一种分离双向启动子的方法及其应用
阅读：914发布：2020-10-03
专利汇可以提供一种分离双向启动子的方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种分离双向启动子的方法。该方法首先分离组织、器官或诱导性cDNA，然后通过 生物 信息学手段寻找在基因组中由同一DNA连接的但转录方向相反的2个基因，并克隆该连接DNA 片段 作为候选双向启动子加以验证。利用此方法，本发明从 水 稻中分离了一个具有很强活性的双向启动子，它在稻瘟菌侵染稻叶中能诱导性地、在根中能特异组成性地驱动两个基因的强烈表达。本发明分别还在该启动子中及其下游发现了2个增强子和2个内含子，它们对该启动子有明显的增强作用。本发明还提供了该双向启动子的系列变体，它们均有不同程度的单向或双向驱动基因表达活性。本发明所提供的双向启动子及其系列变体、增强子和内含子可用于 植物 基因工程中。，下面是一种分离双向启动子的方法及其应用专利的具体信息内容。
1.一种分离植物双向启动子的方法，其特征是首先分离某一发育阶段、器官 或生理状况下表达的多个基因的cDNA，并通过生物信息学手段分析它们在 染色体上的具体位置；然后，从中寻找鉴定出2个位于某一段DNA的相连 两侧、且转录方向相反的cDNA；进一步，以该某一段DNA序列作为后选双 向驱动子通过转基因加以分析和确认其表达的器官和组织特异性以及对 干旱、寒冷、盐碱、高温等非生物逆境与病虫害等生物逆境的响应；最后， 通过渐变缺失确定其中的顺式元件，并选择其中适当的顺式元件和序列、 通过DNA重组构建相应长度和表达强度的人工启动子。该策略尤其适用于 从全基因组序列已测定的生物如水稻、拟南芥等中分离其它具有双向驱动 基因表达功能或从其他植物中克隆具有双向驱动基因表达功能的启动子。 这类启动子驱动其相连两侧基因的表达可具有不同的组织或器官特异性， 可是诱导性表达的，也可组成性表达。
2.根据权利要求1分离自水稻基因组的一段DNA pSCI2/pSCI3，它在水稻基 因组中位于2种转录方向相反、且不同的subtilisin/Chymotrypsin蛋 白酶抑制剂(SCI)基因的5’端上游共有的启动子调控区域。其特征是在 该启动子的两端分别嵌合不同的或相同的目的基因再次导入水稻后，在叶 片中可以快速感应病原菌侵染，并驱动两个目的基因的强烈诱导表达；也 可以在根部驱动两个目的基因的强烈组成性表达。该启动子DNA序列是 SEQ ID NO：1所示序列及其反向互补序列SEQ ID NO：2。
3.一种在水稻基因组中位于权利要求2所述的SEQ ID NO：1序列下游的DNA 序列，它包含属于一种SCI基因5’端非翻译区的内含子，其特征是将该 序列直接连接于SEQ ID NO：1下游后再连接目的基因的完整编码框形成 融合基因，该融合基因嵌合于适当的双元表达载体中再次导入水稻后，可 以在叶片中快速感应病原菌侵染、驱动目的基因的诱导表达，也可以在根 部驱动两个目的基因的强烈组成性表达，并显著增强SEQ ID NO：1的启 动子活性。该DNA序列为SEQ ID NO：5所示序列。
4.一种在水稻基因组中位于权利要求2所述的SEQ ID NO：2序列下游的DNA 序列。它包含属于另一种SCI基因5’端非翻译区的内含子，其特征是将 该序列直接连接于SEQ ID NO：2序列下游后再在其下游连接目的基因的 完整编码框形成融合基因，该融合基因嵌合于适当的双元表达载体中再次 导入水稻后，可以在叶片中快速感应病原菌侵染、驱动目的基因的诱导表 达，也可以在根部驱动两个目的基因的强烈组成性表达，并显著增强SEQ ID NO：2的启动子活性。该DNA序列为SEQ ID NO：6所示序列。
5.一种利用权利要求2中所述的SEQ ID NO：1 DNA序列构建的一个或几个 衍生DNA片段，其DNA序列为SEQ ID NO：7、8、9、10所示序列。这些 衍生片段是由 pSCI2从5’端进行不同的渐变缺失得到的 pSCI2-1、 pSCI2-2、 pSCI2-3和 pSCI2-4，或者通过限制性核酸内切酶 SpeI酶切获 得的 pSCISP2。它们在感应病原菌侵染时具有驱动目的基因不同程度的启 动子活性，其中， pSCISP2衍生体还可以驱动目的基因在水稻叶片中的组 成性表达。
6.根据权利要求2与5， pSCI2-1与 pSCI2相比，启动目的基因表达的能力 显著减弱。导致这种差异是因为 pSCI2具有SEQ ID NO：16的特征序列。 该段DNA特征序列具有增强目的基因的表达作用，可与其它基因启动子嵌 合增强目的基因的表达活性。
7.一种利用权利要求2中所述的SEQ ID NO：1反向互补DNA序列构建的一 个或几个衍生DNA片段，其DNA序列为SEQ ID NO：11、12、13所示序列。 这些衍生片段是由 pSCI3从5’端进行不同的渐变缺失得到的pSCI3-1、 pSCI3-2和 pSCI3-3；或者通过限制性核酸内切酶 SpeI酶切获得的 pSCISP3。这些衍生片段在感应病原菌侵染时具有驱动目的基因不同程度 的启动子活性，其中， pSCISP3衍生体还可以驱动目的基因在水稻叶片中 的组成性表达。
8.根据权利要求2与7， pSCI3-1与 pSCI3相比，启动目的基因表达的能力 显著减弱。导致这种差异是因为 pSCI3具有SEQ ID NO：17的特征序列。 该段DNA特征序列具有增强目的基因的表达作用，可与其它基因启动子嵌 合增强目的基因的表达活性。
9.一种利用权利要求2，3，4，5，6，7，8所述的核苷酸序列及由其改造获 得的不同长度的核苷酸序列构建的表达或双元表达载体及其转化获得的 重组微生物、细胞系和植物。
10.权利要求2，3，4，5，6，7，8所述的目的基因，可以是从植物中分离的 抗病基因、防卫基因及其相关基因，或者防卫过程中的关键酶类或蛋白的 基因，或者具有直接或间接杀菌作用的植保素合成酶基因，也可以是从稻 瘟菌分离的无毒基因或与稻瘟菌寄生密切相关的基因的反义RNA，还可以 是动物或微生物中分离的具有抗病性的活性物质的基因或合成它们的酶 类的基因。
11.权利要求9所述的植物可以为转基因的抗病植物。此类抗病植物可以具有 对叶部病害或/和根部病害的抗性。
12.权利要求9所述的植物可以为转基因植物的抗旱、耐盐碱植物。此类抗逆 植物因其利用权利要求2，3，4，5，6，7，8所述的启动子及其增强子驱 动相关抗逆性基因在根部的表达而获得了相应的抗逆性。
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种分离双向基因启动子的方法及以及 利用。此方法从水稻克隆的稻瘟菌侵染可诱导的两种蛋白酶抑制剂基因的翻译起 始位点上游的启动子和非翻译区的核苷酸序列。该段序列具有双向驱动转基因表 达的能力，并且目标基因的表达在根部具有组成性表达的特性、在叶部表达具有 受病原菌侵染诱导的特性。
背景技术
植物在生长过程中会受到大量的、不同种类的微生物的侵袭，因此，由这些 微生物引起的病害一直是作物歉收的主要原因之一。但是植物在与这些微生物长 期互作过程中，也进化出多种抵御周围潜在病原微生物侵袭的防御机制，以使其 自身在与多种微生物的竞争中得以生存和繁衍。一般来说，植物对病原物的抵御 机制可分为两类：即组成性的被动防御和诱导性的主动防御，其中诱导性的主动 防御在植物抵御病原菌中起主导作用。所谓的主动防御，是指植物在受到病原物 侵染时，能够迅速识别并启动的一系列防卫反应。过敏性反应(hypersensitive response，简称HR)是一类典型的主动防卫反应，其表现为：寄主植物在病原菌 侵染位点周围常常迅速发生局部的细胞死亡。对于活体营养和一些非活体营养的 病原物来说，植物的这种局部细胞死亡即可有效地限制病原物进一步扩展到周围 的细胞中，而表现为抗病。
在许多植物病害体系中，寄主品种(或品系)与病原物小种(或致病型)之 间存在Flor的基因对基因关系，即品种表现抗病性是其中含有的抗性基因(R基 因)与病原菌中对应的无毒基因(Avr基因)互作的结果。在这种互作中，涉及 了信号的识别、转导及级联放大，最终启动一系列防卫反应而使植物表现抗病。 这种抗病性被称为基因对基因抗性，或小种专化抗性。然而，当病原物群体中不 含对应的无毒基因或无毒基因发生变异的情况下，寄主植物由于不能对改变或变 异了的病原物进行有效地识别并启动防卫反应，最终表现为感病。培育利用抗病 品种长期以来一直是控制植物病害的主要有效手段。但是，长期大面积种植单一 抗性基因的品种，会给病原物群体造成高选择压力导致产生新的优势毒性小种， 而使植物“丧失”抗病性。目前，抗病品种主要是通过有性杂交而获得，通常要 经过杂交、回交及一系列的后代筛选过程，周期较长，有时抗病品种的培育速度 甚至跟不上新优势小种的产生速度(Ben J.Corneslissen，1993)。此外，有性杂交 受种间生殖隔离的限制，远源植物或其它类生物的有用基因不能如愿导入，因此， 抗源有限。
近年来，随着一些有用抗性基因与防卫基因的克隆，人们期望通过转基因途 径来培育抗病品种。如将某一克隆的抗病基因转入其它品种或其它种中，可以省 去杂交、回交和后代选择等繁杂步骤而缩短育种进程，但这种转基因植物的抗性 依然是小种专化抗性，只抗某一或某些特定的小种而不抗其它小种，因此，也同 样面临着由于新小种产生而带来的抗病性丧失问题(Ben J.Corneslissen，Plant Physiol.，1993，101：700-712)。利用组成型启动子(如常用的CaMV 35S启动子) 驱动某些基因(如防卫基因)而使转基因植物增强转基因植物抗病性被认为是培 育相对持久抗病品种的有效策略之一，但这一策略有其自身难以克服的缺陷。首 先，如前所述，植物的过敏性反应是通过其自身局部细胞的死亡而杀死或限制病 原菌的扩展从而表现抗性的。对植物而言，这种“牺牲局部保整体”策略中表达 的基因往往是诱导性表达的。如果将这些基因(如HR基因)组成性地表达对植 物往往具有破坏性(de Wit，1992，Annu.Rev.Phytopathol.，30：391-418)。其次，强 组成型启动子驱动的转基因表达易引起转录后的基因沉默，且转基因的转录水平 越高，发生基因沉默的几率越大(Elmayan T and Vaucheret H，1996，The Plant J.， 9(6)：787-797)。因此，通过转基因途径培育广谱或持久抗病作物的理想的策略是： 利用病原菌侵染诱导性基因启动子驱动有用抗病关键基因的非特异诱导性表达， 使植物仅在受到病原物侵染时表达防卫反应，从而限制病原菌的生长，甚至将其 杀死(Peng，1994，Integrated Resource Management for Sustainable Agriculture， pp450-453.)。这样既可缓解抗病过程中植物的受害程度，又可避免或降低转基因 沉默现象的发生。为此，许多实验室都在寻找病原物侵染诱导性启动子()。本 实验室从水稻中克隆了一个稻瘟菌非小种特异性侵染诱导性基因启动子 MPP774，其受诱导表达的最高活性为CaMV35S的3～10倍(张世宏，中国农业 大学博士学位论文，2002)，并利用该启动子驱动不同防卫基因转化水稻，以期 获得具有广谱抗病的水稻株系。尽管如此，缺少可供利用的、病原菌侵染诱导型 高效启动子仍然是限制这一策略实施的主要因素。
