技术领域
[0001] 本
发明涉及一种检测环境雌激素类的酵母重组系统及方法，属于
生物检测技术领域。
背景技术
[0002] 环境雌激素类干扰物(EDCs)是影响人类健康和生态安全的重要环境问题。生态毒理学中内分泌干扰研究的困难在于不同
门类的物种拥有不同的内分泌系统。通过解析EDCs作用的分子机制可识别出敏感的分子标志物，用于污染物环境浓度的指示与暴露
风险评估，并为外推跨物种的干扰效应提供依据。
[0003] 壬基酚(NP)是一类重要的环境雌激素类干扰物，具有持久性和生物蓄积性。由于NP特别是4-NP的结构具有拟雌激素特点，可激活雌激素受体(ER)下游的靶基因而产生内分泌干扰作用，会造成鱼类和
哺乳动物雄性个体性畸变、生殖障碍与发育异常，导致雌性个体性早熟并诱发
肿瘤。近年来NP在我国沿海表层
海水和
沉积物中检出量较高，威胁着海洋生态环境与水产
食品安全，目前已成为环境毒理学领域的研究热点。
[0004] 因此，需要利用快速和灵敏的方法来鉴定和监测环境中具有内分泌破坏活性的化学品。体外试验是筛选激素活性化合物的首选方法，有利于识别新的化合物。目前对环境雌激素类干扰物的研究主要包括三种类型体外实验方法：报告基因方法、原代干细胞试验和竞争配体结合试验。尽管上述检测方式评估了化学物质与激素受体结合的能
力，但在检测配体的结合时均需要采用相当费力的免疫学检测手段，如哺乳动物细胞的裂解步骤。另一方面，广泛应用于人雌激素受体检测的酵母双杂交系统，通常需要数天才能完成底物比色；并且用于检测酵母双杂交系统表达的报告基因需与目的基因连接后转入酵母菌种，从而启动报告基因的表达，无法排除报告基因对酵母双杂交系统的影响；另外，酵母双杂交系统利用化学
试剂裂解酵母细胞，易对后续酶活检测产生影响。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于发明一种检测环境雌激素类干扰物的酵母重组系统及方法，能够实现高灵敏、特异性鉴定和检测环境雌激素类干扰物的快速检测，以克服
现有技术的缺点与不足。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0007] 一种检测环境雌激素类干扰物的酵母重组系统，其特征是该酵母重组系统由以下方法构建：
[0008] (1)构建重组表达质粒：所述的重组表达质粒是以生物体雌激素受体基因ER的cDNA序列为目的序列；
[0009] 利用Primer5.0
软件设计引物，在引物两端添加特异性酶切位点，利用上述引物扩增靶基因保守区域
片段；
[0010] 利用生物体性腺组织cDNA模板及高保真酶进行PCR反应，胶回收纯化获得插入目的片段；
[0011] 选择载体pGADT7，该载体的筛选标志为Leu，使用该载体的目的是用于表达酵母转录因子DNA-AD(位于C端768～881位
氨基酸片段的转录激活域)，而表达DNA-AD之后可以启动酵母下游基因进行转录；
[0012] 利用限制性内切酶线性化处理克隆载体pGADT7，利用凝胶
电泳分离、纯化载体后，经必克隆反应连接上述目的序列，构建重组表达质粒；
[0013] (2)构建重组诱饵质粒：所述的重组诱饵质粒以5’GGTCAnnnTGACC 3’为核心序列，人工合成爪蟾卵黄蛋白原基因雌激素效应元件ERE，
[0014] 为增强对下游靶基因的调控效果，设计两段完全重复的效应元件序列，每段效应元件序列如下：
[0015] TATGAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAATCTAGAAGATCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAACTGCA
