突触融合蛋白7核酸分子用来控制鞘翅目和半翅目害虫
阅读：183发布：2020-05-11
专利汇可以提供突触融合蛋白7核酸分子用来控制鞘翅目和半翅目害虫专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及核酸分子及使用其控制昆虫 害虫 的方法，该方法通过对包括鞘翅目和/或半翅目害虫的昆虫害虫中的靶编码序列和转录非编码序列进行RNA干扰介导的抑制来实现。本公开还涉及制备转基因 植物 的方法，所述转基因植物表达可用于控制昆虫害虫的核酸分子；以及由此获得的植物细胞和植物。，下面是突触融合蛋白7核酸分子用来控制鞘翅目和半翅目害虫专利的具体信息内容。
1.分离的核酸分子，其包含至少一个与异源启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列或反向互补序列；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列或反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属(Meligethes)生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列或反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列或反向互补序列；
SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列或反向互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列或反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的美洲蝽属(Euschistus)生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的互补序列或反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；以及包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列或反向互补序列。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、3和7-9；以及前述的互补序列和反向互补序列。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述分子是载体。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中所述生物体选自油菜露尾甲(Meligethes aeneus)；英雄美洲蝽(Euschistus heros(Fabr.))(新热带棕椿象)；稻绿蝽(Nezara viridula(L.))(南方绿椿象)；盖德拟壁蝽(Piezodorus guildinii(Westwood))(红带椿象)；茶翅蝽(Halyomorpha halys )(棕翅椿象)；Chinavia hilare(Say)(绿椿象)；褐椿象(Euschistus servus(Say))(棕椿象)；椿虫(Dichelops melacanthus(Dallas))；绿腹椿象(Dichelops furcatus(F.))；Edessa meditabunda(F.)；Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)；Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois)；棉红椿(Horcias
nobilellus(Berg))(棉椿象)；Taedia stigmosa(Berg)；秘鲁红蝽(Dysdercus
peruvianus)(Guérin-Méneville)；Neomegalotomus parvus(Westwood)；Leptoglossus zonatus(Dallas)；Niesthrea sidae(F.)；豆荚草盲蝽(Lygus hesperus(Knight))(西方漆黑植物椿象)；以及牧草盲蝽(Lygus lineolaris)(Palisot de Beauvois)。
5.由权利要求1所述的核酸分子编码的核糖核酸(RNA)分子，其中所述RNA分子包含由所述核苷酸序列编码的多核糖核苷酸。
6.根据权利要求5所述的RNA分子，其中所述分子是双链核糖核酸(dsRNA)分子。
7.根据权利要求6所述的dsRNA分子，其中使所述多核糖核苷酸与昆虫害虫接触抑制与所述多核糖核苷酸特异性互补的内源性核酸分子的表达。
8.根据权利要求7所述的dsRNA分子，其中使所述多核糖核苷酸与所述昆虫害虫接触杀死或抑制所述害虫的生长和/或进食。
9.根据权利要求6所述的dsRNA，其包含第一、第二和第三多核糖核苷酸，其中所述第一多核糖核苷酸由所述多核苷酸转录，其中所述第三多核糖核苷酸通过所述第二多核糖核苷酸连接至所述第一多核糖核苷酸，并且其中所述第三多核糖核苷酸基本上是所述第一多核糖核苷酸的反向互补序列，使得所述第一和所述第三多核糖核苷酸在转录成核糖核酸时杂交以形成所述dsRNA。
10.根据权利要求6所述的dsRNA，其中所述分子包含第一和第二多核糖核苷酸，其中所述第一多核糖核苷酸由所述多核苷酸转录，其中所述第三多核糖核苷酸是与所述第二多核糖核苷酸分开的链，并且其中所述第一和所述第二多核糖核苷酸杂交以形成所述dsRNA。
11.根据权利要求3所述的载体，其中所述载体是植物转化载体，并且其中所述异源启动子在植物细胞中是功能性的。
12.包含权利要求1所述的核酸分子的细胞。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
14.根据权利要求12所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
16.包含权利要求1所述的核酸分子的植物。
17.根据权利要求16所述的植物的一部分，其中所述植物部分包含所述核酸分子。
18.根据权利要求17所述的植物部分，其中所述植物部分是种子。
19.由权利要求16所述的植物生产的食品产品或商品产品，其中所述产品包含可检测量的所述多核苷酸。
20.根据权利要求16所述的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表达为双链核糖核酸(dsRNA)分子。
21.根据权利要求15所述的植物细胞，其中所述细胞是玉蜀黍(Zea mays)、大豆
(Glycine max)、芸苔属(Brassica sp.)或棉属(Gossypium sp.)细胞。
22.根据权利要求16所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍、大豆、芸苔属或棉属。
23.根据权利要求16所述的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表达为双链核糖核酸(dsRNA)分子，并且当昆虫害虫摄入所述植物的一部分时，所述dsRNA分子抑制与所述RNA分子特异性互补的内源性多核苷酸的表达。
24.根据权利要求1所述的核酸分子，其还包含与异源启动子可操作地连接的至少一种另外的多核苷酸，其中所述另外的多核苷酸编码RNA分子。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述分子是植物转化载体，并且其中所述异源启动子在植物细胞中是功能性的。
26.控制昆虫害虫种群的方法，所述方法包括提供包含核糖核酸(RNA)分子的试剂，其在与所述昆虫害虫接触时起作用以抑制所述害虫内的生物学功能，其中所述RNA可与选自以下的多核苷酸特异性杂交：SEQ ID NO:86-90；SEQ ID NO:86-90中任一个的互补序列；
SEQ ID NO:86-90中任一个的反向互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO：86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述RNA分子是双链RNA(dsRNA)分子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中提供所述试剂包括使所述昆虫害虫与包含所述试剂的可喷雾组合物接触或使所述昆虫害虫进食包含所述试剂的RNA诱饵。
29.根据权利要求27所述的方法，其中提供所述试剂是表达所述dsRNA分子的转基因植物细胞。
30.控制昆虫害虫种群的方法，所述方法包括：
提供包含第一和第二多核糖核苷酸的试剂，其在与昆虫害虫接触时起作用以抑制所述昆虫害虫内的生物学功能，其中所述第一多核糖核苷酸包含与选自SEQ ID NO:86-90的多核糖核苷酸的约15至约30个连续核苷酸具有约90％至约100％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述第一多核糖核苷酸与所述第二多核糖核苷酸特异性杂交。
31.控制昆虫害虫种群的方法，所述方法包括：
在昆虫害虫的寄主植物中提供包含权利要求1所述的核酸分子的植物细胞，其中所述多核苷酸被表达以产生双链核糖核酸(dsRNA)分子，所述dsRNA分子在与属于所述种群的昆虫害虫接触时起作用以抑制所述昆虫害虫内的靶序列表达，并导致相对于不包含所述多核苷酸的相同寄主植物物种的植物上的相同害虫物种的发育，所述昆虫害虫或害虫种群的生长和/或存活降低。
32.根据权利要求31所述的方法，其中相对于侵害缺乏包含所述核酸分子的植物细胞的相同寄主植物物种的寄主植物的相同害虫物种种群，所述昆虫害虫种群减少。
33.控制植物中的昆虫害虫侵害的方法，所述方法包括在所述昆虫害虫的饮食中提供核糖核酸(RNA)分子，所述RNA分子包含可与选自以下的参考多核糖核苷酸特异性杂交的多核糖核苷酸：
SEQ ID NO:86-90；
SEQ ID NO:86-90中任一个的互补序列或反向互补序列；
SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；
SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列或反向互补序列；
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物；
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的互补序列或反向互补序列；
SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列或反向互补序列。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述RNA分子是双链RNA(dsRNA)分子。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述饮食包含植物细胞，所述植物细胞包含被转录以表达所述dsRNA分子的多核苷酸。
36.提高作物产量的方法，所述方法包括：
在所述作物中培养包含权利要求1所述的核酸的植物以允许所述多核苷酸的表达。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍、大豆、芸苔属或棉属。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述多核苷酸的表达产生双链RNA(dsRNA)分子，其阻抑已与所述植物的一部分接触的昆虫害虫中的靶基因，从而抑制所述昆虫害虫的发育或生长和由所述昆虫害虫的感染引起的产量损失。
39.产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用权利要求11所述的植物转化载体转化植物细胞；
在足以允许包含多个转基因植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化的植物细胞；
选择已将所述多核苷酸整合到其基因组中的转基因植物细胞；
针对由所述多核苷酸编码的双链核糖核酸(dsRNA)分子的表达筛选所述转基因植物细胞；和
选择表达所述dsRNA的转基因植物细胞。
40.生产抗昆虫害虫的转基因植物的方法，所述方法包括：
从包含权利要求1所述的核酸分子的转基因植物细胞再生转基因植物，其中由所述多核苷酸编码的双链核糖核酸(dsRNA)分子的表达足以在昆虫害虫接触所述RNA分子时调节靶基因在所述昆虫害虫中的表达。
41.产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用载体转化植物细胞，所述载体包含用于为植物提供syx7介导的露尾甲属害虫保护的构件；
在足以允许包含多个经转化的植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化的植物细胞；
选择已将所述用于为植物提供syx 7介导的露尾甲属害虫保护的构件整合到其基因组中的经转化的植物细胞；
针对抑制露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件的表达筛选所述经转化的植物细胞；
和
选择表达了所述用于抑制露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件的植物细胞。
42.产生转基因植物的方法，所述方法包括：
从通过根据权利要求40所述的方法产生的转基因植物细胞再生转基因植物，其中所述植物的植物细胞包含所述用于抑制露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述用于抑制露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件的表达足以调节靶syx7基因在侵害所述转基因植物的露尾甲属害虫中的表达。
44.植物，其包含用于抑制露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件。
45.产生转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
用载体转化植物细胞，所述载体包含用于为植物提供syx7介导的美洲蝽属害虫保护的构件；
在足以允许包含多个经转化的植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化的植物细胞；
选择已将所述用于为植物提供syx 7介导的美洲蝽属害虫保护的构件整合到其基因组中的经转化的植物细胞；
针对抑制美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件的表达筛选所述经转化的植物细胞；
和
选择表达了所述用于抑制美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件的植物细胞。
46.产生转基因植物的方法，所述方法包括：
由通过根据权利要求44所述的方法产生的转基因植物细胞再生转基因植物，其中所述植物的植物细胞包含所述用于抑制美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述用于抑制美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件的表达足以调节靶syx7基因在侵害所述转基因植物的美洲蝽属害虫中的表达。
48.植物，其包含用于抑制美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件。
49.根据权利要求1所述的核酸，其还包含编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus
thuringiensis)、产碱杆菌属(Alcaligenes spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp.)的杀虫多肽的多核苷酸。
50.根据权利要求49所述的核酸，其中所述杀虫多肽选自由Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C组成的苏云金芽孢杆菌杀虫多肽。
51.根据权利要求15所述的植物细胞，其中所述细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属或假单胞菌属的杀虫多肽的多核苷酸。
52.根据权利要求51所述的细胞，其中所述杀虫多肽选自由Cry1B、Cry1I、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C组成的苏云金芽孢杆菌杀虫多肽。
53.根据权利要求16所述的植物，其中所述植物包含编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属或假单胞菌属的杀虫多肽的多核苷酸。
54.根据权利要求53所述的植物，其中所述杀虫多肽选自由Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C组成的苏云金芽孢杆菌杀虫多肽。
55.根据权利要求31所述的方法，其中所述植物细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属或假单胞菌属的杀虫多肽的多核苷酸。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述杀虫多肽选自由Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C组成的苏云金芽孢杆菌杀虫多肽。
突触融合蛋白7核酸分子用来控制鞘翅目和半翅目害虫
[0002] 本申请要求于2017年3月21日提交的美国临时专利申请序列号62/474,504“突触融合蛋白7核酸分子用来控制鞘翅目和半翅目害虫(SYNTAXIN 7NUCLEIC ACID MOLECULES TO CONTROL COLEOPTERAN AND HEMIPTERAN PESTS)”的提交日的权益，该临时申请以其全部并入本文中。
[0004] 序列表的正式副本通过EFS-Web以文件名为SeqList的ASCII格式的序列表的形式以电子方式提交，该文件于2017年3月21日修订，大小为45千字节(SEQ ID NO:1-90)，并且与说明书同时提交。ACSII格式文件中包含的序列表是本说明书的一部分，并通过引用将其全部并入本文中。
技术领域
[0005] 本发明总体涉及对由昆虫害虫(例如，鞘翅目(coleopteran)害虫和半翅目(hemipteran)害虫)引起的植物损害的控制。在特定的实施方案中，本发明涉及对靶编码和非编码多核苷酸的鉴定，以及利用重组DNA和RNA技术转录后阻遏或抑制靶编码多核苷酸和非编码多核苷酸在昆虫害虫细胞中的表达，从而提供植物保护作用。
背景技术
[0006] 欧洲花粉甲虫(pollen beetle，PB)是对油菜有严重危害的害虫，幼虫和成虫均以花和花粉为食。花粉甲虫对作物的损害可造成20％至40％的产量损失。主要的害虫物种为油菜露尾甲(Meligethes aeneus)。目前，对油菜中花粉甲虫的控制主要依赖于拟除虫菊酯，鉴于这类物质的环境和监管状况，预料其很快就会遭到淘汰。另外，已报道过花粉甲虫对现有化学杀虫剂的抗性。因此，迫切需要具有新颖作用机制的环境友好型花粉甲虫控制方案。
[0007] 在自然界中，花粉甲虫在土壤中或落叶层下以成虫过冬。在春季，成虫从冬眠中出现，并开始以杂草的花为食，且迁移到开花的油菜植物上。在油菜花芽中产卵。幼虫在花芽和花中发育并以之为食。晚期幼虫在土壤中找到蛹化地点。第二代成虫在七八月出现，并且在找到过冬的处所之前以多种开花植物为食。
[0008] 椿象和其他半翅目昆虫(异翅亚目(heteroptera))构成了另一大类重要的农业害虫。已知全世界有超过50种椿象的近缘物种引起作物损坏。McPherson&McPherson(2000)Stink bugs of economic importance in America north of Mexico，CRC Press。半翅目昆虫存在于大量的重要作物中，包括玉蜀黍、大豆、水果、蔬菜和谷类。
[0009] 椿象在历经多个若虫期后才进入成虫期。这些昆虫在约30至40天内从卵发育为成虫。若虫和成虫均以来自软组织的汁液为食，它们还将消化酶注入软组织中，引发口外组织消化和坏死。然后摄入经消化的植物材料和养分。植物维管系统的水和养分的耗尽造成植物组织损坏。对发育中的籽粒和种子的损害最为显著，因为导致产量和萌发显著减少。在温暖的气候下会出现多个世代，造成重大的昆虫压力。目前对椿象的管理依赖于在单块田基础上的杀虫剂处理。因此，迫切需要替代性管理策略，来将正在发生的作物损失降至最低限度。
[0010] RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种利用内源性细胞途径的方法，凭借该方法，对整个靶基因或对靶基因的尺寸足够大的任一部分有特异性的干扰RNA(interfering RNA，iRNA)分子(例如dsRNA分子)导致由该靶基因编码的mRNA降解。近年来，在许多物种和实验系统中，已使用RNAi执行基因“敲减(knockdown)”，例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、植物、昆虫胚胎和组织培养物中的细胞。参见例如Fire等人，(1998)Nature 391:806-11；Martinez等人，(2002)Cell 110:563-74；McManus和Sharp，(2002)Nature Rev.Genetics 3:737-47。
[0011] RNAi通过包括DICER蛋白复合体的内源性途径实现mRNA的降解。DICER将长的dsRNA分子切割成大约20个核苷酸的短片段，称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA解旋成两个单链RNA：过客链(passenger strand)和引导链(guide strand)。过客链被降解，引导链则被掺入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中。
[0012] 美国专利7,612,194和美国专利公开号2007/0050860的作者证明了在提供针对西方玉米根虫(D.v.virgifera LeConte)的植物保护的背景下，植株原位(in planta)RNAi可作为一种潜在的害虫管理工具，同时证明了即使对于相对较小的候选基因集合而言，也无法准确地先验识别出有效的RNAi靶标。Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11)1322-6。通过利用高通量体内饮食RNAi系统来筛选潜在的靶基因从而开发转基因RNAi玉蜀黍，研究人员发现，在最初的290个靶标的基因池中，只有14个显示出幼虫防治潜力。
发明内容
[0013] 本文公开了核酸分子(例如，靶基因、DNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，及其使用方法，用于控制昆虫害虫，包括例如鞘翅目害虫，例如油菜露尾甲(Meligethes aeneus Fabricius)(花粉甲虫，“PB”)；和半翅目害虫，例如英雄美洲蝽(Euschistus heros(Fabr))(新热带棕椿象，“BSB”)；褐椿象(E.servus(Say))(棕椿象)；稻绿蝽(Nezara viridula(L.))(南方绿椿象)；盖德拟壁蝽(Piezodorus guildinii(Westwood))(红带椿象)；茶翅蝽(Halyomorpha halys )(棕翅椿象)；Chinavia hilare(Say)(绿椿象)；C.marginatum(Palisot de Beauvois)；椿虫(Dichelops Melacanthus(Dallas))；绿腹椿象(D.furcatus(F.))；Edessa meditabunda(F.)；Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)；棉红椿(Horcias nobilellus(Berg))(棉椿象)；Taedia stigmosa(Berg)；秘鲁红蝽(Dysdercus peruvianus)(Guérin-Méneville)；Neomegalotomus parvus(Westwood)；
Leptoglossus zonatus(Dallas)；Niesthrea sidae(F.)；豆荚草盲蝽(Lygus hesperus(Knight))(西方漆黑植物椿象)；以及牧草盲蝽(L.Lineolaris)(Palisot de Beauvois)。
在特定的实例中，公开了示例性的核酸分子，其可以与昆虫害虫中的一种或更多种天然核酸的至少一部分同源。
Leptoglossus zonatus(Dallas)；Niesthrea sidae(F.)；豆荚草盲蝽(Lygus hesperus(Knight))(西方漆黑植物椿象)；以及牧草盲蝽(L.Lineolaris)(Palisot de Beauvois)。
在特定的实例中，公开了示例性的核酸分子，其可以与昆虫害虫中的一种或更多种天然核酸的至少一部分同源。
[0014] 在这些和另一些实例中，天然核酸序列可以是靶基因，其产物可以例如但不限于：参与代谢过程；或参与幼虫/若虫的发育。在一些实例中，由包含与靶基因同源的多核苷酸的核酸分子对靶基因表达的转录后抑制可对昆虫害虫具有致死性或导致昆虫害虫的生长和/或发育降低。在特定的实例中，可以选择突触融合蛋白7(在本文中称为syx7)或syx7同源物作为转录后沉默的靶基因。在特别的实例中，可用于转录后抑制的靶基因是选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的syx7基因。因此，本文公开了分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:
2的多核苷酸；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；和/或前述中任一种的片段(例如，SEQ ID NO:7-9)。
2的多核苷酸；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；和/或前述中任一种的片段(例如，SEQ ID NO:7-9)。
[0015] 还公开了核酸分子，其包含编码与靶基因产物(例如，syx7基因产物)内的氨基酸序列至少约85％相同的多肽的多核苷酸。例如，核酸分子可以包含编码与SEQ ID NO:11(油菜露尾甲SYX7)；SEQ ID NO:12(英雄美洲蝽SYX7)；和/或syx7基因产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸。还公开了包含多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸是编码与靶基因产物内的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸的反向互补序列。
[0016] 还公开了可用于产生与昆虫害虫靶基因例如syx7基因的全部或部分互补的iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)分子的cDNA多核苷酸。在特定的实施方案中，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA可以在体外或体内由遗传修饰的生物体例如植物或细菌产生。在特定的实例中，公开了可用于产生与选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的syx7基因的全部或部分互补的iRNA分子的cDNA分子。
[0017] 还公开了用于抑制露尾甲属(Meligethes)害虫中syx7基因表达的构件，以及用于向植物提供syx7介导的露尾甲属害虫保护的构件。抑制露尾甲属害虫中syx7基因表达的构件是双链RNA分子，其中该分子的一条链由SEQ ID NO:92的多核糖核苷酸及其互补序列组成。用于抑制露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件的功能等价物包括双链RNA分子，其包含与含有SEQ ID NO:7的露尾甲属syx7基因的全部或部分基本上同源的多核糖核苷酸。为植物提供syx7介导的露尾甲属害虫保护的构件是DNA分子，该DNA分子包含编码用于抑制与启动子可操作地连接的露尾甲属害虫中的syx7基因表达的构件的多核苷酸，其中该DNA分子能够被整合到植物的基因组中。
[0018] 还公开了用于抑制美洲蝽属(Euschistus)害虫中syx7基因表达的构件，以及用于向植物提供syx7介导的美洲蝽属害虫保护的构件。抑制美洲蝽属害虫中syx7基因表达的构件是双链RNA分子，其中该分子的一条链由SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的多核糖核苷酸及其互补序列组成。用于抑制美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件的功能等价物包括双链RNA分子，其包含与含有SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属syx7基因的全部或部分基本上同源的多核糖核苷酸。为植物提供syx7介导的美洲蝽属害虫保护的构件是包含编码用于抑制与启动子可操作性第连接的美洲蝽属害虫中的syx7基因表达的构件的多核苷酸，其中该DNA分子能够被整合到植物的基因组中。
[0019] 另外，公开了用于控制昆虫害虫(例如，鞘翅目害虫和半翅目害虫)种群的方法，包括向昆虫害虫提供iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)分子，该iRNA分子在被害虫摄入时起作用以抑制害虫内的生物学功能。
[0020] 在一些实施方案中，用于控制昆虫害虫(例如，鞘翅目害虫和半翅目害虫)种群的方法包括向昆虫害虫提供iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和hpRNA)分子，该iRNA分子在被害虫摄入使起作用以抑制害虫内的生物学功能，其中iRNA分子包含选自以下的多核糖核苷酸的全部或部分：SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:86的互补序列；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补序列；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:88的互补序列；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补序列；SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:90的互补序列；与包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7中任一个的全部或部分的露尾甲属生物体(例如，PB)的天然编码多核苷酸的转录物杂交的多核糖核苷酸；与包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7中任一个全部或部分的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的转录物杂交的多核糖核苷酸的互补序列；与包含SEQ ID NO:3、8和9中任一个全部或部分的英雄美洲蝽生物体的天然编码多核苷酸的转录物杂交的多核糖核苷酸；以及与包含SEQ ID NO:3、8和9中任一个的全部或部分的英雄美洲蝽生物体的天然编码多核苷酸的转录物杂交的多核糖核苷酸的互补序列。
[0021] 在特定实施方案中，当昆虫害虫摄入后时作用以抑制害虫内的生物学功能的iRNA，从包含以下的多核苷酸的全部或部分的DNA转录：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；包含SEQ ID NO:7的全部或部分的露尾甲属生物体(例如，PB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:7的全部或部分的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的全部或部分的美洲蝽属生物体(例如，BSB)的天然编码多核苷酸；以及包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的全部或部分的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列。
[0022] 本文还公开了其中可以在基于饮食的测定中或在表达dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA的基因修饰植物细胞中向昆虫害虫提供dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA的方法。在这些和另一些实例中，所述dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA可被害虫摄入。然后，本发明的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA的摄入可在害虫中产生RNAi，进而可导致害虫生存力所必需的基因发生沉默并最终导致死亡。在特定实例中，通过使用本发明的核酸分子控制的昆虫害虫可以是鞘翅目害虫PB和/或半翅目害虫BSB。
附图说明
[0024] 图1包括对用单对引物由单个转录模板提供dsRNA所采用的策略的描述。
[0025] 图2包括对由两个转录模板提供dsRNA所采用的的策略的描述。
[0026] 序列表
[0027] 所附序列表中列出的核苷酸序列使用如37 C.F.R.§1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写表示。列出的核苷酸和氨基酸序列定义了具有以所述方式排列的核苷酸和氨基酸单体的分子(即，分别为多核苷酸和多核糖核苷酸以及多肽)。列出的核苷酸和氨基酸序列还各自定义了包含以所述方式排列的核苷酸和氨基酸单体的一类多核苷酸/多核糖核苷酸或多肽。考虑到遗传密码冗余性，本领域的技术人员理解，包括编码序列的核苷酸序列还描述了与参考序列所组成的多核苷酸编码相同多肽的一类多核苷酸。还应理解，氨基酸序列描述了编码该多肽的一类多核苷酸ORF。
[0028] 仅示出每个核苷酸序列的一条链，但是对所显示链的任何提及均包括互补链。由于一级核酸序列的互补序列和反向互补序列也必然被该一级序列公开，因此除非另有明确说明(或者从该序列所出现的上下文可以明显看出并非如此)，否则对核苷酸序列的任何提及均包括该核苷酸序列的互补序列和反向互补序列。此外，如本领域所理解的那样，RNA链的核糖核苷酸序列由其所转录的DNA的序列确定(除了用尿嘧啶(U)核碱基替换胸腺嘧啶(T))，所以对编码RNA序列的DNA序列的任何提及包括该RNA序列在内。在随附的序列表中：
[0029] SEQ ID NO:1示出了示例性的西方玉米根虫(玉米根虫(Diabrotica virgifera))syx7DNA，在本文一些地方称为WCR syx7或WCR syx7-1：
[0030]
[0031] SEQ ID NO:2示出了示例性的花粉甲虫(油菜露尾甲)syx7 DNA，在本文一些地方称为PB syx7或PB syx7-1:
[0032]
[0033] SEQ ID NO:3示出了示例性新热带棕椿象(英雄美洲蝽))syx7 DNA，在本文一些地方称为BSB syx7或BSB syx7-1：
[0034]
[0035] SEQ ID NO:4示出了另一示例性叶甲属(Diabrotica)syx7 DNA，在本文一些地方称为WCR syx7 reg1(区域1)，其在一些实例中用于产生dsRNA：
[0036]
[0037] SEQ ID NO:5示出了另一示例性叶甲属syx7 DNA，在本文一些地方称为WCR syx7reg1 v1(区域1版本1)，其在一些实例中用于产生dsRNA：
[0038]
[0039] SEQ ID NO:6示出了另一示例性叶甲属syx7 DNA，在本文一些地方称为WCR syx7reg1 v2(区域1版本2)，其在一些实例中用于产生dsRNA：
[0040]
[0041] SEQ ID NO:7示出了另一示例性露尾甲属syx7 DNA，在本文一些地方称为PB syx7reg1(区域1)，其在一些实例中用于产生dsRNA：
[0042]
[0043] SEQ ID NO:8示出了另一示例性美洲蝽属syx7 DNA，在本文一些地方称为BSB syx7reg1(区域1)，其在一些实例中用于产生dsRNA：