另一方面，在通过基因工程途径培育植物品种的很多时候，需要将多个不同 的基因转入到同一植物中去。但目前被广泛应用的基因启动子多为单向驱动的， 仅能驱动一个基因表达。因此，导入多个基因需要用同一或者多个不同的启动子 构建多个载体，这样就会导致转基因过程烦琐、效率降低。并且，有研究表明同 一启动子驱动下的转基因植物易出现转录水平的转基因沉默(de Eilde C，et al， 2000，Plant Mol.Biol.43：347-359)，而且这种基因沉默与所转基因的编码序列 (Vaucheret H，et al，C.R.Acad.Sci.Paris，1993，317：310-323)和启动子的长度(De Neve，1999)无关。甚至具有序列同源性的不同启动子也能引起转录水平的基因 沉默。Vaucheret H等研究发现启动子间90bp的同源序列即足以引起转录水平的 基因沉默(Vaucheret H，et al，C.R.Acad.Sci.Paris，1993，317：310-323)。因此，在 将不同基因转入同一植物时，应尽量避免使用同一启动子或具有同源序列的启动 子。从这一角度考虑，利用具有双向驱动基因表达能力的基因启动子应可有效地 避免上述转录水平基因沉默的发生。为此，Xie MT等提出了人工构建双向基因启 动子以驱动两个基因表达的策略，并证明：在单向启动子的反方向融合一基本启 动子区域(TATA盒区域)，其具有双向驱动基因表达的能力(Xie MT，et al，2001， Nature Biotechnol.19：677-679)。
从培育广谱抗病作物品种的角度讲，分离、鉴定病原菌非小种特异性诱导的、 具有双向驱动基因表达能力的植物基因启动子，对于通过基因工程来培育持久或 广谱抗病作物是非常迫切的。而且，水稻、拟南芥等植物全基因组序列的测定和 释放，有助于分离这种双向基因启动子。本发明首先通过负向扣除筛选-反向 Northem确认的方法，克隆了1642个病原菌诱导性水稻基因的cDNA；然后，根 据基因组生物信息学分析，发现其中2个基因的cDNA分别位于一段基因组序列 的各一侧，因此，推测该段DNA序列可能具有双向驱动基因表达的能力；进一 步通过转基因途径证明：该DNA片段的确具有很强的双向驱动报告基因表达的 功能，而且报告基因在转基因水稻叶片中的表达为病原菌诱导性、在根部的表达 为组成性。该启动子在广谱抗病基因工程中将具有重要的应用价值。
在许多植物病害体系中，寄主品种(或品系)与病原物小种(或致病型)之 间存在Flor的基因对基因关系，即品种表现抗病性是其中含有的抗性基因(R基 因)与病原菌中对应的无毒基因(Avr基因)互作的结果。在这种互作中，涉及 了信号的识别、转导及级联放大，最终启动一系列防卫反应而使植物表现抗病。 这种抗病性被称为基因对基因抗性，或小种专化抗性。然而，当病原物群体中不 含对应的无毒基因或无毒基因发生变异的情况下，寄主植物由于不能对改变或变 异了的病原物进行有效地识别并启动防卫反应，最终表现为感病。培育利用抗病 品种长期以来一直是控制植物病害的主要有效手段。但是，长期大面积种植单一 抗性基因的品种，会给病原物群体造成高选择压力导致产生新的优势毒性小种， 而使植物“丧失”抗病性。目前，抗病品种主要是通过有性杂交而获得，通常要 经过杂交、回交及一系列的后代筛选过程，周期较长，有时抗病品种的培育速度 甚至跟不上新优势小种的产生速度(Ben J.Corneslissen，1993)。此外，有性杂交 受种间生殖隔离的限制，远源植物或其它类生物的有用基因不能如愿导入，因此， 抗源有限。
近年来，随着一些有用抗性基因与防卫基因的克隆，人们期望通过转基因途 径来培育抗病品种。如将某一克隆的抗病基因转入其它品种或其它种中，可以省 去杂交、回交和后代选择等繁杂步骤而缩短育种进程，但这种转基因植物的抗性 依然是小种专化抗性，只抗某一或某些特定的小种而不抗其它小种，因此，也同 样面临着由于新小种产生而带来的抗病性丧失问题(Ben J.Corneslissen，Plant Physiol.，1993，101：700-712)。利用组成型启动子(如常用的CaMV 35S启动子) 驱动某些基因(如防卫基因)而使转基因植物增强转基因植物抗病性被认为是培 育相对持久抗病品种的有效策略之一，但这一策略有其自身难以克服的缺陷。首 先，如前所述，植物的过敏性反应是通过其自身局部细胞的死亡而杀死或限制病 原菌的扩展从而表现抗性的。对植物而言，这种“牺牲局部保整体”策略中表达 的基因往往是诱导性表达的。如果将这些基因(如HR基因)组成性地表达对植 物往往具有破坏性(de Wit，1992，Annu.Rev.Phytopathol.，30：391-418)。其次，强 组成型启动子驱动的转基因表达易引起转录后的基因沉默，且转基因的转录水平 越高，发生基因沉默的几率越大(Elmayan T and Vaucheret H，1996，The Plant J.， 9(6)：787-797)。因此，通过转基因途径培育广谱或持久抗病作物的理想的策略是： 利用病原菌侵染诱导性基因启动子驱动有用抗病关键基因的非特异诱导性表达， 使植物仅在受到病原物侵染时表达防卫反应，从而限制病原菌的生长，甚至将其 杀死(Peng，1994，Integrated Resource Management for Sustainable Agriculture， pp450-453.)。这样既可缓解抗病过程中植物的受害程度，又可避免或降低转基因 沉默现象的发生。为此，许多实验室都在寻找病原物侵染诱导性启动子()。本 实验室从水稻中克隆了一个稻瘟菌非小种特异性侵染诱导性基因启动子 MPP774，其受诱导表达的最高活性为CaMV35S的3～10倍(张世宏，中国农业 大学博士学位论文，2002)，并利用该启动子驱动不同防卫基因转化水稻，以期 获得具有广谱抗病的水稻株系。尽管如此，缺少可供利用的、病原菌侵染诱导型 高效启动子仍然是限制这一策略实施的主要因素。
另一方面，在通过基因工程途径培育植物品种的很多时候，需要将多个不同 的基因转入到同一植物中去。但目前被广泛应用的基因启动子多为单向驱动的， 仅能驱动一个基因表达。因此，导入多个基因需要用同一或者多个不同的启动子 构建多个载体，这样就会导致转基因过程烦琐、效率降低。并且，有研究表明同 一启动子驱动下的转基因植物易出现转录水平的转基因沉默(de Eilde C，et al， 2000，Plant Mol.Biol.43：347-359)，而且这种基因沉默与所转基因的编码序列 (Vaucheret H，et al，C.R.Acad.Sci.Paris，1993，317：310-323)和启动子的长度(De Neve，1999)无关。甚至具有序列同源性的不同启动子也能引起转录水平的基因 沉默。Vaucheret H等研究发现启动子间90bp的同源序列即足以引起转录水平的 基因沉默(Vaucheret H，et al，C.R.Acad.Sci.Paris，1993，317：310-323)。因此，在 将不同基因转入同一植物时，应尽量避免使用同一启动子或具有同源序列的启动 子。从这一角度考虑，利用具有双向驱动基因表达能力的基因启动子应可有效地 避免上述转录水平基因沉默的发生。为此，Xie MT等提出了人工构建双向基因启 动子以驱动两个基因表达的策略，并证明：在单向启动子的反方向融合一基本启 动子区域(TATA盒区域)，其具有双向驱动基因表达的能力(Xie MT，et al，2001， Nature Biotechnol.19：677-679)。
从培育广谱抗病作物品种的角度讲，分离、鉴定病原菌非小种特异性诱导的、 具有双向驱动基因表达能力的植物基因启动子，对于通过基因工程来培育持久或 广谱抗病作物是非常迫切的。而且，水稻、拟南芥等植物全基因组序列的测定和 释放，有助于分离这种双向基因启动子。本发明首先通过负向扣除筛选-反向 Northem确认的方法，克隆了1642个病原菌诱导性水稻基因的cDNA；然后，根 据基因组生物信息学分析，发现其中2个基因的cDNA分别位于一段基因组序列 的各一侧，因此，推测该段DNA序列可能具有双向驱动基因表达的能力；进一 步通过转基因途径证明：该DNA片段的确具有很强的双向驱动报告基因表达的 功能，而且报告基因在转基因水稻叶片中的表达为病原菌诱导性、在根部的表达 为组成性。该启动子在广谱抗病基因工程中将具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种从生物中分离具有双向驱动基因表达能力 的启动子的方法。该方法是首先分离某一发育阶段、器官或生理状况下表达的多 个基因的cDNA，并通过生物信息学手段分析在染色体上的具体位置；然后，从 中寻找鉴定出2个位于某一段DNA的相连两侧、且转录方向相反的cDNA；进 一步，以该某段DNA序列作为后选双向驱动子通过转基因加以分析和确认其表 达的器官和组织特异性以及对干旱、寒冷、盐碱、高温等非生物逆境与病虫害等 生物逆境的响应；最后，通过渐变缺失确定其中的顺式元件，并选择其中适当的 顺式元件和序列、通过DNA重组构建相应长度和表达强度的人工启动子。该策 略尤其适用于从全基因组序列已测定的生物如水稻、拟南芥等中分离其它具有双 向驱动基因表达功能或从其他植物中克隆具有双向驱动基因表达功能的启动子。 这类启动子驱动其相连两侧基因的表达可具有不同的组织或器官特异性，可是诱 导性表达的，也可组成性表达。
