品种。优选的是，所述欧洲甜樱桃是“Sweet Valentine”品种。在一个实施方案中，其部分是花或其部分或果实或其部分。在一个实施方案中，所述水果是樱桃。
[0186] 在一个实施方案中，葡萄藤是葡萄属物种或其栽培品种，优选地是葡萄或其栽培品种。优选的是，所述葡萄是“汤普森无籽葡萄”品种。在一个实施方案中，其部分是花或其部分或果实或其部分。在一个实施方案中，所述水果是葡萄。
[0187] 在一个实施方案中，苹果树是苹果属物种或其栽培品种，优选地是苹果或其栽培品种。优选的是，所述苹果是‘太平洋玫瑰’品种。在一个实施方案中，其部分是花或其部分或果实或其部分。在一个实施方案中，所述水果是苹果。
[0188] 在另一个方面，本发明涉及经过YBCA5或包含YBCA5的组合物处理的至少一种植物或其部分。
[0189] 在另一个方面，本发明涉及经过YBCA5或包含YBCA5的组合物处理的至少一种水果或蔬菜植物或其部分。
[0190] 在一个实施方案中，所述组合物基本上由YBCA5组成。
[0191] YBCA5或包含YBCA5或基本上由YBCA5组成的组合物用于防治植物病原性真菌和/或用于增加植物或其部分或水果或蔬菜植物或其部分的产量的用途根据如本文所述的本发明的方法和用途执行。举例来说，根据如本文所述的本发明，YBCA5和其组合物可以被制备，配制并且施用于植物或其部分，特别是水果或蔬菜植物或其部分，特别是樱桃树或葡萄藤。
[0192] 现在将通过参考以下实施例以非限制性方式说明本发明的各个方面。
[0193] 实施例
[0194] 实施例1：鉴定具有生物防治活性的酵母
[0195] 酵母筛选
[0196] 如下在21世纪初从来自奥塔哥(Otago)中部的杏(“Clutha Gold”)中分离出YBCA5。将新鲜的收获的杏在-20℃冷冻过夜，然后在20℃孵育长达5天。使用标准方案在适用于酵母繁殖的一般培养基上分离在所选择的杏的表面上生长的酵母或酵母样菌落。
[0197] 实施例2：丁香假单胞菌猕猴桃变种(Psa)的酵母生物防治
[0198] 一般方法
[0199] 在汉密尔顿的鲁阿库拉研究中心(Ruakura Research Centre,Hamilton)和新西兰蒂普基的蒂普基研究果园(Te Puke Research Orchard,Te Puke,New Zealand)的实验室和温室中进行基于植物的筛选测定。植物与食品(Plant and Food，PFR)测定侧重于叶面施用生物防治剂(BCA)，特别是YBCA5和其它PFR专有酵母菌株。
[0200] 佳沛(Zespri)测定26：YBCA5的剂量施用量
[0201] 本测定的目的是比较几个剂量施用量的新鲜发酵的YBCA5与配制的和干燥的YBCA5制剂对抗Psa的功效。
[0202] 植物材料
[0203] 在鲁阿库拉的PC1温室中使用在1L盆中种植的组织培养的中华猕猴桃美味变种‘海沃德’植物进行佳沛测定26。植物具有30cm-50cm的高度，每株植物并且每次处理时各自有至少4片-5片可用的叶片并且每种处理存在10株平行测定植物。
[0204] 酵母制备
[0205] 通过在10L生物反应器(Labfors)中使用无菌液体培养基(4％糖蜜和1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来获得新鲜发酵的YBCA5。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，rotorcode33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将湿沉淀物的子样品重悬并且借助于血细胞计数器确定细胞密度并且进行适当稀释以实现6×106CFU/mL、1.25×107CFU/mL、2.5×107CFU/mL以及5.0×107CFU/mL的最终喷雾浓度。
[0206] 通过将来自先前在10L发酵罐中的发酵的湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度来制备YBCA5颗粒并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
[0207] 通过将0.2g颗粒充分溶解到20mL PBSTw中来计算干燥的YBCA5颗粒中的CFU数。对该原液进行连续稀释(到10-6)并且将每一种稀释液的三个10μl液滴转移到MYA上。在25℃孵育24小时，继而在冰箱(4℃-6℃)中再孵育24小时之后，对从每一个液滴生长的酵母菌落数进行计数。通过将适量的颗粒称取到500mL水中来制备2.5×107CFU/mL的喷雾浓度。
[0208] Psa接种物制备
[0209] 将Psa培养物(分离株代码10627，生物变种3)用于本报道中包括的所有针刺和喷雾接种测定，所述Psa培养物是在2010年期间从位于蒂普基地区的受感染的中华猕猴桃中华变种‘Hort16A’猕猴桃藤分离的(Vanneste等,2013)。通过将这种Psa菌株在金氏B(King's B，KB)培养基上培养2天-3天并且通过将板用无菌蒸馏水(SDW)洗涤以收获细菌来制备目视确定为浓度>1×109CFU/mL的接种物的储备悬浮液来制备Psa接种物。将该Psa原液的子样品连续稀释并且将10μL液滴放置到新鲜KB培养基上以使得可以在两天孵育之后对CFU数/mL进行计数。为了有助于在温室(鲁阿库拉)中进行液滴接种，使用分光光度计(600nm)9
确定Psa接种物(储备溶液浓度×10CFU/mL)光密度，然后基于先前开发的校准曲线，将所述溶液用无菌PBS稀释以得到5×108CFU/mL和2×107CFU/mL的所得悬浮液。然后将佐剂Du-Wett添加到悬浮液中以得到0.03％(v/v)的最终浓度。
确定Psa接种物(储备溶液浓度×10CFU/mL)光密度，然后基于先前开发的校准曲线，将所述溶液用无菌PBS稀释以得到5×108CFU/mL和2×107CFU/mL的所得悬浮液。然后将佐剂Du-Wett添加到悬浮液中以得到0.03％(v/v)的最终浓度。
[0210] 叶片喷雾接种测定
[0211] 在2014年9月11日和18日，在用两个剂量的Psa接种前7天和1天(dbi)，施用每一个新鲜发酵的YBCA5浓度和颗粒制剂的喷雾处理以径流到已经在温室中种植在盆中的每一株植物上的所有叶片，并且使植物在喷雾密封棚中干燥。一旦干燥，就将经过喷雾处理的植物放回温室中。在用YBCA5第二次喷雾处理之后一天，即在2014年9月19日，在4片或5片所选择的叶片(避免最老和最嫩的叶片)的中肋的任一侧上成对地将Psa接种物吸移(10μL)到每一片叶片的下面上。然后，在用Psa接种之后，将植物放入PFR鲁阿库拉的密封温室中的高湿度帐篷中，持续长达三周，然后对Psa严重程度进行评分。
[0212] 测量Psa症状
[0213] 在Psa液滴接种后21天，目视估计每一个接种点的由Psa所引起的坏死面积(mm2)。为了确保一致性，只有两名工作人员进行Psa叶片严重程度评估，其中定期交叉检查严重程度分数。
[0214] 统计分析
[0215] 在自然对数变换后使用GenStat分析所有数据。呈现原始数据平均值并且统计差异是基于对数变换分析。
[0216] KRIP-BCA测定39
[0217] 本测定的目的是研究与YBCA5相比，出芽短梗霉的不同分离株的发酵、配制以及对抗Psa的功效。
[0218] 植物材料
[0219] 在鲁阿库拉的PC1温室中使用种植在1.5L盆中的组织培养的中华猕猴桃美味变种‘海沃德’植物进行KRIP-BCA测定39。植物具有30cm-50cm的高度，每株植物并且每次处理时各自有至少4片-5片可用的叶片并且每种处理存在10株平行测定植物。
[0220] 酵母制备
[0221] 通过在10L生物反应器(Labfors)中使用无菌液体培养基(4％糖蜜和1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来制备YBCA5颗粒。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，转子编码33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将该湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