[0016] 根据效应元件序列的特异性，选择用于插入的唯一酶切位点，并在效应元件序列的5’端和3’端分别加上限制性内切酶粘性末端序列，同时将5’端进行磷
酸化处理；
[0017] 选择载体pGBKT7用于表达酵母转录因子DNA-BD(位于N端1～174位氨基酸片段的DNA结合域)，该载体的筛选标志为Trp，使用该载体的目的在于可以识别上游激活序列，并与之结合，利用限制性内切酶线性化处理克隆载体pGBKT7，利用凝胶电泳分离、纯化后，经必克隆反应连接上述目的片段，构建重组诱饵质粒；
[0018] (3)酵母菌的转化：
[0019] 将重组表达质粒与诱饵质粒共转化入Y187感受态细胞中，筛选培养阳性克隆菌株后确定酵母重组系统构建成功；
[0020] 同时仅
转染重组表达质粒入Y187感受态细胞中，筛选培养阳性克隆菌株后确定酵母阴性对照组构建成功；
[0021] 所述的酵母菌株是Y187，是一种带有营养
缺陷筛选标记的菌株，含有报告基因U-半乳糖甘酶基因(Lac Z)。
[0022] 利用上述酵母重组系统检测环境雌激素类干扰物的方法，特征在于包括以下步骤：
[0023] 以非转染菌株作为空白对照组，仅转染表达质粒菌株作为阴性对照组，重组菌株作为实验组；
[0024] 分别加入不同浓度系列的待测环境雌激素样品，振荡培养后，进行诱导与液氮反复冻融破壁处理；
[0025] 以底物是否发生显色反应来判断是否存在β半乳糖甘酶，进而计算β半乳糖甘酶的活性变化，进行数据标准化分析，从而得到关于剂量-效应曲线作为检测结果。
[0026] 所述数据标准化分析为酵母重组系统对不同化学物质的剂量-效应(其中零和百分之百被定义为每个数据集分别对各化学物质的最低和最高效应)，获得剂量-效应曲线(浓度-活性曲线)；将平行试验参数非线性回归(斜率＝1)拟合到归一化数据上以便分析数据。
[0027] 所述的检测方法中，所述的环境雌激素包括天然激素与内分泌干扰物，其中天然激素包括但不限于17β-雌二醇E2，雌
酮E1，孕酮P，睾酮T，内分泌干扰物包括但不限于壬基酚4-NP。
[0028] 本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
[0029] 目前用于检测环境雌激素的酵母双杂交系统主要利用人类与鱼类雌激素受体基因片段构建表达质粒，雌激素效应元件片段连接报告基因Lac Z后构建报告质粒。然而环境雌激素类干扰物通常以工业
废水或生活污水的形式排放，并在
水体环境中汇集。与人体生活的大气环境相比，长期生活于水体环境的水生生物更易受到严重危害。相比于鱼类，附着变态后营底栖固着生活的双壳贝类具有生物毒性蓄积能力强的特点，更能揭示污染物对生物的潜在危害。
[0030] 长牡蛎作为我国主要
海水养殖贝类之一，营滤食性生活，具有代谢率低，毒性蓄积能力强等特点，被认为是一种较为理想的海洋环境监测生物。因此本发明中选择双壳贝类长牡蛎为实验生物，构建由长牡蛎雌激素受体调控的酵母重组系统。选择Y187菌株作为酵母宿主菌株，含有报告基因Lac Z，简化了构建报告质粒的步骤，大大的降低了重组酵母
假阳性发生的概率。其次利用细胞壁较厚的酵母细胞检测环境样品，减少因外界环境因素或实验操作引起的细胞生长与活力降低，使得酵母检测系统可直接应用于不同的样品基质。选择17β-雌二醇E2，雌酮E1，孕酮P，睾酮T等四种天然激素用于检测酵母重组系统的灵敏性与特异性，并选择壬基酚4-NP作为内分泌干扰物的典型代表。壬基酚(NP)是环境雌激素类内分泌干扰物(EDCs)的典型代表，在环境中污染极为广泛。由于NP的分子结构与天然雌激素雌二醇(E2)的分子结构相似，导致NP具有模拟雌激素的能力，通过与生物体内雌激素受体结合，能够干扰生物体的内分泌代谢。通过比较上述五种化合物对酵母重组系统的激活活性，得到活性诱导的剂量-效应曲线，确定系统敏感性。因此依据本发明构建的环境雌激素类干扰物的酵母重组系统，是一种具有高灵敏、特异性鉴定或检测具有内分泌破坏活性化学品的检测方法，对壬基酚等EDCs污染的早期预警与毒理评价具有重要意义。
