技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域,具体涉及一种金龟子绿僵菌IPPMHBC-009及其应用。
背景技术
[0002] 蝗虫为直翅目蝗科灾害性昆虫,蝗灾频繁的在我国发生,给我国农业造成了巨大的伤害。目前,我国控制草原蝗虫危害的手段主要是采用
化学防治法,其具有快速、高效、使用灵活等优点,但是,随着人们越来越重视环境经济的可持续发展,生物治蝗方法被研发出来并运用到实际工作中去。生物灭蝗法,特别是绿僵菌、白僵菌等,具有一定的专一性,对人畜无害,同时还具有不污染环境、无残留、
害虫不会产生抗药性等优点。
[0003] 虽然杀虫
真菌防治蝗虫具有一定的防治效果,但是真菌
击倒、杀死害虫作用缓慢,需要经过一段时间才能起作用,适合一般发生年份防治应用,而在蝗虫大发生年份,或局部地区严重发生时,杀虫真菌不能短时间内快速降低虫口
密度。同时,生产实践和应用过程中发现一些菌株常出现一定程度的退化,表现为经过几代人工培养后,菌落不稳定、气生菌丝徒长、产孢量减少等特点,从而影响防治效果。
发明内容
[0004] 为了解决
现有技术中存在的真菌击倒、杀死害虫作用缓慢等问题,本发明提供一种金龟子绿僵菌IPPMHBC-009及其应用。
[0005] 本发明的目的在于提供一种金龟子绿僵菌IPPMHBC-009。
[0006] 本发明的再一目的在于提供金龟子绿僵菌IPPMHBC-009的应用。
[0007] 本发明的再一目的在于提供含有金龟子绿僵菌IPPMHBC-009的生防制剂。
[0008] 本发明的再一目的在于提供利用金龟子绿僵菌IPPMHBC-009防治蝗虫的方法。
[0009] 根据本发明具体实施方式的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBC-009菌株的保藏编号CGMCC No.16000,该菌株于2018年08月02日保存于中国普通
微生物菌种保藏中心,保藏中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
[0010] 根据本发明具体实施方式的生防制剂,可将金龟子绿僵菌IPPMHBC-009制成孢子粉直接施用,或者与其他化学药品联用使用。
[0011] 根据本发明的具体实施方式的防治蝗虫的方法,包括向田间播撒或喷洒含有绿僵菌IPPMHBC-009的农用制剂。
[0012] 本发明的金龟子绿僵菌IPPMHBC-009对毛足棒
角蝗的半致死时间为3.87d,僵虫率为91.67%,对亚洲小车蝗的半致死时间为3.55d,僵虫率为93.33%,因此,本发明的金龟子绿僵菌IPPMHBC-009具有较好的应用前景。
附图说明
[0013] 图1显示9种绿僵菌对毛足棒角蝗15d的累计死亡率曲线;
[0014] 图2显示9种绿僵菌对亚洲小车蝗15d的累计死亡率曲线。
[0015] 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)IPPMHBC-009菌株的保藏编号CGMCC No.16000于2018年08月02日保存于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
[0016] 本发明菌株来源:
[0017] 本发明测试用9种绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株,分别编号为:
[0018] ①IPPBHC-5;
[0019] ②IPPMHBC-009;
[0020] ③IPPMHK-7;
[0021] ④IPPM189;
[0022] ⑤IPPM803;
[0023] ⑥IPPM200614;
[0024] ⑦IPPM2010-10;
[0025] ⑧IPPB054;
[0026] ⑨IPPMC384;
[0027] 本发明试虫的来源:
[0028] ①毛足棒角蝗(Dasyhippus barbipes Fischer-Waldheim):2~3龄蝗蝻,扫网法采集于内蒙古
锡林郭勒盟白
云库伦蝗区。
[0029] ②亚洲小车蝗(Oedaleus decorus asiaticus B.Bienko):2~3龄蝗蝻,扫网法采集于内蒙古锡林郭勒盟西乌旗巴彦高勒北7公里处蝗区。
[0030] 采集的蝗虫饲养于试验站内专
门用于养蝗虫的大框中,每天饲喂适量的新鲜羊草
叶片。为保证试验效果,试验前一天饥饿处理。
[0031]
实施例1绿僵菌IPPMHBC-009的筛选
[0032] 采用大蜡螟诱集法从收集的