[0222] 将选自大型培养物保藏中心的十二种出芽短梗霉分离株在烧瓶培养中发酵3天(在500mL锥形烧瓶中200mL的4％糖蜜、1.2g/L尿素无菌液体培养基)。通过二次取样1mL的发酵液并且在0.05M磷酸盐缓冲盐水+0.05％Tween80(PBSTw)中进行连续稀释(到10-7)来确定活菌落形成单位(CFU)数。对于每一种稀释液，将三个10μl液滴转移到麦芽酵母提取物琼脂(MYA)上。在25℃孵育24小时，继而在冰箱(4℃-6℃)中再孵育24小时之后，对该从每一个液滴生长的酵母菌落数进行计数。然后如上文对于YBCA5所述处理发酵液以形成干燥的配制的颗粒。
[0223] 通过将0.2g颗粒充分溶解到20mL PBSTw中来计算干燥颗粒中每一种出芽短梗霉分离株的CFU数。对该原液进行连续稀释(到10-6)并且将每一种稀释液的三个10μl液滴转移到MYA上。在25℃孵育24小时，继而在冰箱(4℃-6℃)中再孵育24小时之后，对该从每一个液滴生长的酵母菌落数进行计数。通过将适量的颗粒称取到500mL水中来制备用于喷雾施用的组合物。
[0224] Psa接种物制备
[0225] 将Psa培养物(分离株代码10627，生物变种3)用于本报道中包括的所有针刺和喷雾接种测定，所述Psa培养物是在2010年期间从位于蒂普基地区的受感染的中华猕猴桃中华变种‘Hort16A’猕猴桃藤分离的(Vanneste等,2013)。通过将这种Psa菌株在金氏B(KB)培养基上培养2天-3天并且通过将板用无菌蒸馏水(SDW)洗涤以收获细菌来制备目视确定为浓度>1×109CFU/mL的接种物的储备悬浮液来制备Psa接种物。将该Psa原液的子样品连续稀释并且将10μL液滴放置到新鲜KB培养基上以使得可以在两天孵育之后对CFU数/mL进行计数。为了有助于在温室(鲁阿库拉)中进行液滴接种，使用分光光度计(600nm)确定Psa接种物(储备溶液浓度×109CFU/mL)光密度，然后基于先前开发的校准曲线，将所述溶液用无菌PBS稀释以得到1×108CFU/mL的所得悬浮液。然后将佐剂Du-Wett添加到悬浮液中以得到0.03％(v/v)的最终浓度。
[0226] 叶片喷雾接种测定
[0227] 在2016年5月9日，在使用Psa(1×108CFU/mL)接种前7天(dbi)施用每一种出芽短梗霉分离株和YBCA5的喷雾处理以径流到已经在温室中种植在盆中的每一株植物上的所有叶片。包括YBCA5在内的所有出芽短梗霉处理都是以2×107CFU/mL的最终浓度施用的并且使植物在喷雾密封棚中干燥。一旦干燥，就将经过喷雾处理的植物放回温室中。在喷雾处理后七天时，即在2016年5月16日，在4片或5片所选择的叶片(避免最老和最嫩的叶片)的中肋的任一侧上成对地将Psa接种物剂量吸移(10μL)到每一片叶片的下面上。然后，在用Psa接种之后，将植物放入PFR鲁阿库拉的密封温室中的高湿度帐篷中，持续长达三周，然后对Psa严重程度进行评分。
[0228] 测量Psa症状
[0229] 在Psa液滴接种后21天，目视估计每一个接种点的由Psa所引起的坏死面积(mm2)。为了确保一致性，只有两名工作人员进行Psa叶片严重程度评估，其中定期交叉检查严重程度分数。
[0230] 统计分析
[0231] 在自然对数变换后使用GenStat分析所有数据。呈现原始数据平均值并且统计差异是基于对数变换分析。
[0232] 结果：剂量施用量测定
[0233] 图1显示YBCA5在降低‘海沃德’猕猴桃叶片上Psa症状的严重程度方面是非常有效的。与未处理的对照相比，本实验中使用的所有剂量施用量都显著降低(P<0.001)叶片坏死的严重程度。与新鲜发酵的YBCA5相比，YBCA5颗粒制剂的功效没有差异。
[0234] 结果：发酵和配制
[0235] 12种烧瓶培养的出芽短梗霉分离株的发酵产量在1.3×108CFU/mL至2.3×109CFU/mL的范围，并且烧瓶培养的YBCA5的发酵产量是3.3×108CFU/mL(表1)，这表明与YBCA5相比，一些分离株能够产生更高的发酵产量，而其它分离株产生更低的发酵产量。
[0236] YBCA5(来自10L发酵)的干燥颗粒的CFU数/g是2.3×1010，并且对于出芽短梗霉的12种分离株，干燥颗粒的CFU数/g在低的3.1×109CFU/g至2.0×1010CFU/g的范围(表1)，这表明与YBCA5相比，大多数的出芽短梗霉分离株产生更低产量的活CFU/g。
[0237] 每毫升发酵液的颗粒中的CFU数的比较(以允许更直接比较YBCA5的10L发酵和12种出芽短梗霉分离株的烧瓶培养)显示，YBCA5具有最高产量(4×108CFU/mL)，并且对于其它出芽短梗霉分离株，这在低到4.2×107CFU/mL至2.4×108CFU/mL的范围(表1)。
[0238] 表1：包括YBCA5在内的一系列出芽短梗霉分离株的发酵产量和配制产量。
[0239]
[0240]
[0241] *对于YBCA5，该数据是使用10L发酵罐发酵的三批的平均值。
[0242] **ND＝无数据。
[0243] 结果：叶片液滴接种测定：功效(KRIP-BCA 39)
[0244] 在无(仅润湿剂)处理中，平均Psa病变面积是57mm2(图2)。与无处理对照相比，一种分离株(MSB8-6-2)不显著降低(P>0.05)Psa严重程度(病变尺寸＝54mm2)。YBCA5将Psa病变面积显著减小到43mm2(功效＝25％)。本测定证实并非所有出芽短梗霉分离株都具有显著降低盆栽猕猴桃植物上的Psa严重程度的能力并且对抗Psa的功效取决于所选择的分离株。
[0245] 佳沛测定31
[0246] 本测定的目的是比较单独施用的YBCA5和与铜或Actigard结合施用的YBCA5在研究果园中暴露于天然Psa接种物的盆栽植物上防治Psa的功效。
[0247] 植物材料
[0248] 在蒂普基研究果园的遮荫室结构(区组20)中进行本测定。最初在鲁阿库拉温室，使用种植在1.5L盆中的组织培养的中华猕猴桃美味变种‘海沃德’植物来使植物生长。一旦植物具有25cm的高度，就将它们重新盆栽到2.5L盆上并且在2015年10月30日移动到鲁阿库拉遮荫室中并且连接到滴头灌溉。在2015年11月3日处理时，每一株植物具有每株植物至少4片可用的叶片并且每种处理存在15株平行测定植物。处理和叶面喷雾日期描述于表2中。
[0249] 表2：在蒂普基研究果园暴露于天然Psa接种物的盆栽‘海沃德’植物的处理方案。
[0250]
[0251] *美国的米勒化学与肥料公司(Miller Chemical&Fertilizer Corporation,USA)[0252] **美国的杜邦公司(DuPont,USA)
[0253] 酵母制备
[0254] 通过在10L生物反应器(Labfors)中使用无菌液体培养基(4％糖蜜和1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来制备YBCA5颗粒。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，转子编码33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将该湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
[0255] 所有YBCA5处理都是以2×107CFU/mL的最终浓度施用的并且使植物干燥。所制备的最终体积根据所处理的植物的大小从500mL到1升不等。
[0256] Psa接种物制备
[0257] 本项目的目的是使盆栽植物在蒂普基研究果园(区组20)暴露于Psa接种物。该区组被有Psa病史的成熟猕猴桃藤包围并且这在本测定的时间段内提供了接种物。
[0258] 叶片喷雾
[0259] 在鲁阿库拉在2016年11月3日施用第一次喷雾处理并且之后以10天-14天的时间间隔施用。(细节描述于上表2中)。用手持式泵喷雾器在即将径流之前施用所有处理。以0.7g/L施用氢氧化铜(Kocide Opti)并且以0.1g/L施用Actigard。将YBCA5与润湿剂/粘着剂佐剂Nu-Film(每500ml 250μl)一起施用。
[0260] 在2015年12月17日，通过估计所有经过处理的叶片上叶片坏死的面积百分比来进行疾病评估。
[0261] 结果：测定佳沛31
[0262] 在不存在任何处理(仅Nu-film，对照)的情况下，Psa叶斑病发病率是66％并且这由Kocide Opti(18％)、YBCA5(35％)、YBCA5和Kocide Opti(结合程序I)(15％)、YBCA5和Actigard(结合程序II)(22％)显著降低(图3)。