附图说明
[0031] 图1 17-β-雌二醇对酵母重组系统β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应曲线、阴性及空白对照组反应曲线；
[0032] 其中，Y187为空白对照组，Cg-ER为阴性对照组，Cg-ER/ERE为剂量-效应曲线。
[0033] 图2五种化合物对酵母重组系统β-半乳糖苷酶活性诱导的剂量-效应曲线；
[0034] 其中，E1为雌酮，E2为17-β-雌二醇，NP为4-壬基酚，P为孕酮，T为睾酮。
[0035] 表1不同化合物对酵母重组系统的EC50值。
具体实施方式
[0036] 以下通过
实施例及附图对本发明进行详细描述，以实施例1与实施例2分别说明酵母重组系统的构建与激活活性效果。
[0037] 构建酵母重组系统的特征在于包括以下步骤：
[0038] 实施例1酵母重组系统的构建
[0039] (1)将长牡蛎雌激素受体基因CgER连接到克隆载体pGADT7，构建重组表达质粒：
[0040] 本实施例中选取长牡蛎(Crassostrea gigas)的雌激素受体基因的cDNA序列CgER作为目的序列(GenBank登录号为AB259818.1)；首先利用Primer5.0软件设计CgER的引物，在引物两端添加EcoRI/XhoI酶切位点，引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，下划线部分为限制性内切酶序列，斜体部分为载体接头序列；
[0041]
[0042] 利用上述引物对CgER扩增靶基因保守区域片段，利用长牡蛎性腺组织cDNA模板及高保真酶 Max DNA Polymerase进行PCR反应，胶回收纯化获得插入目的片段；
[0043] 利用限制性内切酶EcoR I/Xho I线性化处理克隆载体pGADT7；
[0044] 利用凝胶电泳分离、纯化载体后，经必克隆反应连接上述目的片段，构建重组表达质粒，命名为pGADT7-CgER；
[0045] (2)将人工合成爪蟾卵黄蛋白原基因雌激素效应元件ERE连接到克隆载体pGBKT7，构建重组诱饵质粒：
[0046] 以5’GGTCAnnnTGACC 3’为核心序列，人工合成爪蟾卵黄蛋白原基因雌激素效应元件ERE；
[0047] 为增强对酵母下游靶基因的调控效果，设计两段完全重复的效应元件序列(SEQ ID NO.3)；
[0048] TATGAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAATCTAGAAGATCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAACTGCA
[0049] 在序列NO.3的5’端和3’端分别加上粘性末端NdeI和PstI，同时将5’端进行
磷酸化处理；
[0050] 利用限制性内切酶NdeI/PstI线性化处理克隆载体pGBKT7，
[0051] 利用凝胶电泳分离、纯化后，经必克隆反应连接上述目的片段，构建重组诱饵质粒，命名为pGBKT7-ERE；
[0052] (3)酵母菌的转化
[0053] 利用
醋酸锂(LiAc)方法制备酵母菌株Y187感受态细胞，并将pGADT7-CgER与pGBKT7-ERE共转化入Y187感受态细胞中；用二缺选择培养基SD/-Trp/-Leu筛选出阳性克隆菌株，经测序鉴定确定质粒是否已成功转化酵母菌；此时确定酵母重组系统构建成功，命名为Cg-ER/ERE。
[0054] 同时仅转染pGADT7-CgER入Y187感受态细胞中，用SD/-Leu单缺培养基筛选出阳性克隆菌株，经测序鉴定确定质粒已成功转化酵母菌，此时确定酵母阴性对照组构建成功，命名为Cg-ER。