本发明的目的还在于提供上述方法可行性的实验证明。利用上述方法，本发 明以水稻为材料，从中克隆了一个具有双向驱动2个目的基因表达能力的启动子。 该启动子可在稻瘟菌侵染的水稻叶中诱导性地表达2个目的基因(附图8)，还可 在水稻根部特异组成性地表达2个目的基因(附图14)。该双向启动子的序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，上述两序列为反向互补序列，即为同一DNA 片段的两条互补单链的序列，为方便叙述，将其分别命名为 pSCI2和 pSCI3。其 中，pSCI2的TATA盒和转录起始位点(TSS)分别位于SEQ ID NO：1的1095bp 和1125bp， pSCI3的TATA盒和TSS分别位于SEQ ID NO：2的1096bp和1026bp； 任选一段可转录的DNA序列可置于 pSCI2或/和 pSCI3的3’端并与之相连，构 建双元表达载体，经适当途径导入水稻后，在该转基因水稻中 pSCI2或/和 pSCI3 能驱动该可转录的DNA序列的转录。
本发明还提供了分别位于 pSCI2和 pSCI3 3’端的、属于水稻2种不同蛋白 酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂( OsSci2和 OsSci3)基因的内含子，它们分别包含在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列中。其中，SEQ ID NO：5中从49bp至 176bp为OsSci2基因的内含子序列，SEQ ID NO：6中从45bp至497bp为OsSci3 因的内含子序列。将EQ ID NO：5置于SEQ ID NO：1的3’端并与其融合，SEQ ID NO：6置于SEQ ID NO：2的3’端并与其融合，分别所得的两段DNA序列： pSCI2+I和pSCI3+I，它们分别具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核 苷酸序列。其特征在于： pSCI2+I比pSCI2具有更强诱导表达目标基因的活性(附 图11)； pSCI3+I比 pSCI3具有更强诱导表达目标基因的活性(附图12)。该内 含子也可与其它启动子的融合、并具有对目标基因表达的增强作用。
本发明还提供了由 pSCI2和 pSCI3经过碱基缺失所获得的几种衍生变体。它 们分别是通过PCR扩增由 pSCI2经5’端缺失获得了衍生变体 pSCI2-1、pSCI2-2、 pSCI2-3和 pSCI2-4；由 pSCI3经5’端缺失获得了衍生变体 pSCIS-1、pSCI3-2和 pSCI3-3。PCR扩增引物如图7所示。 pSCI2-1、pSCI2-2、pSCI2-3和 pSCI2-4分 别具有SEQ ID NO：1序列中从第69、226、403和616位到第1152位的核苷酸 序列，其序列分别如SEQ ID NO：7、8、9、10所示； pSCI3-1、pSCI3-2和 pSCI3-3 分别具有SEQ ID NO：2序列中从第93、214和400位到第1152位的核苷酸序列， 其序列分别如SEQ ID NO：11、12、13所示。其特征在于：这些衍生变体均具有 不同程度的启动子活性，可根据使用的需要，选择其中任一衍生变体用于驱动目 标基因不同程度的表达(图9和图10)。
本发明还提供了由 pSCI2和 pSCI3经限制性核酸内切酶切所得到的两种衍生 变体 pSCISP2和 pSCSP3。 pSCISP2是由 pSCI2经限制性核酸内切酶 SpeI酶切后 自连所得，具有SEQ ID NO：14的核苷酸序列，其特征在于缺失了SEQ ID NO： 1中162位到932位的核苷酸； pSCISP3是由 pSCI3经限制性核酸内切酶 SpeI酶 切后自连所得，具有SEQ ID NO：15的核苷酸序列，其特征在于缺失了SEQ ID NO：2中217位到987位的核苷酸。该衍生变体也可通过PCR获得，它们均具 有双方向驱动目的基因在叶片中组成性表达的能力，且病原菌侵染可增强其表达 活性(附图13)。
上述水稻双向基因启动子及其衍生变体的启动子活性可以通过在启动子下 游嵌合报告基因GUS，以GUS的表达情况得以确认。一个较佳的实施例是利用 Jerfferson等(EMBO J.，1987，6：3901～3907)建立的成熟的方法。
由上述pSCI2、pSCI3、pSCI2+I、pSCI3+I及其各种衍生变体经缺失、碱基 改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合所得到的、且具有驱动目 的基因表达能力的DNA片段，均属于本发明所保护的范围。
利用上述水稻双向基因启动子及其衍生变体的任意一DNA序列构建的表达 载体或双元表达载体及其转化获得的细胞系、重组微生物、转基因植物，均属本 专利的保护范围。即由以上所述的具有启动子活性的DNA序列片段构成的、或 利用其中任选的DNA序列片段重组构建载体用于转化植物及其细胞系或微生 物。本发明所涉及的重组DNA技术是本领域一般技术人员能够实现的。
本发明所提供的的双向启动子及其衍生变体可与任意感兴趣DNA片段相连， 构建相关载体、表达载体或双元表达载体，在水稻或其它植物中确定该任意DNA 片段功能。任意DNA片段在本发明中是报告基因GUS或Luciferase基因，但在 实际应用中首选的所要表达的基因可以是直接抑制、干扰或破坏病原菌生存的基 因，抗病基因、防卫基因、信号传导基因以及能在水稻等植物中表达的可有效控 制病害的异源基因(如无毒基因、反义RNA等)，也可以是具有其它用途的基因。
本发明所提供的双向启动子可用于抗病水稻的培育。将本发明所提供的双向 启动子与两个在抗病中起关键作用的基因连接并构建双元表达载体，导入根癌农 杆菌，并通过根癌农杆菌介导转化水稻从而获得抗病的或耐病的转基因水稻。本 发明所涉及抗病水稻的一个首选实施方案是培育抗稻瘟病水稻，另一个首选的实 施方案是抗根部病害的水稻。另外，本发明所提供的双向启动子的应用不限于水 稻。
根据本发明的双向启动子及其衍生变体的特点，在其两端连接同一基因的反 向序列构建RNA干扰载体并转入植物，可进行相关基因的功能与利用研究。
本发明中DNA片段的“克隆”是指从自然界天然水稻基因组中分离出的，可 以不经任何改变直接单独利用的一段启动子序列。依据本发明的序列，可以设计 上下游一对引物，通过PCR技术简单再次获得，也可以利用其标记探针从水稻基 因组文库中筛选获得，甚至可以用经典的酶法或化学方法合成获得，这些途径都 是本领域一般技术人员可以做到的。
本发明还提供了 pSCI2和 pSCI3启动子中作用的关键顺式作用元件，其特征 在于具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。在本发明中，这些顺式作用元件 的缺失导致 pSCI2和 pSCI3启动子驱动的报告基因的表达显著减弱，也就是它们 对 pSCI2和 pSCI3启动子驱动的报告基因的表达具有增强作用。这些顺式作用元 件也可以与其它启动子连接对目的基因的表达具有增强作用。
本发明中抗病双元表达载体的导入水稻的方法在本领域是简单易行的，也是 本领域中一般技术人员可以做到的。上述启动子或其衍生变体的活性检测以及利 用该启动子进行有针对性的抗病分子操作，都不可避免的要在植物系统中进行， 一个优选的实施方案是采用农杆菌介导的方法(Hiei等，Plant J.1994，6：271～282； Hiei等，Plant Mol.Biol.，1997，35：205～218)将其导入水稻中；使用者也可根据自己 的熟练程度灵活的选用以下转化方法：原生质体融合法、基因枪法轰击法、电激 法、PEG法、叶盘法等(Horsch等，Science，1984，234：496；Barton等， Cell，1983，32：1033；Liu等，Acta Phytophysiol.Sin，21：195～205；Horsch等Science， 277：1229)
根据本发明的启动子有活性的其它衍生变体，在转基因完成后，从抗性愈伤 到生根后移入自然环境(如田间)的组织培养期间，转化组织或个体有类似组成 型表达的活性，这是由于组织培养基中激发活性成分或组培期间其同自然植株的 差异(如类似损伤)所致，在移入田间恢复后即基本失去。
以下通过附图进一步说明本发明。
本发明的目的还在于提供上述方法可行性的实验证明。利用上述方法，本发 明以水稻为材料，从中克隆了一个具有双向驱动2个目的基因表达能力的启动子。 该启动子可在稻瘟菌侵染的水稻叶中诱导性地表达2个目的基因(附图8)，还可 在水稻根部特异组成性地表达2个目的基因(附图14)。该双向启动子的序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，上述两序列为反向互补序列，即为同一DNA 片段的两条互补单链的序列，为方便叙述，将其分别命名为 pSCI2和 pSCI3。其 中，pSCI2的TATA盒和转录起始位点(TSS)分别位于SEQ ID NO：1的1095bp 和1125bp， pSCI3的TATA盒和TSS分别位于SEQ ID NO：2的1096bp和1026bp； 任选一段可转录的DNA序列可置于 pSCI2或/和 pSCI3的3’端并与之相连，构 建双元表达载体，经适当途径导入水稻后，在该转基因水稻中 pSCI2或/和 pSCI3 能驱动该可转录的DNA序列的转录。
本发明还提供了分别位于 pSCI2和 pSCI3 3’端的、属于水稻2种不同蛋白 酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂( OsSci2和 OsSci3)基因的内含子，它们分别包含在SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列中。其中，SEQ ID NO：5中从49bp至 176bp为OsSci2基因的内含子序列，SEQ ID NO：6中从45bp至497bp为OsSci3 因的内含子序列。将EQ ID NO：5置于SEQ ID NO：1的3’端并与其融合，SEQ ID NO：6置于SEQ ID NO：2的3’端并与其融合，分别所得的两段DNA序列： pSCI2+I和pSCI3+I，它们分别具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核 苷酸序列。其特征在于： pSCI2+I比pSCI2具有更强诱导表达目标基因的活性(附 图11)； pSCI3+I比 pSCI3具有更强诱导表达目标基因的活性(附图12)。该内 含子也可与其它启动子的融合、并具有对目标基因表达的增强作用。