[0263] 本测定证实了YBCA5显著降低(P<0.05)在遮荫结构下在暴露于天然Psa接种物时盆栽植物上Psa叶斑病的发病率。尽管疾病防治的水平不如基于Kocide Opti的程序那么有效，但是所述测定证实了YBCA5可以成功地与基于铜的产品和Actigard结合而与仅铜处理相比，没有显著的功效损失。
[0264] 实施例3：植物病原性真菌的酵母生物防治
[0265] 果生链核盘菌(Monilinia fructicola)和葡萄孢属菌种的YBCA5生物防治[0266] 方法
[0267] 在新西兰汉密尔顿的植物与食品研究院鲁阿库拉研究中心(Plant and Food Research Ruakura Research Centre,Hamilton,New Zealand，PFR)的实验室中进行基于水果的筛选测定。PFR测定侧重于YBCA5和杀真菌剂对照的浸渍处理施用。
[0268] 水果材料(测定1至测定4)
[0269] 对于基于水果的测定1和测定2，在2016年1月8日在收获成熟阶段采摘并且源自于奥塔哥中部的PFR Clyde研究果园的甜樱桃(欧洲甜樱桃‘Sweet Valentine’)上进行水果的果生链核盘菌和葡萄孢属菌种接种测定。对于基于水果的测定3和测定4，在2016年1月13日进行第二次收获。
[0270] 然后对每一个樱桃进行双重洗涤过程。洗涤1由在旋转振荡器(110rpm)上在自来水中洗涤10分钟组成，之后在SDW中洗涤5分钟(洗涤2)。将所有樱桃放置到带有两张无菌纸巾的无菌塑料肉盘中的无菌黑色塑料网格上并且使其在层流罩中干燥。将每一个樱桃在处理中浸渍60秒，并且再次使其干燥，如上文所述。将40ml去离子水添加到纸巾中以确保高相对湿度，然后装入塑料袋中以在23℃孵育24小时(测定1)和48小时(测定2)以允许YBCA5处理在水果表面上建立。
[0271] 测定5水果材料
[0272] 在从加利福尼亚州进口的源自于汉密尔顿当地超市的分离的白色鲜食葡萄浆果(‘汤普森无籽葡萄’，测定5)上进行水果测定。将每一个浆果从串上分离，剩下3mm-4mm的果梗，然后进行双重洗涤过程。洗涤1由在旋转振荡器(110rpm)上在自来水中洗涤10分钟组成，之后在SDW中洗涤5分钟(洗涤2)。将所有浆果放置到带有两张无菌纸巾的无菌塑料肉盘中的无菌黑色塑料网格上并且使其在层流罩中干燥。借助于细砂纸(P220级)使每一个浆果轻微受伤，然后在处理中浸渍60秒并且再次使其干燥。
[0273] YBCA5制备(测定1至测定5)
[0274] 通过在10L生物反应器(Labfors)中使用无菌液体培养基(4％糖蜜和1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来制备YBCA5颗粒。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，rotorcode 33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将该湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
[0275] 从已经在冰箱中储存在5℃-7℃的这些水分散性颗粒来制备YBCA5处理，并且通过每升去离子水添加1g(最终浓度＝2×107CFU/ml)来制备悬浮液并且平缓搅拌以形成悬浮液。为了确保所有细胞都均匀分散并且保持悬浮，以每升0.5ml添加润湿剂(Nu-Film)。
[0276] 杀真菌剂(测定1至测定5)
[0277] 对于测定1和测定2，以0.85mL/L(针对核果中的链核盘菌属的0.75mL/L和针对浆果中的葡萄孢属的1.0mL/L的推荐田间施用量的平均值)的推荐田间施用量来制备含有500g/L的液体悬浮液。不使用润湿剂。
[0278] 对于测定3和测定4，以160毫升/升的用于核果的推荐田间施用量从Captan Flo(Nufarm NZ公司)(含有600g/L的克菌丹)制备克菌丹的液体悬浮液。不使用润湿剂。
[0279] 链核盘菌属接种物制备(测定1和测定3)
[0280] 将最初在1998年期间从位于汉密尔顿地区的受感染的桃树分离的果生链核盘菌培养物(分离株代码MFGQ3)用于本部分中包括的喷雾接种测定(基于鲁阿库拉的测定)。通过将该链核盘菌属菌株在PDA(Difco公司，Fort Richard公司)培养基上培养7天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备链核盘菌属接种物。然后使用70μm细胞过滤器过滤该储备悬浮液(以去除菌丝体碎片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到1×104个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0281] 葡萄孢属菌种接种物制备(测定2和测定4)
[0282] 将最初在21世纪从位于丰盛湾(Bay of Plenty)地区的受感染的猕猴桃分离的葡萄孢属菌种培养物(分离株代码09-2)用于本部分中包括的在樱桃上进行的喷雾接种测定。通过将该葡萄孢属菌种菌株在PDA(DIFCO公司，Fort Richard公司)培养基上培养5天-7天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备葡萄孢属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器(70μm筛网)过滤该储备悬浮液以去除菌丝体碎片，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.01％v/v)稀释到1×
105个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
105个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0283] 葡萄孢属接种物制备(测定5)
[0284] 将最初在2010年期间从奥克兰(Auckland)地区的受感染的番茄分离的两种葡萄孢属菌种培养物(分离株代码189和547)用于本测定中包括的液滴接种测定。一种分离株对两种常用的杀真菌剂(二甲酰亚胺和多菌灵(carbendazim))敏感并且另一种分离株对这些相同的杀真菌剂中的每一种具有抗性。
[0285] 通过将葡萄孢属菌种的每一种分离株在PDA(DIFCO公司，Fort Richard公司)培养基上培养5天-7天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.01％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备葡萄孢属菌种接种物。然后使用细胞过滤器(70μm筛网，Falcon公司)过滤该储备悬浮液以去除菌丝体碎片，使用血细胞计数器确定浓度并且调整到所需的浓度(2×104个分生孢子/毫升)，这相当于每一个10μL液滴中有200个分生孢子。为了确保分生孢子悬浮液保留在受伤浆果表面上，通过将1mm-2mm厚的石蜡层涂抹到载玻片上，将1mL移液器吸头的基部轻拍到石蜡层上，然后将该‘石蜡环’转移到伤口表面上来在伤口表面周围产生石蜡‘蜡堤’。这有效产生5mm-6mm直径的石蜡环(‘堤’)，其保留了分生孢子悬浮液并且防止它从圆形浆果表面上滚落。然后将受伤的和经过处理的浆果用葡萄孢属菌种分生孢子悬浮液的10μL液滴接种。
[0286] 在病原体接种之后，在实验室工作台上在23℃(测定1-测定4)或21℃(测定5)将盘中所有经过接种的水果样品装入塑料袋中48小时。对于所有樱桃和浆果测定，在上面放有浆果的塑料网格下面放置两张无菌纸巾，然后用40mL SDW润湿并且将每一个盘装入干净的塑料袋中，然后密封以在前72小时内维持高相对湿度。之后，去除袋，在盘上折叠(以确保盘的每一端都是开放的以获得足够的空气流量)，以使相对湿度在15小时期间(傍晚5pm到第二天早上8am)下降，之后，将它们重新密封。在实验的持续时间内重复该在孵育室内交替相对湿度的过程并且这是已经被证实避免过度菌丝体生长的方法。在5天孵育之后，记录具有典型的链核盘菌属菌种或葡萄孢属菌种症状的水果并且从每一个平行测定盘中去除。每天记录腐病并且在13天(测定1和测定2)、16天(测定3和测定4)以及9天(测定5)之后得到累积链核盘菌属菌种或葡萄孢属菌种腐病的发病率(％)。在测定5中，通过对葡萄孢属菌种分生孢子梗覆盖的浆果表面的比例进行目视评分来针对每一种处理确定葡萄孢属菌种感染的严重程度。
[0287] 苹果中刺盘孢属菌种和青霉属菌种的YBCA5生物防治
[0288] 苹果测定6和7
