技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物领域蛋白相互作用的检测方法，具体涉及一种高通量检测蛋白相互作用的方法及其应用。
背景技术
[0002]
蛋白质是生命活动的执行者，蛋白质与蛋白质之间的相互作用几乎调控一切生命活动，细胞内的生理变化都是通过蛋白质来实现的。但是生命活动中各项功能和行为不是由单一的蛋白质来完成的，需要蛋白质与蛋白质，蛋白质与核酸之间的相互作用来实现的。蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其
信号有重要意义。
[0003] 研究蛋白质相互作用的方法有很多，目前用的最多的方法是主要有两种，一种是
酵母双杂交系统，另一种是免疫沉淀与质谱分析。酵母双杂交方法在检测蛋白质相互作用中存在的不足主要表现在以下方面：1.
假阳性发生较为频繁；90%结果为假阳性；2. 双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内，因此并不能适用于所有蛋白； 3. 双杂交系统是基于转录的筛选系统，不适用于转录激活因子相互作用蛋白的筛选。免疫沉淀与质谱分析在检测蛋白质相互作用中存在的不足主要表现在以下方面：1. 免疫沉淀需要富集足够多的蛋白，因此采用该方法需要大量细胞，需求细胞的数量一般为8
10左右；2. 免疫沉淀适合研究有稳定相互作用的蛋白
复合体，但不能用来检测蛋白的瞬时相互作用；3. 免疫沉淀与质谱分析背景信号高，灵敏度低。因此酵母双杂交系统和免疫沉淀与质谱分析这两种方法都不适用于检测蛋白的瞬时和微弱的相互作用。
发明内容
[0004] 为了克服
现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法，用于筛选在刺激或非刺激条件下与目的蛋白相互作用的蛋白网络，可检测较弱或瞬时相互作用，
信噪比高，假阳性率低，灵敏度高。
[0005] 本发明的另一目的在于提供高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法测应用。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 一种高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法，其是顺次按照以下步骤进行：
[0008] A）BiFC质粒库的构建：将
哺乳动物的基因 cDNA克隆入含YFPc 的逆转录病毒表达载体pB-CMV-NC/CC-puro中，获得含YFPc的质粒；
[0009] B）YFPn-诱饵蛋白稳定表达细胞系构建：将待研究的蛋白的cDNA亚克隆进与YFPn融合的逆转录病毒表达载体pB-CMV-CVN/VN-neo中，通过转化、挑取单克隆、质粒提取，获得该诱饵蛋白与YFPn的融合蛋白真核表达载体，经过病毒
包装后，使用YFPn载体上的抗生素抗性筛选获取带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞系；
[0010] C）YFPc-X逆转录病毒包装:将步骤A）获得的带有YFPc的质粒分为若干个库，每个库含有等量的不同质粒，然后将这些质粒库进行YFPc-X逆转录病毒的包装，获得对应的病毒库；
[0011] D）YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的稳定细胞系构建：将上述病毒库分别感染带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞，感染后筛选出YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞群；
[0012] E）BiFC 筛选：对YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞群进非诱导条件下的相互作用筛选或诱导条件下的相互作用筛选，收集BiFC阳性细胞，进行扩大培养；
[0013] F）细胞总mRNA的提取：筛选后获得的BiFC阳性细胞进行扩大培养后，进行细胞mRNA的提取，获得mRNA；
[0014] G）PCR扩增：利用pB-CMV-NC -puro载体设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，根据pB-CMV-CC-puro 设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，以上述mRNA为模板反转录为cDNA后，进行cDNA的RT-PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶
电泳鉴定之后对PCR产物进行纯化；
[0015] H）高通量测序：将纯化后的PCR产物进行高通量测序分析出所有的cDNA来至哪些基因，即可知与诱饵蛋白相互作用的蛋白质网络。
[0016] 作为本发明的一种实施方式，所述高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法中B）步骤所述病毒包装的方法如下：
[0017] 1） 制备病毒上清液：传293T 到 6孔细胞培养板，待生长达70%
