一株用于防治黄瓜枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
阅读：1031发布：2020-08-07
专利汇可以提供一株用于防治黄瓜枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株用于防治黄瓜枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌编号为FJ17-4，其在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册的保藏号为CGMCC No.14642。本发明的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4对黄瓜枯萎病菌---尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）具有显著的拮抗作用，能有效防治黄瓜枯萎病，防治效果稳定。本发明为黄瓜枯萎病 生物防治 提供了优良菌种资源。，下面是一株用于防治黄瓜枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1. 一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）FJ17-4，已于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14642。
2.利用权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4制备的生防菌剂。
3.如权利要求2所述生防菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在LB平板培养基上活化，在28℃下培养24小时，得到活化的菌株；
（2）用灭菌的接种环刮取一环步骤（1）活化的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.5～0.8，获得种子液；
（3）将种子液接种于发酵培养基中扩大培养24小时，调节发酵液中贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4的浓度至1×109～1010CFU/mL，获得所述生防菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）种子液的接种量为1～2%。
5.如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在防治黄瓜枯萎病中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在黄瓜开花结瓜期或枯萎病发病初期，将贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液浇灌于黄瓜根部，每株150～200 mL；所述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液的浓度为1×109～1010CFU/mL。
一株用于防治黄瓜枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 由尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen）侵染引起的黄瓜枯萎病，是黄瓜生产上一种较难防治的土传系统性病害之一，该病害具发病快、病害重、传播迅速等特点，一旦发生常造成巨大经济损失。此病的初侵染源主要是带菌的土壤、病株残体、种子和粪肥等，病菌从腐烂的寄主组织里散布到土中可营腐生活，存活时间长达5-6年或更长的时间。黄瓜枯萎病菌可借助雨水、灌溉水等进行远距离传播，整个生长期均能发生，以开花结瓜期发病最多。随着农业结构的调整和设施栽培技术的发展，黄瓜种植面积也在不断扩大，加之多年连作，使病菌在土壤中大量累积，导致黄瓜枯萎病大量暴发，并有进一步加重的趋势，发病率一般在15%-35%之间，严重时达80%-90%，甚至绝收，严重影响黄瓜的产量和品质，是限制黄瓜生产发展的关键因素之一。黄瓜枯萎病是一种典型的土传病害，病原菌侵染早期不表现症状，中后期才表现症状，目前该病害防治仍以化学杀菌剂为主，大量化学农药长期、反复使用，严重污染环境、威胁人类身心健康，使病原菌逐渐产生抗性随之变异产生很多生理小种。因此，黄瓜枯萎病防治急需绿色安全无公害且靶标性强的生物农药。
[0003] 本发明从健康黄瓜根部土壤中分离到一株对黄瓜枯萎病菌具有较高拮抗能力的细菌，经微生物分类学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。本发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株，同时对促进黄瓜产业的健康生产发展、增加瓜农收入、保障消费者健康、减少环境污染和维持农业可持续发展具有重大的理论和生产意义。
发明内容
[0004] 本发明提供了一株用于防治黄瓜枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌及其应用，该贝莱斯芽孢杆菌对黄瓜枯萎病具有稳定的防治作用。
[0005] 一种贝莱斯芽孢杆菌，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis），菌株编号：FJ17-4，已于2017年9月18日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14642。