[0289] 苹果水果(‘太平洋玫瑰’)源自于霍克斯湾(Hawkes Bay)的有机果园并且将其在10L桶中在流动的自来水中洗涤。然后将苹果在生物危害防护罩中干燥约1.5小时，在45分钟之后将它们转动，然后用浸泡在乙醇中的纸巾擦拭并且使其再次干燥。然后将苹果放置到内衬塑料蛤壳式容器底部的润湿的纸巾上，每个容器有两个苹果。在测定6和测定7中每一种处理有10个平行测定苹果。
[0290] 存在五种处理：无处理对照(0.05％Tween80)、杀真菌剂(0.5mL/L的Prolific(含有500g/L多菌灵))、在病原体之前24小时以1×107CFU/mL施用的YBCA5、在病原体之前2小时以1×107CFU/mL施用的YBCA5以及仅病原体(对于测定6，是刺盘孢属菌种并且对于测定7，是青霉属菌种)。通过在10L生物反应器(Labfors)中使用无菌液体培养基(4％糖蜜和
1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来制备YBCA5颗粒。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以
5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，rotorcode 33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将该湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来制备YBCA5颗粒。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以
5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，rotorcode 33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将该湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
[0291] 从已经在冰箱中储存在5℃-7℃的这些水分散性颗粒来制备YBCA5处理，并且通过7
每升去离子水添加0.5g(最终浓度＝1×10CFU/mL)来制备悬浮液并且平缓搅拌以形成悬浮液。
每升去离子水添加0.5g(最终浓度＝1×10CFU/mL)来制备悬浮液并且平缓搅拌以形成悬浮液。
[0292] 从在PDA上生长的刺盘孢属菌种和青霉属菌种的培养物制备病原体孢子悬浮液。从PDA皮氏培养皿(Petri dish)中去除三分之一的培养物并且转移到容纳30mL SDW(含有
0.05％Tween80)的50mL Falcon管中。将其剧烈振荡1分钟以将孢子移入悬浮液中，然后通过70μ的细胞过滤器以去除任何菌丝体碎片。利用血细胞计数器的辅助计算孢子浓度并且进行稀释以实现1×105个孢子/毫升的最终浓度。
0.05％Tween80)的50mL Falcon管中。将其剧烈振荡1分钟以将孢子移入悬浮液中，然后通过70μ的细胞过滤器以去除任何菌丝体碎片。利用血细胞计数器的辅助计算孢子浓度并且进行稀释以实现1×105个孢子/毫升的最终浓度。
[0293] 在洗涤和制备苹果的当天(第1天)，在每一个苹果的侧面制作小伤口(3mm直径×2mm-3mm深度)并且编号为处理3。将YBCA5悬浮液的10μL等分试样添加到伤口中，足以填充所述伤口。在第二天(第2天)，再制作4个伤口并且编号为处理1、处理2、处理4以及处理5。通过将每一种溶液的10μL等分试样添加到对应的伤口中来将处理1、处理2以及处理4施用于伤口。在2小时后，通过将刺盘孢属菌种的10μL等分试样添加到每一个伤口(处理2、处理3、处理4以及处理5)(测定6)以及将青霉属菌种的10μL等分试样添加到每一个伤口(处理2、处理3、处理4以及处理5)(测定7)来施用病原体。将另外30mL的SDW添加到每一个蛤壳式容器中的纸巾上以维持相对湿度并且将容器在Sanyo孵育箱中在23℃孵育1周-2周以允许发生腐病。
[0294] 在8天之后使用数字卡尺测量腐病的病变直径。通过从每一个测量值中减去3mm来针对伤口的直径校正病变尺寸，然后使用Genstat进行方差分析以基于最小显著性差异检验处理差异。
[0295] 实验设计
[0296] 樱桃测定(测定1-测定4)由每个平行测定10个樱桃组成并且按照随机区组布局，每一种处理有六个平行测定(测定1和测定2)和八个平行测定(测定3和测定4)。
[0297] 葡萄浆果测定(测定5)由每个平行测定五个浆果组成并且按照随机区组布局，每一种处理有四个平行测定。
[0298] 统计分析
[0299] 使用GenStat第13版，用随机区组实验设计和方差分析来分析数据。将平均水果感染(发病率％)进行对数变换以均衡方差以更好地满足分析的正态假设。呈现了原始数据平均值和最小显著性差异(LSD)，然而，所有统计比较都是基于对数分析。
[0300] 樱桃接种测定的结果
[0301] 测定1
[0302] 图9总结了YBCA5对樱桃中的链核盘菌属果腐病的作用。无处理中的链核盘菌属果腐病的发病率是50％并且尽管YBCA5(34％)和异菌脲处理(22％)具有更低的链核盘菌属发病率，但是这些与无处理相比不是显著性降低(图9)。
[0303] 测定2
[0304] 图10总结了YBCA5对樱桃中的葡萄孢属菌种果腐病的作用。无处理中葡萄孢属菌种果腐病的发病率是35％并且这在YBCA5(24％)和异菌脲处理(22％)中没有显著(P>0.05)降低(图10)。
[0305] 测定3
[0306] 图11总结了在另一个测定(测定3)中YBCA5对樱桃中的链核盘菌属果腐病的作用。在无处理中链核盘菌属果腐病的发病率是88％并且这没有由YBCA5显著(P>0.05)降低(59％)。与无处理相比，克菌丹杀真菌剂处理(12％)显著降低(P<0.001)链核盘菌属果腐病的发病率(图11)。
[0307] 测定4
[0308] 图12总结了在另一个测定中YBCA5对樱桃中的葡萄孢属菌种果腐病的作用。在无处理中葡萄孢属菌种果腐病的发病率是67％并且这在YBCA5(49％)和克菌丹处理(43％)中没有显著降低(P>0.05)(图12)。
[0309] 葡萄接种测定的结果
[0310] 测定5
[0311] 图13总结了在另一个测定(测定5)中YBCA5对鲜食葡萄中的葡萄孢属菌种果腐病的作用。在无处理中葡萄孢属菌种果腐病的发病率是30％并且这由YBCA5(7％)和克菌丹处理(10％)显著(P<0.001)降低(图13)。
[0312] 其它疾病的处理：苹果测定6和7的苹果结果
[0313] 测定6
[0314] 未处理的刺盘孢属对照中的平均病变尺寸是10.1mm并且这在杀真菌剂和两种YBCA5处理中显著(P<0.05)减小(表3)。
[0315] 在病原体之前24小时施用YBCA5比在病原体之前2小时施用提供更好的保护。
[0316] 表3：在用刺盘孢属菌种孢子(1×105个孢子/毫升)接种之前用杀真菌剂和YBCA5处理并且在23℃孵育8天之后评估的受伤苹果(“太平洋玫瑰”)上的平均病变尺寸。
[0317]
[0318] 后跟不同字母的处理平均值显示出显著性差异。
[0319] 测定7：
[0320] 未处理的青霉属对照中的平均病变尺寸是15.2mm并且这在杀真菌剂和两种YBCA5处理中显著(P<0.05)减小(表4)。类似于先前的测定，在病原体之前24小时施用YBCA5比在病原体之前2小时施用YBCA5提供显著更好的保护。
[0321] 表4：在用青霉属菌种孢子(1×105个孢子/毫升)接种之前用杀真菌剂和YBCA5处理并且在23℃孵育8天之后评估的受伤苹果(“太平洋玫瑰”)上的平均病变尺寸。
[0322]
[0323] 后跟不同字母的处理平均值显示出显著性差异。
[0324] 测定8：‘红阳’猕猴桃上由植物病原性真菌引起的收获后腐病
[0325] 来自中国的最重要的出口栽培品种是‘红阳’并且这种红色和黄色果肉的栽培品种受到一系列收获后病原体的攻击，包括青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、拟隐孢壳属菌种以及葡萄孢属菌种。
[0326] 我们研究了作为伤口保护剂施用的YBCA5对抗水果的一系列收获后真菌病原体的功效，特别是：青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、拟隐孢壳属菌种以及葡萄孢属菌种。
[0327] 进行初步测试以确定在不存在任何处理的情况下受伤之后使水果腐烂所需的每一种病原体的浓度。