密度；取250 μl opti-MEM，加入 9μl Lipo2000溶解，混匀后室温放置5min，得A液；取250μl opti-MEM，加入2ug pDEST plasmid 和2μg Pcl-ampho得B液，将A液和B液混合，放置 20min，得到
混合液；取500μl 上述混合液至上述6孔细胞培养板中，6h后换含10%小
牛血清的DMEM培养液，
转染48h后收集病毒上清；
[0018] 2）
病毒感染：传HTC75至6孔板，待铺板达30%左右；加上述病毒上清1ml 至6孔板，并加 polybrene至终浓度为4μg/ml；病毒感染12-24h后更换为含10%
小牛血清的DMEM培养液；病毒感染48h后加G418至终浓度为500μg/ml进行筛选，筛选7天待对照组细胞死亡达100%时更换新鲜筛选培养液，待剩余细胞扩繁后保种，进入到C）步骤。
[0019] 作为本发明的一种实施方式，所述高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法中步骤D）中所述的筛选方法是在感染48小时后加1ug/ml puromycin筛选3天。
[0020] 作为本发明的一种实施方式，所述高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法中步骤E）中非诱导条件下的相互作用筛选方法如下：利用流式分选的方法，将YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞在流式细胞仪上机检测，并用已知有相互作用的蛋白对和已知没有相互作用的蛋白对分别作为阳性对照和阴性对照，然后收集BiFC阳性细胞进行扩大培养。
[0021] 作为本发明的一种实施方式，所述高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法中所述BiFC阳性细胞进行扩大培养后重复流式分选2-4次。
[0022] 作为本发明的一种优选的实施方式，所述高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法中步骤E）中诱导条件下的相互作用筛选方法如下：
[0023] a）获得在不加诱导条件时没有相互作用的细胞，利用流式分选的方法，将YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞进行流式细胞仪上机检测，并用已知有相互作用的蛋白对和已知没有相互作用的蛋白对分别作为阳性对照和阴性对照，收集BiFC阴性的细胞并培养；
[0024] b）对第一轮筛选的阴性细胞进行药物诱导，然后进行上机检测，收集BiFC阳性的细胞；
[0025] c）将第一轮分选和第二轮分选分别重复3次，经过3轮的分选，获得可信的在诱导条件下有相互作用的蛋白对。
[0026] 作为本发明的一种实施方式，所述高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法中步骤G）中PCR扩增条件为：95℃3 min1个循环；94℃30s，60℃30s，72℃2.5 min，34个循环；72℃10 min一个循环；12℃ ∞。
[0027] 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法在检测活
体细胞内蛋白相互作用中的应用。
[0028] 本发明以双分子
荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)为
基础高通量筛选蛋白质间相互作用，其机理如下：完整的黄色荧光蛋白(YFP) 能发出荧光。然而,当将荧光蛋白分割分成了N 和 C端两半时,任何一半均不能产生荧光。将N 和 C端两个不具有荧光活性的
片段分别与目标蛋白连接，如果两个目标蛋白有相互作用，就 使得荧光蛋白的两个片段在空间上相互靠近并重新形成有功能的荧光蛋白而发出荧光。在BiFC系统中，黄色荧光蛋白(YFP)可以被绿色、青色、蓝色、红色荧光蛋白取代。本发明中以逆转录病毒为基础的BiFC系统，分别将“诱饵”蛋白cDNA克隆入含YFPn(黄色荧光蛋白1-155
氨基酸)的逆转录病毒表达载体，而将18000个人类基因 cDNA克隆入含YFPc(黄色荧光蛋白156-239氨基酸)的逆转录病毒表达载体，通过逆转录病毒感染产生同时稳定表达待筛选基因-YFPc融合蛋白和“诱饵”蛋白-YFPn融合蛋白的细胞，如果“诱饵”蛋白能与目标蛋白相互作用，通过流式细胞仪在FITC
波长范围内将观察到发出荧光的细胞并能检测信号强弱。在敏感的荧光
显微镜下，也能直接观察到发出荧光的细胞 并能观察到其相互作用发生的
位置。通过BiFC平台可以高通量快速筛选出在活细胞内与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质，从而并绘制与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质网络图谱，而数据的信息处理则由蛋白质组生物信息学平台完成。
[0029] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0030] 1. 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法是在哺乳动物细胞内进行，并且非转录依赖系统；