本发明还提供了由 pSCI2和 pSCI3经过碱基缺失所获得的几种衍生变体。它 们分别是通过PCR扩增由 pSCI2经5’端缺失获得了衍生变体 pSCI2-1、pSCI2-2、 pSCI2-3和 pSCI2-4；由 pSCI3经5’端缺失获得了衍生变体 pSCIS-1、pSCI3-2和 pSCI3-3。PCR扩增引物如图7所示。 pSCI2-1、pSCI2-2、pSCI2-3和 pSCI2-4分 别具有SEQ ID NO：1序列中从第69、226、403和616位到第1152位的核苷酸 序列，其序列分别如SEQ ID NO：7、8、9、10所示； pSCI3-1、pSCI3-2和 pSCI3-3 分别具有SEQ ID NO：2序列中从第93、214和400位到第1152位的核苷酸序列， 其序列分别如SEQ ID NO：11、12、13所示。其特征在于：这些衍生变体均具有 不同程度的启动子活性，可根据使用的需要，选择其中任一衍生变体用于驱动目 标基因不同程度的表达(图9和图10)。
本发明还提供了由 pSCI2和 pSCI3经限制性核酸内切酶切所得到的两种衍生 变体 pSCISP2和 pSCSP3。 pSCISP2是由 pSCI2经限制性核酸内切酶 SpeI酶切后 自连所得，具有SEQ ID NO：14的核苷酸序列，其特征在于缺失了SEQ ID NO： 1中162位到932位的核苷酸； pSCISP3是由 pSCI3经限制性核酸内切酶 SpeI酶 切后自连所得，具有SEQ ID NO：15的核苷酸序列，其特征在于缺失了SEQ ID NO：2中217位到987位的核苷酸。该衍生变体也可通过PCR获得，它们均具 有双方向驱动目的基因在叶片中组成性表达的能力，且病原菌侵染可增强其表达 活性(附图13)。
上述水稻双向基因启动子及其衍生变体的启动子活性可以通过在启动子下 游嵌合报告基因GUS，以GUS的表达情况得以确认。一个较佳的实施例是利用 Jerfferson等(EMBO J.，1987，6：3901～3907)建立的成熟的方法。
由上述pSCI2、pSCI3、pSCI2+I、pSCI3+I及其各种衍生变体经缺失、碱基 改变、碱基添加或再次分离的一部分、几部分或其组合所得到的、且具有驱动目 的基因表达能力的DNA片段，均属于本发明所保护的范围。
利用上述水稻双向基因启动子及其衍生变体的任意一DNA序列构建的表达 载体或双元表达载体及其转化获得的细胞系、重组微生物、转基因植物，均属本 专利的保护范围。即由以上所述的具有启动子活性的DNA序列片段构成的、或 利用其中任选的DNA序列片段重组构建载体用于转化植物及其细胞系或微生 物。本发明所涉及的重组DNA技术是本领域一般技术人员能够实现的。
本发明所提供的的双向启动子及其衍生变体可与任意感兴趣DNA片段相连， 构建相关载体、表达载体或双元表达载体，在水稻或其它植物中确定该任意DNA 片段功能。任意DNA片段在本发明中是报告基因GUS或Luciferase基因，但在 实际应用中首选的所要表达的基因可以是直接抑制、干扰或破坏病原菌生存的基 因，抗病基因、防卫基因、信号传导基因以及能在水稻等植物中表达的可有效控 制病害的异源基因(如无毒基因、反义RNA等)，也可以是具有其它用途的基因。
本发明所提供的双向启动子可用于抗病水稻的培育。将本发明所提供的双向 启动子与两个在抗病中起关键作用的基因连接并构建双元表达载体，导入根癌农 杆菌，并通过根癌农杆菌介导转化水稻从而获得抗病的或耐病的转基因水稻。本 发明所涉及抗病水稻的一个首选实施方案是培育抗稻瘟病水稻，另一个首选的实 施方案是抗根部病害的水稻。另外，本发明所提供的双向启动子的应用不限于水 稻。
根据本发明的双向启动子及其衍生变体的特点，在其两端连接同一基因的反 向序列构建RNA干扰载体并转入植物，可进行相关基因的功能与利用研究。
本发明中DNA片段的“克隆”是指从自然界天然水稻基因组中分离出的，可 以不经任何改变直接单独利用的一段启动子序列。依据本发明的序列，可以设计 上下游一对引物，通过PCR技术简单再次获得，也可以利用其标记探针从水稻基 因组文库中筛选获得，甚至可以用经典的酶法或化学方法合成获得，这些途径都 是本领域一般技术人员可以做到的。
本发明还提供了 pSCI2和 pSCI3启动子中作用的关键顺式作用元件，其特征 在于具有SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。在本发明中，这些顺式作用元件 的缺失导致 pSCI2和 pSCI3启动子驱动的报告基因的表达显著减弱，也就是它们 对 pSCI2和 pSCI3启动子驱动的报告基因的表达具有增强作用。这些顺式作用元 件也可以与其它启动子连接对目的基因的表达具有增强作用。
本发明中抗病双元表达载体的导入水稻的方法在本领域是简单易行的，也是 本领域中一般技术人员可以做到的。上述启动子或其衍生变体的活性检测以及利 用该启动子进行有针对性的抗病分子操作，都不可避免的要在植物系统中进行， 一个优选的实施方案是采用农杆菌介导的方法(Hiei等，Plant J.1994，6：271～282； Hiei等，Plant Mol.Biol.，1997，35：205～218)将其导入水稻中；使用者也可根据自己 的熟练程度灵活的选用以下转化方法：原生质体融合法、基因枪法轰击法、电激 法、PEG法、叶盘法等(Horsch等，Science，1984，234：496；Barton等， Cell，1983，32：1033；Liu等，Acta Phytophysiol.Sin，21：195～205；Horsch等Science， 277：1229)
根据本发明的启动子有活性的其它衍生变体，在转基因完成后，从抗性愈伤 到生根后移入自然环境(如田间)的组织培养期间，转化组织或个体有类似组成 型表达的活性，这是由于组织培养基中激发活性成分或组培期间其同自然植株的 差异(如类似损伤)所致，在移入田间恢复后即基本失去。
以下通过附图进一步说明本发明。
附图说明
附图1，负向扣除筛选-反向Northem确认克隆稻瘟菌诱导性水稻cDNA示意图。
图示说明：上图圆形部分为将水稻cDNA文库单克隆铺板并转膜，以健康稻叶的 mRNA为探针杂交；选取未杂交上的克隆(上图中空心圆点表示)作为候选诱导 性cDNA克隆。下图表示候选诱导性cDNA克隆分别阵列于两张尼龙膜上，分别 以健康稻叶和接种稻叶的mRNA为探针杂交进行反向Northern确认；图中左为 接种叶mRNA(R)探针，右为健叶mRNA(H)探针。其中，具有杂交信号(图中 黑色圆点)的确定为诱导性cDNA克隆。
附图2，稻瘟菌诱导性水稻cDNA克隆的反向Northern实际确认。图示说明：经 过的候选cDNA经PCR扩增后，等量阵列于两张尼龙膜上，分别以水稻健叶 mRNA(左)和稻瘟菌接种稻叶mRNA(右)为探针杂交，绝大多数阳性克隆仅 在右侧膜上有杂交信号，为诱导性克隆。
附图3，水稻枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂基因 OsSci2和 OsSci3在染色体上 的结构。图示说明：上为结构示意，右向的兰色箭头表示 OsSci2基因转录的cDNA 及其方向，左向的兰色箭头表示 OsSci3基因转录的cDNA及其方向；红色实心框 表示内含子；ATG为翻译起始密码子；TSS为转录起始位点。黑线表示DNA。 两个基因分别位于该段DNA的互补序列上；下为水稻品种爱知旭的基因组 Southern杂交图，左、右侧它针分别为OsSci2和OsSci3的编码区，泳道内样品 自左至右分别为DNA分子量标准、Hind III酶切基因组和EcoRV酶切基因组。
附图4，稻瘟菌侵染后 OsSci2和 OsSci3基因的表达动态的Northem分析。图示 说明：0、4、8、12、36、48、72为接种时间，单位为小时(h)，接种稻瘟菌分 别为非亲和小种131与亲和小种MS220，ribosomal RNA为上样量内标。
附图5，稻瘟菌诱导性水稻双向基因启动子区域及其衍生变体与报告基因GUS嵌 合的双元载体构建的示意图。图示说明：上为启动子及其衍生变体与报告基因 GUS融合的示意图；下为去除了CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体，载体 上标注的限制性酶切位点 EcoRI和 NcoI为启动子片段的连接位点。
附图6，稻瘟菌诱导性水稻双向基因启动子(灰色)与感兴趣基因(红褐色基因 1与紫色基因II)嵌合的双元表达载体的结构示意图。
附图7，稻瘟菌诱导性水稻双向基因启动子区域及其从5’端渐变缺失的衍生变体 所需PCR引物对。图示说明：引物对名称与启动子或其变体名称相对应，下划线 为增加的酶切位点，上游引物增加的位点是 EcoRI，下游引物增加的是 NcoI。
附图8，接种稻瘟菌的转基因水稻叶片中本发明发现的启动子pSCI2和pSCI3与 广泛利用CaMV35S启动子驱动的报告基因GUS表达的活性比较。图示说明：左 为pSCI2和pSCI3与GUS基因连接的示意图，图中绿色的(对应于右图的WP) 为报告基因，数字标示以转录起始位点为+1。右为GUS表达活性，Inoculation 为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的样品，Untreated 为不经任何处理的样品，CaMV 35S为花椰菜花叶病毒的35S启动子。pSCI2和 pSCI3驱动的报告基因GUS表达的活性分别是CaMV 35S驱动的报告基因GUS 表达的活性28和12倍。
附图9，接种稻瘟菌的转基因水稻叶片中pSCI2与其衍生变体驱动GUS基因表 达的活性比较。图示说明：左为pSCI2及其衍生变体与GUS基因连接的示意图， 图中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活 性，Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的 样品，Untreated为不经任何处理的样品。
附图10，接种稻瘟菌的转基因水稻叶片中 pSCI3与其衍生变体驱动 GUS基因表 达的活性比较。图示说明：左为 pSCI3及其衍生变体与 GUS基因连接的示意图， 图中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活 性，Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的 样品，Untreated为不经任何处理的样品。