[0328] 方法
[0329] 在新西兰汉密尔顿的植物与食品研究院鲁阿库拉研究中心(PFR)的实验室中进行基于猕猴桃‘红阳’的筛选测定(测定8和测定9)。PFR测定侧重于YBCA5处理的伤口施用，使用市售的生物防治处理和杀真菌剂作为比较对照。
[0330] 水果材料(测定8)
[0331] 对于基于水果的测定8和9，‘红阳’猕猴桃在2017年4月12日源自于莫图依卡(Motueka)的PFR里瓦卡研究果园(Riwaka Research Orchard)。在收获成熟阶段采摘的‘红阳’猕猴桃上进行青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、链格孢属菌种、刺盘孢属菌种、拟隐孢壳属菌种以及葡萄孢属菌种接种测定。
[0332] 在从1℃的冷藏库中取出之后，对每一个水果进行三重洗涤过程。洗涤1由在70％乙醇中洗涤30秒组成，然后在旋转振荡器(80rpm，洗涤2)上在自来水中洗涤10分钟，继而最终在SDW中洗涤5分钟(洗涤3)。将所有水果放置到带有两张无菌纸巾的无菌塑料肉盘中的无菌黑色塑料网格上并且使其在层流罩中干燥过夜。
[0334] 处理和施用量详述于下文中。
[0335]
[0336] *YBCA5和Serenade Opti在Tween 80(0.05％)中制备，Rovral Aquaflo在去离子水中制备。
[0337] 对于测定8和测定9，将两张无菌纸巾放置在Plix切口下面，用40mL SDW润湿并且将每一个水果放置在一次性午餐盒(Plix Extra Deep 45/45，容纳五个Plix水果切口以防止水果移动)中，密封，然后放入大(40L)塑料箱中，将这些塑料箱封闭以确保在前24小时内保持高相对湿度并且在实验室工作台上在24℃孵育。在24小时之后，将Plix午餐盒从箱中取出并且将每一种真菌病原体的10μl悬浮液吸移到经过处理的伤口中。将所有午餐盒都重新密封并且放回大塑料箱中以确保在随后48小时内保持高相对湿度。在此之后，将Plix午餐盒从大塑料箱中取出，并且将插销放置在Plix盒盖与基部之间以允许一些空气循环并且相对湿度在15小时期间(傍晚的5pm到第二天早上8am)下降，之后，再次将它们重新密封。在实验的持续时间内重复该在孵育室内交替相对湿度的过程并且这是已经被证实避免过度菌丝体生长的方法。在6天(链格孢属菌种、葡萄孢属菌种、青霉属菌种、拟茎点霉属菌种、刺盘孢属菌种)和7天(拟隐孢壳属菌种)之后，通过测量水果沿轴线的病变长度(mm)来针对每一种处理评估真菌腐病的严重程度。数据表示为平均病变长度，减去伤口的初始宽度(3mm)。
[0338] YBCA5制备(测定8和测定9)
[0339] 通过在10L生物反应器(Labfors)中使用无菌液体培养基(4％糖蜜和1.2g/L尿素)将酵母发酵3天来制备YBCA5颗粒。将发酵液在离心机(Sorvall RC-5C)中以5000rpm旋转15分钟(转子编号：SLC-4000，转子编码33)以在弃去上清液之后获得细胞浓缩物的湿沉淀物。将该湿沉淀物与约30％(w/w)玉米淀粉混合以形成硬面团稠度并且将其通过钢丝网(3mm孔径)挤出并且在层流罩中干燥过夜(20℃-25℃)以形成干燥的颗粒。
[0340] 从已经在冰箱中储存在5℃-7℃的这些水分散性颗粒来制备YBCA5处理，并且通过每升去离子水添加0.5g(最终浓度＝1×107CFU/ml)来制备悬浮液并且平缓搅拌以形成悬浮液。
[0341] 收获后病原体制备
[0342] 链格孢属菌种接种物制备(测定8)
[0343] 将最初在2016年期间从来自奥塔哥中部的受感染的樱桃水果分离的链格孢属菌种培养物(分离株代码＝‘Alternaria ex cherry’)用于本测定的伤口接种部分。通过将该链格孢属菌种菌株在燕麦粉琼脂培养基上培养21天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备链格孢属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器过滤该储备悬浮液(以去除菌丝体碎片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到2×104个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0344] 葡萄孢属菌种接种物制备(测定8)
[0345] 将最初在21世纪从位于丰盛湾地区的受感染的猕猴桃分离的葡萄孢属菌种培养物(分离株代码09-2)用于本部分中包括的在樱桃上进行的喷雾接种测定。通过将该葡萄孢属菌种菌株在燕麦粉琼脂培养基上培养12天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备葡萄孢属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器(70μm筛网)过滤该储备悬浮液以去除菌丝体碎片，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.01％v/v)稀释到1×105个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0346] 刺盘孢属菌种接种物制备(测定8)
[0347] 将最初在2017年期间从来自鲁阿库拉研究果园的受感染的金三猕猴桃分离的刺盘孢属菌种培养物(分离株代码＝‘ex G3’)用于本测定的伤口接种部分。通过将该刺盘孢属菌种菌株在PDA(Difco公司，Fort Richard公司)培养基上培养21天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备刺盘孢属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器过滤该储备悬浮液(以去除菌丝体碎片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到2×104个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0348] 青霉属菌种接种物制备(测定8)
[0349] 将最初在2017年从来自超市的受感染的柠檬水果分离的青霉属菌种培养物(分离株代码＝‘Penicillium ex lemon’)用于本测定的伤口接种部分。通过将该青霉属菌种菌株在PDA(Difco公司，Fort Richard公司)培养基上培养12天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备青霉属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器过滤该储备悬浮液(以去除菌丝体碎片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到2×104个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0350] 拟茎点霉属菌种接种物制备(测定8)
[0351] 将最初在2017年期间从来自鲁阿库拉研究果园的受感染的金三猕猴桃分离的拟茎点霉属菌种培养物(分离株代码＝‘Phomopsis ex G3’)用于本测定的伤口接种部分。通过将该拟茎点霉属菌种菌株在PDA(Difco公司，Fort Richard公司)培养基上培养21天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备拟茎点霉属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器过滤该储备悬浮液(以去除菌丝体碎4
片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到2×10 个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到2×10 个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0352] 拟隐孢壳属菌种接种物制备(仅测定9)