土壤中诱集绿僵菌菌株。将用消毒的废胶卷盒装入供试土样,每盒埋入1头大蜡螟,重复3次。土样盒放置在24~27℃,保湿诱集1周后,拣出死虫,在恒温25~26℃,
相对湿度100中培养7~10天后,从僵虫上分离目标菌株,菌株分离用培养基为PDAY。
[0033] 将分离到的绿僵菌接种到PDAY固体培养基上,培养至产孢,孢子粉用0.1%吐温
水悬浮,漩涡
振荡器振荡均匀,调整孢子浓度为1×108个/mL。取1mL孢子悬浮液接种到100mL产菌丝培养基,置28℃、200r/min摇床振荡培养3d至对数期。用
真空泵抽滤得到菌丝,取1g菌丝用液氮
研磨至粉末,提取基因组DNA。以基因组DNA为模板,设计特异性引物扩增IPPMHBC-009菌株的ITS1-5.8SrRDNA-ITS2序列。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶
电泳分离,用胶回收
试剂盒回收目的片断,克隆至pGEM-T Easy Vector载体,转化至Trans-T1Phage Resistant感受态细胞中,在
氨苄青霉素平板上通过蓝白斑筛选转化子,经PCR检测后,测序。将测定的序列在GenBank中进行BLAST分析,确定菌株为绿僵菌菌株,并定名为IPPMHBC-009。
[0034] 实施例2.绿僵菌沧09对毛足棒角蝗蝻致病
力的生物测定
[0035] 采用胃毒法测定上述9种绿僵菌菌株对蝗虫的
毒力效果。
[0036] 首先秤取0.2g绿僵菌孢子粉加入2.0g麦麸中,再加入0.1ml食用油,充分搅拌均匀。然后秤取0.2g配好的绿僵菌麦麸饵剂放入培养皿中,连同培养皿一起放入盖玻璃板的养虫筐,编号,再在养虫筐中放入20头大小一致的3龄毛足棒角蝗蝻。空白对照组麦麸饵剂中不加绿僵菌孢子粉。本实验共9种绿僵菌孢子粉以及一个对照CK,每种孢子粉设置3次重复,于养虫室内饲养。第二天将饵剂取出,之后每天饲喂适量的新鲜羊草,并调查每筐蝗蝻的死亡情况,分别做好记录。
[0037] 将死亡的蝗蝻拣出,放入对应编号的垫有
滤纸的培养皿中,保持一定湿度,使之长出僵虫。待试验蝗蝻全部死亡后调查每种菌处理后的蝗蝻的僵虫率,结合处理后15日内每日的累积死亡率和半致死时间(LT50)挑选出对蝗虫致死作用较好的菌种。
[0038]
[0039]
[0040] 9株绿僵菌菌株对3龄毛足棒角蝗蝻致病力的生物测定结果见图l、表1。
[0041] 表1 9种绿僵菌对毛足棒角蝗致病力的比较
[0042]
[0043] 由表1分析可知,上述9种供试菌株对蝗蝻均有致病性,半致死时间在3.87d~8.83d之间,僵虫率在43.33%~91.67%之间。其中绿僵菌IPPMHBC-009的半致死时间为
3.87d,僵虫率为91.67%,而IPPM803、IPPM200614、IPPM2010-10等菌株半致死时间稍长、僵虫率较低。因此,绿僵菌菌株IPPMHBC-009与绿僵菌菌株IPPM803、IPPM200614比较存在显著差异,表明菌株IPPMHBC-009对毛足棒角蝗有较高的致病力。
[0044] 实施例3.绿僵菌对亚洲小车蝗致病力的生物测
[0045] 测定9株菌株对亚洲小车蝗的治病力,测定方法同实施例2的方法。
[0046] 9株绿僵菌菌株对亚洲小车蝗致病力的生物测定结果见图2、表2。
[0047] 表2 9株绿僵菌对亚洲小车蝗致病力的比较
[0048]
[0049] 由表2分析可知,供试菌株对蝗蝻均有致病性,半致死时间在3.55d~10.67d之间,僵虫率在38.33%~93.33%之间,其中绿僵菌IPPMHBC-009的半致死时间为3.55d,僵虫率为93.33%。因此,绿僵菌菌株IPPMHBC-009与绿僵菌菌株IPPM803、IPPM200614比较存在显著差异,表明菌株IPPMHBC-009对亚洲小车蝗有较高的致病力。
[0050] 实施例4.绿僵菌不同菌株生长速率和产孢量测定
[0051] 将不同的绿僵菌菌株孢子稀释到相同的2.5x108孢子/克,分别取10ul转接到PDAY固体平板上,将平板置于27℃
培养箱中培养,从第4天开始,每两天测定一次菌落直径,结果见表3。
[0052] 表3不同绿僵菌菌株的生长速率比较
[0053]
[0054] 如表3所示,绿僵菌IPPMHBC-009的生长速率明显高于对照菌株IPPM189和其他4个绿僵菌野生菌株。
[0055] 将不同绿僵菌菌株转接到PDAY固体平板上,在室内连续培养5代,每代培养至15天(约产孢后10天),测定其产孢量,结果见表4。
[0056] 表4不同绿僵菌菌株的产孢量比较
[0057]
[0058] 如表4所示,培养多代后,IPPMHBC-009仍然具有较好的产孢量,而且产孢性状稳定,与对照菌株没有显著差异。