附图11，接种稻瘟菌后转基因水稻叶片中pSCI2与pSCI2+I驱动的GUS基因表 达强度的比较。图示说明：左为pSCI2与pSCI2+I与GUS基因连接的示意图，图 中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活性， Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的样品， Untreated为不经任何处理的样品。
附图12，接种稻瘟菌后转基因水稻叶片中 pSCI3与 pSCI1+I驱动的 GUS基因表 达强度的比较。图示说明：左为 pSCI3与 pSCI3+I与 GUS基因连接的示意图，图 中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活性， Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的样品， Untreated为不经任何处理的样品。
附图13， pSCISP2与 pSCISP3驱动的 GUS基因表达的转基因水稻叶片在接种稻 瘟菌等处理后GUS表达活性分析。图示说明：上为 pSCISP2与 pSCISP3驱动的 GUS基因表达载体的示意图，图中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动 子的空载体；右为GUS表达活性，Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样 品，Mock为水处理后36小时的样品，Untreated为不经任何处理的样品。
图14、水稻双向基因启动子 pSCI2、pSCI3区域驱动的 GUS基因在转基因水稻根 部表达的组织染色照片。图示说明：WP为无启动子空载体的转基因水稻 GUS 染色照片，左侧列示主根根尖，中间列示侧根萌发部位，右侧列示侧根。
具体实施方案
为了更好地理解本发明，以下结合具体的实例作以说明，但并非用来限制本发明。 实施例1、稻瘟菌侵染诱导型水稻基因cDNA的克隆
为了克隆病原菌诱导性、具有双向驱动基因表达能力的基因启动子，本发明首先 通过负向扣除筛选-反向Northern确认的方法，从稻瘟菌侵染稻叶的cDNA文库中筛 选获得了诱导性的cDNA克隆1642个。具体实施为：种植爱知旭品种水稻，待4-5 叶抽出时，一部分取健康水稻叶片，立即液氮冷冻后保存，提取叶片总RNA并纯化 mRNA(记为HmRNA)；另一部分活体接种稻瘟菌，分别在接种后0、8、24、48、 72小时取发病叶片，立即液氮冷冻后保存，分别提取叶片总RNA，分别取各时间点 适量RNA等量混合并纯化mRNA(记为PmRNA)。同时将稻瘟菌侵染稻叶的cDNA 文库铺成单克隆平板并印记到尼龙膜上。用Superscrip II反转录酶对HmRNA进行放 射性同位素α-32p标记，以α-32p标记的cDNA为探针杂交上述尼龙膜。杂交后挑取 阴性克隆进行PCR扩增，扩增产物分别阵列于两张尼龙膜上。分别以α-32p标记的 HmRNA和PmRNA的cDNA探针进行反向Northern杂交(附图1和附图2)。将仅 与PmRNA的cDNA探针杂交为阳性的克隆作为候选克隆并进行测序。
实施例2、诱导性cDNA序列的生物信息学分析
将经负向扣除筛选-反向Northern确认的1790个cDNA序列与水稻基因组数据 库(http：//ricegaas.dna.affrc.go.jp)进行比对分析，结果发现其中1642个序列来源于 水稻。进一步对来源于水稻的cDNA进行相互比较、BLAST查询和基因组数据库分 析，发现它们分别属于1075个独立的水稻基因。同时发现：两个基因与已报道的其 它生物来源的枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂基因同源，分别命名为 OsSci2和 OsSci3(GenBank登录号分别为AY878694和AY878695)；且这两个cDNA位于同 一个BAC克隆上，两者分别以头对头方式与一段DNA片段的互补链匹配，两cDNA 间相距1152bp，两基因所在的染色体位置如图3所示。
实施例3、 OsSci2和 OsSci3受稻瘟菌侵染诱导表达的特异性和时间动态分析。
采用Northem blot分析 OsSci2和 OsSci3受稻瘟菌侵染诱导表达特性和时间动 态。具体实施方法为：种植水稻品种爱知旭，待4-5叶抽出时，一部分水稻叶片活 体接种稻瘟菌亲和性小种MS220，另一部分活体接种稻瘟菌小种P131，分别在接种 后0、8、24、48、72小时取发病叶片，立即液氮冷冻后保存，提取总RNA。按《分 子克隆》(Sambrook et al，1998)的方法进行并行凝胶电泳，每样品上样量约为20μ g。杂交探针分别为放射性同位素α-32p标记的 OsSci2和 OsSci3的编码区。杂交后 安常规方法洗膜、压磷屏，并在CycloneTM磷屏扫描系统成像，结果如图3所示。 结果表明： OsSci2和 OsSci3的诱导表达无小种特异性，且两基因表达的时间动态相 似：均在接种后8小时开始表达，到48小时达到高峰。
实施例4双向启动子 pSCI2和 pSCI3及其与内含子相连的双向启动子 pSCI2+I和 pSCI3+I的克隆
根据生物信息学分析的结果，在水稻基因组中，这两个基因分别位于同一DNA 片段互补链上并以头对头方式分布，两cDNA间相距1152bp，且两基因的5’非翻 译区均含有一内含子。首先根据基因组序列设计特异引物对pSCI2+I和pSCI3+I， 扩增水稻品种爱知旭的基因组DNA。扩增片段经克隆到pMD-18T载体并测序，获 得了如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的DNA片段的核苷酸序列。在此 基础上，设计引物对pSCI2和pSCI3，以上述克隆的片段为模板进行扩增，扩增产 物克隆到pMD-18T载体并测序确认，获得如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示的DNA序列。
实施例5、稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子的一系列衍生变体的获得。
对上述克隆的稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子pSCI2和pSCI3序列进行数据 库检索和软件分析，推测其潜在的顺式元件位置，然后在这些位置之前设计携带合 适酶切位点的PCR引物(附图7)，以克隆的原始序列为模板扩增出5’端上游调控 片段的一系列衍生变体(附图5)。扩增产物分别克隆到pMD-18T载体并测序确认。
实例6、稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子pSCI2和pSCI3及其一系列衍生变体与 GMS基因嵌合的双元载体构建。
上述克隆到pMD-18T载体上的稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子 pSCI2和 pSCI3及其一系列衍生变体在其5’端均含有EcoRI位点，在其3’端均含 NcoI位点 (图5)。因此，分别对双元载体pCAMBIA1301和克隆到pMD-18T上的衍生变体 用限制性内切酶 EcoRI和 NcoI进行双酶切。两组双酶切后的产物经葡聚糖凝胶电泳 分开后，切取目标DNA片段的凝胶块，分别用回收试剂盒回收：(1)双元载体 pCAMBIA1301缺失35S启动子的剩余部分，(2)pMD-18T载体切出的 pSCI2和 pSCI3 及其衍生变体部分。最后按一定比例分别将回收的(1)(2)两部分混合并用T4DNA 连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，并经酶切鉴定和测序确认。这样 获得的启动子和衍生变体为： pSCI2、pSCI3、pSCI2+I、pSCI3+I、pSCI2-1、pSCI2-2、 pSCI2-3、pSCI2-4、pSCI3-1、pSCI-2和pSCI-3(见附图8，9，10，11和12的左图)。 为获得衍生变体 pSCISP2和pSCISP3，分别在 pSCI2和pSCI3基础上，利用限制性 内切酶SpeI酶切、回收大片段，自连(见附图13左图)。
实施例7、双向基因启动子 psCI2和pSCI3及其一系列衍生变体与 GUS基因表达双 元载体转化水稻。
1.双元载体转化根癌农杆菌
分别将上述双元载体质粒DNA用电激法导入EHA105感受态细胞，28℃培养 到形成单菌落。挑取转化的农杆菌接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基 中，28℃，220rpm摇培16hr，直接对菌液进行PCR鉴定。
2.根癌农杆菌介导的水稻转化
准备水稻未成熟种子，经表面消毒后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB) 上，暗培养诱导俞伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配置的继代培养基 (NB)上，在相同条件下继代培养5天左右；或者准备水稻成熟胚愈伤组织，挑选 继代培养5-7天，色泽淡黄的愈伤组织共培养。挑选状态较好的愈伤组织与适量农 杆菌悬浮液(OD0.3-0.5)共培养15-20分钟，转入固体人工培养基上，26℃黑暗培 养2-3天。将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/L Hygromycin的分化培养基上， 先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件上培养，经过15-25天左右，长出绿点。 30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移 到生根培养基上，培养两周左右，在室温内移栽入土。各结构获得T0代转基因水 稻株系数如表1所示。
实施例8、转基因水稻活性的鉴定及分析