[0353] 将最初从来自蒂普基研究果园的受感染的金三猕猴桃分离的拟隐孢壳属菌种培养物(分离株代码＝‘Cryptosporiopsis ex G3’)用于测定9中的伤口接种。通过将该拟隐孢壳属菌种菌株在PDA(Difco公司，Fort Richard公司)培养基上培养28天并且通过将板用SDW加Tween 80(0.05％)洗涤来收获分生孢子以制备接种物的储备悬浮液来制备拟隐孢壳属菌种接种物。然后使用70μm细胞过滤器过滤该储备悬浮液(以去除菌丝体碎片)，使用血细胞计数器确定浓度，然后通过用SDW+Tw 80(0.05％)稀释到2×104个分生孢子/毫升的最终浓度来调整。
[0354] 在测定8和测定9中病原体接种之后，将所有经过接种的水果样品都放置在一次性午餐盒(Plix Extra Deep 45/45，其容纳五个Plix水果切口以防止水果移动)中，并且将40mL SDW添加到放置在Plix切口下面的两张无菌纸巾上，然后放入大(40L)塑料箱中，将这些塑料箱封闭以确保在前48小时内保持高相对湿度并且在实验室工作台上用自然光和荧光灯在24℃孵育长达3天。在48小时之后，将Plix午餐盒从箱中取出，并且将插销放置在盖与基部之间以允许空气循环并且相对湿度在15小时期间(傍晚的5pm到第二天早上8am)下降，之后，再次将它们重新密封。在实验的持续时间内重复该在孵育室内交替相对湿度的过程并且这是已经被证实避免过度菌丝体生长的方法。在6天至7天之后，通过测量水果沿轴线的病变长度(mm)针对每一种处理评估真菌腐病感染的严重程度。数据表示为平均病变长度，减去伤口的初始宽度(3mm)。
[0355] 实验设计
[0356] 猕猴桃‘红阳’测定8由每个平行测定4个‘红阳’猕猴桃组成并且按照随机区组布局，每一种处理有五个平行测定。总共存在22种处理，包括无处理(无伤口和无处理)无病原体接种对照和无处理(加上伤口，然后SDW+Tw80)无病原体接种对照。
[0357] 在测定9中
[0358] 猕猴桃‘红阳’测定9由每个平行测定4个‘红阳’猕猴桃组成并且按照随机区组布局，每一种处理有四个平行测定。总共存在5种处理，包括无处理(无伤口和无处理)无病原体接种对照和无处理(加上伤口，然后SDW+Tw80)无病原体接种对照。
[0359] 统计分析
[0360] 使用GenStat第13版，用随机区组实验设计和方差分析来分析数据。平均病变直径不需要数据变换以均衡方差并且呈现了原始数据平均值和最小显著性差异(LSD)。
[0361] 结果
[0362] 测定8
[0363] 当将水果用链格孢属、刺盘孢属、青霉属以及拟茎点霉属接种时，与Rovral Aquaflo、Serenade Opti处理以及未处理对照相比，YBCA5处理的水果在‘红阳’水果中具有显著更小的病变。当将水果用葡萄孢属菌种接种时，YBCA5处理的水果具有不显著小于Rovral Aquaflo的病变，但是它们显著小于Serenade Opti处理和未处理对照。
[0364] 当将水果用葡萄孢属菌种和青霉属菌种接种时，Rovral Aquaflo处理的水果具有显著小于未处理对照的病变。当将水果用拟茎点霉属接种时，Serenade Opti处理的水果具有显著小于未处理对照的病变(图14)。
[0365] 在测定9中，当将水果用拟隐孢壳属接种时，与Rovral Aquaflo、Serenade Opti处理以及未处理对照相比，YBCA5处理的水果在‘红阳’水果中也具有显著更小的病变(图15)。
[0366] 讨论
[0367] 在将病原体引入伤口之前24小时允许YBCA5在相同的伤口部位定殖时YBCA5对一系列收获后猕猴桃水果病原体显示出活性。制作伤口作为实验技术很好地证实了一些生物农药的活性。
[0368] 总体而言，Rovral Aquaflo在这些实验中表现不佳，并且这种农用化学品可能不适用于伤口保护测定以及对抗本研究中使用的病原体。
[0369] Serenade Opti在这些测定中表现不佳，并且这种生物农药可能不适合作为受伤水果伤口保护剂对抗这些测定中使用的病原体。
[0370] 实施例5：田间PSA的酵母生物防治
[0371] 概要
[0372] 种植者标准处理：Kocide Opti+1×Kasumin
[0373]1 产品： 2 活性成分(AI)
3 Kocide： 4 氢氧化铜
5 Kasumin： 6 春雷霉素
7 ActiGard： 8 阿拉酸式苯-S-甲基
3 Kocide： 4 氢氧化铜
5 Kasumin： 6 春雷霉素
7 ActiGard： 8 阿拉酸式苯-S-甲基
[0374] 方法：在发芽时向所有植物施用铜，处理组然后接受酵母处理，而对照分别不接受处理和接受种植者标准。
[0375] 田间试验2015年-2016年
[0376] 方法
[0377] 在2015年春季期间建立两个田间试验点，意图跨越连续两个季节。两个‘海沃德’区组(编码的区组B和区组C)位于单独的果园，接近丰盛湾的马凯图。区组C是与2014-15试验相同的果园，但是使用区组中不同的区域。所有区组中的藤都经过藤架培植，每个海湾有单个藤。所述藤在试验开始时大体上看起来很健康，但是根据种植者的说法，在2年-3年前遭受了显著的Psa症状。
[0378] 将喷雾处理施用于以随机区组设计布置的单个藤(每种处理八个平行测定)。所述处理是：
[0379] 1.无处理：在生长季节期间不施用Psa防治产品
[0380] 2.种植者标准：基于铜的叶面喷雾程序，包括最多一种抗生素喷雾
[0381] 3.YBCA5：基于酵母的叶面喷雾程序(2×107CFU/mL)
[0382] 根据表5中的时间表施用种植者标准和YBCA5处理中的喷雾施用。将常见的农业佐剂添加到种植者标准(0.04％ )和YBCA5(0.03％ )施用中。
[0383] 表5：在2015年-2016年季节期间从发芽到开花后用于猕猴桃对抗丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的种植者标准和YBCA5处理在区组B和区组C中的施用日期。
[0384]
[0385]
[0386] 1 OptiTM以70g/100L与 (0.04％)一起施用。
[0387] 2YBCA5以100g/100L与 (0.03％)一起施用。
[0388] 3 以500g/100L施用(无佐剂)。
[0389] 通过液体发酵产生YBCA5酵母，源自于三个单独的生产设施：PFR(鲁阿库拉)、AgResearch(林肯(Lincoln))以及Callaghan Innovation(下哈特(Lower Hutt))。将离心之后的浓缩酵母沉淀物供应到鲁阿库拉的实验室并且将其与惰性载体混合并且挤出形成颗粒，将这些颗粒在层流罩中风干过夜。通过将0.2g样品溶解到20mL用0.05％Tween 80改良的磷酸盐缓冲盐水(PBSTw)中来计算菌落形成单位数/克。将其连续稀释并且将每一种稀释液的10μL液滴转移到具有用氯霉素改良的麦芽酵母提取物琼脂的皮氏培养皿中。将皮氏培养皿在25℃孵育24小时，然后在4℃-6℃再孵育24小时，之后对菌落数进行计数。颗粒中YBCA5的浓度是2.1×1010CFU/g。将所有颗粒在气密容器中储存在冰箱(4℃-6℃)中并且以100g/100L的施用量称出以实现2×107CFU/mL的目标喷雾浓度。
[0390] 在2015年11月11日在‘海沃德’区组中在即将开花之前通过目视评估叶片的Psa斑点严重程度(具有坏死的叶片面积％)来进行Psa疾病评估。对定位于从主警戒线向外第二线与第三线之间的叶片进行评估。在从小区边缘迈出一步(即1m)之后开始评估并且对一组25片叶片进行评分。在沿小区向下迈出另一步之后重复该过程。然后沿藤的另一侧向下重复该过程以使得在每一个小区内对四组25片叶片(总数＝100片)进行评分。类似地，如上文所述，对100个芽/小区的芽褐变的严重程度进行评分。
[0391] 数据表示为Psa发病率(基于带有Psa斑点的叶片的比例/带有褐色萼片的芽的比例)和平均Psa严重程度(平均坏死叶片面积％/芽上褐色萼片的平均数)。将数据进行对数变换并且使用Genstat(第16版)通过方差分析进行分析以确定处理差异。呈现原始数据，所示的统计差异是基于对数变换的数据。还在检查任何显著的试验点×处理相互作用之后，通过组合来自这两个果园试验点的数据进行分析。
[0392] 结果
[0393] 对有叶斑病(坏死)的叶片的发病率和严重程度以及类似地对芽症状的分析表明没有显著的处理×果园相互作用；因此，数据被呈现为两个果园(区组B和区组C)的平均值。
[0394] 无处理对照具有50％的具有坏死的叶片的平均发病率，并且这由Kocide Opti和两种YBCA5处理显著降低(P<0.05)(表6)。YBCA5的功效是33％。种植者标准处理(Kocide Opti+Kasumin)具有74％的功效并且与YBCA5和Kocide Opti处理相比，引起具有坏死的叶片的发病率的进一步显著降低。