[0044]
[0045] SEQ ID NO:9示出了另一示例性美洲蝽属syx7 DNA，在本文一些地方称为BSB syx7reg2(区域2)，其在一些实例中用于产生dsRNA：
[0046]
[0047] SEQ ID NO:10示出了由示例性WCR syx7 DNA编码的WCR SYX7多肽的氨基酸序列：
[0048]
[0049] SEQ ID NO:11示出了由示例性PB syx7 DNA编码的PB SYX7多肽的氨基酸序列：
[0050]
[0051] SEQ ID NO:12示出了由示例性BSB syx7 DNA编码的BSB SYX7多肽的氨基酸序列：
[0052]
[0053] SEQ ID NO:13示出了T7噬菌体启动子的核苷酸序列。
[0054] SEQ ID NO:14示出了YFP靶向的dsRNA(YFP v2)的有义链。
[0055] SEQ ID NO:15-28示出了用于PCR扩增syx7序列的引物，该syx7序列包括用于在一些实例中产生dsRNA的WCR syx7 reg1、WCR syx7 reg1 v1、WCR syx7 reg1 v2、PB syx7 reg1、BSB syx7 reg 1、BSB syx7 reg 2和YFP v2。
[0056] SEQ ID NO:29示出了示例性的YFP基因。
[0057] SEQ ID NO:30示出了膜联蛋白区域1的DNA序列。
[0058] SEQ ID NO:31示出了膜联蛋白区域2的DNA序列。
[0059] SEQ ID NO:32示出了β血影蛋白2区域1的DNA序列。
[0060] SEQ ID NO:33示出了β血影蛋白2区域2的DNA序列。
[0061] SEQ ID NO:34示出了mtRP-L4区域1的DNA序列。
[0062] SEQ ID NO:35示出了mtRP-L4区域2的DNA序列。
[0063] SEQ ID NO:36-63示出了用于扩增用来合成dsRNA的膜联蛋白、β血影蛋白2、mtRP-L4和YFP的基因区域的引物。
[0064] SEQ ID NO:64示出了编码TIP41样蛋白的玉米DNA序列。
[0065] SEQ ID NO:65示出了T20VN引物寡核苷酸的核苷酸序列。
[0066] SEQ ID NO:66-70示出了用于玉米中dsRNA转录物表达分析的引物和探针。
[0067] SEQ ID NO:71示出了用于二元载体骨架检测的SpecR编码区的一部分的核苷酸序列。
[0068] SEQ ID NO:72示出了用于基因组拷贝数分析的AAD1编码区的核苷酸序列。
[0069] SEQ ID NO:73示出了玉米转化酶基因的DNA序列。
[0070] SEQ ID NO:74-82示出了用于基因拷贝数测定和二元载体骨架检测的DNA寡核苷酸的核苷酸序列。
[0071] SEQ ID NO:83-85示出了用于dsRNA转录物玉米表达分析的引物和探针。
[0072] SEQ ID NO:86-90示出了从示例性syx7多核苷酸及其片段转录的示例性RNA。
具体实施方式
[0073] I.若干实施方案的概述
[0074] 我们利用针对表达dsRNA的转基因植物的靶标害虫欧洲花粉甲虫和新热带棕椿象，开发了RNA干扰(RNAi)作为害虫管理工具。如在根虫中所示出的，大多数被提出作为生物体内RNAi靶标的基因实际上并没有实现它们的目的。在本文中，我们描述了在PB和BSB中对突触融合蛋白7(syx7)进行RNAi介导的敲减，例如当经摄入或注射的syx7 dsRNA递送iRNA分子时，PB和BSB被示出具有致死表型。在本文的实施方案中，通过喂食昆虫来递送syx7 dsRNA的能力赋予了RNAi作用，这对于昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫的管理非常有用。通过将syx7介导的RNAi和其他有用的RNAi靶标进行组合，对(例如，具有多种作用模式的)多个靶序列进行影响的可能性可提高开发涉及RNAi技术的可持续昆虫害虫管理方法的机会。
[0075] 本文公开了用于遗传控制昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫侵害的方法和组合物。还提供了鉴定昆虫害虫生命周期所必需的一个或更多个基因以用作RNAi介导的昆虫害虫种群控制之靶基因的方法。可以设计编码RNA分子的DNA质粒载体，来阻抑(suppress)生长、存活和/或发育所必需的一个或更多个靶基因。在一些实施方案中，所述RNA分子可能够形成dsRNA分子。在一些实施方案中，提供了经由与昆虫害虫中的靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转录后阻遏(post-transcriptional repression)靶基因表达或抑制靶基因的方法。在这些和另一些实施方案中，害虫可摄入一种或更多种从与靶基因的编码或非编码序列互补的核酸分子的全部或一部分转录的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA分子，从而提供植物保护作用。
[0076] 因此，一些实施方案涉及使用与一个或多个靶基因的编码序列和/或非编码序列互补的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA和/或hpRNA对靶基因产物的表达进行序列特异性抑制，以实现对昆虫害虫的至少部分控制。公开了一组经分离和纯化的核酸分子，其包含例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的多核苷酸及前述任一者的片段。在一些实施方案中，可由这些多核苷酸、其片段或包含这些多核苷酸中的一者或更多者的基因来表达稳定化的dsRNA分子，用于转录后沉默或抑制靶基因。在某些实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一者的全部或部分(例如SEQ ID NO:7-9)，和/或其互补序列。
[0077] 一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如dsRNA)分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞(例如植物细胞)。在特定的实施方案中，经编码的一种或多种dsRNA分子可以在被昆虫害虫摄入时提供，从而转录后沉默或抑制害虫中靶基因的表达。所述重组DNA可包含例如：SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一者；SEQ ID NO:2、3和7-9中任一者的片段；以及由包含SEQ ID NO:7-9中的一个或更多个的基因的部分序列组成的多核苷酸；上述的互补序列；和/或上述的反向互补序列。
[0078] 一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种iRNA(例如dsRNA)分子的重组DNA的重组宿主细胞，其包含SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88(例如，至少一个选自包括SEQ ID NO:87、89和90的组的多核糖核苷酸)的全部或部分。当被昆虫害虫摄取时，一种或多种iRNA分子可以沉默或抑制害虫中的靶syx7 DNA(例如，包含选自SEQ ID NO:2、3和7-9的多核苷酸的全部或部分的DNA)的表达，从而导致害虫的生长、发育和/或进食的停止。
[0079] 在一些实施方案中，在其基因组中具有编码能够形成dsRNA分子的至少一种RNA分子的至少一种重组DNA的重组宿主细胞可以是经转化植物细胞。一些实施方案涉及包含这样的经转化植物细胞的转基因植物。除此类转基因植物之外，任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子和转基因植物产品也都得以提供，它们中的每一者都包含一种或多种重组DNA。在特定的实施方案中，可以在转基因植物细胞中表达能够形成dsRNA分子的RNA分子。因此，在这些和另一些实施方案中，可以从转基因植物细胞分离dsRNA分子。在特定的实施方案中，转基因植物是选自包括以下的组的植物：玉蜀黍(Zea mays)、大豆(Glycine max)、棉花、禾本科(Poaceae)植物以及芸苔科(Brassica)植物，例如甘蓝型油菜(Brassica napus)。
[0080] 一些实施方案涉及调节昆虫害虫细胞中靶基因的表达的方法。在这些和另一些实施方案中，可提供核酸分子，其中该核酸分子包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸。在特定的实施方案中，编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸可以可操作地与启动子连接，并且还可以可操作地与转录终止序列连接。在特定的实施方案中，用于调节昆虫害虫细胞中靶基因的表达的方法可包括：(a)用包含编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸的载体转化植物细胞；(b)在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化植物细胞；(c)选择已将所述载体整合到其基因组中的经转化植物细胞；以及(d)确定选择的经转化植物细胞包含能够形成由所述载体的多核苷酸编码的dsRNA分子的RNA分子。可以由基因组中整合有该载体并且包含由该载体的多核苷酸编码的dsRNA分子的植物细胞来再生植物。
[0081] 因此，还公开了在其基因组中整合有载体的转基因植物，所述载体具有编码能够形成dsRNA分子的RNA分子的多核苷酸，其中所述转基因植物包含由所述载体的多核苷酸编码的dsRNA分子。在特定的实施方案中，能够形成dsRNA分子的RNA分子在植物中的表达足以调节与所述经转化的植物或植物细胞接触(例如，通过以所述经转化植物、该植物的一部分(例如根)或植物细胞为食)的昆虫害虫的细胞中靶基因的表达，使得害虫的生长和/或存活受到抑制。本文公开的转基因植物可展示出对昆虫害虫侵害的抗性和/或增强的耐受。特定的转基因植物可展示出对一种或更多种选自以下的鞘翅目和/或半翅目害虫的抗性和/或增强的防护：油菜露尾甲；盖德拟壁蝽；茶翅蝽；稻绿蝽；Chinavia hilare；英雄美洲椿；褐椿象(Euschistus servus)；椿虫；绿腹椿象；Edessa meditabunda；Thyanta perditor；Chinavia marginatum；棉红椿；Taedia stigmosa；秘鲁红蝽；Neomegalotomus parvus；
Leptoglossus zonatus；Niesthrea sidae；豆荚草盲蝽和牧草盲蝽。
Leptoglossus zonatus；Niesthrea sidae；豆荚草盲蝽和牧草盲蝽。
[0082] 本文还公开了将控制剂(诸如iRNA分子)递送到昆虫害虫的方法。此类控制剂可直接或间接地削弱昆虫害虫种群进食、生长或以其他方式造成宿主损害的能力。在一些实施方案中，提供了一种方法，包括将稳定化的dsRNA分子递送至昆虫害虫以阻抑该害虫中的至少一种靶基因，从而造成RNAi并减轻或消除害虫宿主中的植物损害。在一些实施方案中，抑制靶基因在昆虫害虫中的表达的方法可引起害虫的生长、存活和/或发育停止。
[0083] 在一些实施方案中，提供了包含iRNA(例如dsRNA)分子的组合物(例如局部用组合物)，以供植物、动物使用和/或在植物或动物环境中使用，从而实现消除或减轻昆虫害虫侵害。在特定实施方案中，该组合物可以是待喂食给昆虫害虫的营养组合物或食物来源。一些实施方案包括使害虫可得到所述营养组合物或食物来源。摄入包含iRNA分子的组合物可引起该分子被害虫的一个或更多个细胞摄取，进而可引起对害虫一个或多个细胞中的至少一种靶基因的表达的抑制。通过在害虫的宿主中提供一种或更多种包含iRNA分子的组合物，可以在任何存在害虫的宿主组织或环境之中或之上，限制或消除由昆虫害虫侵害导致的对植物或植物细胞的摄入或损害。
[0084] 本文公开的组合物和方法可与控制昆虫害虫所致损害的其他方法和组合物一起组合使用。例如，如本文所述的用于保护植物免受昆虫害虫损害的iRNA分子可在这样的方法中使用：该方法包括另外使用一种或更多种对昆虫害虫有效的化学药剂、对这种害虫有效的生物杀虫剂、作物轮作、所表现特点与RNAi介导的方法和RNAi组合物的特点不同的重组基因技术(例如，在植物中重组产生对昆虫害虫有害的蛋白质(例如Bt毒素和PIP-1多肽(参见美国专利公开号US2014/0007292A1))，和/或其他iRNA分子的重组表达。
[0085] II.缩略语
[0086] BSB 新热带棕椿象(英雄美洲蝽)
[0087] dsRNA 双链核糖核酸
[0088] EST 表达序列标签
[0089] GI 生长抑制
[0090] NCBI 美国国家生物技术信息中心
[0091] gDNA 基因组DNA
[0092] iRNA 抑制性核糖核酸
[0093] ORF 开放阅读框
[0094] PB 花粉甲虫(油菜露尾甲)
[0095] RNAi 核糖核酸干扰
[0096] miRNA 微小核糖核酸
[0097] shRNA 短发夹核糖核酸
[0098] siRNA 小抑制核糖核酸
[0099] hpRNA 发夹核糖核酸
[0100] UTR 非翻译区
[0101] MCR 墨西哥玉米根虫(Diabrotica virgifera zeae Krysan and Smith)[0102] NCR 北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi Smith andLawrence))
[0103] PB 花粉甲虫(油菜露尾甲)
[0104] PCR 聚合酶链式反应
[0105] qPCR 定量聚合酶链式反应
[0106] RISC RNA诱导的沉默复合体
[0107] SCR 南方玉米根虫(十一星根萤叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardiBarber))
[0108] SEM 平均值标准误差
[0109] WCR 西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgiferaLeConte))
[0110] YFP 黄色荧光蛋白
[0111] III.术语
[0113] 鞘翅目害虫：如本文所用，术语“鞘翅目害虫”是指鞘翅目(Coleoptera)的害虫昆虫，包括以农作物和作物产物(包括低芥酸菜子(canola))为食的露尾甲属害虫昆虫。在特定的实例中，鞘翅目害虫包括油菜露尾甲。
[0114] (与生物体)接触：如本文所用，与生物体(例如鞘翅目或半翅目害虫)“接触”或被生物体“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括将核酸分子内化到生物体中，例如但不限于：生物体摄入所述分子(例如通过进食)；使生物体与包含核酸分子的组合物接触；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物体。
[0115] 重叠群(contig)：如本文所用，术语“重叠群”是指由来源于单个遗传来源的一组重叠DNA区段重建的DNA序列。
[0116] 玉米植物：如本文所用，术语“玉米植物”是指玉蜀黍(玉米)物种的植物。
[0117] 表达：如本文所用，编码多核苷酸(例如，基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括例如gDNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的操作部分、非操作部分或结构性部分，通常包括蛋白质的合成。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织或生物体暴露于提高或降低基因表达的药剂。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调控。对基因表达的调控例如通过对转录、翻译、RNA转运和加工、中间分子(诸如mRNA)降解进行控制，或通过在特异性蛋白分子已产生之后的活化、失活、区室化或降解，或这些的组合而发生。可通过本领域已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达，包括但不限于northern印迹、RT-PCR、western印迹，或者体外、原位或活体内蛋白质活性测定。
[0118] 遗传物质：如本文所用，术语“遗传物质”包括所有的基因和核酸分子，诸如DNA与RNA。
[0119] 半翅目害虫：如本文所用，术语“半翅目害虫”是指半翅目(Hemiptera)的害虫昆虫，其以广泛的宿主植物为食并具有刺吸式口器，包括(例如但不限于)蝽科(Pentatomidae)、盲蝽科(Miridae)、红蝽科(Pyrrhocoridae)、缘蝽科(Coreidae)、蛛缘蝽科(Alydidae)和姬缘蝽科(Rhopalidae)的昆虫。在特定的实例中，半翅目害虫选自以下列表：英雄美洲蝽(新热带区棕椿象)、稻绿蝽(南方绿椿象)、盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅蝽)、Chinavia hilare(Say)(绿椿象)、褐臭蝽(棕椿象)、椿虫、绿腹椿象、Edessa meditabunda(F.)、Thyanta perditor(F.)(新热带区红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois)、棉红椿(棉椿象)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Guérin-Méneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、Leptoglossus zonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(西方漆黑植物椿象)和牧草盲蝽(Palisot de Beauvois)。
[0120] 抑制：如本文所用，术语“抑制”在用来描述对编码多核苷酸(例如基因)的作用时，是指从该编码多核苷酸转录的mRNA和/或该编码多核苷酸的肽、多肽或蛋白质产物在细胞水平上可测量地减少。在一些实例中，抑制编码多核苷酸的表达可使得表达近似消失。“特异性抑制”是指在正实现特异性抑制的细胞内对靶编码多核苷酸进行抑制，而不最终对其他编码多核苷酸(例如基因)的表达产生影响。
[0121] 昆虫：如本文所用，术语“昆虫害虫”具体包括鞘翅目昆虫害虫(例如油菜露尾甲)和半翅目昆虫害虫(例如英雄美洲蝽)。
[0122] 经分离的：“经分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已从与该组分所天然存在的生物体细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白质)基本上分开、分开产生或纯化出来，同时实现组分中的化学或功能变化(例如，核酸可通过断开将该核酸连接到染色体中的其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“经分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
[0123] 核酸分子：如本文所用，术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合形式，可包括RNA、cDNA、gDNA的有义链和反义链两者，以及上述各项的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核碱基可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或这两种类型核苷酸中任一者的修饰形式。如本文所用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。按照惯例，核酸分子的核苷酸序列从该分子的5’端向3’端阅读。核酸分子的“互补序列”是指具有可与该核酸分子的核碱基形成碱基对(即A-T/U和G-C)的核碱基的多核苷酸。
[0124] 一些实施方案包括含有转录为RNA分子的模板DNA的核酸，所述RNA分子是mRNA分子的互补序列。在这些实施方案中，转录为mRNA分子的核酸的互补序列以5’至3’取向存在，使得RNA聚合酶(其以5’至3’方向转录DNA)将从互补序列转录出可与mRNA分子杂交的核酸。因此，除非另有明确说明或者从上下文可清楚看出另有所指，术语“互补序列”是指从5’至
3’具有可与参考核酸的核碱基形成碱基对的核碱基的多核苷酸。类似地，除非另有明确说明(或者从上下文可清楚看出另有所指)，核酸的“反向互补序列”是指取向相反的互补序列。前述内容在以下图解中演示：
3’具有可与参考核酸的核碱基形成碱基对的核碱基的多核苷酸。类似地，除非另有明确说明(或者从上下文可清楚看出另有所指)，核酸的“反向互补序列”是指取向相反的互补序列。前述内容在以下图解中演示：
[0125] ATGATGATG多核苷酸
[0126] TACTACTAC多核苷酸的“互补序列”
[0127] CATCATCAT多核苷酸的“反向互补序列”
[0128] 本发明的一些实施方案可包括形成发夹RNA的RNAi分子。在这些RNAi分子中，RNA干扰所靶向的多核苷酸的转录物的互补序列和所述反向互补序列两者可出现在同一个分子中，使得单链RNA分子可以“折叠”到包含互补多核糖核苷酸和反向互补多核糖核苷酸的区域上并在该区域上与自身杂交。
[0129] “核酸分子”包括所有的多核苷酸，例如：单链和双链形式的DNA；单链形式的RNA；和双链形式的RNA(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为单独单链或在双链体中的核酸有义链和反义链两者。术语“核糖核酸”(RNA)包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(小发夹RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、hpRNA(发夹RNA)、tRNA(转移RNA，无论是否装载有对应的酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA)。术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA、gDNA和DNA-RNA杂交体。本领域技术人员会将术语“多核苷酸”和“核酸”及其“片段”理解为这样的术语：包括两种gDNA、核糖体RNA、转移RNA、信使RNA、操纵子，以及较小的工程化改造多核苷酸(其编码或可适于编码肽、多肽或蛋白质)。
[0130] 寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸多聚体。寡核苷酸可通过切割较长的核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪允许合成长度多达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核酸结合，所以可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可在PCR(一种用于扩增DNA的技术)中使用。在PCR中，寡核苷酸通常被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
[0131] 核酸分子可包括天然存在的核苷酸和/或经修饰的核苷酸的任一者或两者，它们通过天然存在的核苷酸连键和/或非天然存在的核苷酸连键而连接在一起。如本领域技术人员易于理解的那样，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物置换天然存在的核苷酸中的一者或更多者、核苷酸间修饰(例如不带电连键：例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连键：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如肽类；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；以及经修饰的连键：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹状的、环状的和挂锁状(padlocked)构象。
[0132] 如本文所用，就DNA而言，术语“编码多核苷酸”、“结构性多核苷酸”或“结构性核酸分子”是指这样的多核苷酸：在被置于适当的调控元件控制下时，经由转录和mRNA最终翻译成多肽。就RNA而言，术语“编码多核苷酸”是指翻译成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。编码多核苷酸的边界由5’末端的翻译起始密码子和3’末端的翻译终止密码子来确定。编码多核苷酸包括但不限于：gDNA、cDNA、EST和重组多核苷酸。
[0133] 如本文所用，“转录的非编码多核苷酸”是指mRNA分子的未翻译成肽、多肽或蛋白质的区段，诸如5'UTR、3'UTR和内含子区段。进一步地，“转录的非编码多核苷酸”是指转录成在细胞中起作用的RNA的核酸，所述RNA例如结构性RNA(例如核糖体RNA(rRNA)，举例来说5S rRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA和28S rRNA等)、转移RNA(tRNA)，以及snRNA诸如U4、U5、U6等。转录的非编码多核苷酸还包括(例如但不限于)小RNA(sRNA)，该术语通常用来描述小的细菌非编码RNA、小核仁RNA(snoRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi交互作用RNA(Piwi-interacting RNA，piRNA)和长的非编码RNA。还进一步，“转录的非编码多核苷酸”是可天然地在核酸中作为基因内的“间隔序列”存在，并且转录为RNA分子的多核苷酸。
[0134] 致命的RNA干扰：如本文所用，术语“致命的RNA干扰”是指向对象个体递送例如dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA和/或hpRNA时造成对象个体死亡或活力降低的RNA干扰。
[0135] 基因组：如本文所用，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色体DNA，也指存在于细胞的亚细胞组分内的细胞器DNA。在本发明的一些实施方案中，可将DNA分子导入植物细胞中，使得DNA分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和另一些实施方案中，DNA分子可整合到植物细胞的核DNA中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的DNA中。术语“基因组”在应用于细菌时，是指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本发明的一些实施方案中，可将DNA分子导入细菌中，使得该DNA分子整合到细菌的基因组中。在这些和另一些实施方案中，DNA分子可整合于染色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
[0137] 如本文所用，术语“序列同一性百分比”可以指通过在比较窗口上比较分子的两个最佳比对序列(例如核酸序列或多肽序列)所确定的值，其中为了实现这两个序列的最佳比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)。通过确定在两个序列中出现相同的核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认为与参考序列100％相同，反之亦然。
[0138] 用于比较的序列比对方法是本领域公知的。多种程序和比对算法描述于例如以下文献中：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:
155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
[0139] 美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可从诸多来源(包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda，MD))获得并且可在互联网上获得，可结合若干序列分析程序使用。怎样使用该程序确定序列同一性的说明可在互联网上BLASTTM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以利用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵，采用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”功能。在用这种方法评估时，与参考多核苷酸的序列具有甚至更大的序列相似性的核酸将显示百分比同一性增加。
[0140] 可特异性杂交/特异性互补：如本文所用，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明足够程度的互补性的术语，该互补性足以使得在核酸分子与靶核酸分子之间发生稳定且特异性的结合。两个核酸分子之间的杂交涉及在这两个核酸分子的核碱基之间形成反向平行队列。然后，这两个分子能够与相对链上的对应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够稳定，则可使用本领域公知的方法检出。多核苷酸与其可特异性杂交的靶核酸不必然是100％互补的。然而，特异性杂交所必须存在的互补性的量随所使用的杂交条件而变化。
[0141] 导致具体严格性程度的杂交条件将根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸的组成和长度而变化。一般说来，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)将决定杂交的严格性，但洗涤次数也影响严格性。有关获得特定严格性程度所需要杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且论述于例如以下文献中：Sambrook等人(编辑)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989年，第9和11章；以及Hames和Higgins(编辑)，Nucleic AcidHybridization，IRL Press，Oxford，1985年。有关核酸杂交的进一步详细说明和指导可在以下文献中找到：例如Tijssen，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，载于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，Elsevier，NY，1993年；以及Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience，NY，1995年。
[0142] 如本文所用，“严格条件”涵盖仅在杂交分子序列与靶核酸分子内的同源多核苷酸之间存在小于20％的错配时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文所用，“中等严格性”条件是序列错配超过20％的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件是错配超过10％的序列不会杂交的条件；而“极高严格性”条件是错配超过5％的序列不会杂交的条件。
[0143] 以下是代表性的非限制性杂交条件。
[0144] 高严格性条件(检测出共享至少90％序列同一性的多核苷酸)：在5x SSC缓冲液中在65℃下杂交16小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；以及在0.5x SSC缓冲液中在65℃下洗涤两次，每次20分钟。
[0145] 中等严格性条件(检测出共享至少80％序列同一性的多核苷酸)：在5x-6x SSC缓冲液中在65-70℃下杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；以及在1x SSC缓冲液中在55-70℃下洗涤两次，每次30分钟。
[0146] 非严格控制条件(共享至少50％序列同一性的多核苷酸会杂交)：在6x SSC缓冲液中在室温至55℃下杂交16-20小时；在2x-3x SSC缓冲液中在室温至55℃下洗涤至少两次，每次20-30分钟。
[0147] 如本文所用，就核酸(例如，多脱氧核糖核苷酸和多核糖核苷酸)而言，术语“基本/基本上同源的”、“基本/基本上相同”或“基本/基本上同源”是指具有在严格条件下与由参考核苷酸序列的互补序列组成的核酸分子(例如寡核苷酸)杂交的连续核碱基的多核苷酸。例如，与SEQ ID NO:2、3和7-9中任一个的参考多核苷酸基本同源的多核苷酸是那些在严格条件(例如，上述中等严格条件)下与具有参考多核苷酸的互补核苷酸序列的寡核苷酸杂交的那些多核苷酸。基本上同源的多核苷酸可具有至少80％的序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可具有约80％至100％的序列同一性，诸如79％、80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％和约100％。实质同源性的特性与特异性杂交密切相关。例如，当存在足够程度的互补性时，核酸分子可特异性杂交，以避免在期望特异性结合的条件下(例如，在严格杂交条件下)，该分子与非靶标多核苷酸非特异性结合。
[0148] 如本文所用，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共同的祖先核酸演变、并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基因。
[0149] 如本文所用，当以5’至3’方向阅读的多核苷酸的每个核苷酸与以3’至5’方向阅读时的另一多核苷酸的每个核苷酸互补时，两个核酸分子被认为表现出“完全互补性”。与参考多核苷酸互补的多核苷酸将表现出与所述参考多核苷酸的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中明确定义的，并且是本领域普通技术人员易于理解的。
[0150] 可操作地连接：当第一多核苷酸与第二多核苷酸具有功能性关系时，则称所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸可操作地连接。以重组方式产生时，可操作地连接的多核苷酸通常是邻接的，并且在必要时可将两个蛋白质编码区连接在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的ORF中)。然而，可操作地连接的核酸不必需邻接。
[0151] 术语“可操作地连接”在关于调控遗传元件和编码多核苷酸的情况下使用时，意味着该调控元件影响连接的编码多核苷酸的表达。“调控元件”或“控制元件”是指影响转录的时机和水平/量、RNA加工或稳定性、或者缔合的编码多核苷酸的翻译的多核苷酸。调控元件可包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏物结合多核苷酸、具有终止序列的多核苷酸、具有多聚腺苷酸化识别序列的多核苷酸，等等。特定的调控元件可位于与其可操作地连接的编码多核苷酸的上游和/或下游。而且，与编码多核苷酸可操作地连接的特定调控元件可位于双链核酸分子的相关互补链上。
[0152] 启动子：如本文所用，术语“启动子”是指可以在转录起始上游、并且可参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录的DNA区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作地连接，或者启动子可与编码信号肽的多核苷酸可操作地连接，所述多核苷酸可与用于在细胞中表达的编码多核苷酸可操作地连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞中的转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织。此类启动子被称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或更多个器官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性启动子、组织优先启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可以在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性的启动子。