1.材料的准备：将收获的T0代转基因种子(即T1代)每株系取30～50粒清 水浸泡48小时，待种子萌动后转入0.6％琼脂平板(内含50μg/毫升的潮霉素)上 发芽。3～4天后调查种子生根情况，并将在潮霉素板上正常生根(即具潮霉素抗性) 的幼苗移入大田，即为T1代转基因苗。待T1带幼苗长至4叶一心时进行处理。处 理时每个结构随机选取10个株系，每株系15株苗，分为3组：第一组接种稻瘟菌 菌株MS220，用0.025％的Tween20水溶液将分生孢子制成浓度为105/毫升的悬浮液， 均匀喷雾于幼苗上部叶片，接种后27℃黑暗保湿24小时，之后持续光照，至接种 后36小时，取接种叶片，液氮速冻，存于-80℃冰箱备用(样品记为Inoculation)；第 二组幼苗仅喷雾0.025％的Tween20水溶液，其它处理和取样同第一组(样品记为 Mock)；第三组幼苗不经任何处理，与第一、第二组同时取田间健康幼苗的上部叶 片，液氮速冻，存于-80℃冰箱备用(样品记为untreated)。上述样品用于GUS表达 活性的定量分析。GUS组织染色材料为直接选取健康幼苗的根、茎、叶和叶鞘。
表1不同结构获得的转基因T0代株系
转基因结构 T0代株系数 转基因结构 T0代株系数 pSCI2 15 pSCI3-1 11 pSCI2+1 18 pSCI3-2 49 pSCI3 26 pSCI3-3 67 pSCI3+1 17 pSCISp2 17 pSCI2-1 108 pSCI3Sp3 15 pSCI2-2 13 WP 20 pSCI2-3 40 CaMV35S 12 pSCI2-4 14
2.GUS表达活性的定量分析：GUS活性检测根据Yang等的方法(Yinong Yang et al，the plant journal，2000，22(6)：543-551)。具体为：取叶片在液氮中迅速研磨至 碎，加入适量的抽提缓冲液，冰浴中磨成匀浆，12000g4℃离心10分钟；取5μ l上清加入45μl2mM的4-MUG(4-methylμmbelliferyl-D-glucuronide)，并快速 吸取5μl混合液加入到100μl0.2M的Na2CO3终止反应作为对照。剩余混合液 37℃保温30min后，吸取5μl加入到入到100μl0.2M的Na2CO3终止反应。反 应结束后在TECAN GENios Plus荧光酶标仪测定产物4-MU的荧光值。同时，取5μ l上清按Bradford法利用TECAN GENios Plus荧光酶标仪测定总蛋白含量。然后按 稀释比例折算每毫克蛋白中每分钟所产生4-MU的物质量，记单位为nmol/min/mg protein，并计算10个株系(5株/株系)的平均值。
根据GUS活性的测定结果，可以得出以下结论：1)pSCI2和pSCI3在转基因水 稻叶片中均具有很强稻瘟菌诱导性启动子活性，其在接种稻瘟菌36小时的活性分 别为CaMV35S启动子的28倍和12倍，与0.025％Tween水喷雾对照相比，分别 增加了约20倍(附图8，9，10，11和12)。2)pSCI2的5’端缺失69bp后(pSCI2-1) 其受稻瘟菌侵染诱导的表达活性显著降低(附图9)；类似地，pSCI3的5’端缺失 98bp后(pSCI3-1)其受稻瘟菌侵染诱导的表达活性也显著降低(附图10)。这一 结果说明5’端序列是其完全启动子活性所必需的。由于pSCI2和pSCI3为同一DNA 片段的两条互补单链，因此可以根据以上结果判定：pSCI2或pSCI3是具有双向驱 动基因表达能力的、在水稻叶片中受病原菌侵染诱导性的启动子。3)OsSCI2和 OsSCI3基因的5’非翻译区，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(分别含一 内含子区域)所示，当将SEQ ID NO：5融合在pSCI2下游(pSCI2+I)、将SEQ ID NO：6融合在pSCI3下游(pSCI3+I)后驱动报告基因GUS，其受稻瘟菌诱导表达 活性均明显增强(附图11和附图12)。这一结果说明5’非翻译区具有增强基因表 达的能力，为增强子。4)通过对双向基因启动子的各种衍生变体驱动GUS基因表 达的定量分析发现：pSCI3-3转基因植株的GUS活性显著高于pSCI3-2转基因植株 (附图10)，说明pSCI3-2和pSCI3-3之间存在一个正调控的顺式元件，该元件位 于序列SEQ ID NO：2中从213到400bp之间。5)将pSCI2(其序列如SEQ ID NO： 1所示)序列从162位到932位缺失后驱动GUS报告基因(pSCISP2)或者将将pSCI3 (其序列如SEQ ID NO：2所示)序列从162位到932位缺失后驱动GUS报告基 因(pSCISP3)，它们的转基因植株既表现了GUS叶片组成性表达的特点，也具有 稻瘟菌侵染诱导增强的特性(附图13)。由于pSCISP2和pSCISP3的序列为反向互 补序列，所以判定：pSCISP2/pSCISP3具有双向驱动基因表达的能力，其在水稻叶 片中组成性表达且具有病原菌侵染诱导增强的特性。
3.GUS组织染色：GUS组织染色法按Jefferson等的方法进行(Jefferson，EMBO J.，1987，6：3901-3907)，首先将选取的转基因材料进行无菌水表面清洗，用无菌 吸水纸吸干后浸入GUS染色液，抽气5分钟后放28℃，200rpm摇床上反应30分 钟到过夜，然后在70％或100％的乙醇内脱色漂洗至显色。结果表明：双向基因启 动子及其衍生变体均可驱动GUS基因在健康转基因水稻根部表达，但表达强弱略 有差异。其在根部表达的特征为主要在根尖分生组织和侧根萌发的部位表达(附图 14)。
实施例9抗病双元载体的构建
该双元载体是在实施例4的基础上构建的。此处仅以由pSCI2而来的抗病双元 载体的构建过程为例，其他一系列启动子的衍生变体均可按此法获得。将pSCI2质 粒用BstE II酶切6小时，然后同T4DNA polymerase补平，酚仿抽提后溶于双蒸无菌 水中用Nco I酶切，回收载体片段，连接将要嵌合的基因II，其在5’端可以带有既有 的或后来增加的Nco I位点接头，其3’端应该是平滑末端。为连接基因I，可将pSCI2 质粒用EcoRI酶切后，补平，然后连入平端的目的基因，并鉴定连接方向。另外， 为了可以嵌合各类基因，可以用BstEII和Nco I双酶切后补平，连入平端的、即将 嵌合的基因II，并鉴定连入方向，然后将质粒用EcoRI酶切后，补平，然后连入平 端的目的基因I(附图6)。
序列表
<110>中国农业大学
<120>
<130>彭友良2003-2
<160>17
<210>1
<211>1152
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>1
caccgcgatg tgtggatatg gatttggatt tgtgtaacgt atatgcgtgc atttatagga 60
ccatatgaac ggagcaattt ggtctaaaaa aaaacacagc acaccaatac atcgagcaac 120
gtgtgtaaat aacgaagttt caaagcgggc cggtacgtgg actagtcatt agtggatagg 180
cttcaatctt catgcatgtg cacccacgtg taaaggggtt gttggatgca tattcaacga 240
tttggacatg gggacatttg gccatatggt gcgtggctac ttgtgggttg cagatttgaa 300
ttttgacgat gaaccttgca catatagagc tgagtataat taattcttct aaacgcattt 360
ggagctagga agatttaatt aatttcgagc taaataatag tagtagctat gtggcgcaga 420
gaggaaatga aaccataatc atggtagaac caaaaataag cattagtgat atgtcagtgc 480
ttagctattc gatgcattta acaggcagcg gcaacaagct tggatggatt tggctgcctg 540
ctgcagtgct gctctaagct atagctccat gctgataact ggccgagtcc atctctgatg 600
gtaatggtgc agaagatgaa caggaggagg ggatgaaaaa aaaaaaagaa gacatggaca 660
agttggttca tcgaagaaat acacatgtag tggcatattt gaaataccta ttaaattaag 720
catgtctaaa attccataaa ttgtagtggt atattttagt attgaagaag ttacaatggc 780
atgatccaat gaatcatatt tatatccacg ttgcacattg taaatttgac ctgtaaaatg 840
tttattaatc atatcgtttt ctgcaaatct gggcaccaag tggtatatgc agaagagtac 900
taccttaaca aattgacact ttctttctct gactagtaga gtctccacca cacacacgtg 960
ccacccttta catccgtgaa ttttctgagt ccagaaggat taataagtct acaagtatat 1020
ctcatctcag caaactggga agcctatcca ttaacggcac cgaaaaattg cacgttttgc 1080
ttcttttctc atcttataaa tacaccacac aactccatcc ctcatacacc aaacgcacac 1140
acaacttaag aa 1152
<210>2
<211>1152
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>2
ttcttaagtt gtgtgtgcgt ttggtgtatg agggatggag ttgtgtggtg tatttataag 60
atgagaaaag aagcaaaacg tgcaattttt cggtgccgtt aatggatagg cttcccagtt 120
tgctgagatg agatatactt gtagacttat taatccttct ggactcagaa aattcacgga 180
tgtaaagggt ggcacgtgtg tgtggtggag actctactag tcagagaaag aaagtgtcaa 240