[0395] 在无处理对照中，叶斑病的平均严重程度仅是0.24％(表6)。然而，与无处理对照相比，在包括两种YBCA5处理在内的处理中的每一种中，叶片坏死的平均严重程度仍然显著降低(P<0.05)。YBCA5的平均功效是58％，相比之下，种植者标准和Kocide Opti处理分别具有91％和73％的功效。
[0396] 在无处理对照中具有坏死萼片的花芽的发病率是61％并且这由所述处理中的每一种显著(P<0.05)降低(表6)。两种YBCA5处理具有39％和37％的具有坏死的芽的发病率和38％的平均功效。与其它处理中的每一种相比，种植者标准处理具有显著(P<0.05)更少的芽坏死(13％)(功效79％)。Kocide Opti处理具有40％的功效。
[0397] 在无处理对照中芽坏死的平均严重程度(坏死萼片数/芽)是1.29，并且类似于具有坏死的芽的发病率，这由所述处理中的每一种显著(P<0.05)降低，种植者标准处理(0.21，功效＝84％)提供了最大的降低(表6)。YBCA5处理的平均功效是46％并且这类似于Kocide Opti处理(功效38％)。
[0398] 表6：与基于 和 OptiTM的种植者标准叶面处理和仅Kocide Opti相比，在区组B和区组C中在叶面施用YBCA5后中华猕猴桃美味变种‘海沃德’藤上叶斑病和芽褐变的平均发病率和严重程度(在2015年11月11日评估)。
[0399]
[0400] 种植者标准是 的一次施用和 OptiTM的三次施用，在Du(0.04％v/v)中施用。
[0401] YBCA5是在 (0.03％v/v)中以100g/100L施用的配制的开发生物防治剂。
[0402] 通过组合来自两个果园试验点的数据进行分析
[0403] *其中在这些疾病评估之前1天向小区土壤施用木霉属(Trichoderma)的处理[0404] LSD是最小显著性差异(P<0.05)
[0405] 后跟相同字母的平均值彼此没有显著性差异(P<0.05)。
[0406] 田间试验2016年-2017年
[0407] 方法
[0408] 在冬季的几个月期间，种植者施用他的Kocide Opti标准冬季喷雾程序并且在春季，将与上述相同的处理施用于相同的藤。喷雾施用开始于在发芽早期(2016年10月2日)种植者在试验区组上施用Kocide Opti，在这之后是表7中概述的时间表，其中无处理对照小区不接受喷雾施用。在这两个田间试验中还继续进行木霉属处理。
[0409] 在该季节中使用的YBCA5酵母颗粒是由制造公司e-nema有限公司通过液体发酵和流化床干燥作为商业前批次(YBCA5e-nema-2)生产的。YBCA5的颗粒在2016年9月23日进口到新西兰并且在气密容器中储存在4℃-6℃直到需要处理施用为止。这些颗粒在2016年9月26日具有平均3×1010CFU/g并且在2016年11月2日测试活力时具有平均2.6×1010CFU/g。
[0410] 该季节的YBCA5施用量被设定在50g/100L的可能商业施用量(以实现1×107CFU/mL的最低浓度)并且不针对颗粒中的实际活力进行调整，这表明实际施用剂量在1.25-1.5×107CFU/mL的范围。如对于前一季节(上述)所述对叶片和芽进行疾病评估。
[0411] 表7：在2016年-2017年季节期间从发芽到开花后用于猕猴桃对抗丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的种植者标准和YBCA5处理在区组B和区组C中的施用日期。
[0412]
[0413]
[0414] 1 OptiTM以70g/100L与 (0.04％)一起施用。
[0415] 2YBCA5以50g/100L与 Xtra(0.06％)一起施用。
[0416] 3 以500g/100L施用(无佐剂)。
[0417] 在‘海沃德’区组中在2016年11月11日即将开花之前，通过目视评估100个芽/小区的芽褐变严重程度来对花芽进行Psa疾病评估，如上文所述。在2016年11月18日在这些试验小区中评估叶片的Psa斑点严重程度(具有坏死的叶片面积％)。如上文所述，对定位于从主警戒线向外第二线与第三线之间的叶片进行评估。在从小区边缘迈出一步(即1m)之后开始评估并且对一组25片叶片进行评分。在沿小区向下迈出另一步之后重复该过程。然后沿藤的另一侧向下重复该过程以使得在每一个小区内对四组25片叶片(总数＝100片)进行评分。
[0418] 结果
[0419] 在该田间试验的第二年，在无处理对照中叶斑病的发病率是31％并且这在两种YBCA5处理中显著降低(表8)。仅YBCA处理的功效是42％。与YBCA5处理相比，包括杀细菌剂Kasumin的种植者标准处理提供了叶斑病发病率的显著进一步降低(功效＝74％)。
[0420] 在无处理对照中叶斑病的平均严重程度是0.19％并且与无处理对照相比，这在YBCA5处理中显著降低(表8)。仅YBCA处理的功效是53％。在种植者标准处理中进一步降低，但是在这种情况下，种植者标准和YBCA5处理彼此没有显著差异。
[0421] 在无处理对照中，具有坏死的芽的发病率是18％并且坏死的严重程度是0.27。与无处理对照相比，两种YBCA5处理显著降低芽发病率和严重程度(仅YBCA5的功效分别是56％和59％)。尽管种植者标准比YBCA5处理具有更少的疾病，但是这些没有显著差异。
[0422] 表8：与基于 和 OptiTM的种植者标准叶面处理和木霉属处理相比，在区组B和区组C中在叶面喷雾施用YBCA5后中华猕猴桃美味变种‘海沃德’藤上叶斑病和芽褐变的平均发病率和严重程度(在2016年11月11日(芽)和2016年11月18日(叶片)评估)。
[0423]
[0424] 种植者标准是 的一次施用和 OptiTM的三次施用，在Du(0.04％v/v)中施用。
[0425] YBCA5是在 Xtra(0.03％v/v)中以100g/100L施用的配制的开发生物防治剂。
[0426] 通过组合来自两个果园试验点的数据进行分析
[0427] *其中在过去的12个月期间曾向这些小区的土壤施用木霉属三次的YBCA5处理[0428] **在区组C中，该变量存在显著的试验点×处理相互作用(P＝0.016)，因此没有显著的处理效果，并且在区组B中，存在非常显著的处理效果(P<0.001)，处理差异与在该组合分析中所示的处理差异相同
[0429] LSD是最小显著性差异(P<0.05)
[0430] 后跟相同字母的平均值彼此没有显著性差异(P<0.05)。
[0431] 结论：
[0432] YBCA5处理显示出‘海沃德’藤的叶斑病和芽褐变的发病率和严重程度的显著降低。
[0433] 应当了解的是，上述说明仅以举例方式提供并且考虑了本领域技术人员已知的所用的材料和技术这两者的变化。
[0435] 此外，在本发明的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。
[0436] 在本说明书中，在已经参考了专利说明书、其它外部文献或其它信息来源的情况下，这一般是为了提供论述本发明的特征的背景。除非另外具体说明，否则对这些外部文献的参考不应当被视为承认在任何管辖区域中这些文献或这些信息来源是现有技术或形成本领域的公知常识的一部分。
[0437]
[0438]
[0439]
[0440] 以下编号的段落限定了本发明的具体方面：
[0441] 1.分离的出芽短梗霉酵母菌株YBCA5(CBS登录号141880)。
[0442] 2.一种组合物，所述组合物包含YBCA5和农业上可接受的载体。
[0443] 3.一种组合物，所述组合物基本上由YBCA5和农业上可接受的载体组成。
[0444] 4.段落2或段落3的组合物，其中YBCA5以有繁殖活力的细胞形式存在。
[0445] 5.段落2至4中任一个的组合物，其中YBCA5活细胞的浓度在以下范围：对于固体组合物，每克约1×103CFU至约1×1014CFU，优选地约1×105CFU至约1×1011CFU，优选地约1×106CFU至约1×109CFU，优选地约1×107CFU至约1×108CFU，优选地约2×107CFU至约2×
108CFU，优选地约2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至约
8
1×10CFU。
108CFU，优选地约2×109CFU至约2×1010CFU，并且对于液体组合物，每毫升约1×107CFU至约
8
1×10CFU。
[0446] 6.段落2至5中任一个的组合物，其中所述农业上可接受的载体是水。
[0447] 7.段落2至6中任一个的组合物，所述组合物还包含至少一种农业上可接受的佐剂。