[0153] 在本发明的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见Ward等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而提高。示例性诱导型启动子包括但不限于：来自ACEI系统的响应于铜的启动子；来自玉蜀黍的响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的In2基因；来自Tn10的Tet阻遏物；以及来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质类固醇激素诱导(Schena等人，1991年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。
[0154] 示例性组成型启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子，诸如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、来自水稻肌动蛋白基因的启动子、泛素启动子、pEMU、MAS、玉蜀黍H3组蛋白启动子和ALS启动子、甘蓝型油菜ALS3结构基因5’的Xba1/NcoI片段(或与所述Xba1/NcoI片段类似的多核苷酸)(国际PCT公布号WO96/30530)。
[0155] 此外，在本发明的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先启动子。用包含与组织特异性启动子可操作地连接的编码多核苷酸的核酸分子转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码多核苷酸的产物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子优先启动子，诸如来自菜豆素基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，诸如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，诸如来自LAT52的启动子；花粉特异性启动子，诸如来自Zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，诸如来自apg的启动子。
[0156] 大豆植物：如本文所用，术语“大豆植物”是指大豆属(Glycine sp.)物种的植物，例如大豆(G.max)。
[0157] 油菜籽(Rapeseed)/油菜(Oilseed Rape)植物：如本文所用，术语“油菜籽”或“油菜”是指芸苔属植物；例如甘蓝型油菜物种植物。
[0158] 转化：如本文所用，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。在通过将核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由细胞稳定复制核酸分子的情况下，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文所用，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等人，1986年，Nature 319:791-3)；脂质体转染(Felgner等人，1987年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等人，1978年，Cell 15:579-85)；农杆菌(Agrobacterium)介导的转移(Fraley等人，1983年，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)；直接DNA摄取；以及微粒轰击(Klein等人，1987年，Nature 327:70)。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)；直接DNA摄取；以及微粒轰击(Klein等人，1987年，Nature 327:70)。
[0159] 转基因：外源性核酸。在一些实例中，转基因可以是编码能够形成dsRNA分子的RNA的一条或两条链的DNA，所述dsRNA分子包含与存在于鞘翅目害虫或半翅目害虫中的核酸分子互补的多核糖核苷酸。在另一些实例中，转基因可以是基因(例如，除草剂耐受性基因、编码工业或药学上有用的化合物的基因，或者编码期望的农业性状的基因)。在这些和另一些实例中，转基因可含有与转基因的编码多核苷酸可操作地连接的调控元件(例如启动子)。
[0160] 载体：导入细胞中例如以产生经转化细胞的核酸分子。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的遗传元件，诸如复制起点。载体的实例包括但不限于：质粒、粘粒、噬菌体，或携带外源性DNA进入细胞的病毒。载体还可包括一种或更多种基因(包括产生反义分子的基因和/或可选择标志物基因)以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。载体任选地包括辅助核酸分子实现进入细胞的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
[0161] 产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对作物有害的鞘翅目和半翅目害虫(其为本文的组合物和方法所靶向的害虫)的相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％或更大的稳定化产量的栽培种。
[0162] 除非特别指明或暗示，如本文所用的，无数量词修饰的名词表示“至少一个/种”。
[0163] 除非另外特别地解释，否则本文使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可在以下出版物中找到：例如Lewin's Genes X，Jones&Bartlett Publishers，2009(ISBN100763766321)；Krebs等人(编辑)，The Encyclopediaof Molecular Biology，Blackwell Science Ltd.，1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Meyers R.A.(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN1-56081-569-8)。除非另外指明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。所有温度均以摄氏度计。
[0164] IV.包含昆虫害虫序列的核酸分子
[0165] A.概述
[0166] 本文描述了可用于控制昆虫害虫的核酸分子。在一些实例中，昆虫害虫是鞘翅目昆虫害虫。在一些实例中，昆虫害虫是或半翅目昆虫害虫。所描述的核酸分子包括靶多核苷酸(例如，天然基因和非编码多核苷酸)、dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA和miRNA。例如，在一些实施方案中描述了dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子，这些分子可与鞘翅目或半翅目害虫中的一种或更多种天然核酸的全部或部分特异性互补。在这些和另一些实施方案中，一种或多种天然核酸可以是一种或更多种靶基因，其产物可以例如但不限于：参与代谢过程或参与幼虫的发育。本文描述的核酸分子在导入包含与所述核酸分子特异性互补的至少一种天然核酸的细胞中时，可以在细胞中启动RNAi，因此降低或消除所述天然核酸的表达。在一些实例中，借助与靶基因特异性互补的核酸分子降低或消除靶基因的表达可造成鞘翅目或半翅目害虫的生长、发育和/或进食减缓或停止。
[0167] 在一些实施方案中，可以选择昆虫害虫中的至少一个靶基因，其中该靶基因包含syx7多核苷酸。在特定实例中，选择包含syx7多核苷酸的靶基因，其中该靶基因包含选自SEQ ID NO:2和包含SEQ ID NO:7的露尾甲属基因的多核苷酸。在特定实例中，选择包含syx7多核苷酸的靶基因，其中该靶基因包含选自SEQ ID NO:3和包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属基因的多核苷酸。
[0168] 在一些实施方案中，靶基因可以是包含这样的多核苷酸的核酸分子：该多核苷酸可以在计算机上(in silico)反向翻译为包含连续氨基酸序列的多肽，所述连续氨基酸序列与syx7多核苷酸的蛋白质产物的氨基酸序列至少约85％相同(例如，至少84％、85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或100％相同)。靶基因可以是昆虫害虫中的任何syx7多核苷酸，转录后抑制该多核苷酸对害虫的生长和/或存活造成有害影响，例如为植物提供对抗害虫的防护益处。在特定的实例中，靶基因是包含这样的多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸可以在计算机上反向翻译为包含连续氨基酸序列的多肽，所述连续氨基酸序列与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列至少约85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同或100％相同。
[0169] 根据本发明提供了DNA，其表达产生包含多核苷酸的RNA分子，该多核苷酸与由鞘翅目或半翅目害虫中的编码多核苷酸编码的天然RNA分子的全部或部分特异性互补。在一些实施方案中，在害虫摄入表达的RNA分子之后，可获得害虫细胞中的靶多核苷酸的下调。在特定的实施方案中，害虫细胞中的编码多核苷酸的下调对害虫的生长和/或发育造成有害影响。
[0170] 在一些实施方案中，靶多核苷酸包括转录的非编码RNA(诸如5'UTR、3'UTR)、剪接前导序列、内含子、末端内含子(例如，随后在反式剪接中修饰的5'UTR RNA)、donatron(例如，提供反式剪接的供体序列所需要的非编码RNA)以及靶标昆虫害虫基因的其他非编码转录RNA。此类多核苷酸可来源于单顺反子基因和多顺反子基因两者。
[0171] 因此，本文结合一些实施方案还描述了包含至少一种多核苷酸的iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，所述多核苷酸与昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫中的靶核酸的全部或部分特异性互补。在一些实施方案中，iRNA分子可包含与多个靶核酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个靶核酸)的全部或部分互补的一种或多种多核苷酸。在特定的实施方案中，iRNA分子可在体外产生，或通过基因修饰生物体(诸如植物或细菌)在活体内产生。还公开了cDNA，其可用于产生与昆虫害虫中的靶核酸的全部或部分特异性互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子和/或hpRNA分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组DNA构建体。经转化宿主靶标可从该重组DNA构建体表达有效水平的dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和/或hpRNA分子。因此，还描述了一种植物转化载体，其包含与在植物细胞中为功能性的异源性启动子可操作地连接的至少一种多核苷酸，其中所述一种或多种多核苷酸的表达产生包含一串邻接核碱基且与昆虫害虫中的靶核酸的全部或部分特异性互补的RNA分子。
[0172] 在特定的实例中，可用于控制昆虫害虫的核酸分子可包括：包含syx7多核苷酸的从露尾甲属中分离的天然核酸的全部或部分(例如，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:7)；当表达时产生RNA分子的DNA，该RNA分子包含与由露尾甲属syx7编码的天然RNA分子的全部或部分特异性互补的多核苷酸；iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，其包含至少一个与露尾甲属syx7的全部或部分特异性互补的多核苷酸；可用于产生与露尾甲属syx7的全部或部分特异性互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子和/或hpRNA分子的cDNA；从美洲蝽属分离的包含syx 7多核苷酸的天然核酸的全部或部分(例如，SEQ ID NO:3、8和9)；当表达时产生RNA分子的DNA，该RNA分子包含与由美洲蝽属syx7编码的天然RNA分子的全部或部分特异性互补的多核苷酸；iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，其包含至少一个与美洲蝽属syx7的全部或部分特异性互补的多核苷酸；可用于产生与美洲蝽属syx7的全部或部分特异性互补的dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子和/或hpRNA分子的cDNA；以及用于实现特定宿主靶标的稳定转化的重组DNA构建体，其中转化的宿主靶标包含一种或更多种前述核酸分子。
[0173] B.核酸分子
[0174] 本发明尤其提供了抑制昆虫害虫(例如鞘翅目害虫和半翅目害虫)的细胞、组织或器官中的靶基因表达的iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子；以及能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制昆虫害虫的细胞、组织或器官中的靶基因表达的DNA分子。
[0175] 本发明的一些实施方案提供了分离的核酸分子，其包含选自以下的至少一种(例如，一种、两种、三种或更多种)多核苷酸：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的至少15个(例如，至少19个)连续核苷酸的片段(例如SEQ ID NO:7-9)；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体(例如，PB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；
包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体(例如，BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；和包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列。
包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体(例如，BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；和包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列。
[0176] 在特定的实施方案中，从分离的多核苷酸转录的iRNA与昆虫害虫接触或被其吸收抑制该害虫的生长、发育和/或摄食。在一些实施方案中，通过以包含iRNA的植物材料或诱饵为食，发生与昆虫的接触或被昆虫吸收。在一些实施方案中，通过用包含iRNA的组合物对包含昆虫的植物喷雾来发生与昆虫的接触或被昆虫吸收。
[0177] 在一些实施方案中，本发明的分离的核酸分子可以包含选自以下的至少一种(例如，一种、两种、三种或更多种)多核糖核苷酸：SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:86的互补序列；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补序列；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:88的互补序列；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:89的互补序列；SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:90的互补序列；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:87的露尾甲属生物体中转录的天然多核糖核苷酸；包含SEQ ID NO:87的露尾甲属生物体中转录的天然多核糖核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:87的露尾甲属生物体中转录的天然多核糖核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:87的露尾甲属生物体中转录的天然多核糖核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:89和/或SEQ ID NO:90的美洲蝽属生物体中转录的天然多核糖核苷酸；包含SEQ ID NO:89和/或SEQ ID NO:90的美洲蝽属生物体中转录的天然多核糖核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:89和/或SEQ ID NO:90的美洲蝽属生物体中转录的天然多核糖核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；以及包含SEQ ID NO:89和/或SEQ ID NO:90的美洲蝽属生物体中转录的天然多核糖核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列。
[0178] 在特定的实施方案中，分离的多核苷酸与鞘翅目或半翅目昆虫害虫的接触或被其吸收抑制该害虫的生长、发育和/进食。在一些实施方案中，通过以包含iRNA的植物材料或诱饵为食，发生与昆虫接触或被昆虫吸收。在一些实施方案中，通过用包含iRNA的组合物对包含昆虫的植物喷雾来发生与昆虫害虫的接触或被昆虫害虫吸收。
[0179] 在某些实施方案中，本发明提供的dsRNA分子包含与来自靶基因的转录物互补的多核糖核苷酸，所述靶基因包含SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个，及其片段，在害虫中对靶基因的抑制导致将对害虫的生长、发育或其他生物学功能必不可少的多肽或多核苷酸减少或去除。所选择的靶多核苷酸可以与以下具有约80％至约100％的序列同一性：SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个；SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个的连续片段；前述中任一个的互补序列；以及前述中任一个的反向互补序列。例如，选择的多核苷酸可以与以下具有79％；
80％；约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约
91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约
99.5％；或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个；SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个的连续片段；前述中任一个的互补序列；以及前述中任一个的反向互补序列。在一些实例中，从多核苷酸转录dsRNA分子，所述多核苷酸含有有义核苷酸序列，其与SEQ ID NO：2、3和7-9中任一个的连续片段基本相同或相同；反义核苷酸序列，其至少基本上是有义核苷酸序列的反向互补序列；以及位于有义序列和反义序列之间的插入核苷酸序列(intervening nucleotide sequence)，由此，从相应的有义和反义核苷酸序列转录而来的有义和反义多核糖核苷酸杂交以形成dsRNA中的“茎(stem)”结构，而由插入序列转录的多核糖核苷酸形成“环(loop)”。这样的dsRNA分子可被称为发夹RNA(hpRNA)分子。
80％；约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约
91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约
99.5％；或约100％的序列同一性：SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个；SEQ ID NO:2、3和7-9中的任一个的连续片段；前述中任一个的互补序列；以及前述中任一个的反向互补序列。在一些实例中，从多核苷酸转录dsRNA分子，所述多核苷酸含有有义核苷酸序列，其与SEQ ID NO：2、3和7-9中任一个的连续片段基本相同或相同；反义核苷酸序列，其至少基本上是有义核苷酸序列的反向互补序列；以及位于有义序列和反义序列之间的插入核苷酸序列(intervening nucleotide sequence)，由此，从相应的有义和反义核苷酸序列转录而来的有义和反义多核糖核苷酸杂交以形成dsRNA中的“茎(stem)”结构，而由插入序列转录的多核糖核苷酸形成“环(loop)”。这样的dsRNA分子可被称为发夹RNA(hpRNA)分子。
[0180] 在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为iRNA分子以抑制靶基因表达的DNA分子可包含与存在于一个或更多个靶标昆虫害虫物种中的天然多核苷酸的全部或部分特异性互补的单个多核苷酸，或者DNA分子可以是由多个此类特异性互补的多核苷酸构建而成的嵌合体。
[0181] 在一些实施方案中，核酸分子可包含由“间隔序列”分开的第一多核苷酸和第二多核苷酸。间隔序列可以是包含促进第一多核苷酸和第二多核苷酸所编码的多核糖核苷酸之间的二级结构形成(在期望的情况下)的任何核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，间隔序列是mRNA的有义或反义编码多核苷酸的一部分。作为替代，间隔序列可包含能够共价连接到核酸分子中的核苷酸或其同源物的任何组合。在一些实例中，间隔序列可以是内含子(例如作为ST-LS1内含子或RTM1内含子)。
[0182] 例如，在一些实施方案中，DNA分子可包含编码一种或更多种不同iRNA分子的一种或多种多核苷酸，其中所述不同iRNA分子中的每一种都包含第一多核糖核苷酸和第二多核糖核苷酸，其中第一多核糖核苷酸和第二多核糖核苷酸彼此互补。第一多核糖核苷酸和第二多核糖核苷酸可在RNA分子内通过间隔序列连接。间隔序列可构成第一或第二多核糖核苷酸的一部分。包含第一和第二多核糖核苷酸的RNA分子的表达可通过该第一和第二多核糖核苷酸的特异性分子内碱基配对而引起dsRNA分子的形成。第一多核糖核苷酸或第二多核糖核苷酸可与由对于昆虫害虫而言天然的多核糖核苷酸(例如，靶基因转录物或转录的非编码多核苷酸)、其衍生物或其互补多核苷酸基本上相同。
[0183] dsRNA核酸分子包含聚合核糖核苷酸的双链，并且可包含对磷酸酯-糖主链或核苷的任一者的修饰。可以适当调整RNA结构中的修饰以使特异性抑制能够发生。在一个实施方案中，可通过普遍存在的酶促过程来修饰dsRNA分子，以便可以生成siRNA分子。该酶促过程可利用体外或活体内的RNase III酶，诸如真核生物中的DICER。参见Elbashir等人，(2001)Nature411:494-8；以及Hamilton和Baulcombe，(1999)Science 286(5441):950-2。DICER或功能上等同的RNase III酶将较大的dsRNA链和/或hpRNA分子切割成较小的寡核苷酸(例如siRNA)，所述寡核苷酸中每一者的长度为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的siRNA分子具有2至3个核苷酸3’突出，以及5’磷酸末端和3’羟基末端。由RNase III酶生成的siRNA分子在细胞中解旋并分成单链RNA。然后，siRNA分子与从靶基因转录的RNA特异性杂交，这两种RNA分子随后通过固有的细胞RNA降解机制而被降解。该过程可导致由靶标生物体中的靶基因编码的RNA的有效降解或去除。结果是所靶向的基因发生转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源性RNase III酶由异源性核酸分子产生的siRNA分子可有效介导昆虫害虫中的靶基因的下调。
[0184] 在一些实施方案中，核酸分子可包括至少一种可被转录成单链RNA分子的非天然存在的多核苷酸，所述单链RNA分子能够在体外通过分子间杂交形成dsRNA分子。此类dsRNA通常自组装，并且可被提供于昆虫害虫的营养来源中，以实现靶基因的转录后抑制。在这些和另一些实施方案中，核酸分子可包含两种不同的非天然存在的多核苷酸，其中每种多核苷酸与昆虫害虫中的不同靶基因特异性互补。当向例如鞘翅目害虫或半翅目害虫提供dsRNA分子形式的提供这样的核酸分子时，该dsRNA分子抑制害虫中至少两种不同靶基因的表达。
[0185] C.获得核酸分子
[0186] 可使用昆虫害虫中的多种多核苷酸作为靶标来设计核酸分子，诸如iRNA和编码iRNA的DNA分子。然而，天然多核苷酸的选择并非是直截了当的过程。例如，鞘翅目害虫或半翅目害虫中的天然多核苷酸中只有少数会是有效的靶标。Baum等人(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-6。无法肯定地预测特定的天然多核苷酸是否可被本发明的核酸分子有效下调，或者特定的天然多核苷酸的下调是否会对昆虫害虫的生长、活力、进食和/或存活有不利影响。例如，绝大多数的天然鞘翅目害虫多核苷酸，诸如自其分离的EST(例如，美国专利号7,612,194中列出的鞘翅目害虫多核苷酸)，对害虫的生长和/或活力没有不利影响。也无法预测，在可能对昆虫害虫有不利影响的天然多核苷酸中，哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与此类天然多核苷酸互补的核酸分子，并且在害虫进食后对其造成不利影响，同时不对宿主植物造成危害。
[0187] 在一些实施方案中，核酸分子(例如，要在昆虫害虫的宿主植物中提供的dsRNA分子)靶向这样的cDNA，其编码害虫发育和/或存活所必需的蛋白质或蛋白质部分(诸如参与合成代谢或分解代谢生物化学途径、细胞分裂、能量代谢、消化、宿主植物识别等的多肽)。如本文所述，靶标害虫生物体对含有一种或更多种dsRNA(所述dsRNA的至少一个区段与靶标害虫生物体的细胞中产生的RNA的至少一个基本上相同的区段特异性互补)的组合物的摄入可导致该靶标的死亡或其他抑制作用。可使用来源于昆虫害虫的多核苷酸(DNA或RNA)来构建被保护免受害虫侵害的植物细胞。例如，可以转化鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主植物(例如玉蜀黍、甘蓝型油菜、棉花和大豆)，使其含有来源于鞘翅目害虫或半翅目害虫的如本文所提供的一种或更多种多核苷酸。转化到宿主中的多核苷酸可编码在经转化宿主内的细胞或生物流体中形成dsRNA结构的一种或更多种RNA，因此，如果害虫与转基因宿主形成营养关系或者当害虫与转基因宿主形成营养关系时，使得dsRNA可用。这可引起对害虫细胞中一种或更多种基因的表达的阻抑，并最终造成死亡或者对害虫生长或发育的抑制。
[0188] 在特定的实施方案中，靶向的是实质性参与昆虫害虫的生长和发育的基因。本发明中使用的另一些靶基因可包括例如那些在害虫的活力、运动、迀移、生长、发育、感染性和进食部位的建立中发挥重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或转录因子。此外，本发明中使用的天然昆虫害虫多核苷酸也可来源于植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例如直系同源物)，该同源物的功能是本领域技术人员已知的，并且其多核苷酸与靶标害虫的基因组中的靶基因可特异性杂交。通过杂交鉴定具有已知核苷酸序列的基因的同源物的方法是本领域技术人员已知的。
[0189] 在一些实施方案中，本发明提供了用于获得核酸分子的方法，该核酸分子包含用于产生iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子的多核苷酸。一种这样的实施方案包括：(a)分析一种或更多种靶基因在昆虫害虫中，在dsRNA介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cDNA或gDNA文库，所述探针包含来自所靶向害虫的多核苷酸的全部或部分或者其同源物，所靶向害虫在dsRNA介导的阻抑分析中显示出改变的(例如减弱的)生长或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的DNA克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的DNA克隆；(e)对包含步骤(d)中所分离的克隆的cDNA或gDNA片段测序，其中测序的核酸分子包含所述RNA的全部或实质性部分或者其同源物；以及(f)化学合成基因或者siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或dsRNA的全部或实质性部分。
[0190] 在另一些实施方案中，用于获得包含用于产生iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子的实质性部分的多核苷酸的核酸片段的方法包括：(a)合成第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，它们与来自所靶向的昆虫害虫的天然多核苷酸的一部分特异性互补；以及(b)使用步骤(a)的第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的cDNA或gDNA插入物，其中扩增的核酸分子包含siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或dsRNA分子的实质性部分。
[0191] 核酸可通过多种方法分离、扩增或产生。例如，可通过PCR扩增来源于gDNA或cDNA文库的靶多核苷酸(例如，靶基因或靶转录非编码多核苷酸)或其部分来获得iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子。可从靶标生物体提取DNA或RNA，并且可使用本领域普通技术人员已知的方法从所述DNA或RNA制备核酸文库。可使用由靶标生物体生成的gDNA文库或cDNA文库对靶基因进行PCR扩增和测序。可使用确认的PCR产物作为体外转录的模板，以在最低限度启动子的情况下生成有义和反义RNA。作为替代，核酸分子可通过许多技术中的任一种合成(参见例如Ozaki等人，(1992)Nucleic Acids Research，20:5205-5214；以及Agrawal等人，(1990)Nucleic Acids Research，18:5419-5423)，包括使用自动DNA合成仪(例如，P.E.Biosystems,Inc.(Foster City，Calif.)的392或394型DNA/RNA合成仪)、使用标准化学品(诸如亚磷酰胺化学品)。参见例如Beaucage等人，(1992)
Tetrahedron，48:2223-2311；美国专利号4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066和
4,973,679。还可采用产生非天然主链基团的替代性化学品，诸如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。
Tetrahedron，48:2223-2311；美国专利号4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066和
4,973,679。还可采用产生非天然主链基团的替代性化学品，诸如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。
[0192] 本发明的RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子可由本领域技术人员通过手动反应或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含含有编码RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子的多核苷酸的核酸分子的细胞中于活体内产生。还可通过部分或完全有机合成产生RNA，可通过体外酶促或有机合成导入任何经修饰的核糖核苷酸。可通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶)合成RNA分子。可用于克隆和表达多核苷酸的表达构建体是本领域已知的。参见例如国际PCT公布号WO97/32016，以及美国专利号5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693。可以先纯化化学合成的或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，再将其导入细胞中。例如，可通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法或这些手段的组合从混合物纯化RNA分子。作为替代，可以在不纯化或最小程度纯化的情况下使用化学合成的或通过体外酶促合成而合成的RNA分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可将RNA分子干燥以贮存，或溶解在水性溶液中。该溶液可含有缓冲剂或盐，以促进dsRNA分子双链体链退火和/或稳定化。
[0193] 在一些实施方案中，可通过单条自身互补的RNA链或者由两条互补的RNA链形成dsRNA分子。dsRNA分子可以在活体内或在体外合成。细胞的内源性RNA聚合酶可在活体内介导一条或两条RNA链的转录，或者可使用克隆的RNA聚合酶在活体内或在体外介导转录。对昆虫害虫中靶基因的转录后抑制可以是宿主靶向的，这通过以下实现：宿主的器官、组织或细胞类型中的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子)；刺激宿主中的环境条件(例如，通过使用响应于感染、应激、温度和/或化学诱导物的诱导型启动子)；和/或工程化改造宿主的某个发育期或发育龄的转录(例如，通过使用发育期特异性启动子)。形成dsRNA分子的RNA链(不论是体外还是活体内转录的)可以是也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能够被细胞的翻译装置翻译成多肽，也可以不能被细胞的翻译装置翻译成多肽。
[0194] D.重组载体和宿主细胞转化
[0195] 在一些实施方案中，本发明还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞或植物细胞)中的DNA分子，其中该DNA分子包含这样的多核苷酸，该多核苷酸在表达为RNA并被昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫摄取后，可实现对害虫的细胞、组织或器官中的靶基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包含能够在植物细胞中表达为iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)分子以抑制昆虫害虫中的靶基因表达的多核苷酸。为了启动或增强表达，此类重组核酸分子可包含一种或更多种调控元件，所述调控元件可以与能够表达为iRNA的多核苷酸可操作地连接。在植物中表达基因阻抑分子的方法是已知的，并且可用于表达本发明的多核苷酸。参见例如国际PCT公布号WO06/073727；以及美国专利公布号2006/0200878Al)。