[0006] 本发明还提供了一种含有贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4的生防菌剂，该生防菌剂活性成分为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌株，含菌量为1×109～1010CFU/mL。
[0007] 所述生防菌剂的制备方法，包括如下步骤：（1）将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在LB平板培养基上活化，在28℃下培养24小时，得到活化的菌株；
（2）用灭菌的接种环刮取一环步骤（1）活化的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.5～0.8，获得种子液；
（3）将种子液接种于发酵培养基中扩大培养24小时，调节发酵液中贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4的浓度至1×109～1010CFU/mL，获得所述生防菌剂。
（2）用灭菌的接种环刮取一环步骤（1）活化的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.5～0.8，获得种子液；
（3）将种子液接种于发酵培养基中扩大培养24小时，调节发酵液中贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4的浓度至1×109～1010CFU/mL，获得所述生防菌剂。
[0008] 其中，所述种子液的接种量优选为1～2%。所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂粉15 g，水1000mL，pH 7.2；所述LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2；所述的发酵培养基为玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉2.0%，黄豆粉2.0%，NaCl 0.5%，MnSO4·H2O 0.8%，其余为水，pH 7.2。
[0009] 本发明还提供了所述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在防治黄瓜枯萎病中的应用，即在黄瓜开花结瓜期或枯萎病发病初期，将贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液浇灌于黄瓜根部，每株9 10
150～200 mL；所述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液的浓度为1×10～10 CFU/mL。
150～200 mL；所述贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液的浓度为1×10～10 CFU/mL。
[0010] 本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4对黄瓜枯萎病具有较好的防治效果，可用于黄瓜枯萎病的生物防治，对减少化学杀菌剂的使用、降低农药污染和避免病原菌抗性产生等具有重要的意义。
附图说明
附图说明
[0011] 图1为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4的菌落形态。
[0012] 图2为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌体的扫描电镜观察图。
[0013] 图3为菌株FJ17-4基于16SrRNA基因序列比对结果以Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446 (AJ496806)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。
[0014] 图4为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4对黄瓜枯萎病菌的平板拮抗效果。
[0015] 图5为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬浮液对黄瓜枯萎病的室内盆栽防治效果。
具体实施方式
[0016] 以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
[0017] 实施例1 含FJ17-4菌株的生防菌剂制备1、FJ17-4菌株的获取及鉴定
贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4从福建省福州市闽清县云龙乡健康黄瓜根围土壤中分离获得，采用平板稀释法对所采集土样中的细菌进行分离，所使的培养基为LB（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2）。根据不同菌落形态，对所分离细菌进行纯化，共分离纯化得到326株细菌。然后以黄瓜疫病菌为目标病原菌，采用平板对峙培养法（图4）对所纯化细菌对黄瓜疫病菌的拮抗能力进行测定，得到对黄瓜疫病菌具有拮抗作用初筛细菌18株。通过室内盆栽试验，进一步对初筛菌株的防病能力进行评估，最终得到具拮抗作用又有盆栽防治作用的菌株6株。综合拮抗和盆栽防病能力，选取FJ17-4拮抗菌为代表，该菌对黄瓜枯萎病菌菌丝生长具有较强的拮抗作用。经形态学、生理生化及分子生物学