tttgttaagg tagtactctt ctgcatatac cacttggtgc ccagatttgc agaaaacgat 300
atgattaata aacattttac aggtcaaatt tacaatgtgc aacgtggata taaatatgat 360
tcattggatc atgccattgt aacttcttca atactaaaat ataccactac aatttatgga 420
attttagaca tgcttaattt aataggtatt tcaaatatgc cactacatgt gtatttcttc 480
gatgaaccaa cttgtccatg tcttcttttt tttttttcat cccctcctcc tgttcatctt 540
ctgcaccatt accatcagag atggactcgg ccagttatca gcatggagct atagcttaga 600
gcagcactgc agcaggcagc caaatccatc caagcttgtt gccgctgcct gttaaatgca 660
tcgaatagct aagcactgac atatcactaa tgcttatttt tggttctacc atgattatgg 720
tttcatttcc tctctgcgcc acatagctac tactattatt tagctcgaaa ttaattaaat 780
cttcctagct ccaaatgcgt ttagaagaat taattatact cagctctata tgtgcaaggt 840
tcatcgtcaa aattcaaatc tgcaacccac aagtagccac gcaccatatg gccaaatgtc 900
cccatgtcca aatcgttgaa tatgcatcca acaacccctt tacacgtggg tgcacatgca 960
tgaagattga agcctatcca ctaatgacta gtccacgtac cggcccgctt tgaaacttcg 1020
ttatttacac acgttgctcg atgtattggt gtgctgtgtt tttttttaga ccaaattgct 1080
ccgttcatat ggtcctataa atgcacgcat atacgttaca caaatccaaa tccatatcca 1140
cacatcgcgg tg 1152
<210>3
<211>1362
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>3
caccgcgatg tgtggatatg gatttggatt tgtgtaacgt atatgcgtgc atttatagga 60
ccatatgaac ggagcaattt ggtctaaaaa aaaacacagc acaccaatac atcgagcaac 120
gtgtgtaaat aacgaagttt caaagcgggc cggtacgtgg actagtcatt agtggatagg 180
cttcaatctt catgcatgtg cacccacgtg tagaggggtt gttggatgca tattcaacga 240
tttggacatg gggacatttg gccatatggt gcgtggctac ttgtgggttg cagatttgaa 300
ttttgacgat gaaccttgca catatagagc tgagtataat taattcttct aaacgcattt 360
ggagctagga agatttaatt aatttcgagc taaataatag tagtagctat gtggcgcaga 420
gaggaaatga aaccataatc atggtagaac caaaaataag cattagtgat atgtcagtgc 480
ttagctattc gatgcattta acaggcagcg gcaacaagct tggatggatt tggctgcctg 540
ctgcagtgct gctctaagct atagctccat gctgataact ggccgagtcc atctctgatg 600
gtaatggtgc agaagatgaa caggaggagg ggatgaaaaa aaaaaaagaa gacatggaca 660
agttggttca tcgaagaaat acacatgtag tggcatattt gaaataccta ttaaattaag 720
catgtctaaa attccataaa ttgtagtggt atattttagt attgaagaag ttacaatggc 780
atgatccaat gaatcatatt tatatccacg ttgcacattg taaatttgac ctgtaaaatg 840
tttattaatc atatcgtttt ctgcaaatct gggcaccaag tggtatatgc agaagagtac 900
taccttaaca aattgacact ttctttctct gactagtaga gtctccacca cacacacgtg 960
ccacccttta catccgtgaa ttttctgagt ccagaaggat taataagtct acaagtatat 1020
ctcatctcag caaactggga agcctatcca ttaacggcac cgaaaaattg cacgttttgc 1080
ttcttttctc atcttataaa tacaccacac aactccatcc ctcatacacc aaacgcacac 1140
acaacttaag aatcgatcaa tagagcatct atcattctgc tggacaataa cacccgtttc 1200
agtctcgata gcaagcagtt tcaattggtt gtaagtacct gttctgatct taatttgatg 1260
aaagagtgtt tcgaattaag tgccttgcgt gtacacaaca acaaattaat cctagctata 1320
tttgcaggaa ttttgcttca ttaatttgct gtgaccagaa tg 1362
<210>4
<211>1677
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>4
ttcttaagtt gtgtgtgcgt ttggtgtatg agggatggag ttgtgtggtg tatttataag 60
atgagaaaag aagcaaaacg tgcaattttt cggtgccgtt aatggatagg cttcccagtt 120
tgctgagatg agatatactt gtagacttat taatccttct ggactcagaa aattcacgga 180
tgtaaagggt ggcacgtgtg tgtggtggag actctactag tcagagaaag aaagtgtcaa 240
tttgttaagg tagtactctt ctgcatatac cacttggtgc ccagatttgc agaaaacgat 300
atgattaata aacattttac aggtcaaatt tacaatgtgc aacgtggata taaatatgat 360
tcattggatc atgccattgt aacttcttca atactaaaat ataccactac aatttatgga 420
attttagaca tgcttaattt aataggtatt tcaaatatgc cactacatgt gtatttcttc 480
gatgaaccaa cttgtccatg tcttcttttt tttttttcat cccctcctcc tgttcatctt 540
ctgcaccatt accatcagag atggactcgg ccagttatca gcatggagct atagcttaga 600
gcagcactgc agcaggcagc caaatccatc caagcttgtt gccgctgcct gttaaatgca 660
tcgaatagct aagcactgac atatcactaa tgcttatttt tggttctacc atgattatgg 720
tttcatttcc tctctgcgcc acatagctac tactattatt tagctcgaaa ttaattaaat 780
cttcctagct ccaaatgcgt ttagaagaat taattatact cagctctata tgtgcaaggt 840
tcatcgtcaa aattcaaatc tgcaacccac aagtagccac gcaccatatg gccaaatgtc 900
cccatgtcca aatcgttgaa tatgcatcca acaacccctt tacacgtggg tgcacatgca 960
tgaagattga agcctatcca ctaatgacta gtccacgtac cggcccgctt tgaaacttcg 1020
ttatttacac acgttgctcg atgtattggt gtgctgtgtt tttttttaga ccaaattgct 1080
ccgttcatat ggtcctataa atgcacgcat atacgttaca caaatccaaa tccatatcca 1140
cacatcgcgg tgcaaaacca aaacccactg cagagaagaa gcatcgatca attcaagtta 1200
ccaagtacgt actcctgtct ctaccgtatg tgtctacctg tttaggttct ttattatttg 1260
aatctacaca tgaggagagg ttccgttttt tgattagtgg cgtttggagt catcgtttcg 1320
cttattcacg gcatatttgt aaagaaaaat aatttatgaa taaaactttt atgtgtatgt 1380
tcttagcgat ttaaaagtaa aggctgaaaa ataaacttcg ataaaaaaaa ccttgaaatc 1440