[0196] 在具体的实施方案中，本发明的重组DNA分子可包含编码可形成dsRNA分子的RNA的多核苷酸。此类重组DNA分子可以编码可形成这样的dsRNA分子的RNA，所述dsRNA分子在被摄入后能够抑制昆虫害虫细胞中一种或多种内源性靶基因的表达。在许多实施方案中，转录的RNA可形成这样的dsRNA分子，所述dsRNA分子可以以稳定化形式提供；例如，以发夹形式和茎环结构提供。
[0197] 在一些实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自以下的组中的多核苷酸基本同源的多核苷酸转录而形成：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3(例如SEQ ID NO:7-9)中任一个的至少15个(例如，至少19个)连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的至少
15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体(例如，PB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体(例如，BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少
15个连续核苷酸的片段；和包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列。
15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体(例如，PB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体(例如，BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少
15个连续核苷酸的片段；和包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列。
[0198] 在一些实施方案中，dsRNA分子的一条链可以通过从与选自以下的组中的多核苷酸基本同源的多核苷酸转录而形成：SEQ ID NO:7-9；SEQ ID NO:7-9中任一个的互补序列；SEQ ID NO:7-9中任一个的反向互补序列；SEQ ID NOs:7-9中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:7-9中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:
7-9中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
7-9中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0199] 在特定的实施方案中，编码可形成dsRNA分子的RNA的重组DNA分子可包含这样的编码区：其中至少两个多核苷酸被排列成使得相对于至少一个启动子，一个多核苷酸处于有义取向，并且另一个多核苷酸处于反义取向，其中有义多核苷酸和反义多核苷酸通过例如约五(约5)至约一千(约1000)个核苷酸的间隔序列连接或相连。间隔序列可以在有义多核苷酸和反义多核苷酸之间形成环。有义多核苷酸或反义多核苷酸可以与靶基因(例如，包含SEQ ID NO:2、3和7-9中任一项的syx7基因)或其片段基本上同源。然而，在一些实施方案中，重组DNA分子可以编码可形成不含间隔序列的dsRNA分子的RNA。在实施方案中，有义编码多核苷酸和反义编码多核苷酸可具有不同长度。
[0200] 通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒，可容易地将鉴定为对昆虫害虫存在有害影响或者具有就害虫而言的植物保护效果的多核苷酸掺入表达的dsRNA分子中。例如，可通过以下步骤将此类多核苷酸表达为具有茎环结构的发夹：取得对应于靶基因多核苷酸(例如，包含SEQ ID NO:2、3和7-9中任一项的syx7基因)的第一区段；将该多核苷酸连接到第二区段间隔序列区，所述第二区段间隔序列区与第一区段不是同源或互补的；然后将该连接物连接到第三区段，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体的转录物通过由第一区段编码的多核糖核苷酸与由第三区段编码的多核糖核苷酸的分子内碱基配对而形成茎环结构，其中所述环结构形式包含由第二区段编码的多核糖核苷酸。参见例如美国专利公布号2002/0048814和2003/0018993；以及国际PCT公布号WO94/01550和WO98/05770。可例如以双链结构诸如茎环结构(例如发夹)的形式生成dsRNA分子，由此通过例如在另外的可在植物中表达的盒上共表达靶基因的片段来增强靶向天然昆虫害虫多核苷酸的siRNA的产生，所述共表达使得siRNA产生增强，或者减轻甲基化以防止dsRNA发夹启动子的转录基因沉默。
[0201] 本发明的某些实施方案包括将本发明的重组核酸分子导入植物中(即转化)，以实现一种或更多种iRNA分子的抑制性昆虫害虫表达水平。重组DNA分子可以例如是载体，诸如线性或闭合环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总DNA的两个或更多个载体或质粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如在合适启动子的控制下将本发明的多核苷酸适当地插入载体中，所述启动子在一种或更多种宿主中起作用以驱动连接的编码多核苷酸或其他DNA元件表达。许多载体可用于该目的，并且对适当载体的选择将主要取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的具体宿主细胞。根据载体的功能(例如，扩增DNA或表达DNA)及与其相容的具体宿主细胞，每种载体含有多种组件。
[0202] 为了赋予转基因植物对鞘翅目或半翅目昆虫害虫的防护性，例如可以在重组植物的组织或流体内将重组DNA转录成iRNA分子(例如，形成dsRNA分子的RNA分子)。iRNA分子可包含与可对宿主植物物种造成损害的昆虫害虫内的相应转录多核糖核苷酸基本上同源且可特异性杂交的多核糖核苷酸。害虫可例如通过摄入包含iRNA分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿主植物的细胞中转录的iRNA分子。因此，在特定的实例中，在侵害转基因宿主植物的昆虫害虫内，靶基因的表达受到iRNA分子阻抑。在一些实施方案中，对靶鞘翅目害虫或半翅目害虫中靶基因表达的阻抑可保护植物免受害虫攻击。
[0203] 为了使iRNA分子能够被递送给与已用本发明的重组核酸分子转化的植物细胞处于营养关系的昆虫害虫，需要在植物细胞中表达(即转录)iRNA分子。因此，重组核酸分子可包含与一种或更多种调控元件(诸如在宿主细胞中起作用的异源性启动子元件)可操作地连接的本发明的多核苷酸，所述宿主细胞诸如其中待扩增核酸分子的细菌细胞，或其中待表达核酸分子的植物细胞。
[0204] 适合用于本发明的核酸分子的启动子包括诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子或组成型启动子，它们都是本领域公知的。描述此类启动子的非限制性实例包括美国专利号6,437,217(玉蜀黍RS81启动子)、5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)、6,426,446(玉蜀黍RS324启动子)、6,429,362(玉蜀黍PR-1启动子)、6,232,526(玉蜀黍A3启动子)、6,177,611(玉蜀黍组成型启动子)，5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(CaMV 35S启动子)，6,433,252(玉蜀黍L3油质蛋白启动子)、6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和水稻肌动蛋白2内含子)、6,294,714(光诱导型启动子)、6,140,078(盐诱导型启动子)、6,252,138(病原体诱导型启动子)、6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、6,388,170(双向启动子)、6,635,
806(γ-薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子)，以及美国专利公布号2009/757,089(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)。另外的启动子包括胭脂碱合酶(nopaline synthase，NOS)启动子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(16):5745-9)和章鱼碱合酶(octopine
synthase，OCS)启动子(两者都在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导型质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:
810-2)；玄参花叶病毒35S-启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(19):
6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；
R基因复合体启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利号5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196)；FMV
35S(美国专利号6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利号5,850,019)；SCP1启动子(美国专利号6,677,503)；以及AGRtu.nos启动子(GenBankTM登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
806(γ-薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子)，以及美国专利公布号2009/757,089(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)。另外的启动子包括胭脂碱合酶(nopaline synthase，NOS)启动子(Ebert等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(16):5745-9)和章鱼碱合酶(octopine
synthase，OCS)启动子(两者都在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导型质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组启动子，诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人，(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313:
810-2)；玄参花叶病毒35S-启动子(Walker等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(19):
6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；
R基因复合体启动子(Chandler等人，(1989)Plant Cell 1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV 35S(美国专利号5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196)；FMV
35S(美国专利号6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利号5,850,019)；SCP1启动子(美国专利号6,677,503)；以及AGRtu.nos启动子(GenBankTM登录号V00087；Depicker等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7)。
[0205] 在特定的实施方案中，本发明的核酸分子包含组织特异性启动子，诸如根特异性启动子。根特异性启动子驱动唯一地或优先地在根组织中表达可操作地连接的编码多核苷酸。根特异性启动子的实例是本领域已知的。参见例如美国专利号5,110,732、5,459,252和5,837,848；以及Opperman等人，(1994)Science 263:221-3；以及Hirel等人，(1992)Plant Mol.Biol.20:207-18。在一些实施方案中，可以在两个根特异性启动子之间克隆根据本发明的用于鞘翅目和/或半翅目害虫控制的多核苷酸或片段，所述两个根特异性启动子相对于所述多核苷酸或片段以相反的转录方向取向、在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达从而在其中产生RNA分子，这些RNA分子随后可形成dsRNA分子，如前文所述。昆虫害虫可以摄入植物组织中表达的iRNA分子，从而实现对靶基因表达的阻抑。
[0206] 可任选地与核酸可操作地连接的另外的调控元件包括5'UTR，5'UTR位于启动子元件和编码多核苷酸之间充当翻译前导序列元件。翻译前导序列元件存在于完全加工的mRNA中，并且可影响初级转录物的加工和/或RNA的稳定性。翻译前导序列元件的实例包括玉蜀黍和矮牵牛花(petunia)热休克蛋白前导序列(美国专利号5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)前导序列等。参见例如Turner和Foster，(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5'UTR的非限制性实例包括GmHsp(美国专利号5,659,122)、PhDnaK(美国专利号5,362,865)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed，(1990)J.Virol.64:1590-7)和AGRtunos(GenBankTM登录号V00087；Bevan等人，(1983)Nature 304:
184-7)。
184-7)。
[0207] 可任选地与核酸可操作地连接的另外的调控元件还包括3’非翻译元件、3’转录终止区或多聚腺苷酸区。这些是位于多核苷酸下游的遗传元件，包括提供多聚腺苷酸化信号和/或能够影响转录或mRNA加工的其他调控信号的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号在植物中起作用，引起多聚腺苷酸核苷酸添加至mRNA前体的3’端。多聚腺苷酸化元件可以来源于多种植物基因或T-DNA基因。3’转录终止区的一个非限制性实例是胭脂碱合酶3’区(nos 3’；Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。使用不同的3’非翻译区的一个实例在Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1:671-80中提供。多聚腺苷酸化信号的非限制性实例包括来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因的信号(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人，(1984)EMBOJ.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBankTM登录号E01312)。
[0208] 一些实施方案可包括植物转化载体，该植物转化载体包含经分离和纯化的DNA分子，该DNA分子包含与本发明的一种或更多种多核苷酸可操作地连接的上述调控元件中的至少一者。所述一种或更多种多核苷酸在表达时生成一种或更多种包含多核糖核苷酸的iRNA分子，所述多核糖核苷酸与昆虫害虫中的天然RNA分子的全部或部分特异性互补。因此，所述一种或多种多核苷酸可包含编码所靶向的昆虫害虫RNA转录物内存在的多聚核糖核苷酸的全部或部分的区段，并且可包含所靶向的害虫转录物的全部或部分的反向重复序列。植物转化载体可含有与超过一种靶多核苷酸特异性互补的多核苷酸，从而允许产生超过一种dsRNA以抑制靶标昆虫害虫的一个或更多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。可将与不同基因中存在的多核苷酸特异性互补的多核苷酸的区段组合成单个复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续的，或由间隔序列分开。
[0209] 在一些实施方案中，已含有本发明的至少一种多核苷酸的本发明的质粒可通过在同一质粒中顺序插入另外的一种或多种多核苷酸来修饰，其中所述另外的一种或多种多核苷酸与第一多核苷酸可操作地连接于相同的调控元件。在一些实施方案中，核酸分子可设计用于抑制多种靶基因。在一些实施方案中，要抑制的多种基因可获自相同的昆虫害虫物种，这样可增强核酸分子的有效性。在另一些实施方案中，基因可来源于不同的昆虫害虫，这样可拓宽一种或多种药剂对其有效的害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑或者表达和阻抑的组合时，可以工程化改造多顺反子DNA元件。
[0210] 本发明的重组核酸分子或载体可包含赋予经转化细胞(诸如植物细胞)可选择表型的可选择标志物。也可使用可选择标志物来选择包含本发明的重组核酸分子的植物或植物细胞。所述标志物可编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素等)或除草剂耐受性(例如草甘膦等)。可选择标志物的实例包括但不限于：编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等选择的neo基因；编码双丙氨膦抗性的bar基因；编码草甘膦耐受性的突变EPSP合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的nitrilase基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变乙酰乳酸合酶(ALS)基因；以及甲氨蝶呤抗性DHFR基因。有多种可选择标志物可供使用，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素、壮观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。此类可选择标志物的实例例示于例如美国专利号5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中。
[0211] 本发明的重组核酸分子或载体还可包含可筛选标志物。可使用可筛选标志物来监测表达。示例性可筛选标志物包括：β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码已知多种生色底物的酶(Jefferson等人，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)；R-基因座基因，其编码调控植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，(1988)"Molecularcloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac”，载于第18届斯塔德勒遗传学研讨会(Stadler Genetics Symposium)，P.Gustafson和R.Appels编辑，NewYork:Plenum，第263-82页)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，(1978)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码已知多种生色底物的酶(例如PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；荧光素酶基因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因，其编码可转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:
2703-14)；以及α-半乳糖苷酶。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码已知多种生色底物的酶(例如PADAC，一种生色头孢菌素)的基因；荧光素酶基因(Ow等人，(1986)Science 234:856-9)；xylE基因，其编码可转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(Zukowski等人，(1983)Gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatu等人，(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(其继而缩合成黑色素)的酶(Katz等人，(1983)J.Gen.Microbiol.129:
2703-14)；以及α-半乳糖苷酶。
[0212] 在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源性核酸的方法中，可使用如前文所述的重组核酸分子来制备表现出对昆虫害虫的易感性降低的转基因植物。可以例如通过将编码iRNA分子的核酸插入植物转化载体中，然后将其导入植物中来制备植物转化载体。
[0213] 用于转化宿主细胞的合适方法包括可将DNA导入细胞中的任何方法，诸如通过转化原生质体(参见例如美国专利号5,508,184)、通过干燥(desiccation)/抑制介导的DNA摄取(参见例如Potrykus等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)、通过电穿孔(参见例如美国专利号5,384,253)、通过用碳化硅纤维搅拌(参见例如美国专利号5,302,523和5,464,765)、通过农杆菌介导的转化(参见例如美国专利号5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,
824,877、5,981,840和6,384,301)以及通过加速DNA包被的粒子(参见例如美国专利号5,
015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865)，等等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利号7,060,876和5,591,616，以及国际PCT公布号WO95/
06722中。通过应用诸如这些的技术，可稳定地转化几乎任何物种的细胞。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，可将转基因细胞再生为转基因生物体。可使用这些技术中的任一种来产生转基因植物，例如在其基因组中包含编码一种或更多种iRNA分子的一种或更多种核酸的转基因植物。
824,877、5,981,840和6,384,301)以及通过加速DNA包被的粒子(参见例如美国专利号5,
015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865)，等等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利号7,060,876和5,591,616，以及国际PCT公布号WO95/
06722中。通过应用诸如这些的技术，可稳定地转化几乎任何物种的细胞。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，可将转基因细胞再生为转基因生物体。可使用这些技术中的任一种来产生转基因植物，例如在其基因组中包含编码一种或更多种iRNA分子的一种或更多种核酸的转基因植物。
[0214] 用于将表达载体导入植物中的最广泛使用的方法以农杆菌的天然转化系统为基础。根癌农杆菌和发根农杆菌(A.rhizogenes)是遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒分别携带负责遗传转化植物的基因。Ti(肿瘤诱导型)质粒含有转移到经转化植物的大区段，称为T-DNA。Ti质粒的另一个区段Vir区负责T-DNA转移。T-DNA区以末端重复序列为边界。在经修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，Vir区的功能用来转移以T-DNA边界元件为边界的外来DNA。T区还可含有用于有效回收转基因细胞和植物的可选择标志物，以及用于插入转移多核苷酸诸如dsRNA编码核酸的多克隆位点。
[0215] 因此，在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌农杆菌的Ti质粒(参见例如美国专利号4,536,475、4,693,977、4,886,937和5,501,967，以及欧洲专利号EP 0 122 791)或发根农杆菌的Ri质粒。额另外的植物转化载体包括(例如但不限于)由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及欧洲专利号EP 0 120 516描述的那些，以及来源于前述载体中任一者的那些。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌以介导至许多不同植物的基因转移，诸如中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)，。通过获取卸甲(disarmed)Ti质粒和合适的二元载体二者，可使这些植物相关的共生细菌能够胜任基因转移。
[0216] 在用将外源DNA提供至受体细胞之后，通常鉴定经转化的细胞以供进一步培养和植物再生。为了提高鉴定经转化细胞的能力，技术人员可能期望采用如前提出的可选择或可筛选标志物基因，其中转化载体用来生成转化体。在使用可选择标志物的情况下，通过使细胞暴露于一种或多种选择剂而在可能转化的细胞群体内鉴定出经转化细胞。在使用可筛选标志物的情况下，可针对期望的标志物基因性状来筛选细胞。
[0217] 可将暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞置于支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可通过包含另外的物质(诸如生长调节剂)来改良任何合适的植物组织培养基(例如MS培养基和N6培养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基础培养基上，直到可得到足够的组织用于启动植物再生工作，或者在重复多轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生(例如，至少2周)，然后转移到诱导芽形成的培养基中。定期转移培养物，直到已出现足够的芽形成。一旦形成芽，就将其转移到诱导根形成的培养基中。一旦形成足够的根，就可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
[0218] 为了确认再生植物中存在目的核酸分子(例如，编码一种或更多种iRNA分子的DNA)，可执行多种测定。此类测定包括例如：分子生物学测定，诸如Southern印迹和northern印迹、PCR和核酸测序；生物化学测定，诸如检测是否存在蛋白质产物，例如通过免疫学手段(ELISA和/或western印迹)或借助酶促功能；植物部分测定，诸如叶或根测定；以及对整个再生植物的表型的分析。
[0219] 可例如通过使用例如对目的核酸分子有特异性的寡核苷酸引物进行PCR扩增来分析整合事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于：来源于经分离的宿主植物愈伤组织的gDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，预测其中含有整合到基因组中的目的核酸分子，接着是PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。PCR基因分型的方法已得到充分描述(例如Rios,G.等人，(2002)Plant J.32:243-53)，并且可应用于来源于任何植物物种(例如玉蜀黍、棉花、大豆和甘蓝型油菜)或组织类型(包括细胞培养物)的gDNA。
[0220] 使用农杆菌依赖性转化方法形成的转基因植物通常含有插入一条染色体中的单个重组DNA。该单个重组DNA的多核苷酸被称为“转基因事件”或“整合事件”。此类转基因植物对于插入的外源性多核苷酸而言是杂合的。在一些实施方案中，通过将含有单个外源性基因的独立的分离转基因植物与自身(例如T0植物)有性交配(自交)以产生T1种子，可获得相转基因纯合的转基因植物。所产生的T1种子的四分之一将会是所述转基因纯合的。萌发T1种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试通常使用SNP测定或热扩增测定，使得允许区分杂合子和纯合子(即接合性测定(zygosity assay))。
[0221] 在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有昆虫害虫抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种、或者更多种不同的iRNA分子。可以由在不同转化事件中导入的多种核酸、或由在单个转化事件中导入的单种核酸表达iRNA分子(例如dsRNA分子)。在一些实施方案中，在单个启动子的控制下表达多个iRNA分子。在另一些实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个iRNA分子。可以由多核苷酸表达单一iRNA分子，所述多核苷酸包含各自与在相同的昆虫害虫物种的不同群体中或在不同的昆虫害虫物种中的一种或更多种昆虫害虫内的不同基因座(例如，由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3限定的基因座)同源的多个核苷酸序列，所述昆虫害虫例如鞘翅目害虫(如PB)和半翅目害虫(如BSB)。
[0222] 除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将包含编码iRNA分子的多核苷酸的重组核酸分子导入易于转化的第一植物株系中以产生转基因植物，该转基因植物可与第二植物株系杂交，以使该编码iRNA分子的多核苷酸渗入(introgress)到第二植物株系中。
[0223] 在一些方面，包括由来源于经转化植物细胞的转基因植物产生的种子和商品产品，其中所述种子或商品产品包含可检出量的本发明的核酸。在一些实施方案中，可例如通过获得转基因植物并由其制备食品或饲料来生产此类商品产品。包含本发明的多核苷酸中的一者或更多者的商品产品包括(例如但不限于)：植物的粗粉、油、碾碎的或完整的籽粒或种子，以及包含含有本发明的核酸分子中的一者或更多者的重组植物或种子的任何粗粉、油或者碾碎的或完整的籽粒的任何食品产品。在特定实例中，商品产品为饵料组合物或酯基，其包含一种或更多种本发明的核酸分子。在一种或更多种商品或商品产品中检出本发明的多核苷酸中的一者或更多者，实际上证明了该商品或商品产品是由出于控制昆虫害虫的目的被设计为表达本发明的iRNA分子中的一者或更多者的转基因植物产生的。
[0224] 在一些实施方案中，包含本发明的核酸分子的转基因植物或种子还可以在其基因组中包含至少一个另外的转基因事件，包括但不限于：从其转录iRNA分子转基因事件，该iRNA分子靶向露尾甲属中除了由SEQ ID NO:2所定义的基因座之外的基因座、美洲蝽属中除了由SEQ ID NO:3所定义的基因座之外的基因座，以及叶甲属中的基因座，诸如例如选自以下的一个或更多个基因座：syx7(SEQ ID NO:1)，Caf 1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rhol(美国专利申请公开号
2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA 70(美国专利申请公开号2013/0091601)、RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)、ROP(美国专利申请公开号14/577,811)、RNA聚合酶II(美国专利申请公开号62/133,214)、RNA聚合酶III 40(美国专利申请公开号14/577,854)、RNA聚合酶II
215(美国专利申请公开号62/133,202)、RNA聚合酶II 33(美国专利申请公开号62/133,
210)、转录延伸因子spt5(美国专利申请号62/168,613)、转录延伸因子spt6(美国专利申请号62/168,606)、ncm(美国专利申请号62/095487)、dre4(美国专利申请号14/705,807)、COPIα(美国专利申请号62/063,199)、COPIβ(美国专利申请号62/063,203)、COPIγ(美国专利申请号62/063,192)和COPIδ(美国专利申请号62/063,216)；由其转录靶向以下基因的iRNA分子的转基因事件：除鞘翅目害虫以外的生物体(例如，植物寄生线虫中的基因)；编码杀虫蛋白的基因(例如，苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白和PIP-1多肽)；除草剂耐受基因(例如，对草甘膦具有耐受性的基因)；以及在转基因植物中导致期望表型的基因，例如增加产量、改变脂肪酸代谢或细胞质雄性不育的恢复。在特定的实施方案中，可将编码本发明的iRNA分子的多核苷酸与植物中的其他昆虫控制和疾病性状组合以获得期望性状，以增强对植物疾病和昆虫损害的控制。在一些实例中，可以组合编码杀虫蛋白的基因，包括例如但不限于：编码产碱杆菌属杀虫蛋白-1A和产碱杆菌属杀虫蛋白-1B(AflP-1A和AflP-1B)多肽的分离或重组核酸分子(美国专利申请公开号2014/0033361)；编码PIP多肽的分离的或重组的核酸分子(WO 2015038734)。例如由于降低了在田间对性状产生抗性的可能性，因此，将采用不同作用方式的昆虫控制性状进行组合可以为受保护的转基因植物提供优于具有单一控制性状的植物的持久性。
2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA 70(美国专利申请公开号2013/0091601)、RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)、ROP(美国专利申请公开号14/577,811)、RNA聚合酶II(美国专利申请公开号62/133,214)、RNA聚合酶III 40(美国专利申请公开号14/577,854)、RNA聚合酶II
215(美国专利申请公开号62/133,202)、RNA聚合酶II 33(美国专利申请公开号62/133,
210)、转录延伸因子spt5(美国专利申请号62/168,613)、转录延伸因子spt6(美国专利申请号62/168,606)、ncm(美国专利申请号62/095487)、dre4(美国专利申请号14/705,807)、COPIα(美国专利申请号62/063,199)、COPIβ(美国专利申请号62/063,203)、COPIγ(美国专利申请号62/063,192)和COPIδ(美国专利申请号62/063,216)；由其转录靶向以下基因的iRNA分子的转基因事件：除鞘翅目害虫以外的生物体(例如，植物寄生线虫中的基因)；编码杀虫蛋白的基因(例如，苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫蛋白和PIP-1多肽)；除草剂耐受基因(例如，对草甘膦具有耐受性的基因)；以及在转基因植物中导致期望表型的基因，例如增加产量、改变脂肪酸代谢或细胞质雄性不育的恢复。在特定的实施方案中，可将编码本发明的iRNA分子的多核苷酸与植物中的其他昆虫控制和疾病性状组合以获得期望性状，以增强对植物疾病和昆虫损害的控制。在一些实例中，可以组合编码杀虫蛋白的基因，包括例如但不限于：编码产碱杆菌属杀虫蛋白-1A和产碱杆菌属杀虫蛋白-1B(AflP-1A和AflP-1B)多肽的分离或重组核酸分子(美国专利申请公开号2014/0033361)；编码PIP多肽的分离的或重组的核酸分子(WO 2015038734)。例如由于降低了在田间对性状产生抗性的可能性，因此，将采用不同作用方式的昆虫控制性状进行组合可以为受保护的转基因植物提供优于具有单一控制性状的植物的持久性。