[0031] 2. 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法假阳性率低；
[0032] 3. 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法可实现对整个蛋白组相互作用的研究；
[0033] 4. 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法可检测较弱或瞬时相互作用，信噪比高；
[0034] 5. 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法可检测在活体细胞内的相互作用，更加真实的反应体内的相互作用情况；
[0035] 6. 本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法可检测蛋白在诱导条件下的相互作用，灵敏度高；
[0036] 7. 通过本发明所述的高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法成功筛选了十多个蛋白的蛋白相互作用网络，假阳性率低，筛选出来的蛋白相互作用85%以上可以通过GST-pull down或Western Blot验证。
[0037] 下面结合
附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
[0038] 图1为用高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法筛选到的hTERT互作蛋白AKR1B1蛋白；hTERT与AKR1B1蛋白相互作用，从而使YFPn和YFPc重新结合形成有功能的YFP蛋白发出荧光；
[0039] 图2为用高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法筛选到的hTERT互作蛋白EEF1B2蛋白；hTERT与EEF1B2蛋白相互作用，从而使YFPn和YFPc重新结合形成有功能的YFP蛋白发出荧光。
具体实施方式
[0041] 一种高通量检测活细胞内非诱导条件下蛋白相互作用的方法，其是顺次按照以下步骤进行：
[0042] A）BiFC质粒库的构建：将18000个人类基因 cDNA克隆入含YFPc 的逆转录病毒表达载体pB-CMV-NC/CC-puro中，获得含YFPc的质粒；
[0043] B）YFPn-诱饵蛋白稳定表达细胞系构建：将待研究的蛋白的cDNA亚克隆进与YFPn融合的逆转录病毒表达载体pB-CMV-CVN/VN-neo中，通过转化、挑取单克隆、质粒提取，获得该诱饵蛋白与YFPn的融合蛋白真核表达载体，经过病毒包装后，使用YFPn载体上的抗生素（G148）抗性取带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞系；其中病毒包装的方法如下：
[0044] 1） 制备病毒上清液：传293T 到 6孔细胞培养板，待生长达90%密度；取250 μl opti-MEM，加入 9μl Lipo2000溶解，混匀后室温放置5min，得A液；取250μl opti-MEM，加入2ug pDEST plasmid 和2μg Pcl-ampho得B液，将A液和B液混合，放置 20min，得到混合液；取500μl 上述混合液至上述6孔细胞培养板中，6h后换含10%小牛血清的DMEM培养液，转染48h后收集病毒上清；
[0045] 2）病毒感染：传HTC75至6孔板，待铺板达30%左右；加上述病毒上清1ml 至6孔板，并加 polybrene至终浓度为4μg/ml；病毒感染12-24h后更换为含10%小牛血清的DMEM培养液；病毒感染48h后加G418至终浓度为500μg/ml进行筛选，筛选7天待对照组细胞死亡达100%时更换新鲜筛选培养液，待剩余细胞扩繁后保种，进入到C）步骤。
[0046] C）YFPc-X逆转录病毒包装:将步骤A）获得的带有YFPc的18000个质粒分为36个库，每个库约含有500多种质粒，然后将这些质粒库进行YFPc-X逆转录病毒的包装，获得36个病毒库；
[0047] D）YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的稳定细胞系构建：将上述36个病毒库分别加如1ug/ml puromycin感染带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞，感染48小时后筛选3天，筛选出YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞群；
[0048] E）非诱导条件下的相互作用下BiFC 筛选：利用流式分选的方法，将YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞在流式细胞仪上机检测，并用已知有相互作用的蛋白对和已知没有相互作用的蛋白对分别作为阳性对照和阴性对照，然后收集BiFC阳性细胞进行扩大培养后重复流式分选3次。