16s rDNA鉴定，所分离菌株FJ17-4为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。其形态学特征如图1、2所示：菌株革兰氏染色呈阳性；在LB培养基平板上，菌落表面扁平，粗糙不透明，乳白色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，菌落中央凹状突起（图）；扫描电镜观察其菌体呈短杆状（图），最适生长温度为28℃；其生理生化特征如表1-表3所示，其16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示，基于16SrRNA基因序列比对结果系统发育树如图2所示。
贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4从福建省福州市闽清县云龙乡健康黄瓜根围土壤中分离获得，采用平板稀释法对所采集土样中的细菌进行分离，所使的培养基为LB（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2）。根据不同菌落形态，对所分离细菌进行纯化，共分离纯化得到326株细菌。然后以黄瓜疫病菌为目标病原菌，采用平板对峙培养法（图4）对所纯化细菌对黄瓜疫病菌的拮抗能力进行测定，得到对黄瓜疫病菌具有拮抗作用初筛细菌18株。通过室内盆栽试验，进一步对初筛菌株的防病能力进行评估，最终得到具拮抗作用又有盆栽防治作用的菌株6株。综合拮抗和盆栽防病能力，选取FJ17-4拮抗菌为代表，该菌对黄瓜枯萎病菌菌丝生长具有较强的拮抗作用。经形态学、生理生化及分子生物学
16s rDNA鉴定，所分离菌株FJ17-4为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。其形态学特征如图1、2所示：菌株革兰氏染色呈阳性；在LB培养基平板上，菌落表面扁平，粗糙不透明，乳白色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，菌落中央凹状突起（图）；扫描电镜观察其菌体呈短杆状（图），最适生长温度为28℃；其生理生化特征如表1-表3所示，其16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示，基于16SrRNA基因序列比对结果系统发育树如图2所示。
[0018] 表1 菌株FJ17-4 生理生化特性-酶活、碳源氧化+：阳性反应； -：阴性反应；W：弱阳性反应
表2 菌株FJ17-4 生理生化特性-利用碳源产酸
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
表3 菌株FJ17-4 生理生化特性-碳源利用
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
2、生防菌剂的制备
（1）将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在LB平板培养基上活化，在28℃下培养24小时，得到活化的菌株；
1）将FJ17-4菌株接种于LB培养液中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.7，获得种子液，测定过程中以未接菌的培养液来调零。LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2。
表2 菌株FJ17-4 生理生化特性-利用碳源产酸
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
表3 菌株FJ17-4 生理生化特性-碳源利用
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
2、生防菌剂的制备
（1）将低温保存的贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4在LB平板培养基上活化，在28℃下培养24小时，得到活化的菌株；
1）将FJ17-4菌株接种于LB培养液中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.7，获得种子液，测定过程中以未接菌的培养液来调零。LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2。
[0019] 2）将种子菌液以1:100体积比加入发酵培养基中扩大培养，培养条件为28℃，180rmp，培养时间为24小时。培养结束后，采用稀释液涂平板计算细菌菌落数法检测发酵中菌体的数量，并将发酵液中菌体浓度调到1×1010CFU/mL，获得所述生防菌剂。发酵培养基为玉米粉黄豆粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：玉米粉2.0%，黄豆粉2.0%，NaCl
0.5%，MnSO4·H2O 0.8%，其余为水，pH 7.2。
0.5%，MnSO4·H2O 0.8%，其余为水，pH 7.2。
[0020] 实施例2：FJ17-4菌株对黄瓜枯萎病菌的拮抗活性用对峙培养法，将保存于4℃中的黄瓜枯萎病菌接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为5 mm的圆形菌块。将菌丝块接种在改良的NB培养基平板（蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH=7.2）中央，在其四周距中心约25mm处分别接种FJ17-4，试验以清水为对照组。25℃培养，待菌丝长满平板后观察并记录抑菌圈的大小。