[0225] V.昆虫害虫中的靶基因阻抑
[0226] A.概述
[0227] 在本发明的一些实施方案中，可向昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫提供至少一种可用于控制昆虫害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在所述害虫中引起RNAi介导的基因沉默。在特定的实施方案中，可向昆虫害虫提供iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)。在一些实施方案中，可通过使可用于控制昆虫害虫的核酸分子与害虫接触，来向所述害虫提供所述核酸分子。在这些和另一些实施方案中，可以在昆虫害虫的进食基质(例如营养组合物)中提供可用于控制所述害虫的核酸分子。在这些和另一些实施方案中，可通过摄入被昆虫害虫摄入的包含可用于控制所述害虫的核酸分子的植物材料，来提供所述核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子通过导入植物材料中的重组核酸的表达而存在于所述植物材料中，例如通过用包含重组核酸的载体转化植物细胞，然后从经转化的植物细胞再生植物材料或整个植株而进行。
[0228] 在一些实施方案中，害虫通过与局部组合物(例如，通过喷雾施用的组合物)或RNAi诱饵接触而与导致害虫中RNAi介导的基因沉默的核酸分子接触。将dsRNA与食物或引诱剂或两者混合时会形成RNAi诱饵。当害虫吃掉诱饵时，它们也会食用dsRNA。诱饵可以采取颗粒、凝胶、可流动粉末、液体或固体形式。在特定的实施方案中，可将靶向syx7的iRNA分子掺入诱饵制剂中，例如通过引用并入本文的美国专利号8,530,440中描述的那些。通常，使用诱饵时，例如将诱饵放置在昆虫害虫的环境中或周围，以使昆虫害虫可以与诱饵接触和/或被其吸引。
[0229] B.RNAi介导的靶基因阻抑
[0230] 在一些实施方案中，本发明提供了iRNA分子(例如，dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA和hpRNA)，可例如设计此类分子使之靶向昆虫害虫(例如鞘翅目(例如PB)或半翅目(例如BSB)害虫)的转录组中的必需天然多核苷酸(例如必需基因)，例如通过设计有至少一条链包含与靶多核苷酸特异性互补的多核苷酸的iRNA分子来进行。如此设计的iRNA分子的序列可以与靶多核苷酸的序列相同，或者可以掺入不阻止iRNA分子与其靶多核苷酸之间的特异性杂交的错配。
[0231] 本发明的iRNA分子可以在用于昆虫害虫中的基因阻抑的方法中使用，从而降低由害虫对植物(例如，包含iRNA分子的受保护的经转化植物)造成的损害的水平或发生率。如本文所用，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因转录成mRNA及随后mRNA翻译而产生的蛋白质的水平的任一种公知方法，包括降低由基因或编码多核苷酸的蛋白质表达，包括转录后抑制表达和转录阻抑。转录后抑制通过从被靶向以受阻抑的基因转录的mRNA的全部或部分与用于阻抑的相应iRNA分子之间的特异性同源性来介导。此外，转录后抑制是指细胞中用于被核糖体结合的可用mRNA的量出现实质性及可测量的下降。
[0232] 在其中iRNA分子为dsRNA分子的实施方案中，酶DICER可将dsRNA分子切割成短siRNA分子(长度大约为20个核苷酸)。借助DICER对dsRNA分子的活性而生成的双链siRNA分子可分成两个单链siRNA：“过客链”和“引导链”。过客链可降解，引导链则可掺入RISC中。转录后抑制通过引导链与mRNA分子的特异性互补多核苷酸特异性杂交，随后通过酶Argonaute(RISC复合物的催化组分)切割而发生。
[0233] 在本发明的实施方案中，可使用任何形式的iRNA分子。本领域的技术人员会理解，在制备过程中以及在对细胞提供iRNA分子的步骤过程中，dsRNA分子通常比单链RNA分子更稳定，并且在细胞中通常也是更稳定的。因此，例如，虽然在一些实施方案中siRNA分子和miRNA分子可能是同等有效的，但dsRNA分子可能由于其稳定性而被选用。
[0234] 在特定的实施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，该多核苷酸可在体外表达以产生iRNA分子，该iRNA分子包含与昆虫害虫基因组内的多核苷酸所编码的RNA分子的多核糖核苷酸基本上同源的多核糖核苷酸。在某些实施方案中，体外转录的iRNA分子可以是包含茎环结构的稳定化dsRNA分子。在昆虫害虫接触体外转录的iRNA分子之后，可发生对该害虫中的靶基因(例如必需基因)的转录后抑制。
[0235] 在本发明的一些实施方案中，在鞘翅目害虫中靶基因的转录后抑制方法中使用包含多核苷酸的至少15个连续核苷酸(例如，至少19个连续核苷酸)的核酸分子的表达，其中多核苷酸选自SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:2的反向互补序列；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体(例如，PB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。在某些实施方案中，可以使用与前述任一种至少约80％相同(例如，79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约
98％、约99％、约100％和100％)的核酸分子的表达。在这些和另一些实施方案中，可以表达与存在于鞘翅目昆虫(例如，露尾甲属)害虫的至少一个细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
98％、约99％、约100％和100％)的核酸分子的表达。在这些和另一些实施方案中，可以表达与存在于鞘翅目昆虫(例如，露尾甲属)害虫的至少一个细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
[0236] 在本发明的一些实施方案中，在半翅目害虫中靶基因的转录后抑制方法中使用包含多核苷酸的至少15个连续核苷酸(例如，至少19个连续核苷酸)的核酸分子的表达，其中多核苷酸选自SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:3的反向互补序列；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:8的互补序列；SEQ ID NO:8的反向互补序列；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:9的互补序列；SEQ ID NO:9的反向互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体(例如，BSB)的天然编码多核苷酸；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码多核苷酸的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。在某些实施方案中，可以使用与前述任一种至少约80％相同(例如，79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％和100％)的核酸分子的表达。在这些和另一些实施方案中，可以表达与存在于半翅目昆虫(例如，美洲蝽属)害虫的至少一个细胞中的RNA分子特异性杂交的核酸分子。
[0237] 本文的一些实施方案的重要特征在于，RNAi转录后抑制系统能够容忍靶基因中预期由于遗传突变、株系多态性或演化趋异而可能发生的序列变异。导入的核酸分子可以不必与靶基因的初级转录产物或充分加工的mRNA绝对同源，只要导入的核酸分子与靶基因的初级转录产物或充分加工的mRNA可特异性杂交即可。另外，相对于靶基因的初级转录产物或充分加工的mRNA，导入的核酸分子不必是全长的。
[0238] 使用本发明的iRNA技术抑制靶基因是序列特异性的；也就是说，靶向与一种或多种iRNA分子基本上同源的多核苷酸进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用这样的RNA分子进行抑制：其包含核苷酸序列与靶基因的一部分的核苷酸序列相同的多核苷酸。在这些和另一些实施方案中，可以使用包含相对于靶多核苷酸具有一个或更多个插入、缺失和/或点突变的多核苷酸的RNA分子。在特定的实施方案中，iRNA分子和靶基因的一部分可共享例如至少从约80％、至少从约81％、至少从约82％、至少从约83％、至少从约84％、至少从约85％、至少从约86％、至少从约87％、至少从约88％、至少从约89％、至少从约90％、至少从约91％、至少从约92％、至少从约93％、至少从约94％、至少从约95％、至少从约96％、至少从约97％、至少从约98％、至少从约99％、至少从约100％以及100％的序列同一性。可替选地，dsRNA分子的双链体区可与靶基因转录物的一部分可特异性杂交。在可特异性杂交的分子中，表现出较大同源性的小于全长的多核苷酸补偿较长的、较小同源性的多核苷酸。
dsRNA分子的双链体区中与靶基因转录物的一部分相同的多核苷酸的长度可以是至少约
25、50、100、200、300、400、500个或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于20个至100个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，可以使用大于约200个至300个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，根据靶基因的大小，可以使用大于约500个至1000个核苷酸的多核苷酸。
dsRNA分子的双链体区中与靶基因转录物的一部分相同的多核苷酸的长度可以是至少约
25、50、100、200、300、400、500个或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于20个至100个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，可以使用大于约200个至300个核苷酸的多核苷酸。在特定的实施方案中，根据靶基因的大小，可以使用大于约500个至1000个核苷酸的多核苷酸。
[0239] 在某些实施方案中，可以将昆虫害虫中靶基因的表达在该害虫的细胞内抑制至少10％、至少33％、至少50％或至少80％，使得发生显著抑制。显著抑制是指高于阈值的抑制，该抑制造成可检出的表型(例如，生长停止、进食停止、发育停止、诱导性死亡等)，或者与正被抑制的靶基因对应的RNA和/或基因产物出现可检出的减少。虽然在本发明的某些实施方案中，在所述害虫的基本上所有细胞中均发生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶基因的细胞子集中发生抑制。
[0240] 在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由与启动子DNA或其互补序列表现出实质性序列同一性的dsRNA分子的存在所介导，从而实现所谓的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可摄入或接触此类dsRNA分子的昆虫害虫中(例如通过摄入或接触含有所述dsRNA分子的植物材料)针对靶基因起效。在启动子反式阻抑中使用的dsRNA分子可以特异性地设计为抑制或阻抑昆虫害虫细胞中的一种或更多种同源多核苷酸或互补多核苷酸的表达。美国专利号5,107,065、5,759,829、5,283,184和5,231,020中公开了通过反义或有义取向的RNA进行转录后基因阻抑以调控植物细胞中的基因表达。
[0241] C.提供给昆虫害虫的iRNA分子的表达
[0242] 可按许多体外形式或活体内形式中的任一种表达用于在昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫中进行RNAi介导的基因抑制的iRNA分子。然后可向昆虫害虫提供iRNA分子，例如通过使iRNA分子与害虫接触，或通过引起害虫摄入或以其他方式内化iRNA分子。一些实施方案包括昆虫害虫的经转化宿主植物、经转化植物细胞和经转化植物的后代。经转化植物细胞和经转化植物可工程化改造为例如在异源性启动子的控制下表达所述iRNA分子中的一者或更多者，以提供害虫防护效果。因此，当昆虫害虫在进食期间食用转基因植物或植物细胞时，该害虫可摄入转基因植物或细胞中表达的iRNA分子。也可将本发明的多核苷酸导入多种多样的原核微生物宿主和真核微生物宿主中以产生iRNA分子。术语“微生物”包括原核物种和真核物种，诸如细菌和真菌。
[0243] 基因表达的调控可包括对这种表达的部分或完全阻抑。在另一些实施方案中，用于阻抑昆虫害虫中的基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提供基因阻抑量的由如本文所述的多核苷酸在转录后形成的至少一种dsRNA分子，其至少一个区段与昆虫害虫细胞内的mRNA互补。昆虫害虫所摄入的dsRNA分子，包括其经修饰形式诸如siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子，可以与由例如包含选自SEQ ID NO:2，3和7-9的多核苷酸的syx7 DNA分子转录的RNA分子有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％相同。因此，提供了用于提供dsRNA分子的经分离和基本上纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的多核苷酸和重组DNA构建体，其在导入昆虫害虫时阻抑或抑制其中的内源性编码多核苷酸或靶编码多核苷酸的表达。
[0244] 特定的实施方案提供了用于递送iRNA分子以便转录后抑制昆虫类植物害虫中的一种或更多种靶基因并且控制所述植物害虫的种群体递送系统。在一些实施方案中，所述递送系统包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转录的RNA分子的宿主细胞内容物的摄入。在这些和另一些实施方案中，创建转基因植物细胞或转基因植物，其含有提供本发明的稳定化dsRNA分子的重组DNA构建体。包含编码特定iRNA分子的核酸的转基因植物细胞和转基因植物可通过下述方式产生：采用重组DNA技术(这些基础技术是本领域公知的)构建包含编码本发明的iRNA分子(例如，稳定化的dsRNA分子)的多核苷酸的植物转化载体，转化植物细胞或植物，以及生成含有经转录iRNA分子的转基因植物细胞或转基因植物。
[0245] 为了赋予转基因植物对昆虫害虫的防护性，可以例如将重组DNA分子转录成iRNA分子，诸如dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子或hpRNA分子。在一些实施方案中，从重组DNA分子转录的RNA分子可以在重组植物的组织或流体内形成dsRNA分子。这样的dsRNA分子可以部分地包含与由可能侵害宿主植物的昆虫害虫类型内的DNA转录而来的对应多核糖核苷酸相同的多核糖核苷酸。所述害虫内靶基因的表达受到dsRNA分子阻抑，并且对所述害虫中靶基因表达的阻抑导致保护转基因植物免受害虫损害。已显示dsRNA分子的调控作用适用于害虫中表达的多种基因，包括例如负责细胞代谢或细胞转化的内源性基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；以及编码参与细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
[0246] 为了从活体内的转基因或表达构建体进行转录，可以在一些实施方案中使用调控区(例如，启动子、增强子、沉默子和多聚腺苷酸化信号)来转录一条或多条RNA链。因此，在一些实施方案中，如前文示出的，用于产生iRNA分子的多核苷酸可以与在植物宿主细胞中具有功能的一种或更多种启动子元件可操作地连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源性启动子。在可操作地连接的启动子元件控制下，本发明的多核苷酸可进一步侧接有利地影响其转录和/或所得转录物的稳定性的额外元件。此类元件可位于可操作地连接的启动子的上游、表达构建体3’端的下游，并且可既存在于所述启动子的上游、又存在于表达构建体3’端的下游。
[0247] 一些实施方案提供了用于减轻由以植物为食的昆虫害虫所引起的对宿主作物植物(例如玉米植物、大豆植物、棉花植物以及低芥酸菜子)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表达本发明的至少一种核酸分子的经转化植物细胞，其中所述核酸分子在被一种或多种害虫摄取后起作用以抑制所述害虫内靶多核苷酸的表达，该表达抑制造成所述害虫死亡和/或生长减缓，从而减轻由所述害虫引起的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，所述核酸分子包括dsRNA分子。在这些和另一些实施方案中，所述核酸分子包括分别含有超过一种与鞘翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核糖核苷酸的dsRNA分子。在一些实施方案中，所述核酸分子由一种与昆虫害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核苷酸组成。
[0248] 在一些实施方案中，提供了用于提高作物植物(例如玉米植物、大豆植物、棉花植物以及低芥酸菜子)产量的方法，其中所述方法包括将包含本发明的多核苷酸的至少一种核酸分子导入植物中；栽培该植物，以允许由所述多核苷酸表达iRNA分子，其中所述iRNA分子的表达抑制昆虫害虫损害和/或生长，从而降低或消除由于害虫侵害所致的产量损失。在一些实施方案中，所述iRNA分子为dsRNA分子。在这些和另一些实施方案中，所述dsRNA分子可各自包含超过一种与昆虫害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的多核糖核苷酸。因此，dsRNA分子的特异性多核糖核苷酸可由在本发明的多核苷酸内的一种或更多种核苷酸序列表达。
[0249] 在一些实施方案中，提供了用于调控昆虫害虫中靶基因的表达的方法，所述方法包括：用包含编码本发明的至少一种iRNA分子的多核苷酸的载体转化植物细胞，其中所述多核苷酸与启动子和转录终止元件可操作地连接；在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养经转化植物细胞；选择已将所述多核苷酸整合到其基因组中的经转化植物细胞；针对由整合的多核苷酸编码的iRNA分子的表达，筛选经转化植物细胞；选择表达iRNA分子的转基因植物细胞；然后用选择的转基因植物细胞喂食所述昆虫害虫。还可从表达由整合的核酸分子编码的iRNA分子的转基因植物细胞再生植物。在一些实施方案中，所述iRNA分子为dsRNA分子，其包含与昆虫害虫中的靶基因转录物可特异性杂交的多核糖核苷酸。在这些和另一些实施方案中，所述dsRNA分子包含超过一种由编码该dsRNA分子的多核苷酸内的核苷酸序列转录的多核糖核苷酸。
[0250] 可将本发明的iRNA分子作为由掺入植物细胞基因组中重组基因的表达产物、或将其掺入至种植前施用于种子的包衣或种子处理剂中，从而将其掺入植物物种(例如玉米植物、大豆植物、棉花植物以及低芥酸菜子)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。本发明的实施方案中还包括用于将iRNA分子递送到昆虫害虫的递送系统。例如，可将本发明的iRNA分子直接导入一种或多种害虫的细胞中。用于导入的方法可包括将iRNA与来自一种或多种昆虫害虫宿主的植物组织直接混合，以及向宿主植物组织施用包含本发明的iRNA分子的组合物。例如，可将iRNA分子喷洒到植物表面上。作为替代，可通过微生物表达iRNA分子，然后可将微生物施用到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入根或茎中。如前文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以足以杀死已知侵害植物的昆虫害虫的量来表达至少一种iRNA分子。通过化学或酶促合成产生的iRNA分子也可按符合常见农业实践的方式配制，并且作为喷雾产品或诱饵产品使用以控制昆虫害虫所致的植物损害。制剂可包含有效叶覆盖所需的适当佐剂(例如粘着剂和湿润剂)，以及保护iRNA分子(例如，dsRNA分子)免受紫外线损害的紫外线保护剂。此类添加剂常用于生物杀虫剂产业中，并且是本领域技术人员公知的。此类应用可与其他喷雾杀虫剂应用(基于生物学或其他方面)组合，以增强对所述害虫的植物防护性。
[0251] 本文引用的全部参考文献(包括出版物、专利和专利申请)，以其不与本公开内容的明确细节矛盾的程度并且以如同单独地和具体地指明每篇参考文献均以引用方式并入且在本文中全文示出的程度，通过引用并入本文。对本文论述的参考文献进行提供仅仅是为了参考其在本申请提交日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被理解为承认发明人由于在先发明而无权先于这样的公开内容。
[0252] 提供以下实施例是为了例示某些特定的特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限于所描述的特定特征或方面。
[0253] 实施例
[0254] 实施例1：花粉甲虫转录组
[0255] 昆虫。幼虫和成虫花粉甲虫采自开花油菜植物的田间(Giessen，Germany)。通过注射两种不同细菌(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、一种酵母菌(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和细菌LPS的混合物对幼年成虫(每个治疗组：n＝20；3次重复)进行攻击。细菌培养物在搅拌下于37℃下生长，并在600nm(OD600)处监测光密度。通过离心在OD600-1下收获细胞，并重悬于磷酸盐缓冲盐水中。使用浸入10mg/ml的LPS(纯化的大肠杆菌(E.Coli)内毒素；SIGMA，Taufkirchen，Germany)以及细菌和酵母培养物的水溶液中的解剖针刺破花粉甲虫成虫的腹部，从腹外侧引入混合物。在同一时间点，与免疫攻击的甲虫一起收集原初 甲虫和幼虫(每组n＝20，每组3个重复)。
[0256] RNA分离。免疫接种后8小时，使用TriReagent(Molecular Research Centre，Cincinnati，OH，USA)从冷冻的甲虫和幼虫中提取总RNA，并在每种情况下使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)按照制造商的指导纯化总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000Nano试剂盒(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)验证RNA的完整性。使用Nanodrop ND-1000分光光度计测定RNA的量。从各成虫免疫诱导的处理组、成虫对照组和幼虫组分别提取RNA，然后将每个样品(免疫攻击的成虫、对照成虫和幼虫)的等量总RNA合并到一个池中进行测序。
[0257] 转录组信息。RNA-Seq数据生成和集成。对由免疫攻击的成虫、原初(对照)成虫和未处理的幼虫分离的5μg总RNA分别进行单读数(Single-read)100-bp RNA-Seq。测序由EUROFINS MWG Operon使用Illumina HiSeq-2000平台进行。这对于成虫对照甲虫样品产生2080万读数，对LPS攻击的成虫样品产生2150万读数，对幼虫样品产生2510万读数。使用Velvet/Oases汇编软件(Schulz等人，(2012)Bioinformatics 28:1086-92；Zerbino和Birney(2008)Genome Res.18:821-9)汇编合并的读数(6750万)。转录组包含55,648个序列。
[0258] 花粉甲虫syx7鉴定。转录组的tblastn搜索用于鉴定匹配的重叠群。作为查询，使用来自赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的syx7的肽序列(Genbank XP_973455.1)。鉴定了一个重叠群(RGK_contig6520)。
[0259] 实施例2：使用Syx7 iRNA处理后的花粉甲虫的死亡率
[0260] 使用在5'端包含T7聚合酶启动子序列的基因特异性引物，通过PCR产生约424bp的PCR产物(SEQ ID NO:7)。根据制造商的方案，将PCR片段克隆到pGEM T easy载体中，并发送至测序公司以验证序列。然后根据制造商的方案，通过T7 RNA聚合酶( RNAi试剂盒，Applied Biosystems)，由经测序的质粒产生的PCR构建体产生dsRNA。
[0261] 注射生物测定。在解剖立体显微镜下，用显微操作器向成年甲虫(表12)和幼年甲虫(表13)注射约100nL dsRNA(1μg/uL)(n＝10，三个生物学重复)。在将动物在冰上麻醉，然后粘贴到双面胶带上。对照组接受了相同体积的水。由于缺少动物，因此无法测试所有阶段的所有对照。由于昆虫的可利用性受限，在不同的日期进行对照。用干燥的花粉和湿纸巾将花粉甲虫保存在皮氏培养皿中。
[0262] 表12.油菜露尾甲成虫花粉甲虫注射生物测定的结果(百分比存活平均值±标准偏差(SD)，n＝3组，每组10个)。
[0263]
[0264] 表13.油菜露尾甲幼虫花粉甲虫注射生物测定的结果(百分比存活平均值±标准偏差(SD)，n＝3组，每组10个)。
[0265]
[0266] 进食生物测定。在处理前24小时，将甲虫保持在空的离心管中，不能获取水。将一滴dsRNA(约5μL)放在一个小的皮氏培养皿中，并向皮氏培养皿中加入5至8个甲虫。在立体显微镜下观察动物，并选择摄取了含有dsRNA的饮食溶液的动物进行生物测定。将甲虫转移到带有干花粉和湿纸巾的皮氏培养皿中。对照组接受相同体积的水。进行IMPI(鳞翅目大蜡螟(Galleria mellonella)的昆虫金属蛋白酶抑制剂基因)的阴性对照dsRNA。由于缺少动物，因此无法测试所有阶段的所有对照。由于昆虫的可利用性受限，因此在不同的日期进行对照。
[0267] 表14.油菜露尾甲成虫进食生物测定的结果(百分比存活平均值±标准偏差(SD)，n＝3组，每组10个)。
[0268]
[0269] 实施例3：农杆菌介导转化低芥酸菜子下胚轴
[0270] 产生用于花粉甲虫攻击的10-20株转基因甘蓝型油菜植物，其包含表达靶向syx7的发夹dsRNA的RNAi构建体。编码发夹dsRNA的多核苷酸包含SEQ ID NO:2的连续核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:7)。
[0271] 农杆菌制备。将含有二元质粒的农杆菌菌株在含有链霉素(100mg/mL)和壮观霉素(50mg/mL)的YEP培养基(Bacto PeptoneTM20.0gm/L和酵母提取物10.0gm/L)平板上划线，并在28℃下孵育2天。使用无菌接种环从2天的划线平板上刮下含有二元质粒的繁殖的农杆菌菌株。然后，将刮下的含有二元质粒的农杆菌菌株接种到含有链霉素(100mg/mL)和壮观霉素(50mg/mL)的150mL改良YEP液体中，并注入一个或多个无菌的500mL折流烧瓶中，并在200rpm下于28℃下摇动。将培养物离心并重悬于M-培养基(LS盐，3％葡萄糖、改良B5维生素、1μM激动素、1μM 2,4-D、pH 5.8)中，并在转化低芥酸菜子下胚轴之前稀释至合适的密度(50Klett单位，如使用分光光度计测量的)。
[0272] 低芥酸菜子转化
[0273] 种子萌发：将低芥酸菜子种子(NEXERA 710TM变种)在10％CloroxTM中表面灭菌10分钟，并用无菌蒸馏水冲洗3次(在此过程中，种子包含在钢制滤器中)。将种子种植在PhytatraysTM(每PhytatrayTM中25粒种子)中包含的1/2MS的低芥酸菜子培养基(1/2MS，2％蔗糖，0.8％琼脂)上进行萌发，并放入PercivalTM生长室中，生长方案设定为25℃，光周期为16:8小时的光照:黑暗，持续萌发5天。
[0274] 预处理：第5天，无菌切除长度为约3mm的下胚轴节段，丢弃剩余的根和芽部分(在切除过程期间通过将下胚轴节段浸入10mL的无菌milliQTM水中以防止下胚轴节段变干)。将下胚轴节段水平放置在愈伤组织诱导培养基MSK1D1(MS，1mg/L激动素，1mg/L 2,4-D，3.0％TM蔗糖，0.7％的植物凝胶)上的无菌滤纸上，在Percival 生长室中预处理3天，生长方案设定为22-23℃，且光周期为16:8小时的光照:黑暗。
[0275] 与农杆菌共培养：在农杆菌共培养的前一天，用含有二元质粒的农杆菌菌株接种含有适当抗生素的YEP培养基烧瓶。将下胚轴节段从滤纸愈伤组织诱导培养基MSK1D1转移到包含10mL液态M培养基的空的100x 25mm皮式培养皿中以防止下胚轴节段变干。在此阶段使用刮刀铲出节段并将节段转移到新介质中。用移液管除去液态M培养基，然后将40mL农杆菌悬液添加到皮式培养皿中(500个节段使用40mL农杆菌溶液)。用皮式培养皿的周期性涡旋处理下胚轴节段30分钟，以使下胚轴节段保持浸入在农杆菌溶液中。处理期结束时，用移液枪将农杆菌溶液吸移到废烧杯中；高压灭菌并丢弃(彻底去除农杆菌溶液以防止农杆菌过度生长)。用镊子将处理过的下胚轴转移回含有MSK1D1培养基的原始平板上，并用滤纸覆盖(注意确保节段不会变干)。在降低的光强度下(通过用铝箔覆盖平板)，将经转化的下胚轴节段和未转化的对照下胚轴节段拿回到PercivalTM生长室，并将处理过的下胚轴节段与农杆菌共培养3天。
[0276] 选择培养基上的愈伤组织诱导：共培养3天后，用镊子将下胚轴节段分别转移到愈伤组织诱导培养基MSK1D1H1(MS，1mg/L激动素，1mg/L 2,4-D，0.5gm/L MES，5mg/LAgNO3、300mg/L TimentinTM，200mg/L羧苄青霉素，1mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％植物凝胶)上，生长方案设定为22-26℃。下胚轴节段固定在培养基上，但未深嵌入培养基中。
[0277] 选择和芽再生：在愈伤组织诱导培养基上7天后，将愈伤组织的下胚轴节段转移至具有选择物的芽再生培养基1中：MSB3Z1H1(MS，3mg/L BAP，1mg/L玉米素，0.5gm/L MES，5mg/L AgNO3，300mg/L TimentinTM，200mg/L羧苄青霉素，1mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％植物凝胶)。14天后，将发育芽的下胚轴节段转移到具有增加的选择物的再生培养基2中：
TM
MSB3Z1H3(MS，3mg/L BAP，1mg/L玉米素，0.5gm/L MES，5mg/L AgNO3，300mg/lTimentin ，
200mg/L羧苄青霉素，3mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％植物凝胶)，生长方案设定为22-26℃。
TM
MSB3Z1H3(MS，3mg/L BAP，1mg/L玉米素，0.5gm/L MES，5mg/L AgNO3，300mg/lTimentin ，
200mg/L羧苄青霉素，3mg/L HerbiaceTM，3％蔗糖，0.7％植物凝胶)，生长方案设定为22-26℃。
[0278] 芽伸长：14天后，将发育芽的下胚轴节段从再生培养基2转移到芽伸长培养基MSMESH5(MS，300mg/L TimentinTM，5mg/L HerbiaceTM，2％蔗糖，0.7％TC琼脂)中，生长方案设定为22-26℃。从下胚轴节段中分离出已经伸长的芽，并将其转移至MSMESH5。14天后，将在芽伸长培养基上的第一轮培养中未伸长的剩余芽转移到新鲜芽伸长培养基MSMESH5中。在这个阶段，所有未产生芽的剩余的下胚轴节段被丢弃。
[0279] 生根诱导：在芽伸长培养基上培养14天后，将分离出的芽转移至MSMEST培养基(MS，0.5g/L MES，300mg/L TimentinTM，2％蔗糖，0.7％TC琼脂)以在22-26℃下进行生根诱导。在第一次转移到MSMEST培养基中孵育后，将任何未产生根的芽转移到MSMEST培养基上进行第二轮或第三轮孵育，直到芽发育成根。
[0280] 实施例4：西方玉米根虫控制
[0281] 材料和方法.
[0282] 使用 T7 RNAi试剂盒(LIFE TECHNOLOGIES,Carlsbad,CA)或T7快速高产RNA合成试剂盒(NEW ENGLAND BIOLABS,Whitby,Ontario)合成并纯化多种dsRNA分子(包括与syx7 reg1(SEQ ID NO:4)，syx7 reg1 v1(SEQ ID NO:5)和syx7 reg1 v2(SEQ ID NO:6)对应的那些)。在TE缓冲液中制备纯化的dsRNA分子，所有生物测定均包含由该缓冲液组成的对照处理，其用作WCR(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)死亡率或TM
生长抑制的背景检查。使用NANODROP 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量生物测定缓冲液中dsRNA分子的浓度。
生长抑制的背景检查。使用NANODROP 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量生物测定缓冲液中dsRNA分子的浓度。
[0283] 用人工昆虫饮食对新生昆虫幼虫进行生物测定，对样品的昆虫活性进行测试。WCR卵获自CROP CHARACTERISTICS,INC(Farmington,MN)。
[0284] 生物测定是在专门为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘中进行的(C-DINTERNATIONAL,Pitman,NJ)。每个孔包含约1.0mL的设计用于WCR昆虫生长的人工饮食。通过移液管将60μL等分试样的dsRNA样品递送到每个孔的饮食表面(40μL/cm2)。将dsRNA样品浓度计算为孔表面积(1.5cm2)中每平方厘米(ng/cm2)的dsRNA量。将处理过的托盘放在通风橱中，直到饮食表面的液体蒸发或吸收到饮食中。
[0285] 在羽化的几个小时内，用潮湿的骆驼毛刷拾起单个幼虫，并放置在处理过的饮食上(每孔一个或两个幼虫)。然后，用粘性透明塑料片密封128孔塑料托盘中被侵占的孔，并通风以进行气体交换。将生物测定托盘在受控的环境条件下(28℃，约40％相对湿度，16:8(光:暗)放置9天，然后记录暴露于每个样品的昆虫总数、死亡昆虫的数量和存活昆虫的重量。计算每种处理的平均死亡率百分比和平均生长抑制百分比。生长抑制(GI)的计算如下：
[0286] GI＝[1–(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，
[0287] 其中TWIT是处理中的活昆虫的总重量；
[0288] TNIT是处理中的昆虫的总数；
[0289] TWIBC是背景检查(缓冲液对照)中活昆虫的总重量；以及
[0290] TNIBC是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫总数。
[0291] 使用JMPTM软件(SAS,Cary,NC)进行统计分析。
[0292] LC50(致死浓度)定义为杀死50％的测试昆虫的剂量。GI50(生长抑制)定义为测试昆虫的平均生长(例如活重)为背景检查样品中所见平均值的50％时的剂量。
[0293] 重复的生物测定表明，特定样品的摄入导致了玉米根虫幼虫死亡和生长抑制。
[0294] 扩增WCR syx7以产生dsRNA.