[0055] 实施例2酵母重组系统的激活方法与活性检测
[0056] (1)重组菌株的培养
[0057] 挑取单克隆重组酵母菌株(Y187)添加到YPDA全
营养液体培养基振荡培养，至OD600读数为0.1-0.4；以非转染菌株(用符号Y187表示)作为空白对照组，仅转染表达质粒菌株(用符号Cg-ER表示)作为阴性对照组，重组菌株(用符号Cg-ER/ERE表示)作为实验组。
[0058] 分别加入系列待测样品(含不同浓度类固醇或内分泌干扰物的DMSO溶液，如17β-雌二醇E2，雌酮E1，孕酮P，睾酮T，壬基酚4-NP)，于30℃的恒温摇床中振荡培养18h，测定并记录此时培养液的OD600值。
[0059] (2)重组菌株的诱导与破壁处理
[0060] A.根据预实验检测，为控制重组菌株β-半乳糖甘酶反应时间于1h内，确定本实验中酵母菌株反应体系为3mL。
[0061] 取待测培养液于1.5mLEP管中，以13,300rpm离心1min，弃上清；加入1mL Z buffer缓冲液，再次离心并弃上清；加入100uL Z buffer缓冲液后涡旋重悬沉淀，此时应为已诱导完毕的重组酵母。
[0062] B.放入液氮中30s，然后立即放入37℃水浴30s使酵母菌破壁，反复重复冻融5～6次；用500uL Z缓冲液重悬细胞，将混合物在30℃水浴下预保温样品5min，留作显色反应。
[0063] (3)重组菌株的酶活检测
[0064] 在上述预保温样品中加入200uL ONPG底物溶液，放入30℃水浴，立即计时；待出现浅黄色时(浅黄色显色的标准为等同于新鲜的LB培养液，此时可作为反应终止点)，加500uL Na2CO3溶液终止反应，记录所用时间t。将停止反应的混合物13,300rpm离心1min，弃上清，测定反应物OD420。
[0065] 根据上述实验测得的吸光值与测定酵母菌体积及浓度计算β-半乳糖甘酶活性的酶活，计算公式：
[0066] β-Gal活性(U)＝OD420/(t×V×OD600)*1000
[0067] 式中：时间t用min表示；OD420指产物邻硝基
苯酚的光
密度的测定；OD600指培养物的光密度的测定；测定体积V是指测定时所用培养物体积量，用mL表示。
[0069] 每个实验包括五个不同测试浓度重复，结果表示为平行实验的平均值±SEM。为平均
荧光素酶背景值的活性，将数据标准化为雌激素受体ER对不同化学物质的响应(其中零和百分之百被定义为每个数据集分别对各化学物质的最低和最高响应)和剂量响应。通过将五个参数非线性回归曲线(斜率＝1)拟合到归一化数据上以便分析数据，并使用GraphPad Prism ver.5计算EC50值。
[0070] 由图1可见，Cg-ER/ERE在不同浓度E2的诱导下，β-半乳糖甘酶的活性随E2浓度的升高而呈现出“S”型的剂量-效应关系，E2浓度为102nmol/L时酵母重组系统产生最大效应，随后逐渐稳定。与Y187-DMSO空白对照组相比，阴性对照组Cg-ER在不同浓度E2刺激下无明显诱导；Y187菌株，Cg-ER/ERE在无外界雌激素刺激下，其酶活反应均无明显诱导(分别为0.02137，0.02173)。
[0071] 由图2可见，酵母重组系统不同浓度E1、T、P、4-NP及E2(阳性对照)的诱导下，均呈现明显“S”型剂量-效应关系，且Cg灵敏度表现为E2>T>E1>P>4-NP，各化合物的EC50值见表1。表明本实验汇总所构建的酵母重组测评系统较为稳定，能较为灵敏地评价环境雌激素化合物，初步判定长牡蛎雌激素受体ER基因重组酵母可应用于环境雌激素的检测。证明了酵母检测系统可利用性，以达到定量检测环境雌激素的目的。
[0072] 表1不同化合物的EC50值
[0073]