[0021] 根据抑菌圈的大小对FJ17-4拮抗黄瓜枯萎病菌的活性进行评估：0 mm，无抑制作用；＜2mm，有轻微的抑制作用；2-5mm，中等抑制作用；＞5mm，较强的抑制作用。根据病原菌在拮抗菌方向上的生长直径，计算FJ17-4对黄瓜枯萎病菌的抑制率，抑制率算法如下：抑制率=[(50-R)/50]×100%，其中，因为黄瓜枯萎病菌菌丝块接种于平板中央，而拮抗菌接种点离菌丝块的距离为25mm，在拮抗菌没有任何拮抗作用的条件下，病原菌生长至拮抗菌接种点的菌落直径应为50mm， R为病原菌在细菌方向的菌落半径。
[0023] 实施例3： FJ17-4菌株对黄瓜枯萎病的防治效果1）室内盆栽试验防治效果
将津研4号黄瓜品种播种于育苗盘中，出苗后每穴留1株，待黄瓜苗长至4片真叶时，拔起黄瓜苗，并尽量将根部土壤抖尽，然后将根浸于分生孢子浓度为1×108/mL的黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液中5min后，即获得了接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗，将已接种的黄瓜苗移栽于内径为90mm的花盆中，每盆种2株，24小时后，将FJ17-4菌株发酵液（菌体浓度为1×1010CFU/mL）浇灌于已接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗根部，每株50mL，以30%噁霉灵水剂1000倍液为处理对照，即一组处理为将1000倍30%噁霉灵水剂浇灌于已接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗根部，每株50 mL；以不作任何处理的已接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗为空白对照。6天后，统计各组的发病率，计算防治效果。发病率（%）=（发病株数/总调查株数）×100%，防治效果（%）=[（空白对照发病率-处理发病率）/空白对照发病率]×100%。
将津研4号黄瓜品种播种于育苗盘中，出苗后每穴留1株，待黄瓜苗长至4片真叶时，拔起黄瓜苗，并尽量将根部土壤抖尽，然后将根浸于分生孢子浓度为1×108/mL的黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液中5min后，即获得了接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗，将已接种的黄瓜苗移栽于内径为90mm的花盆中，每盆种2株，24小时后，将FJ17-4菌株发酵液（菌体浓度为1×1010CFU/mL）浇灌于已接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗根部，每株50mL，以30%噁霉灵水剂1000倍液为处理对照，即一组处理为将1000倍30%噁霉灵水剂浇灌于已接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗根部，每株50 mL；以不作任何处理的已接种黄瓜枯萎病菌的黄瓜苗为空白对照。6天后，统计各组的发病率，计算防治效果。发病率（%）=（发病株数/总调查株数）×100%，防治效果（%）=[（空白对照发病率-处理发病率）/空白对照发病率]×100%。
[0024] 由图5和表4可见，FJ17-4菌株菌悬液和30%噁霉灵水剂1000倍对室内盆栽试验的黄瓜枯萎病具有一定的防治效果，防治效果分别为81.25%和75.00%，FJ17-4菌株菌悬液的防治效果略高于30%噁霉灵水剂1000倍的防治效果。
[0025] 表4 贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液对黄瓜枯萎病的室内盆栽防治效果2）大田防治效果
黄瓜枯萎病主要发生于黄瓜开花结瓜期。大田防治试验选择在往年黄瓜枯萎病发生较为严重的福州市闽清县云龙乡官庄村进行。在黄瓜（品种：津研4号）开花结瓜期进行灌根处理，试验设计与室内盆栽试验基本相同，设为3组，第1组使用FJ17-4菌株菌悬液进行灌根处理，每株150mL，第2组使用30%噁霉灵水剂1000倍进行灌根处理，每株150mL，第3组使用清水灌根为对空白对照，每株同样为150mL。每隔7天灌根1次，灌根时间分别为2017年5月12日、5月19日和5月26日，共3次，第3次灌根结束12天后（2017年6月7日）调查田间黄瓜枯萎病的发率株数，根据病发株数，计算发病率和各个处理的防治效果。
黄瓜枯萎病主要发生于黄瓜开花结瓜期。大田防治试验选择在往年黄瓜枯萎病发生较为严重的福州市闽清县云龙乡官庄村进行。在黄瓜（品种：津研4号）开花结瓜期进行灌根处理，试验设计与室内盆栽试验基本相同，设为3组，第1组使用FJ17-4菌株菌悬液进行灌根处理，每株150mL，第2组使用30%噁霉灵水剂1000倍进行灌根处理，每株150mL，第3组使用清水灌根为对空白对照，每株同样为150mL。每隔7天灌根1次，灌根时间分别为2017年5月12日、5月19日和5月26日，共3次，第3次灌根结束12天后（2017年6月7日）调查田间黄瓜枯萎病的发率株数，根据病发株数，计算发病率和各个处理的防治效果。
[0026] 从表5可见，贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌株菌悬液和30%噁霉灵水剂1000倍对田间（大田）的黄瓜枯萎病也具有一定的防治效果，防治效果分别为63.08%和59.68%，FJ17-4菌株菌悬液的防治效果略高于30%噁霉灵水剂1000倍的防治效果，显示出较好的应用前景。
[0027] 表5 贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液对黄瓜枯萎病的田间防治效果
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