[0295] 本文中称为syx 7的叶甲属(Diabrotica)靶基因序列的全长或部分克隆用于产生用来合成dsRNA的PCR扩增子。设计引物以通过PCR扩增每个靶基因的编码区的部分。参见表1。在适当的情况下，将T7噬菌体启动子序列(TTAATACGACTCACTATAGGGAGA；；SEQ ID NO:13)掺入扩增的有义或反义链的5'末端。参见表1。使用 (Life Technologies,Grand Island,NY)从WCR提取总RNA，然后用于使用 第一链合成系统和制造商Oligo
dT引物指导(Life Technologies,Grand Island,NY)制备第一链cDNA。第一链cDNA用作PCR反应的模板，使用被定位来扩增全部或部分天然靶基因序列的相对引物。还从包含黄色荧光蛋白(YFP)(SEQ ID NO:14；Shagin等人，(2004)Mol.Biol.Evol.21(5):841-50)的编码区的DNA克隆扩增dsRNA。
dT引物指导(Life Technologies,Grand Island,NY)制备第一链cDNA。第一链cDNA用作PCR反应的模板，使用被定位来扩增全部或部分天然靶基因序列的相对引物。还从包含黄色荧光蛋白(YFP)(SEQ ID NO:14；Shagin等人，(2004)Mol.Biol.Evol.21(5):841-50)的编码区的DNA克隆扩增dsRNA。
[0296] 表1.用于扩增示例性syx7靶基因和YFP阴性对照基因的编码区部分的引物和引物对。
[0297]
[0298] 通过PCR和dsRNA合成的模板制备。用来提供syx7和YFP dsRNA生产的特定模板的策略在图1中示出。使用表1中的引物对和从WCR卵、一龄幼虫或成虫分离的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，通过PCR制备拟用于syx7 dsRNA合成的模板DNA。对于每个选定的syx7和YFP靶基因区域，在扩增的有义链和反义链的5'末端通过PCR扩增引入T7启动子序列(从YFP编码区的DNA克隆扩增YFP区段)。然后，将靶基因的每个区域的两个PCR扩增片段以大约相等的量混合，并将混合物用作用于dsRNA产生的转录模板。参见图1。用特定引物对扩增的dsRNA模板的序列为：SEQ ID NO:4(syx7-1)、SEQ ID NO:5(syx7-1 v1)、SEQ ID NO:6(syx7-1 v2)以及SEQ ID NO:14(YFPv2)。按照制造商的说明(INVITROGEN)使用RNAi试剂盒或按照制造商的说明(New England Biolabs,
Ipswich,MA)使用 T7体外转录试剂盒合成和纯化用于昆虫生物测定的双链RNA。
使用NANODROPTM8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。
Ipswich,MA)使用 T7体外转录试剂盒合成和纯化用于昆虫生物测定的双链RNA。
使用NANODROPTM8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测量dsRNA的浓度。
[0299] 植物转化载体的构建。使用化学合成的片段(DNA2.0,Menlo Park,Ca)和标准分子克隆方法的组合，组装携带用于形成包含syx7区段(SEQ ID NO:1)的发夹的靶基因构建体的入门载体(entry vector)。通过将syx7靶基因区段的两个拷贝以彼此相反的取向进行排列(在一个转录单元内)，并用接头多核苷酸(例如，ST-LS1内含子；Vancanneyt等人，(1990)Mol.Gen.Genet.220(2):245-50))将两个区段间隔开，来促进由RNA初级转录物形成分子内发夹。因此，初级mRNA转录物包含两个大的、互为反向重复序列(inverted repeat)、且由内含子序列分隔开的syx7基因区段序列。使用玉米泛素1启动子的拷贝(美国专利5,510,474)来驱动初级mRNA发夹转录物的产生，使用包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区的片段(ZmPer5 3'UTR v2；美国专利6,699,984)来终止发夹RNA表达基因的转录。
[0300] 通过使用典型二元目的载体(destination vector)和入门载体的标准重组反应，构建包含表达YFP发夹dsRNA的基因的阴性对照二元载体。
[0301] 二元目的载体包括在甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform badnavirus，ScBV)启动子(Schenk等人，(1999)Plant Molec.Biol.39:1221-30)的调控下的除草剂耐受基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxyalknoate dioxygenase)；AAD-1v3)(美国专利7,838,733(B2)，和Wright等人，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-5)。由来自玉米条纹病毒(Maize Streak Virus，MSV)外壳蛋白基因5'UTR的序列和来自玉米乙醇脱氢酶1(Alcohol Dehydrogenase 1，ADH1)基因的内含子6的序列构成的合成5'UTR序列位于SCBV启动子区段的3'末端和AAD-1编码区的起始密码子之间。使用包含来自玉米脂肪酶基因的
3'非翻译区的片段(ZmLip 3'UTR；美国专利7,179,902)来终止AAD-1mRNA的转录。
3'非翻译区的片段(ZmLip 3'UTR；美国专利7,179,902)来终止AAD-1mRNA的转录。
[0302] 通过使用典型二元目的载体和入门载体的标准 重组反应，构建包含表达YFP蛋白质的基因的另外的阴性对照二元载体。
[0303] 二元目的载体包含在玉米泛素1启动子(如上所述)的表达调控下的除草剂耐受基因(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；AAD-1v3)(如上所述)和包含来自玉米脂肪酶基因的3'非翻译区的片段(ZmLip 3'UTR；如上所述)。入门载体包含在玉米泛素1启动子(如上所述)和包含来自玉米过氧化物酶5基因的3'非翻译区的片段(如上所述)的表达控制下的YFP编码区(SEQ ID NO:29)。
[0304] 与syx7相比，推定的RNAi靶无效。
[0305] 当在基于饮食的测定中，将设计用于抑制实施例1中鉴定的靶基因序列的合成dsRNA施用于WCR时，导致了死亡和生长抑制。
[0306] 重复的生物测定表明，摄入来自syx7-1、syx7-1 v1和syx7-1 v2的dsRNA制备物导致了西方玉米根虫幼虫的死亡和生长抑制。表2示出了在暴露于syx7-1、syx7-1 v1和syx7-1 v2dsRNA 9天后WCR幼虫的基于饮食的进食生物测定结果以及使用从黄色荧光蛋白(YFP)编码区制备的dsRNA阴性对照样品获得的结果。表3示出了暴露于syx7-1、syx7-1 v1和syx7-1v2 dsRNA的LC50和GI50结果。
[0307] 表2.进食9天后，由西方玉米根虫幼虫获得的syx7 dsRNA饮食进食测定结果。ANOVA分析发现平均死亡率％和平均生长抑制％(GI)具有显著差异。使用Tukey-Kramer检验分离平均值。
[0308]
[0309] *括号内的字母表示统计水平。未与相同字母连接的水平存在显著差异(P<0.05)。
[0310] **TE＝Tris HCl(1mM)加EDTA(0.1mM)缓冲液，pH7.2。
[0311] 表3.syx7 dsRNA对WCR幼虫的经口效力总结(ng/cm2)。
[0312]靶标 LC50 范围 GI50 范围
syx7-1 v1 37.10 27.28-51.31 29.24 13.49-63.40
syx7-1 v2 26.70 19.77-36.40 42.10 20.22-87.67
syx7-1 10.76 7.04-16.05 29.45 4.62-187.85
syx7-1 v1 37.10 27.28-51.31 29.24 13.49-63.40
syx7-1 v2 26.70 19.77-36.40 42.10 20.22-87.67
syx7-1 10.76 7.04-16.05 29.45 4.62-187.85
[0313] 先前已经提出了叶甲属的某些基因可能用于RNAi介导的昆虫控制。参见公开了906个序列的美国专利公开号2007/0124836和公开了9,112个序列的美国专利号7,612,
194。然而，已经确定，许多提议用于RNAi介导的昆虫控制的基因在控制叶甲属时是无效的。
还确定了与其他那些提议用于RNAi介导的昆虫控制的基因相比，序列syx7-1、syx7-1 v1和syx7-1 v2dsRNA提供了令人惊讶的和出乎意料的对叶甲属的超强控制。
194。然而，已经确定，许多提议用于RNAi介导的昆虫控制的基因在控制叶甲属时是无效的。
还确定了与其他那些提议用于RNAi介导的昆虫控制的基因相比，序列syx7-1、syx7-1 v1和syx7-1 v2dsRNA提供了令人惊讶的和出乎意料的对叶甲属的超强控制。
[0314] 例如，在美国专利7,612,194中分别提出了膜联蛋白、β血影蛋白2和mtRP-L4在RNAi介导的昆虫控制中有效。SEQ ID NO：30是膜联蛋白区域1(Reg 1)的DNA序列，且SEQ ID NO：31是膜联蛋白区域2(Reg 2)的DNA序列。SEQ ID NO：32是β血影蛋白2区域1(Reg1)的DNA序列，且SEQ ID NO：33是β血影蛋白2区域2(Reg2)的DNA序列。SEQ ID NO：34是mtRP-L4区域1(Reg 1)的DNA序列，且SEQ ID NO：35是mtRP-L4区域2(Reg 2)的DNA序列。YFP序列也用于产生dsRNA作为阴性对照。
[0315] 通过实施例2的方法，使用上述序列的每一种来产生dsRNA。提供用于产生dsRNA的特异性模板的策略在图2中示出。使用表4中的引物对和从WCR一龄幼虫分离的总RNA制备的第一链cDNA(作为PCR模板)，通过PCR制备拟用于dsRNA合成的模板DNA。(YFP是从DNA克隆中扩增得到的。)对于每个选定的靶基因区域，分别进行两个PCR扩增。第一PCR扩增在扩增的有义链的5′末端引入T7启动子序列。第二个反应在反义链的5′末端并入该T7启动子序列。然后，将靶基因的每个区域的两个PCR扩增片段以大约相等的量混合，并将混合物用作用于dsRNA产生的转录模板。参见图2。按照制造商的说明(INVITROGEN)，使用
RNAi试剂盒合成和纯化双链RNA。使用NANODROPTM 8000分光光度
计(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)测量dsRNA的浓度，并且分别通过上述相同的基于饮食的生物测定方法测试该dsRNA。表4列出了用于产生膜联蛋白Reg1、膜联蛋白Reg2、β血影蛋白2Reg1、β血影蛋白2Reg2、mtRP-L4 Reg1，mtRP-L4Reg2和YFP dsRNA分子的引物序列。
表5示出了在暴露于这些dsRNA分子9天后，WCR幼虫的基于饮食的进食生物测定结果。重复的生物测定表明，这些dsRNA的摄入未导致西方玉米根虫幼虫的死亡或生长抑制，与上述对于TE缓冲液、水或YFP蛋白的对照样品所观察到的相比。
RNAi试剂盒合成和纯化双链RNA。使用NANODROPTM 8000分光光度
计(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)测量dsRNA的浓度，并且分别通过上述相同的基于饮食的生物测定方法测试该dsRNA。表4列出了用于产生膜联蛋白Reg1、膜联蛋白Reg2、β血影蛋白2Reg1、β血影蛋白2Reg2、mtRP-L4 Reg1，mtRP-L4Reg2和YFP dsRNA分子的引物序列。
表5示出了在暴露于这些dsRNA分子9天后，WCR幼虫的基于饮食的进食生物测定结果。重复的生物测定表明，这些dsRNA的摄入未导致西方玉米根虫幼虫的死亡或生长抑制，与上述对于TE缓冲液、水或YFP蛋白的对照样品所观察到的相比。
[0316] 表4.用于扩增基因编码区的一部分的引物和引物对。
[0317]
[0318]
[0319] 表5.9天后，由西方玉米根虫幼虫获得的饮食进食测定结果。
[0320]
[0321] *TE＝Tris HCl(10mM)加EDTA(1mM)缓冲液，pH8。
[0322] **YFP＝黄色荧光蛋白
[0323] 包含杀虫dsRNA的转基因玉米组织的生产。
[0324] 杀虫dsRNA的农杆菌介导转化。通过在农杆菌介导转化后稳定整合到植物基因组中的嵌合基因的表达，来生产产生一种或更多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，其中包括靶向包含syx7(例如，SEQ ID NO:1)的基因的dsRNA分子)的转基因玉米细胞、组织和植物。采用超二元或二元转化载体的玉米转化方法是本领域已知的，如例如在美国专利8,304,604中所述，其全部内容通过引入并入本文。根据在含有氟吡甲禾灵(Haloxyfop)的培养基上生长的能力来选择转化的组织，并根据情况对dsRNA的产生进行筛选。基本上如实施例4中所述，可以将这类经转化的组织培养物的一部分提供给新生的玉米根虫幼虫进行生物测定。
[0325] 起始农杆菌培养。将具有上述二元转化载体(实施例4)的农杆菌菌株DAt13192细胞(PCT国际公开号WO 2012/016222 A2)的甘油储备液在含有适当抗生素的AB基本培养基平板上划线(Watson等人，(1975)J.Bacteriol.123：255-264)，并在20℃下生长3天。然后，将培养物划线到含有相同抗生素的YEP平板(gm/L：酵母提取物，10；蛋白胨，10；NaCl，5)上，并在20℃下孵育1天。
[0326] 农杆菌培养。在实验当天，制备接种培养基和乙酰丁香酮的储备液，其体积与实验中的构建体数量相适应，然后将其移液到无菌的一次性250mL烧瓶中。接种培养基(Frame等人，(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe and E.C.Yeung(编辑),Springer Science and Business Media,LLC.pp 327-341)包含：2.2gm/L MS盐；1X ISU修饰的MS维生素(Frame等人，同上)68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；
115mg/L L-脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH 5.4)从1M的100％二甲基亚砜储备溶液中将乙酰丁香酮添加到含有接种培养基的烧瓶中，使其终浓度为200μM，然后将溶液充分混合。
115mg/L L-脯氨酸；和100mg/L肌醇；pH 5.4)从1M的100％二甲基亚砜储备溶液中将乙酰丁香酮添加到含有接种培养基的烧瓶中，使其终浓度为200μM，然后将溶液充分混合。
[0327] 对于每个构建体，将充满了来自YEP平板的农杆菌的1或2个接种环悬浮在15mL接种培养基/乙酰丁香酮储备溶液中，置于无菌的一次性50mL离心管中，用分光光度计测量在550nm下的溶液的光密度(OD550)。然后，使用另外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬液稀释至OD550为0.3至0.4。然后，将农杆菌悬液管水平放置在室温下的设定为75rpm的平台振荡器上，并在进行胚解剖的同时振荡1至4小时。
[0328] 谷穗(ears)消毒和胚分离。玉米未成熟胚是从玉米自交系B104植物(Hallauer等人，(1997)Crop Science 37:1405-1406)中获得的，其在温室中生长并且自花授粉或同胞授粉以产生谷穗。授粉后约10至12天收获谷穗。在实验当天，将去壳的谷穗通过浸入到20％的商用漂白剂溶液(ULTRA Germicidal Bleach，6.15％的次氯酸钠；两滴TWEEN 20)中并摇动20至30分钟进行表面消毒，然后在层流净化罩中在无菌去离子水中冲洗3次。
从每个谷穗上无菌解剖未成熟的合子胚(1.8至2.2mm长)，并随机分配到装有2.0mL适当农杆菌细胞的液体接种培养基悬液的微量离心管中，其含有200μM乙酰丁香酮，并向其中加入了2μL的BREAK- S233表面活性剂(EVONIK INDUSTRIES；Essen,Germany)。对于给定实验组，使用来自合并谷穗的胚进行每次转化。
从每个谷穗上无菌解剖未成熟的合子胚(1.8至2.2mm长)，并随机分配到装有2.0mL适当农杆菌细胞的液体接种培养基悬液的微量离心管中，其含有200μM乙酰丁香酮，并向其中加入了2μL的BREAK- S233表面活性剂(EVONIK INDUSTRIES；Essen,Germany)。对于给定实验组，使用来自合并谷穗的胚进行每次转化。
[0329] 农杆菌共培养。分离后，将胚放在摇臂平台上5分钟。然后，将试管的内容物倒入共培养培养基的平板上，该共培养培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改性MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；在KOH中的3.3mg/L麦草畏(3,6-二氯-邻茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；DMSO中的200μM乙酰丁香酮；以及3gm/L GELZANTM，pH 5.8。用无菌的一次性移液管除去液体农杆菌悬液。然后，使用无菌镊子在显微镜的帮助下将盾片朝上放置胚。封闭板，用3MTMMICROPORETM医用胶带密封，并置于25℃的孵育器中，在约60μmol m-2s-1的光合有效辐射(Photosynthetically Active Radiation，PAR)下连续光照。
[0330] 转基因事件的愈伤组织选择和再生。共培养期后，将胚转移到静置培养基中，该培养基由4.33gm/L MS盐；1X ISU改性MS维生素；30gm/L蔗糖；700mg/L L-脯氨酸；KOH中的3.3mg/L麦草畏；100mg/L肌醇；100mg/L酪蛋白酶水解物；15mg/L AgNO3；0.5gm/LMES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa，KS)；250mg/L羧苄青霉素；
以及2.3gm/L的GELZANTM构成，pH 5.8。向每个板移入不超过36个胚。将板放置在透明的塑料盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育7至10天。然后，将愈伤组织胚转移(<18/板)到选择培养基I上，该培养基由含有100nM R-氟吡甲禾灵酸(0.0362mg/L；用于选择含有AAD-1基因的愈伤组织)的静置培养基(上述)构成。将板放回透明盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育7天。然后，将愈伤组织胚转移(<12/板)到选择培养基II上，该培养基由含有500nM R-氟吡甲禾灵酸(0.181mg/L)的静置培养基(上述)构成。
将板放回透明盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育14天。此选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
以及2.3gm/L的GELZANTM构成，pH 5.8。向每个板移入不超过36个胚。将板放置在透明的塑料盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育7至10天。然后，将愈伤组织胚转移(<18/板)到选择培养基I上，该培养基由含有100nM R-氟吡甲禾灵酸(0.0362mg/L；用于选择含有AAD-1基因的愈伤组织)的静置培养基(上述)构成。将板放回透明盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育7天。然后，将愈伤组织胚转移(<12/板)到选择培养基II上，该培养基由含有500nM R-氟吡甲禾灵酸(0.181mg/L)的静置培养基(上述)构成。
将板放回透明盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育14天。此选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
[0331] 将增殖的胚性愈伤组织转移(<9/板)至再生前培养基。再生前培养基含有4.33gm/LMS盐；1X ISU改性MS维生素；45gm/L蔗糖；350mg/L的L-脯氨酸；100mg/L肌醇；50mg/L酪蛋白酶水解物；1.0mg/L AgNO3；0.25gm/L的MES；NaOH中的0.5mg/L萘乙酸；乙醇中2.5mg/L脱落酸；1mg/L的6-苄基氨基嘌呤；250mg/L羧苄青霉素；2.5gm/L的GELZANTM；和0.181mg/L氟吡甲禾灵酸；pH 5.8。将板储存在透明盒中，并在约50μmol m-2s-1PAR的持续光照下于27℃下孵育7天。然后，将再生的愈伤组织转移(<6/板)到PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)中的再生-2 -1培养基中，并在28℃下，每天16小时光照/8小时黑暗的条件下(约160μmol m s PAR)孵育持续14天或直到芽和根发育。再生培养基包含4.33gm/L MS盐；1X ISU改性MS维生素；60gm/L蔗糖；100mg/L肌醇；125mg/L羧苄青霉素；3gm/L GELLANTM树胶；以及0.181mg/L的R-氟吡甲禾灵酸；pH 5.8。然后，分离出具有初生根的小芽，无需选择即可转移至伸长培养基中。伸长TM
培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改性MS维生素；30gm/L蔗糖；和3.5gm/L GELRITE ；pH
5.8。
培养基含有4.33gm/L MS盐；1X ISU改性MS维生素；30gm/L蔗糖；和3.5gm/L GELRITE ；pH
5.8。
[0332] 将根据其在含有氟吡甲禾灵的培养基上生长的能力选择的经转化植物芽从PHYTATRAYSTM移植到填充有生长培养基(PROMIX BX；PREMIER TECHHORTICULTURE)的小盆中，用杯体或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)覆盖，然后使其在CONVIRON生长室中硬化(白天27℃/夜晚24℃，16小时光周期，50-70％RH，200μmolm-2s-1PAR)。在某些情况下，使用设计用于检测整合到玉米基因组中的AAD1除草剂耐受性基因的引物，通过定量实时PCR测定分析推定的转基因小植株的转基因相对拷贝数。此外，使用RNA qPCR测定检测推定转化子表达的dsRNA中是否存在接头序列。然后将选定的经转化小植株移入温室中以进一步生长和测试。
[0333] 在温室中转移和建立T0植物以进行生物测定和种子生产。当植物达到V3-V4阶段时，将它们移植到IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物中，并在温室中生长到开花(曝光类型：照片或同化；高光限制：1200PAR；昼长16小时；白天27℃/夜晚24℃)。
[0334] 将用于昆虫生物测定的植物从小盆中移植到TINUSTM350-4(SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES,Acheson,Alberta,Canada；)(每个事件每个
一株植株)。移植到 大约四天后，侵害植物以进行生物测
定。
一株植株)。移植到 大约四天后，侵害植物以进行生物测
定。
[0335] 通过用从非转基因优良自交系B104的植物或其他合适的花粉供体收集的花粉对T0转基因植物的丝进行授粉，并种植所得种子来获得T1代植物。在可能的情况下进行正反交。
[0336] 转基因玉米组织的分子分析。对于在评估根进食损害的同一天从温室生长植物中采集的叶和根样品进行玉米组织的分子分析(例如，RNA qPCR)。
[0337] Per5 3'UTR的RNA qPCR测定结果用于验证发夹转基因的表达。(由于在玉米组织中通常存在内源性Per5基因的表达，因此预计在未转化玉米植物中具有低检测水平的Per53'UTR。)使用针对所表达RNA中重复序列之间(对于dsRNA发夹分子形成是不可或缺的)的插入序列的RNA qPCR测定结果来验证发夹转录物的存在。相对于内源性玉米基因的RNA水平测量转基因RNA表达水平。
[0338] 用于检测gDNA中的AAD1编码区的一部分的DNA qPCR分析用于估计转基因插入拷贝数。这些分析的样品是从在环境室中生长的植物收集的。将结果与设计用于检测一部分单拷贝天然基因的DNA qPCR结果进行比较，并用于在温室中进行简单事件(具有syx7转基因的一或两个拷贝)进一步研究。
[0339] 另外，设计用于检测壮观霉素抗性基因的一部分(SpecR；位于T-DNA外部的二元载体质粒上)的qPCR测定用于确定转基因植物是否含有外来整合质粒骨架序列。
[0340] RNA转录表达水平：Per5 3'UTR qPCR。通过Per5 3'UTR序列的实时定量PCR(qPCR)分析愈伤组织细胞事件或转基因植物以确定与内部玉米基因的转录水平相比，全长发夹转录物的相对表达水平，所述内部玉米基因例如GENBANK登录号BT069734，其编码TIP41样蛋白(即，GENBANK登录号AT4G34270的玉米同源物；tBLASTX得分为74％同一性；SEQ ID NO:64)。使用RNEASYTM96试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)分离RNA。洗脱后，根据试剂盒的建议方案对总RNA进行DNase1处理。然后在NANODROP 8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC)上对RNA进行定量，并将浓度归一化为25ng/μL。基本上根据制造商推荐的方案，使用HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT(INVITROGEN)，在含有5μL变性RNA的10μL反应体积中制备第一链cDNA。对方案进行稍微修改以包括将10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)
(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V为A、C或G，N为A、C、G或T；SEQ ID NO:65)添加到随机引物原液混合物的1mL管中，以制备组合的随机引物和寡dT的工作液。
(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V为A、C或G，N为A、C、G或T；SEQ ID NO:65)添加到随机引物原液混合物的1mL管中，以制备组合的随机引物和寡dT的工作液。
[0341] 在cDNA合成后，将样品用无核酸酶的水以1:3稀释，并保存在-20℃直至测定。
[0342] 在LIGHT CYCLERTM480(ROCHE DIAGNOSTICS,Indianapolis,IN)上以10μL反应体积进行Per5 3'UTR和TIP41样转录物的单独实时PCR测定。对于Per5 3'UTR测定，使用引物P5U76S_For(SEQ ID NO:66)和P5U76A_Rev(SEQ ID NO:67)和ROCHE UNIVERSALPROBETM(UPL76；目录号4889960001；标记有FAM)进行反应。对于TIP41样参考基因测定，使用引物TIPmx_For(SEQ ID NO:68)和TIPmx_Rev(SEQ ID NO:69)，以及用HEX(六氯荧光素)标记的探针HXTIP(SEQ ID NO:70)。
[0343] 所有测定均包括无模板的阴性对照(仅混合)。对于标准曲线，在源板中还包括空白(源孔中的水)以检查样品的交叉污染。引物和探针序列列于表6。表7公开了用于检测多种转录物的反应组分配方，表8总结了PCR反应条件。FAM(6-羧基荧光素类星体)荧光部分在465nm处激发，并在510nm处测量荧光；HEX(六氯荧光素)荧光部分的相应值为533nm和
580nm。
580nm。
[0344] 表6.用于转基因玉米中的转录物水平分子分析的寡核苷酸序列。
[0345]
[0346] *TIP41样蛋白。
[0347] **NAv序列无法从供应商处获得。
[0348] 表7.用于转录物检测的PCR反应配方。
[0349]
[0350] 表8.RNA qPCR的热循环仪条件。
[0351]
[0352] 根据供应商的建议，使用LIGHTCYCLERTM软件v1.5通过使用用于计算Cq值的二阶导数max算法的相对定量，对数据进行分析。对于表达分析，使用ΔΔCt方法(即2-(CqTARGET-Cq REF))来计算表达值，该方法依赖于比较两个靶标之间的Cq差值，在假设条件下选择2为基值，对于优化的PCR反应，产物每个周期加倍。
[0353] 转录物大小和完整性：Northern印迹测定。在一些情况下，通过使用Northern印迹(RNA印迹)分析来确定表达syx7发夹dsRNA的转基因植物中syx7发夹dsRNA的分子大小，从而获得转基因植物的另外分子表征。
[0354] 使用前，所有材料和设备均经过RNaseZAP(AMBION/INVITROGEN)处理。将组织样品(100mg至500mg)收集在2mL SAFELOCK EPPENDORF管中，用将三颗钨珠置于1mL TRIzol(INVITROGEN)中的KLECKOTM组织粉碎机(GARCIAMANUFACTURING,Visalia,CA)打碎5分钟，然后在室温(RT)下孵育10分钟。可选地，将样品在4℃下以11,000rpm离心10分钟，并将上清液转移到新鲜的2mL SAFELOCKEPPENDORF管中。向匀浆中加入200μL的氯仿后，将试管倒置2至5分钟进行混合，在室温下孵育10分钟，然后在4℃下以12,000x g离心15分钟。将上层相转移至无菌的1.5mL EPPENDORF管中，加入600μL100％异丙醇，然后在室温下孵育10分钟至2小时，然后在4℃至25℃下以12,000x g离心10分钟。弃去上清液，将RNA沉淀用1mL的70％乙醇洗涤两次，在两次洗涤之间在4℃至25℃下以7,500x g离心10分钟。弃去乙醇，将沉淀短暂风干3至5分钟，然后重悬于50μL无核酸酶的水中。
[0355] 使用NANODROP (THERMO-FISHER)对总RNA进行定量，并将样品归一化为5μg/10μL。然后将10μL的乙二醛(AMBION/INVITROGEN)添加到每个样品中。分配5至14ng的DIG RNA标准标志物混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE,Indianapolis,In)，并加入到等体积的乙二醛中。将样品和标志物RNA在50℃下变性45分钟，并保存在冰上，直至上样到在NORTHERNMAX 10X乙二醛运行缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25％的SEAKEMGOLD琼脂糖(LONZA,Allendale,NJ)凝胶上。通过在65V/30mA下电泳2小时15分钟来分离RNA。
[0356] 电泳后，将凝胶在2X SSC中冲洗5分钟，然后在GEL DOC工作站(BIORAD,Hercules,CA)上成像。然后，使用10X SSC作为转移缓冲液(20X SSC由3氯化钠和300mM柠檬酸三钠组成，pH 7.0)在室温下将RNA被动转移至尼龙膜(MILLIPORE)过夜。转移后，将膜在2X SSC中冲洗5分钟，将RNA紫外交联到膜(AGILENT/STRATAGENE)上，然后将膜在室温下干燥长达2天。
[0357] 将膜在ULTRAHYBTM缓冲液(AMBION/INVITROGEN)中预杂交1至2小时。探针由PCR扩增产物组成，该产物包含通过ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序用洋地黄毒苷标记的目标序列(例如，SEQ ID NO:4-6中的任一个，适当情况下，其互补序列和反向互补序列)。在杂交管中于60℃的温度下在推荐缓冲液中进行杂交过夜。杂交后，将印迹进行DIG洗涤、包裹、暴露于胶片1至30分钟，然后全部按照DIG试剂盒供应商推荐的方法显影胶片。
[0358] 转基因拷贝数确定。在96孔收集板(QIAGEN)中收集大约相当于2个叶片冲头的玉米叶片。在带有一个不锈钢珠的BIOSPRINT96 AP1裂解缓冲液(配有BIOSPRINT96 PLANTKIT；QIAGEN)中，用KLECKOTM组织粉碎机(GARCIA MANUFACTURING,Visalia,CA)进行组织破坏。组织裂解后，使用BIOSPRINT96 PLANT试剂盒和BIOSPRINT96提取机器人以高通量格式分离gDNA。在建立qPCR反应之前，将gDNA以2:3的DNA:水进行稀释。
[0359] qPCR分析。通过 480系统的实时PCR进行用水解探针测定的转基因检测。使用 探针设计软件2.0设计用于水解探针测定的寡核苷酸，以检测接
头序列或检测SpecR基因的一部分(即，二元载体质粒上的壮观霉素抗性基因；SEQ ID NO:
71；表9中的SPC1寡核苷酸)。进一步地，使用PRIMER EXPRESS软件(APPLIED BIOSYSTEMS)设计用于水解探针测定的寡核苷酸，以检测AAD-1除草剂耐受基因区段的(SEQ ID NO:72；表9中的GAAD1寡核苷酸)。表9示出了引物和探针的序列。将测定与针对内源性玉米染色体基因(转化酶(SEQ ID NO:73；GENBANK登录号：U16123；在本文中称为IVR1)的试剂进行复用，该内源性玉米染色体基因用作内部参考序列以确保每次测定中均存在gDNA。为了进行扩增，在10μL体积的包含每个引物(0.4μM)和每个探针(0.2μM)的多重反应中以1x最终浓度制备
480PROBES MASTER混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)。表10。如表11所示，