[0049] F）细胞总DNA的提取：筛选后获得的BiFC阳性细胞进行扩大培养后，进行细胞mRNA的提取，获得mRNA；
[0050] G）PCR扩增：利用pB-CMV-NC -puro载体设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，根据pB-CMV-CC-puro 设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，以上述mRNA为模板转录后，进行cDNA的RT-PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定之后对PCR产物进行纯化；
[0051] H）高通量测序：将纯化后的PCR产物进行高通量测序分析出所有的cDNA来至哪些基因，即可知与诱饵蛋白相互作用的蛋白质网络；
[0052] I）BiFC验证：再通过BiFC逐个验证阳性克隆是否与目标蛋白发生相互作用。
[0053] 实施例2
[0054] 一种高通量检测活细胞内诱导条件下蛋白相互作用的方法，其是顺次按照以下步骤进行：
[0055] A）BiFC质粒库的构建：将18000个人类基因 cDNA克隆入含YFPc 的逆转录病毒表达载体pB-CMV-NC/CC-puro中，获得含YFPc的质粒；
[0056] B）YFPn-诱饵蛋白稳定表达细胞系构建：将待研究的蛋白的cDNA亚克隆进与YFPn融合的逆转录病毒表达载体pB-CMV-CVN/VN-neo中，通过转化、挑取单克隆、质粒提取，获得该诱饵蛋白与YFPn的融合蛋白真核表达载体，经过病毒包装后，使用YFPn载体上的抗生素（G148）抗性获取带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞系；其中病毒包装的方法如下：
[0057] 1） 制备病毒上清液：传293T 到 6孔细胞培养板，待生长达90%密度；取250 μl opti-MEM，加入 9μl Lipo2000溶解，混匀后室温放置5min，得A液；取250μl opti-MEM，加入2ug pDEST plasmid 和2μg Pcl-ampho得B液，将A液和B液混合，放置 20min，得到混合液；取500μl 上述混合液至上述6孔细胞培养板中，6h后换含10%小牛血清的DMEM培养液，转染48h后收集病毒上清；
[0058] 2）病毒感染：传HTC75至6孔板，待铺板达30%左右；加上述病毒上清1ml 至6孔板，并加 polybrene至终浓度为4μg/ml；病毒感染12-24h后更换为含10%小牛血清的DMEM培养液；病毒感染48h后加G418至终浓度为500μg/ml进行筛选，筛选7天待对照组细胞死亡达100%时更换新鲜筛选培养液，待剩余细胞扩繁后保种，进入到C）步骤；
[0059] C）YFPc-X逆转录病毒包装:将步骤A）获得的带有YFPc的18000个质粒分为36个库，每个库约含有500多种质粒，然后将这些质粒库进行YFPc-X逆转录病毒的包装，获得36个病毒库；
[0060] D）YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的稳定细胞系构建：将上述36个病毒库分别加如1ug/ml puromycin感染带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞，感染48小时后筛选3天，筛选出YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞群；
[0061] E）诱导条件下的相互作用下BiFC 筛选：
[0062] a）获得在不加诱导条件时没有相互作用的细胞，利用流式分选的方法，将YFPn-诱饵蛋白与YFPc-X共表达的细胞进行流式细胞仪上机检测，并用已知有相互作用的蛋白对和已知没有相互作用的蛋白对分别作为阳性对照和阴性对照，收集BiFC阴性的细胞并培养；
[0063] b）对第一轮筛选的阴性细胞进行药物诱导，然后进行上机检测，收集BiFC阳性的细胞；
[0064] c）将第一轮分选和第二轮分选分别重复3次，经过3轮的分选，获得可信的在诱导条件下有相互作用的蛋白对。
[0065] F）细胞总DNA的提取：筛选后获得的BiFC阳性细胞进行扩大培养后，进行细胞mRNA的提取，获得mRNA；
[0066] G）PCR扩增：利用pB-CMV-NC -puro载体设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，根据pB-CMV-CC-puro 设计引物SEQ ID NO:3和引物SEQ ID NO:4，以上述mRNA为模板转录后，进行cDNA的RT-PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定之后对PCR产物进行纯化；
[0067] H）高通量测序：将纯化后的PCR产物进行高通量测序分析出所有的cDNA来至哪些基因，即可知与诱饵蛋白相互作用的蛋白质网络；
[0068] I）BiFC验证：再通过BiFC逐个验证阳性克隆是否与目标蛋白发生相互作用。
[0069] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