[0448] 8.段落2至7中任一个的组合物，其中所述农业上可接受的佐剂选自由另外的活性剂和配制剂组成的组。
[0449] 9.段落2至7中任一个的组合物，其中所述农业上可接受的佐剂是一种或多种另外的活性剂。
[0450] 10.段落2至7中任一个的组合物，其中所述农业上可接受的佐剂是一种或多种配制剂。
[0451] 11.段落2至7中任一个的组合物，其中所述农业上可接受的佐剂包括一种或多种另外的活性剂和一种或多种配制剂的组合。
[0452] 12.段落2至11中任一个的组合物，其中所述组合物被配制成固体制剂或液体制剂。
[0453] 13.段落2至12中任一个的组合物，其中所述组合物是预制组合物或其中所述组合物呈浓缩形式。
[0454] 14.一种在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或段落2至13中任一个的组合物接触。
[0455] 15.段落14的方法，其中所述假单胞菌属菌种细菌的至少一种菌株是选自由以下各项组成的组的细菌的菌株：丁香假单胞菌、扁桃假单胞菌、榛色假单胞菌、番木瓜假单胞菌、菊巨假单胞菌、晕斑假单胞菌、天仙果假单胞菌、向日葵假单胞菌、苦楝假单胞菌、萨氏假单胞菌以及浅绿黄假单胞菌或其致病变种或其组合，优选的是，所述至少一种菌株是丁香假单胞菌或其致病变种，更优选的是，所述至少一种菌株是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)。
[0456] 16.段落14或15的方法，其中使所述植物或其部分接触足以防治假单胞菌属菌种细菌，优选的是Psa细菌的时间。
[0457] 17.段落16的方法，其中接触足以减少假单胞菌属菌种细菌，优选的是Psa细菌的存活、生长和/或增殖的时间。
[0458] 18.段落14至17中任一个的方法，其中接触包括将YBCA5或段落2至13中任一个的组合物施用于所述植物的叶、茎、花、果实、树干和/或根或其部分。
[0459] 19.段落18的方法，其中施用包括喷粉、喷洒、滴落、喷淋或混合或其组合。
[0460] 20.段落18的方法，其中向根施用是通过地面喷洒、机械并入或通过与富化剂或肥料混合，之后施用所述富化剂或肥料来进行的。
[0461] 21.段落14至20中任一个的方法，其中所述植物或其部分选自下组：单子叶植物、双子叶植物、一年生植物、两年生植物和多年生植物、蔬菜植物或收获的蔬菜、水果植物或果树或收获的水果、开花植物或树或收获的花、谷类植物、产油植物、蛋白质植物、木本植物以及观赏植物。
[0462] 22.段落14至21中任一个的方法，其中所述植物或其部分是选自由以下各项组成的组的农业上重要的植物、其栽培品种或其产品：农业上重要的藤本植物和农业上重要的果树以及其栽培品种和产品，优选地其中所述农业上重要的果树或其栽培品种选自橄榄树、苹果树、梨树、柑橘类果树、香蕉树、菠萝树、桃树、杏树、樱桃树、核桃树以及榛子树并且其产品分别是橄榄、苹果、梨、柑橘类水果、香蕉、菠萝、桃、杏、樱桃、核桃以及榛子，优选地其中所述农业上重要的藤本植物或其栽培品种选自马铃薯藤、甜菜根藤、菜豆藤、豌豆藤、番茄藤、黄瓜藤、甜瓜藤、浆果藤、葡萄藤以及猕猴桃藤并且其产品分别是马铃薯、甜菜根、菜豆、豌豆、番茄、黄瓜、甜瓜、浆果、葡萄以及猕猴桃，优选地其中所述农业上重要的藤本植物是猕猴桃藤或其栽培品种，并且所述产品是猕猴桃。
[0463] 23.段落22的方法，其中所述猕猴桃藤选自由以下物种组成的组：有绒毛的猕猴桃(美味猕猴桃)、黄金猕猴桃(中华猕猴桃中华变种)、中国卵形醋栗(革叶猕猴桃)、小型猕猴桃(软枣猕猴桃)、北极猕猴桃(狗枣猕猴桃)、红猕猴桃(黑蕊猕猴桃，中华猕猴桃中华变种)、银藤猕猴桃(葛枣猕猴桃)以及紫猕猴桃(紫果猕猴桃)或其栽培品种，优选地其中所述猕猴桃选自由中华猕猴桃美味变种和中华猕猴桃中华变种物种或其栽培品种组成的组，优选地其中所述猕猴桃是中华猕猴桃物种，优选地其中所述猕猴桃是中华猕猴桃中华变种，优选地其中所述栽培品种是‘海沃德’或‘Hort16A’品种栽培品种。
[0464] 24.段落23的方法，其中所述栽培品种是中华猕猴桃中华变种‘Hort16A’。
[0465] 25.段落23的方法，其中所述栽培品种是中华猕猴桃美味变种‘海沃德’。
[0466] 26.段落12至25中任一个的方法，所述植物或其部分是选自以下各项的农业上重要的作物植物、其栽培品种或产品：玉米植物、烟草植物、小麦植物、甘蔗植物、油菜籽植物、大麦植物、水稻植物、高粱植物、小米植物、大豆植物、莴苣植物以及卷心菜植物。
[0467] 27.一种用于在猕猴桃植物或其部分上防治丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Psa)的方法，所述方法包括使所述猕猴桃植物或其部分与YBCA5或段落2至13中任一个的组合物接触，所述猕猴桃植物是物种中华猕猴桃美味变种或中华猕猴桃中华变种或其栽培品种，优选地是物种中华猕猴桃中华变种或其栽培品种，优选地其中所述猕猴桃植物是‘Hort16A’或‘海沃德’。
[0468] 28.一种用于增加受假单胞菌属菌种感染或易受假单胞菌属菌种感染，优选地受Psa感染，优选地易受Psa感染的猕猴桃植物的产量的方法，所述方法包括向所述猕猴桃植物或其部分施用YBCA5或段落2至13中任一个的组合物。
[0469] 29.一种在植物或其部分上防治至少一种植物病原性真菌的方法，所述方法包括使所述植物或其部分与YBCA5或段落2至13中任一个的组合物接触。
[0470] 30.一种用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物的产量的方法，所述方法包括向所述水果或蔬菜植物或其部分施用YBCA5或段落2至13中任一个的组合物；以及使所述植物或其部分生长。
[0471] 31.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌的用途。
[0472] 32.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa的用途。
[0473] 33.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物用于在水果或蔬菜植物或其部分上防治植物病原性真菌的用途。
[0474] 34.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物或其部分的产量的用途。
[0475] 35.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物或其部分的产量的用途。
[0476] 36.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物，其用于或在使用时用于在植物或其部分上防治假单胞菌属菌种细菌。
[0477] 37.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物，其用于或在使用时用于在猕猴桃植物或其部分上防治Psa。
[0478] 38.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物，其用于或在使用时用于在猕猴桃植物或其部分上防治植物病原性真菌。
[0479] 39.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物，其用于或在使用时用于增加受假单胞菌属菌种感染或易受假单胞菌属菌种感染的猕猴桃植物或其部分的产量。
[0480] 40.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物，其用于或在使用时用于增加受Psa感染或易受Psa感染的猕猴桃植物或其部分的产量。
[0481] 41.YBCA5或段落2至13中任一个的组合物，其用于或在使用时用于增加受植物病原性真菌感染或易受植物病原性真菌感染的水果或蔬菜植物或其部分的产量。
[0482] 42.至少一种植物或其部分，其根据段落14至30中任一个的方法或根据段落31至35中任一个的用途用YBCA5或段落2至13中任一个的组合物处理。
[0483] 工业应用
[0484] 本发明的分离的出芽短梗霉酵母菌株YBCA5和包含YBCA5或基本上由YBCA5组成的组合物可用于防治植物病原性细菌和真菌。
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