进行两步扩增反应。FAM和HEX标记探针的荧光团激活和发射如上所述；CY5共轭物在650nm处具有最大激发，荧光素在670nm处具有最大激发。
头序列或检测SpecR基因的一部分(即，二元载体质粒上的壮观霉素抗性基因；SEQ ID NO:
71；表9中的SPC1寡核苷酸)。进一步地，使用PRIMER EXPRESS软件(APPLIED BIOSYSTEMS)设计用于水解探针测定的寡核苷酸，以检测AAD-1除草剂耐受基因区段的(SEQ ID NO:72；表9中的GAAD1寡核苷酸)。表9示出了引物和探针的序列。将测定与针对内源性玉米染色体基因(转化酶(SEQ ID NO:73；GENBANK登录号：U16123；在本文中称为IVR1)的试剂进行复用，该内源性玉米染色体基因用作内部参考序列以确保每次测定中均存在gDNA。为了进行扩增，在10μL体积的包含每个引物(0.4μM)和每个探针(0.2μM)的多重反应中以1x最终浓度制备
480PROBES MASTER混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)。表10。如表11所示，
进行两步扩增反应。FAM和HEX标记探针的荧光团激活和发射如上所述；CY5共轭物在650nm处具有最大激发，荧光素在670nm处具有最大激发。
[0361] 表9.用于基因拷贝数测定和二元载体质粒骨架检测的引物和探针序列(带有荧光共轭物)。
[0362]
[0363] CY5＝青色素-5
[0364] 表10.用于基因拷贝数分析和质粒骨架检测的反应组分。
[0365]组分 Amt.(μL) 原液 最终浓度
2X 缓冲液 5.0 2x 1x
适当的正向引物 0.4 10μM 0.4
适当的反向引物 0.4 10μM 0.4
适当的探针 0.4 5μM 0.2
IVR1-正向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-反向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-探针 0.4 5μM 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
2X 缓冲液 5.0 2x 1x
适当的正向引物 0.4 10μM 0.4
适当的反向引物 0.4 10μM 0.4
适当的探针 0.4 5μM 0.2
IVR1-正向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-反向引物 0.4 10μM 0.4
IVR1-探针 0.4 5μM 0.2
H2O 0.6 NA* NA
gDNA 2.0 ND** ND
[0366] *NA＝不可用的
[0367] **ND＝未测定的
[0368] 表11.DNA qPCR的热循环仪条件。
[0369]
[0370] 通过生物测定方法证明了在植物细胞中产生的本发明的dsRNA的生物活性。参见例如，Baum等人，(2007)Nat.Biotechnol.25(11):1322-1326。例如，可以通过在受控的喂食环境中将来源于产生杀虫dsRNA的植物的多种植物组织或组织块喂食给靶标昆虫来证明功效。或者，从来源于产生杀虫dsRNA的植物的多种植物组织制备提取物，并如本文先前所述的，将提取的核酸分配在人工饮食顶部以进行生物测定。将这种进食测定的结果与采用不产生杀虫dsRNA的宿主植物的适当对照组织或与其他对照样品类似进行的生物测定进行比较。与对照组相比，测试饮食的靶标昆虫的生长和存活降低。
[0371] 带有转基因玉米事件的昆虫生物测定。选择两种从洗净的卵孵化的西方玉米根虫幼虫(1至3天大)，并将其放入生物测定托盘的每个孔中。然后，将孔盖上“PULL N'PEEL”标签盖(BIO-CV-16,BIO-SERV)，并置于28℃的孵育器中，进行18小时/6小时的光照/黑暗循环。初次侵害后9天，评估幼虫的死亡率，将其计算为每次处理中死亡的昆虫占昆虫总数的百分比。将昆虫样品在-20℃下冷冻两天，然后将每次处理的昆虫幼虫合并并称重。生长抑制百分比计算为实验处理的平均重量除以两种对照孔处理的平均重量的平均值。数据表示为(阴性对照的)生长抑制百分比。将超过对照平均重量的平均重量归一化为零。
[0372] 温室中的昆虫生物测定。从CROP CHARACTERISTICS(Farmington,MN)的土壤中获得西方玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))的卵。WCR卵在28℃下孵育10至11天。从土壤中洗涤卵，将其放入0.15％的琼脂溶液中，并将浓度调节至每0.25mL等分试样约75至100个卵。在具有卵悬液的等分试样的皮氏培养皿中放置一个孵化板，以监控孵化率。
[0373] 在 生长的玉米植物周围的土壤被150至200个WCR卵侵害。允许昆虫进食2周，然后给每株植物进行“根评级”。基本上根据Oleson等人，(2005)
J.Econ.Entomol.98:1-8，使用节点伤害量表进行评级。通过这种生物测定的植物显示出减少的伤害，被移植到5加仑的花盆中进行种子生产。对移栽植物进行杀虫剂处理，以避免进一步的根虫损害和向温室释放昆虫。植物通过人工授粉来生产种子。将这些植物产生的种子保存下来，以便对植物的T1代及后代进行评估。
J.Econ.Entomol.98:1-8，使用节点伤害量表进行评级。通过这种生物测定的植物显示出减少的伤害，被移植到5加仑的花盆中进行种子生产。对移栽植物进行杀虫剂处理，以避免进一步的根虫损害和向温室释放昆虫。植物通过人工授粉来生产种子。将这些植物产生的种子保存下来，以便对植物的T1代及后代进行评估。
[0374] 温室生物测定包括两种阴性对照植物。通过用带有设计为产生黄色荧光蛋白(YFP)的基因的载体转化来产生转基因阴性对照植物(参见实施例4)。未转化的阴性对照植物从亲本玉米品种的种子生长，从亲本玉米品种中产生转基因植物。生物测定在两个不同的日期进行，每组植物材料中均包含阴性对照。
[0375] 实施例5：包含鞘翅目害虫序列的转基因植物
[0376] 产生表达靶向syx7的发夹dsRNA的转基因植物。编码发夹dsRNA的多核苷酸包含长度为至少15个核苷酸的核苷酸序列，并且是选自SEQ ID NO:2和7的鞘翅目syx7多核苷酸的连续片段。另外的发夹dsRNA来源于例如，鞘翅目害虫序列，诸如例如Caf1-180(美国专利申请公开号2012/0174258)、VatpaseC(美国专利申请公开号2012/0174259)、Rho1(美国专利申请公开号2012/0174260)、VatpaseH(美国专利申请公开号2012/0198586)、PPI-87B(美国专利申请公开号2013/0091600)、RPA70(美国专利申请公开号2013/0091601)、RPS6(美国专利申请公开号2013/0097730)、ROP(美国专利申请公开号14/577,811)、RNA聚合酶I1(美国专利申请公开号62/133,214)、RNA聚合酶II140(美国专利申请公开号14/577,854)、RNA聚合酶II215(美国专利申请公开号62/133,202)、RNA聚合酶II33(美国专利申请公开号62/133,210)、转录延伸因子spt5(美国专利申请号62/168,613)、转录延伸因子spt6(美国专利申请号62/168,606)、ncm(美国专利申请号62/095487)、dre4(美国专利申请号14/705,
807)、COPIα(美国专利申请号62/063,199)、COPIβ(美国专利申请号62/063,203)、COPIγ(美国专利申请号62/063,192)和COPIδ(美国专利申请号62/063,216)。这些可以通过RT-PCR或其他分子分析方法进行确认。
807)、COPIα(美国专利申请号62/063,199)、COPIβ(美国专利申请号62/063,203)、COPIγ(美国专利申请号62/063,192)和COPIδ(美国专利申请号62/063,216)。这些可以通过RT-PCR或其他分子分析方法进行确认。
[0377] 来自所选的独立T1系的总RNA制备物可选地用于RT-PCR，该引物被设计用于结合每个RNAi构建体中的发夹表达盒的接头。此外，RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物可选地用于扩增和确认用于在植物中产生siRNA所需的预加工mRNA是否产生。每个靶基因的期望条带的扩增证实了每种转基因植物中的发夹RNA的表达。随后任选地使用RNA印迹杂交在独立的转基因系中确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
[0378] 此外，与靶基因序列同一性大于80％的含错配序列RNAi分子和与靶基因序列同一性100％的RNAi分子所见的影响鞘翅目昆虫的方式相似。错配序列与天然序列配对形成同一RNAi构建体中的发夹dsRNA，递送了能够影响进食的鞘翅目害虫的生长、发育和活力的经植物加工的siRNA。
[0379] 与靶基因对应的dsRNA、siRNA或miRNA的植物原位递送以及鞘翅目害虫随后通过进食的摄取导致通过RNA介导的基因沉默而下调了鞘翅目害虫中的靶基因。当靶基因的功能在一个或更多个发育阶段很重要时，鞘翅目害虫的生长和/或发育受到影响，而在油菜露尾甲的情况下，导致无法成功侵害、进食和/或发育，或导致鞘翅目害虫死亡。然后对靶基因进行选择并成功应用RNAi来控制鞘翅目害虫。
[0380] 转基因RNAi株系和未经转化植株的表型比较。选择用于产生发夹dsRNA的靶鞘翅目害虫基因或序列与任何已知植物基因序列没有相似性。因此，预期的是，通过靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体来生产或激活(系统性)RNAi不会对转基因植物产生任何有害作用。然而，还是将转基因株系的发育和形态特征与未经转化植株以及用不具有发夹表达基因的“空”载体转化的转基因株系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和繁殖特征。转基因植物和未经转化植株的根长和生长模式没有可观察到的差异。植物芽的特征如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观是相似的。总地来说，在体外和温室土壤中培养时，转基因株系与未表达靶iRNA分子的株系之间没有可观察到的形态学差异。
[0381] 实施例6：包含鞘翅目害虫序列和其他RNAi构建体的转基因植物
[0382] 通过农杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)二次转化在其基因组中包含异源编码序列的转基因植物，该异源编码序列被转录成靶向除鞘翅目害虫以外的生物体的iRNA分子，以产生一种或更多种杀虫dsRNA分子(例如，至少一种dsRNA分子，包括靶向包含SEQ ID NO:2和7中任一个的基因的dsRNA分子)。通过农杆菌或WHISKERSTM介导的转化方法将植物转化质粒载体递送到从转基因植物中获得的悬浮细胞或未成熟胚中，该转基因植物的基因组中包含转录为靶向除鞘翅目害虫以外的生物体的iRN A分子的异源编码序列。
[0383] 实施例7：包含RNAi构建体和其他鞘翅目害虫控制序列的转基因植物
[0384] 通过农杆菌或WHISKERSTM方法(参见Petolino和Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)二次转化在其基因组中包含异源编码序列的转基因植物，该异源编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫生物体的iRNA分子(例如，至少一个dsRNA分子，其包含靶向包含SEQ ID NO:2和7中任一个的基因的多核糖核苷酸)以产生一种或更多种杀虫蛋白分TM
子，例如Cry3、Cry34和Cry35杀虫蛋白。通过农杆菌或WHISKERS 介导的转化方法将植物转化质粒载体递送到从植物中获得的悬浮细胞或未成熟胚中，该植物在其基因组中包含转录成靶向鞘翅目害虫生物体的iRNA分子的异源编码序列。获得了产生用于控制鞘翅目害虫的iRNA分子和杀虫蛋白的双转化植物。
子，例如Cry3、Cry34和Cry35杀虫蛋白。通过农杆菌或WHISKERS 介导的转化方法将植物转化质粒载体递送到从植物中获得的悬浮细胞或未成熟胚中，该植物在其基因组中包含转录成靶向鞘翅目害虫生物体的iRNA分子的异源编码序列。获得了产生用于控制鞘翅目害虫的iRNA分子和杀虫蛋白的双转化植物。
[0385] 实施例8：新热带棕椿象(英雄美洲蝽)中的候选靶基因的筛选
[0386] 新热带棕椿象(BSB；英雄美洲蝽)集落。在27℃的孵育器中，相对湿度为65％，16:8小时的光照:黑暗循环下饲养BSB。将2-3天收集到的1克卵接种到5L容器中，该容器的底部装有滤纸圆盘，然后用#18网盖住容器进行通风。每个饲养容器产生大约300-400个成虫BSB。在所有阶段，每周给昆虫喂新鲜的青豆3次，每周更换一次包含向日葵种子、大豆和花生(重量比3:1:1)的一袋种子混合物。在具有棉芯的小瓶中补充水。在最初的两周后，每周一次将昆虫转移到新的容器中。
[0387] BSB人工饮食。如下制备BSB人工饮食。将冻干的青豆在单独的MAGIC 混合器中混合成细粉，而粗的(有机)花生在单独的MAGIC 混合器中混合。将混合的
干成分合并(重量百分比：青豆，35％；花生，35％；蔗糖，5％；维生素复合物(例如，用于昆虫的Vanderzant维生素混合物，SIGMA-ALDRICH，目录号V1007)，0.9％)；在大型MAGIC混合器中，将其加盖并充分摇晃以混合各成分。然后将混合的干成分添加到混合
碗中。在单独的容器中，将水和苯菌灵抗真菌剂(50ppm；25μL的20,000ppm溶液/50mL饮食溶液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。用手混合所有成分，直到溶液完全混合。将饮食成形所需的大小，将其松散地包裹在铝箔中，在60℃下加热4小时，然后冷却并在4℃下储存。在准备的两周内使用人工饮食。
干成分合并(重量百分比：青豆，35％；花生，35％；蔗糖，5％；维生素复合物(例如，用于昆虫的Vanderzant维生素混合物，SIGMA-ALDRICH，目录号V1007)，0.9％)；在大型MAGIC混合器中，将其加盖并充分摇晃以混合各成分。然后将混合的干成分添加到混合
碗中。在单独的容器中，将水和苯菌灵抗真菌剂(50ppm；25μL的20,000ppm溶液/50mL饮食溶液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。用手混合所有成分，直到溶液完全混合。将饮食成形所需的大小，将其松散地包裹在铝箔中，在60℃下加热4小时，然后冷却并在4℃下储存。在准备的两周内使用人工饮食。
[0388] BSB转录组组装。选择6个BSB发育阶段进行mRNA库制备。从-70℃下冷冻的昆虫提取总RNA，并在 -24仪器(MP BIOMEDICALS)上，在裂解MATRIX A 2mL管(MP BIOMEDICALS,Santa Ana,Ca)中，在10体积的裂解/结合缓冲液中将其匀化。根据制造商的方案，使用mirVanaTM miRNA分离试剂盒(AMBION；INVITROGEN)提取总mRNA。使用HiSeqTM系统(San Diego,CA)的RNA测序提供可用于RNAi昆虫控制技术的候选靶基因序列。
对于六个样品，HiSeqTM产生了总共约3.78亿次读取。使用TRINITYTM汇编软件(Grabherr等人，(2011)Nature Biotech.29:644-652)，对每个样品单独组装读数。将组装的转录物合并以产生合并的转录组。该BSB合并的转录组包含378,457个序列。
对于六个样品，HiSeqTM产生了总共约3.78亿次读取。使用TRINITYTM汇编软件(Grabherr等人，(2011)Nature Biotech.29:644-652)，对每个样品单独组装读数。将组装的转录物合并以产生合并的转录组。该BSB合并的转录组包含378,457个序列。
[0389] BSB syx7直系同源物鉴定。使用果蝇属(Drosophila)syx7(蛋白序列GENBANK登录号NP_730632和NP_730633)作为查询，对BSB合并的转录组进行tBLASTn搜索。BSB syx7(SEQ ID NO:3)被鉴定为具有预测氨基酸序列SEQ ID NO:12的英雄美洲蝽候选靶基因产物。
[0390] 模板制备和dsRNA的合成。使用 Reagent(LIFE TECHNOLOGIES)，从一只年轻成年昆虫中(约90mg)提取的总BSB RNA制备cDNA。在室温下，使用捣碎杵(FISHERBRAND目录号12-141-363)和杵马达搅拌器(COLE-PARMER,Vernon Hills,IL)，在含200μL 的1.5mL微量离心管中将昆虫均质化。在均质化后，加入另外的800μL的 将匀浆涡旋，然后在室温下孵育5分钟。通过离心去除细胞碎片，并将上清液转移至新管中。按照制造商推荐的 提取方案，对于1mL的 将RNA沉淀物在室温下干燥，并使用洗脱缓冲
液类型4(即，10mM的Tris-HCl；pH8.0)重悬于来自GFX PCRDNA和凝胶提取试剂盒TM
(illustra ；GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)中的200μL的Tris缓冲液中。使用
NANODROPTM8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测定RNA浓度。
液类型4(即，10mM的Tris-HCl；pH8.0)重悬于来自GFX PCRDNA和凝胶提取试剂盒TM
(illustra ；GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES)中的200μL的Tris缓冲液中。使用
NANODROPTM8000分光光度计(THERMO SCIENTIFIC,Wilmington,DE)测定RNA浓度。
[0391] cDNA扩增。使用SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEMTM进行RT-PCR(INVITROGEN)，按照供应商推荐的方案，从5μg BSB总RNA模板和寡dT引物逆转录cDNA。用无核酸酶的水使转录反应的最终体积达到100μL。
[0392] 引物BSB_syx7-1_For(SEQ ID NO:23)、BSB_syx7-1_Rev(SEQ ID NO:24)、BSB_syx7-2_For(SEQ ID NO:25)和BSB_syx7-2_Rev(SEQ ID NO:26)用于扩增BSB_syx7区域1和BSB_syx7区域2(表12)，也称为BSB_syx7-1或BSB_syx7-2模板。DNA模板通过touch-down PCR(退火温度从60℃降至50℃，以1℃/循环降低)进行扩增，以1μL cDNA(上述)为模板。在35个PCR循环中产生了包含BSB_syx7-1的189bp区段(SEQ ID NO:8)或BSB_syx7-2的300bp区段(SEQ ID NO:9)的片段。使用YFPv2_For(SEQ ID NO:27)和YFPv2_Rev(SEQ ID NO:28)引物，上述程序也用于扩增301bp阴性对照模板YFPv2(SEQ ID NO:14)。BSB_syx7和YFPv2引物在其5'端包含T7噬菌体启动子序列(SEQ ID NO:13)，因此能够将YFPv2和BSB_syx7 DNA片段用于dsRNA转录。
[0393] 表15.用于扩增示例性syx7靶基因和YFP阴性对照基因的编码区部分的引物和引物对。
[0394]
[0395] dsRNA合成。根据制造商的说明，使用2μL PCR产物(以上)作为模板，使用MEGAscriptTM T7 RNAi试剂盒(AMBION)合成dsRNA。参见图1。将dsRNA在NANODROPTM8000分光光度计上进行定量，并在无核酸酶的0.1X TE缓冲液(1mM Tris HCL,0.1mM EDTA,pH7.4)中稀释至500ng/μL。
[0396] 将dsRNA注入BSB血腔中。在27℃的孵育器中，65％相对湿度和16:8小时光照:黑暗光周期下，以青豆和种子饮食饲养BSB，作为集落。用小刷子轻柔地处理二龄若虫(每只重1至1.5mg)，以避免伤害，然后将其放在冰上的皮氏培养皿中以冷却并固定昆虫。向每只昆虫注射55.2nL 500ng/μL的dsRNA溶液(即，27.6ng dsRNA；剂量为18.4至27.6μg/g体重)。使用配备有从Drummond 3.5英寸#3-000-203-G/X玻璃毛细管拉出的注射针的NANOJECTTM II注射器(DRUMMOND SCIENTIFIC,Broomhall,PA)进行注射。针尖折断，用轻矿物油回填毛细管，然后填充2至3μL dsRNA。将dsRNA注射到若虫的腹部(每个试验中每种dsRNA注射10种昆虫)，并在三个不同的日期重复试验。将经注射的昆虫(每孔5只)转移到含有人工BSB饮食颗粒的32孔托盘(Bio-RT-32饲养托盘；BIO-SERV，Frenchtown，NJ)中，并用Pull-N-PeelTM标签覆盖(BIO-CV-4；BIO-SERV)。在装有棉芯的1.5mL微量离心管中，通过1.25mL水提供水分。将托盘在26.5℃，60％湿度和16:8小时光照:黑暗光周期下孵育。注射后第7天进行活力计数和重量采集。
[0397] BSB syx7是致死性的dsRNA靶标。如表13所总结，在每个重复实验中，对至少十只二龄BSB若虫(每只1-1.5mg)，将55.2nL BSB_syx7-1或BSB_syx7-2 dsRNA(500ng/μL)注射到血腔中，大约终浓度为18.4-27.6μg的dsRNA/g昆虫。针对BSB_syx7-1 dsRNA确定的死亡率与相同量的注射的YFPv2 dsRNA(阴性对照)观察到的死亡率显著不同，p<0.05(学生t检验)。
[0398] 表16.注射后7天，将BSB_syx7-1和BSB_syx7-2 dsRNA注入二龄新热带棕椿象若虫的血腔中的结果。
[0399]
[0400] *每次试验中为每种dsRNA注射了十只昆虫。
[0401] 表示使用学生t检验的与YFPv2 dsRNA对照的显著差异，p≤0.05。
[0402] 实施例9：包含半翅目害虫序列的转基因玉蜀黍
[0403] 如实施例4中所述，产生十至二十株带有包含SEQ ID NO:3的任何部分(例如，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)的核酸的表达载体的转基因T0玉蜀黍植物。获得表达用于RNAi构建体的发夹dsRNA的另外十至二十株T1玉蜀黍独立系用于BSB攻击。衍生包含一部分SEQ ID NO:88或其区段(例如，SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90)的发夹dsRNA。这些通过RT-PCR或其他分子分析方法进行确认。来自选择的独立T1系的总RNA制备物可选地用于RT-PCR，引物设计用于结合每个RNAi构建体中的发夹表达盒的接头内含子。此外，RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物可选地用于扩增和确认用于植物原味siRNA产生所需的预加工mRNA的产生。每个靶基因的期望条带的扩增证实了每种转基因玉蜀黍植物中的发夹RNA的表达。随后可选地使用RNA印迹杂交在独立的转基因系中确认靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
[0404] 此外，与靶基因具有超过80％的序列同一性的错配序列的RNAi分子与和靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子以相似的方式影响半翅目昆虫。在同一RNAi构建体中，错配序列与天然序列配对以形成发夹dsRNA，递送了经植物加工的siRNA，其能够影响进食的半翅目害虫的生长、发育和活力。
[0405] 在植物原位递送与靶基因相对应的dsRNA、siRNA、shRNA、hpRNA或miRNA以及随后半翅目害虫通过进食的摄取导致靶基因通过RNA介导的基因沉默而下调。当靶基因的功能在发育的一个或更多个阶段重要时，会影响半翅目害虫的生长、发育和/或存活，并且对于至少一种英雄美洲蝽、褐椿象稻绿蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、绿椿象(Chinavia hilare)、(C.Marginatum)、椿虫、绿腹椿象；Edessa meditabunda、Thyanta perditor、棉红椿、Taedia stigmosa、秘鲁红蝽、Neomegalotomus parvus、Leptoglossus zonatus、Niesthrea sidae、豆荚草盲蝽和牧草盲蝽情况下导致半翅目害虫无法成功侵害、进食、发育、和/或导致死亡。继而对靶基因进行选择并成功应用RNAi来控制半翅目害虫。
[0406] 转基因RNAi株系和未转化玉蜀黍的表型比较。选择用于产生发夹dsRNA的靶标半翅目害虫基因或序列与任何已知植物基因序列均无显著相似性。因此，预期的是，通过靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体来生产或激活(系统性)RNAi不会对转基因植物产生任何有害作用。然而，还是将转基因株系的发育和形态特征与未经转化植株以及用不具有发夹表达基因的“空”载体转化的转基因株系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和繁殖特征。转基因植物和未经转化植株的根长和生长模式没有可观察到的差异。植物芽的特征如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观是相似的。总地来说，在体外和温室土壤中培养时，转基因株系与未表达靶iRNA分子的株系之间没有可观察到的形态学差异。
[0407] 实施例10：包含半翅目害虫序列的转基因大豆
[0408] 如在本领域中已知的，包括例如通过农杆菌介导的转化，产生了10至20株携带核酸的表达载体的转基因T0大豆植物，所述核酸包含SEQ ID NO:3的一部分和/或其区段(例如，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)，如下所述。将成熟的大豆(Glycine max)种子用氯气灭菌过夜，持续16小时。用氯气灭菌后，将种子放在LAMINARTM流动罩中的敞开容器中以驱散氯气。接下来，在24℃下，使用黑箱，在黑暗中使灭菌后的种子吸收无菌H2O 16个小时。
[0409] 制备种子分开的大豆。包含一部分胚轴的分开的大豆种子的方案需要制备大豆种子材料，该材料使用固定在解剖刀上的#10刀片沿种子的种脐纵向切割，以分离并去除种皮，然后将种子分成两个子叶部分。要特别注意去除部分胚轴，其中约1/2-1/3的胚轴保持附着在子叶的节末端。
[0410] 接种。然后，将包含胚轴一部分的裂开的大豆种子浸入含有包含SEQ ID NO:3和/或其区段(例如，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)的二元质粒的根癌农杆菌溶液(例如，菌株EHA 101或EHA 105)中约30分钟。在浸没包含胚轴的子叶之前，将根癌农杆菌溶液稀释至λ＝0.6OD650的终浓度。
[0411] 共培养。接种后，在用一张滤纸覆盖的皮氏培养皿中使裂开的大豆种子与根癌农杆菌菌株在共培养培养基上共培养5天(Agrobacterium Protocols,vol.2,2nd Ed.,Wang,K.(编辑)Humana Press,New Jersey,2006)。
[0412] 芽诱导。共培养5天后，在液体芽诱导(SI)培养基中洗涤裂开的大豆种子，该培养基由B5盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA，30g/L蔗糖、0.6g/L MES，1.11mg/L BAP、100mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟和50mg/L的万古霉素(pH 5.7)组成。然后，将裂开的大豆种子在芽诱导I(SI I)培养基上培养，该培养基由B5盐、B5维生素、7g/L诺布尔琼脂、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖、0.6g/L MES、1.11mg/LBAP、50mg/L TIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟和50mg/L万古霉素组成(pH 5.7)，子叶的平坦侧面朝上，并且子叶的节末端嵌入培养基中。培养2周后，将来自经转化的裂开大豆种子的外植体转移至芽诱导II(SI II)培养基中，该培养基含有补充有6mg/L草铵膦的SI I培养基
[0413] 芽伸长。在SI II培养基上培养2周后，将子叶从外植体中移出，并通过在子叶基部进行切割来切除含有胚轴的齐平芽垫。将从子叶分离出的芽垫转移到芽伸长(SE)培养基中。SE培养基由MS盐、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA、30g/L蔗糖和0.6g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA3、1mg/L玉米素核苷、50mg/LTIMENTINTM、200mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、6mg/L草铵膦和7g/L诺布尔琼脂组成(pH 5.7)。每两周将培养物转移到新鲜的SE培养基中。在CONVIRONTM生长室中于24℃，18h光周期，80-90μmol/m2sec的光强度下生长培养物。
[0414] 生根。通过从子叶芽垫的根部切下细长芽，来分离从子叶芽垫上形成的细长芽，然后将细长芽浸入1mg/L IBA(吲哚3-丁酸)中1-3分钟，以促进生根。接下来，在植物托盘中将细长芽转移到生根培养基(MS盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L Na2EDTA，20g/L蔗糖和0.59g/L MES、50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、7g/L诺布尔琼脂，pH 5.6)。
[0415] 培养。在CONVIRONTM生长室中于24℃，18h光周期条件下培养1-2周后，将在长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)在恒定温度(22℃)和湿度(40-50％)下在光强度为120-150μmol/m2sec下已长出根的芽转移到有盖圣代杯中的土壤混合物中，并置于ConvironTM生长室中(型号CMP4030和CMP3244(Controlled Environments Limited,Winnipeg,
Manitoba,Canada)以使小植株适应环境。将生根的小植株在圣代杯中适应数周，然后将其转移到温室中以进一步适应并建立强健的转基因大豆植物。
Manitoba,Canada)以使小植株适应环境。将生根的小植株在圣代杯中适应数周，然后将其转移到温室中以进一步适应并建立强健的转基因大豆植物。
[0416] 获得表达用于RNAi构建体的发夹dsRNA的另外10-20株T1大豆独立系用于BSB攻击。衍生包含SEQ ID NO:88及其区段(例如，SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94)中的任一个的发夹dsRNA。这些可以通过RT-PCR或本领域已知的其他分子分析方法进行确认。可选地，将从选定的独立T1系的总RNA制备物用于RT-PCR，将引物设计用于结合每个RNAi构建体中的发夹表达盒的接头内含子。此外，可选地，将RNAi构建体中每个靶基因的特异性引物用于扩增和确认用于植物原位siRNA产生所需的预加工mRNA的产生。每个靶基因的期望条带的扩增确认了每种转基因大豆植物中发夹RNA的表达。随后，可选地，利用RNA印迹杂交，在独立的转基因系中确认将靶基因的dsRNA发夹加工成siRNA。
[0417] 具有与靶基因超过80％序列同一性的错配序列的RNAi分子影响BSB的方式类似于与靶基因具有100％序列同一性的RNAi分子。在同一RNAi构建体中，错配序列与天然序列配对以形成发夹dsRNA，递送了经植物加工的siRNA，其能够影响进食的半翅目害虫的生长、发育和活力。
[0418] 在植物原位递送与靶基因相对应的dsRNA、siRNA、shRNA或miRNA以及随后半翅目害虫通过进食的摄取导致靶基因通过RNA介导的基因沉默而下调。当靶基因的功能在发育的一个或更多个阶段重要时，会影响进食的半翅目害虫的生长、发育和活力，并且对于至少一种英雄美洲蝽、褐椿象、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、绿椿象(Chinavia hilare)、褐椿象、椿虫、绿腹椿象；Edessa meditabunda、Thyanta perditor、Chinavia marginatum、棉红椿、Taedia stigmosa、秘鲁红蝽、Neomegalotomus parvus、Leptoglossus zonatus、Niesthrea sidae和牧草盲蝽导致半翅目害虫无法成功侵害、进食、发育、和/或导致死亡。继而对靶基因进行选择并成功应用RNAi来控制半翅目害虫。
[0419] 转基因RNAi系和非转基因大豆的表型比较。选择用于产生发夹dsRNA的目标半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列均无显著性差异。因此，预期的是，通过靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体来生产或激活(系统性)RNAi不会对转基因植物产生任何有害作用。然而，还是将转基因株系的发育和形态特征与未经转化植株以及用不具有发夹表达基因的“空”载体转化的转基因株系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和繁殖特征。转基因植物和未经转化植株的根长和生长模式没有可观察到的差异。植物芽的特征如高度、叶数和大小、开花时间、花大小和外观是相似的。总地来说，在体外和温室土壤中培养时，转基因株系与未表达靶iRNA分子的株系之间没有可观察到的形态学差异。
[0420] 实施例11：人工饮食的英雄美洲蝽的生物测定.
[0421] 在人工饮食的dsRNA进食测定中，将32孔托盘放置约18mg的人工饮食颗粒和水，如用于注射实验一样(参见实施例7)。将浓度为200ng/μL的dsRNA加入食物颗粒和水样中；两个孔中的每孔加100μL。向每个孔中引入五只二龄英雄美洲蝽若虫。靶向YFP转录物的水样和dsRNA用作阴性对照。在三个不同的日期重复进行实验。对存活的昆虫进行称重，并在处理8天后测定死亡率。与对照孔相比，在提供有BSB syx7 dsRNA的孔中观察到死亡和/或生长抑制。
[0422] 实施例12：包含半翅目害虫序列的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)[0423] 使用类似于实施例4的标准分子学方法来产生拟南芥转化载体，其含有用于形成包含syx7区段(例如，SEQ ID NO:3)的发夹的靶基因构建体。使用标准的基于农杆菌的程序进行拟南芥转化。用草铵膦耐受性选择标志物来选择T1种子。产生转基因的T1拟南芥植物，并产生纯合子简单拷贝的T2转基因植物用于昆虫研究。对具有花序的生长中的拟南芥植物进行生物测定。将五至十只昆虫放在每棵植株上，并在14天内监测其存活情况。
[0424] 拟南芥转化载体的构建。使用化学合成的片段(DNA2.0,Menlo Park,CA)和标准分子克隆方法的组合来组装基于入门载体的入门克隆，所述入门载体携带用于形成包含SEQ IDNO:3的区段的发夹的靶基因构建体。通过在相反取向上(在单个转录单元内)排列两个靶基因区段的拷贝，并将这两个区段通过接头序列(例如环)间隔开，促使由RNA初级转录物形成分子内发夹。因此，初级mRNA转录物包含两个大的、互为反向重复序列、且由接头序列分隔开的syx7基因区段序列。使用启动子的拷贝(例如，拟南芥泛素10启动子(Callis等人，(1990)J.Biological Chem.265:12486-12493))来驱动初级mRNA发夹转录物的产生，并且使用包含来自根癌农杆菌的开放阅读框23的3'非翻译区的片段(AtuORF23 3'UTR v1；美国专利5,428,147)来终止发夹RNA表达基因的转录。
[0425] 将入门载体内的发夹克隆用于采用典型二元目的载体的标准 重组反应中，以产生用于农杆菌介导的拟南芥转化的发夹RNA表达转化载体。
[0426] 在木薯脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子v2，美国专利7,601,885；Verdaguer等人(1996)Plant Mol.Biol.31:1129-39)的调控下，二元目的载体包含除草剂耐受基因DSM-2v2(美国专利公开号2011/0107455)。使用包含来自根癌农杆菌开放阅读框1的3'非翻译区的片段(AtuORF1 3'UTR v6；Huang等人，(1990)J.Bacteriol.172:1814-22)来终止DSM2v2 mRNA的转录。
[0427] 通过具有典型二元目的载体和入门载体的标准 重组反应来构建包含表达YFP发夹RNA的基因的阴性对照二元构建体。入门构建体包含在拟南芥泛素10启动子(如上所述)和包含来自根癌农杆菌的ORF23 3'非翻译区的片段(如上所述)的表达控制下的YFP发夹序列。
[0428] 包含杀虫RNA的转基因拟南芥的生产：农杆菌介导的转化。将含有发夹dsRNA序列的二元质粒电穿孔到农杆菌菌株GV3101(pMP90RK)中。通过对重组农杆菌菌落的质粒制备物的限制性分析来确认重组农杆菌克隆。按照制造商推荐的方案，使用QIAGEN Plasmid Max试剂盒(QIAGEN,Cat#12162)从农杆菌培养物中提取质粒。
[0429] 拟南芥转化和T1选择。在温室中的4”盆中栽培十二至十五株拟南芥植物(c.v.Columbia)，光照强度为250μmol/m2，25℃，18:6小时的光照:黑暗条件。在转化前一周修剪初生花茎。通过将10μL重组农杆菌甘油储备液在100mL LB肉汤(Sigma L3022)+100mg/L壮观霉素+50mg/L卡那霉素中于28℃温育，并以225rpm摇动72小时来制备农杆菌接种物。
收获农杆菌细胞，并在浸花(floral dipping)前将其悬浮于5％蔗糖+0.04％Silwet-L77(Lehle Seeds目录号VIS-02)+10μg/L苯甲酰胺嘌呤(benzamino purine，BA)溶液中至OD600为0.8至1.0。将植物的地上部分在缓慢搅拌下浸入农杆菌溶液5-10分钟。然后将植物转移到温室中使其正常生长，定期浇水和施肥直至种子结实。
收获农杆菌细胞，并在浸花(floral dipping)前将其悬浮于5％蔗糖+0.04％Silwet-L77(Lehle Seeds目录号VIS-02)+10μg/L苯甲酰胺嘌呤(benzamino purine，BA)溶液中至OD600为0.8至1.0。将植物的地上部分在缓慢搅拌下浸入农杆菌溶液5-10分钟。然后将植物转移到温室中使其正常生长，定期浇水和施肥直至种子结实。
[0430] 实施例13：转基因拟南芥的生长和生物测定
[0431] 用dsRNA构建体转化的T1拟南芥的选择。在0.1％的琼脂糖溶液中，将来自每个转化的多至200mg T1种子分层。将种子种植在含有#5阳光培养基的萌发托盘中(10.5”x 21”x1”；T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)。在种植后第6天和第9天，针对280g/ha的(草铵膦)，选择转化体。所选事件被移植到4”直径的花盆中。使用Roche LightCycler480TM通过水解定量RT-qPCR在移植后一周内进行插入拷贝分析。使用LightCyclerTM探针设计软件2.0(Roche)针对DSM2v2选择标志物设计PCR引物和水解探针。将植物保持在24℃下，具有在强度为100-150mE/m2s的荧光灯和白炽灯下的16:8小时的光照:黑暗光周期。
[0432] 英雄美洲蝽植物进食生物测定。为每个构建体至少选择四个低拷贝(1-2个插入)、四个中等拷贝(2-3个插入)和四个高拷贝(≥4个插入)事件。使植物生长到繁殖阶段(含有花和角果的植物)。土壤表面覆盖有约50mL体积的白色沙子，以轻松识别昆虫。向每棵植物上引入五至十只二龄英雄美洲蝽若虫。用3”直径、16”高、0.03”壁厚的塑料管(货号484485，Visipack Fenton Mo)覆盖植物；管上覆盖有尼龙网以隔离昆虫。将植物保持在人工气候室中的常温、光照和浇水条件下。在14天之内，收集昆虫并称重；计算百分比死亡率和生长抑制(1-处理组重量/对照组重量)。将表达YFP发夹的植物用作对照。
[0433] T2拟南芥种子产生和T2生物测定。由每个构建体的选定低拷贝(1-2个插入)事件产生T2种子。如上所述，对植物(纯合和/或杂合的)进行英雄美洲蝽进食生物测定。由纯合子收获T3种子并保存以备将来分析。
[0434] 实施例14：其他作物物种的转化
[0435] 通过使用本领域技术人员已知的方法，例如与先前在美国专利7,838,733的实施例14或PCT国际专利公开号WO 2007/053482的实施例12中描述的基本相同的技术，用syx7dsRNA转基因转化棉花，以提供对半翅目昆虫的控制。
[0436] 实施例15：在昆虫管理中的Syx7 dsRNA
[0437] 在转基因植物中将Syx7 dsRNA转基因与另一些dsRNA分子组合，提供过多的RNAi靶向和协同RNAi效应。表达靶向syx7的dsRNA的转基因植物例如(包括但不限于，如玉米、大豆和棉花)可用于防止鞘翅目和半翅目昆虫的进食损害。还将Syx7 dsRNA转基因与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术和/或PIP-1杀虫多肽一起组合在植物中，以代表昆虫抗性管理基因聚合(Insect Resistance Management gene pyramid)中的一种新的作用方式。当与靶向昆虫害虫的另外的dsRNA分子和/或杀虫蛋白在转基因植物中组合时，观察到协同杀虫作用，这也减缓了抗性昆虫种群的发生。
[0438] 虽然本公开内容可能容易受到多种修改和替代形式，但是在此已经通过示例的方式详细描述了特定实施方案。然而，应当理解的是，本公开内容并不旨在限于所公开的特定形式。相反，本公开内容将涵盖本公开内容范围内的所有修改、等同物和替代品，如以下所附权利要求及其法律等同物所定义。
[0439] 代表性实施方案的特定非限制性实例如下阐述：
[0440] 实施方案1：分离的核酸分子，其包含至少一个与异源启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:2的反向互补序列；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:3的反向互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列；包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的互补序列；包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的反向互补序列；包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；包括SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0441] 实施方案2：根据实施方案1所述的核酸分子，其中所述多核苷酸选自：SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:2的互补序列；SEQ ID NO:2的反向互补序列；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:2的至少
15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的反向互补序列；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及包含SEQ ID NO:7的露尾甲属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0442] 实施方案3：根据实施方案1所述的核酸分子，其中所述多核苷酸选自：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:3的互补序列；SEQ ID NO:3的反向互补序列；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:3的至少
15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的反向互补序列；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段；包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及包含SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:9的美洲蝽属生物体的天然编码序列的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0443] 实施方案4：根据实施方案1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、前述的互补序列和前述的反向互补序列。
[0444] 实施方案5：根据实施方案1、2和4中任一项所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、前述的互补序列和前述的反向互补序列。
[0445] 实施方案6：根据实施方案1、3和4中任一项所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、前述的互补序列和前述的反向互补序列。
[0446] 实施方案7：根据实施方案1、2、4和5中任一项所述的核酸分子，其中所述生物体是油菜露尾甲(Meligethes aeneus Fabricius)(花粉甲虫)。
[0447] 实施方案8：根据实施方案1、3、4和6中任一项所述的核酸分子，其中所述生物体选自英雄美洲蝽(Euschistus heros(Fabr.))(新热带棕椿象)、稻绿蝽(Nezara viridula(L.))(南方绿椿象)；盖德拟壁蝽(Piezodorus guildinii(Westwood))(红带椿象)、茶翅蝽(Halyomorpha halys )(棕翅椿象)、Chinavia hilare(Say)(绿椿象)、褐椿象(E.servus(Say))(棕椿象)、椿虫(Dichelops Melacanthus(Dallas))、绿腹椿象(Dichelop furcatus(F.))、Edessa meditabunda(F.)、Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisotde Beauvois)、棉红椿(Horcias nobilellus(Berg))(棉椿象)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Dysdercus peruvianus)(Guérin-Méneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、Leptoglossus zonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(Lygus hesperus(Knight))(西方漆黑植物椿象)；以及牧草盲蝽(Lygus lineolaris)(Palisot de Beauvois)。
[0448] 实施方案9：根据实施方案1-8中任一项所述的核酸分子，其中所述分子是载体。
[0449] 实施方案10：由实施方案1-9中任一项所述的核酸分子编码的RNA分子，其中所述RNA分子包含由所述多核苷酸编码的多核糖核苷酸。
[0450] 实施方案11：根据实施方案10所述的RNA分子，其中所述分子是dsRNA分子。
[0451] 实施方案12：根据实施方案11所述的dsRNA分子，其中使所述分子与鞘翅目害虫接触抑制与所述多核糖核苷酸特异性互补的内源性核酸分子的表达。
[0452] 实施方案13：根据实施方案12所述的dsRNA分子，其中所述鞘翅目害虫是油菜露尾甲(花粉甲虫)。
[0453] 实施方案14：根据实施方案11-13中任一项所述的dsRNA分子，其中使所述分子与所述鞘翅目害虫接触杀死或抑制所述害虫的生长和/或进食。
[0454] 实施方案15：根据实施方案11所述的dsRNA分子，其中使所述分子与半翅目害虫接触抑制与所述多核糖核苷酸特异性互补的内源性核酸分子的表达。
[0455] 实施方案16：根据实施方案15所述的dsRNA分子，其中所述半翅目害虫选自：英雄美洲蝽(新热带棕椿象)、稻绿蝽(南方绿椿象)；盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅椿象)、Chinavia hilare(Say)(绿椿象)、褐椿象(棕椿象)、椿虫、绿腹椿象、Edessa meditabunda(F.)、Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisot de Beauvois)、棉红椿(Berg)(棉椿象)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Guérin-Méneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、Leptoglossus zonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(西方漆黑植物椿象)；以及牧草盲蝽(Palisot de Beauvois)。
[0456] 实施方案17：根据实施方案15-16中任一项所述的dsRNA分子，其中使所述分子与所述半翅目害虫接触杀死或抑制所述害虫的生长和/或进食。
[0457] 实施方案18：根据实施方案11-17中任一项所述的dsRNA分子，其包含第一、第二和第三多核糖核苷酸，其中所述第一多核糖核苷酸由所述核苷酸序列编码，其中所述第三多核糖核苷酸通过所述第二多核糖核苷酸连接至所述第一多核糖核苷酸，并且其中所述第三多核糖核苷酸基本上是所述第一多核糖核苷酸的反向互补序列，使得所述第一和所述第三多核糖核苷酸在转录成核糖核酸时杂交以形成所述dsRNA。
[0458] 实施方案19：根据实施方案11-17中任一项所述的dsRNA分子，其中所述分子包含由所述多核苷酸编码的长度为约15至约30个核苷酸的单链多核糖核苷酸。
[0459] 实施方案20：根据实施方案9所述的载体，其中所述异源启动子在植物细胞中是功能性的，并且其中所述载体是植物转化载体。
[0460] 实施方案21：包含实施方案1-20中任一项所述的核酸分子的细胞。
[0461] 实施方案22：根据实施方案21所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
[0462] 实施方案23：根据实施方案21所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
[0463] 实施方案24：根据实施方案23所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
[0464] 实施方案25：植物部分或植物细胞，其包含实施方案1-20中任一项所述的核酸分子。
[0465] 实施方案26：根据实施方案25所述的植物部分，其中所述植物部分是种子。
[0466] 实施方案27：包含实施方案25所述的植物部分或植物细胞的转基因植物。
[0467] 实施方案28：由实施方案27所述的植物生产的食品产品或商品产品，其中所述产品包含可检测量的所述核酸分子。
[0468] 实施方案29：根据实施方案28所述的食品产品或商品产品，其中所述产品选自油、谷物和纤维。
[0469] 实施方案30：根据实施方案27所述的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表达为dsRNA分子。
[0470] 实施方案31：根据实施方案25所述的细胞，其中所述细胞是玉蜀黍(Zea mays)、大豆(Glycine max)、芸苔属(Brassica sp.)、棉属(Gossypium sp.)或禾本科细胞。
[0471] 实施方案32：根据实施方案31所述的细胞，其中所述细胞是玉蜀黍细胞。
[0472] 实施方案33：根据实施方案31所述的细胞，其中所述细胞是芸苔属或禾本科细胞。
[0473] 实施方案34：根据实施方案31所述的细胞，其中所述细胞是棉属细胞。
[0474] 实施方案35：根据实施方案27和30中任一项所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍、大豆、芸苔属、棉属或禾本科植物。
[0475] 实施方案36：根据实施方案35所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍。
[0476] 实施方案37：根据实施方案35所述的植物，其中所述植物是芸苔属或禾本科植物。
[0477] 实施方案38：根据实施方案35所述的植物，其中所述植物是棉属。
[0478] 实施方案39：根据实施方案30和35-38中任一项所述的植物，其中所述多核苷酸在所述植物中表达为dsRNA分子，并且当昆虫害虫摄入所述植物的一部分时，所述dsRNA分子抑制与所述RNA分子特异性互补的内源性多核苷酸的表达。
[0479] 实施方案40：根据实施方案39所述的植物，其中所述昆虫害虫为鞘翅目害虫。
[0480] 实施方案41：根据实施方案40所述的植物，其中所述鞘翅目害虫是油菜露尾甲(花粉甲虫)。
[0481] 实施方案42：根据实施方案39所述的植物，其中所述昆虫害虫为半翅目害虫，其选自英雄美洲蝽(新热带棕椿象)、稻绿蝽(南方绿椿象)；盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅椿象)、Chinavia hilare(Say)(绿椿象)、褐椿象(棕椿象)、椿虫(Dallas)、绿腹椿象、Edessa meditabunda(F.)、Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisotde Beauvois)、棉红椿(Berg)(棉椿象)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Guérin-Méneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、Leptoglossus zonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(西方漆黑植物椿象)；和牧草盲蝽(Palisot de Beauvois)。
[0482] 实施方案43：根据实施方案42所述的植物，其中所述半翅目害虫是英雄美洲蝽(新热带棕椿象)。
[0483] 实施方案44：包含实施方案10-19中任一项所述的RNA分子的可喷雾制剂或诱饵组合物。
[0484] 实施方案45：根据实施方案1-9中任一项所述的核酸分子，其还包含与异源启动子可操作地连接的至少一种另外的多核苷酸，其中所述另外的多核苷酸编码多核糖核苷酸。
[0485] 实施方案46：根据实施方案45所述的核酸分子，其中与所述另外的多核苷酸可操作地连接的所述异源启动子在植物细胞中是功能性的，并且其中所述分子是植物转化载体。
[0486] 实施方案47：控制昆虫害虫种群的方法，所述方法包括使所述种群的昆虫害虫与包含dsRNA分子的试剂接触，所述dsRNA分子在与所述昆虫害虫接触后起作用以抑制所述害虫内的生物学功能，其中所述分子包含多核糖核苷酸，其可与选自以下的参考多核糖核苷酸特异性杂交：SEQ ID NO:86-90；SEQ ID NO:86-90中任一个的互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的反向互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；
SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的反向互补序列。
SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的反向互补序列。
[0487] 实施方案48：根据实施方案47所述的方法，其中所述多核糖核苷酸可与选自以下的参考多核糖核苷酸特异性杂交：SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的互补序列；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的反向互补序列；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:2的转录物；SEQ ID NO:2的转录物的互补序列；以及SEQ ID NO:2的转录物的反向互补序列。
[0488] 实施方案49：根据实施方案47所述的方法，其中所述多核糖核苷酸可与选自以下的参考多核糖核苷酸特异性杂交：SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中任一个的互补序列；SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中任一个的反向互补序列；SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:3的转录物；SEQ ID NO:3的转录物的互补序列；以及SEQ ID NO:3的转录物的反向互补序列。
[0489] 实施方案50：控制鞘翅目害虫种群的方法，所述方法包括使所述种群的鞘翅目害虫与包含含有第一和第二多核糖核苷酸的dsRNA分子的试剂接触，其中所述dsRNA分子在与所述鞘翅目害虫接触时起作用以抑制所述鞘翅目害虫内的生物学功能，其中所述第一多核糖核苷酸包含与SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的参考多核糖核苷酸的约15至约30个连续核苷酸具有约90％至约100％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述第一多核糖核苷酸与所述第二多核糖核苷酸特异性杂交。
[0490] 实施方案51：根据实施方案50所述的方法，其中所述参考多核糖核苷酸是SEQ ID NO:87。
[0491] 实施方案52：控制半翅目害虫种群的方法，所述方法包括使所述种群的半翅目害虫与包含含有第一和第二多核糖核苷酸的dsRNA分子的试剂接触，所述dsRNA分子在与所述鞘翅目害虫接触时起作用以抑制所述鞘翅目害虫内的生物学功能，其中所述第一多核糖核苷酸包含与选自SEQ ID NO:88-90的参考多核糖核苷酸的约15至约30个连续核苷酸具有约90％至约100％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述第一多核糖核苷酸与所述第二多核糖核苷酸特异性杂交。
[0492] 实施方案53：根据实施方案52所述的方法，其中所述参考多核糖核苷酸是SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90。
[0493] 实施方案54：根据实施方案47-53中任一项所述的方法，其中使所述害虫与所述试剂接触包括使所述害虫与包含所述dsRNA分子的可喷雾制剂接触。
[0494] 实施方案55：根据实施方案47-53中任一项所述的方法，其中使所述害虫与所述试剂接触包括使所述害虫进食所述试剂，并且所述试剂是包含所述dsRNA分子的植物细胞或包含所述dsRNA分子的RNA诱饵。
[0495] 实施方案56：控制害虫种群的方法，所述方法包括在害虫的宿主植物中提供包含实施方案1-9中任一项所述的核酸分子的植物细胞，其中所述多核苷酸被表达以产生RNA分子，所述RNA分子在与属于所述种群的昆虫害虫接触时起作用以抑制所述昆虫害虫内的靶序列表达，并导致相对于不包含所述多核苷酸的相同宿主植物物种的植物上的相同害虫物种的发育，所述昆虫害虫或害虫种群的生长和/或存活降低。
[0496] 实施方案57：根据实施方案56所述的方法，其中相对于侵害缺乏包含所述核酸分子的植物细胞的相同宿主植物物种的宿主植物的相同害虫物种的种群，所述昆虫害虫种群减少。
[0497] 实施方案58：根据实施方案56-57中任一项所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目害虫。
[0498] 实施方案59：根据实施方案56-57中任一项所述的方法，其中所述昆虫害虫为半翅目害虫。
[0499] 实施方案60：控制植物中的昆虫害虫侵害的方法，所述方法包括在所述昆虫害虫的饮食中提供包含多核糖核苷酸的RNA分子，所述多核糖核苷酸可与选自以下的参考多核糖核苷酸特异性杂交：SEQ ID NO:86-90；SEQ ID NO:86-90中任一个的互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的反向互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:86-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:
3中任一个的转录物；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
3中任一个的转录物；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的反向互补序列；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0500] 实施方案61：根据实施方案60所述的方法，其中所述饮食包含植物细胞，所述植物细胞包含被转录以表达所述RNA分子的多核苷酸。
[0501] 实施方案62：根据实施方案60或实施方案61所述的方法，其中所述参考多核糖核苷酸选自：SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:86的互补序列；SEQ ID NO:86的反向互补序列；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:87的互补序列；SEQ ID NO:87的反向互补序列；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:2的转录物；SEQ ID NO:2的转录物的互补序列；SEQ ID NO:2的转录物的反向互补序列；SEQ ID NO:2的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:2的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及SEQ ID NO:2的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0502] 实施方案63：根据实施方案60或实施方案61所述的方法，其中所述参考多核糖核苷酸选自：SEQ ID NO:88-90；SEQ ID NO:88-90中任一个的互补序列；SEQ ID NO:88-90中任一个的反向互补序列；SEQ ID NO:88-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO：88-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；SEQ ID NO:88-90中任一个的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列；SEQ ID NO:3的转录物；SEQ ID NO:3的转录物的互补序列；SEQ ID NO:3的转录物的反向互补序列；SEQ ID NO:3的转录物的至少15个连续核苷酸的片段；SEQ ID NO:3的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的互补序列；以及SEQ ID NO:3的转录物的至少15个连续核苷酸的片段的反向互补序列。
[0503] 实施方案64：用于提高作物产量的方法，所述方法包括在作物中培养包含实施方案1-9中任一项所述的核酸分子的植物以允许所述多核苷酸的表达。
[0504] 实施方案65：根据实施方案64所述的方法，其中所述多核苷酸的表达产生dsRNA分子，其阻抑已与所述植物的一部分接触的昆虫害虫中的至少第一靶基因，从而抑制所述昆虫害虫的发育或生长和由所述害虫的感染引起的产量损失。
[0505] 实施方案66：生产转基因植物细胞的方法，所述方法包括用实施方案9所述的载体转化植物细胞；在足以允许包含多个转基因植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化的植物细胞；选择已将多核苷酸整合到其基因组中的转基因植物细胞；针对由所述多核苷酸编码的dsRNA分子的表达筛选所述转基因植物细胞；以及选择表达所述dsRNA的转基因植物细胞。
[0506] 实施方案67：根据实施方案64-66中任一项所述的方法，其中所述植物或植物细胞是玉蜀黍、大豆、芸苔属、棉属或禾本科植物或植物细胞。
[0507] 实施方案68：根据实施方案67所述的方法，其中所述植物或植物细胞是玉蜀黍。
[0508] 实施方案69：根据实施方案67所述的方法，其中所述植物或植物细胞是芸苔属或禾本科。
[0509] 实施方案70：根据实施方案67所述的方法，其中所述植物或植物细胞是棉属。
[0510] 实施方案71：产生抗昆虫害虫的转基因植物的方法，所述方法包括从包含实施方案1-9中任一项所述的核酸分子的转基因植物细胞再生转基因植物，其中由所述多核苷酸编码的dsRNA分子的表达足以在昆虫害虫接触所述RNA分子时调节所述害虫中的靶基因表达。
[0511] 实施方案72：根据实施方案1-9中任一项所述的核酸分子，其还包含编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫多肽的多核苷酸。
[0512] 实施方案73：根据实施方案24和31-35中任一项所述的植物细胞，其还包含编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属(Alcaligenes spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp.)的杀虫多肽的多核苷酸。
[0513] 实施方案74：根据实施方案27、30和35-43中任一项所述的植物，其还包含编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属或假单胞菌属杀虫多肽的多核苷酸。
[0514] 实施方案75：根据实施方案55-59和61-71中任一项所述的方法，其中所述植物或植物细胞包含编码来自苏云金芽孢杆菌、产碱杆菌属或假单胞菌属的杀虫多肽的多核苷酸。
[0515] 实施方案76：根据实施方案72所述的核酸分子，实施方案73所述的植物细胞，实施方案74所述的植物或实施方案75所述的方法，其中所述杀虫多肽选自由Cry1B、Cry1I、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A和Cyt2C组成的苏云金芽孢杆菌杀虫多肽。
[0516] 实施方案77：根据实施方案47、48、54-57、60-62、65、67-70和76中任一项所述的方法，其中所述害虫为鞘翅目害虫。
[0517] 实施方案78：根据实施方案50、51和58中任一项所述的方法，其中所述鞘翅目害虫是油菜露尾甲(花粉甲虫)。
[0518] 实施方案79：根据实施方案47、49、54-57、60、61、63、65、67-71和76中任一项所述的方法，其中所述害虫为半翅目害虫。
[0519] 实施方案80：根据实施方案52、53、59和79中任一项所述的方法，其中所述半翅目害虫选自英雄美洲蝽(新热带棕椿象)、稻绿蝽(南方绿椿象)；盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅椿象)、Chinavia hilare(Say)(绿椿象)、褐椿象(棕椿象)、椿虫、绿腹椿象、Edessa meditabunda(F.)、Thyanta perditor(F.)(新热带红肩椿象)、Chinavia marginatum(Palisotde Beauvois)、棉红椿(棉椿象)、Taedia stigmosa(Berg)、秘鲁红蝽(Guérin-Méneville)、Neomegalotomus parvus(Westwood)、Leptoglossus zonatus(Dallas)、Niesthrea sidae(F.)、豆荚草盲蝽(西方漆黑植物椿象)；和牧草盲蝽(Palisot de Beauvois)。
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