agctccaaat ttaaggttaa aaatttaaat tttaattaat aagcataaac ataagcgaaa 1500
agatgaggct ctaattaagg tcccatttgc aacaatttta aagaacaaaa tatgattcaa 1560
caagtaatta acatagaaag gtgtttcttt gatgatctga agatgcagta atcatgaatt 1620
aaccactcat aatttgcagg caacttggat cttctcgatt gtttccttgc gaagatg 1677
<210>5
<211>211
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>5
atcgatcaat agagcatcta tcattctgct ggacaataac acccgtttca gtctcgatag 60
caagcagttt caattggttg taagtacctg ttctgatctt aatttgatga aagagtgttt 120
cgaattaagt gccttgcgtg tacacaacaa caaattaatc ctagctatat ttgcaggaat 180
tttgcttcat taatttgctg tgaccagaat g 211
<210>6
<211>525
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>6
caaaaccaaa acccactgca gagaagaagc atcgatcaat tcaagttacc aagtacgtac 60
tcctgtctct accgtatgtg tctacctgtt taggttcttt attatttgaa tctacacatg 120
aggagaggtt ccgttttttg attagtggcg tttggagtca tcgtttcgct tattcacggc 180
atatttgtaa agaaaaataa tttatgaata aaacttttat gtgtatgttc ttagcgattt 240
aaaagtaaag gctgaaaaat aaacttcgat aaaaaaaacc ttgaaatcag ctccaaattt 300
aaggttaaaa atttaaattt taattaataa gcataaacat aagcgaaaag atgaggctct 360
aattaaggtc ccatttgcaa caattttaaa gaacaaaata tgattcaaca agtaattaac 420
atagaaaggt gtttctttga tgatctgaag atgcagtaat catgaattaa ccactcataa 480
tttgcaggca acttggatct tctcgattgt ttccttgcga agatg 525
<210>7
<211>1083
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>7
cggagcaatt tggtctaaaa aaaaacacag cacaccaata catcgagcaa cgtgtgtaaa 60
taacgaagtt tcaaagcggg ccggtacgtg gactagtcat tagtggatag gcttcaatct 120
tcatgcatgt gcacccacgt gtaaaggggt tgttggatgc atattcaacg atttggacat 180
ggggacattt ggccatatgg tgcgtggcta cttgtgggtt gcagatttga attttgacga 240
tgaaccttgc acatatagag ctgagtataa ttaattcttc taaacgcatt tggagctagg 300
aagatttaat taatttcgag ctaaataata gtagtagcta tgtggcgcag agaggaaatg 360
aaaccataat catggtagaa ccaaaaataa gcattagtga tatgtcagtg cttagctatt 420
cgatgcattt aacaggcagc ggcaacaagc ttggatggat ttggctgcct gctgcagtgc 480
tgctctaagc tatagctcca tgctgataac tggccgagtc catctctgat ggtaatggtg 540
cagaagatga acaggaggag gggatgaaaa aaaaaaaaga agacatggac aagttggttc 600
atcgaagaaa tacacatgta gtggcatatt tgaaatacct attaaattaa gcatgtctaa 660
aattccataa attgtagtgg tatattttag tattgaagaa gttacaatgg catgatccaa 720
tgaatcatat ttatatccac gttgcacatt gtaaatttga cctgtaaaat gtttattaat 780
catatcgttt tctgcaaatc tgggcaccaa gtggtatatg cagaagagta ctaccttaac 840
aaattgacac tttctttctc tgactagtag agtctccacc acacacacgt gccacccttt 900
acatccgtga attttctgag tccagaagga ttaataagtc tacaagtata tctcatctca 960
gcaaactggg aagcctatcc attaacggca ccgaaaaatt gcacgttttg cttcttttct 1020
catcttataa atacaccaca caactccatc cctcatacac caaacgcaca cacaacttaa 1080
gaa 1083
<210>8
<211>837
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>8
gggttgttgg atgcatattc aacgatttgg acatggggac atttggccat atggtgcgtg 60
gctacttgtg ggttgcagat ttgaattttg acgatgaacc ttgcacatat agagctgagt 120
ataattaatt cttctaaacg catttggagc taggaagatt taattaattt cgagctaaat 180
aatagtagta gctatgtggc gcagagagga aatgaaacca taatcatggt agaaccaaaa 240
ataagcatta gtgatatgtc agtgcttagc tattcgatgc atttaacagg cagcggcaac 300
aagcttggat ggatttggct gcctgctgca gtgctgctct aagctatagc tccatgctga 360
taactggccg agtccatctc tgatggtaat ggtgcagaag atgaacagga ggaggggatg 420
aaaaaaaaaa aagaagacat ggacaagttg gttcatcgaa gaaatacaca tgtagtggca 480
tatttgaaat acctattaaa ttaagcatgt ctaaaattcc ataaattgta gtggtatatt 540
ttagtattga agaagttaca atggcatgat ccaatgaatc atatttatat ccacgttgca 600
cattgtaaat ttgacctgta aaatgtttat taatcatatc gttttctgca aatctgggca 660
ccaagtggta tatgcagaag agtactacct taacaaattg acactttctt tctctgacta 720
gtagagtctc caccacacac acgtgccacc ctttacatcc gtgaattttc tgagtccaga 780
aggattaata agtctacaag tatatctcat ctcagcaaac tgggaagcct atccattaac 840
ggcaccgaaa aattgcacgt tttgcttctt ttctcatctt ataaatacac cacacaactc 900
catccctcat acaccaaacg cacacacaac ttaagaa 937
<210>9
<211>750
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>9
gtagctatgt ggcgcagaga ggaaatgaaa ccataatcat ggtagaacca aaaataagca 60
ttagtgatat gtcagtgctt agctattcga tgcatttaac aggcagcggc aacaagcttg 120
gatggatttg gctgcctgct gcagtgctgc tctaagctat agctccatgc tgataactgg 180
ccgagtccat ctctgatggt aatggtgcag aagatgaaca ggaggagggg atgaaaaaaa 240
aaaaagaaga catggacaag ttggttcatc gaagaaatac acatgtagtg gcatatttga 300
aatacctatt aaattaagca tgtctaaaat tccataaatt gtagtggtat attttagtat 360
tgaagaagtt acaatggcat gatccaatga atcatattta tatccacgtt gcacattgta 420
aatttgacct gtaaaatgtt tattaatcat atcgttttct gcaaatctgg gcaccaagtg 480
gtatatgcag aagagtacta ccttaacaaa ttgacacttt ctttctctga ctagtagagt 540
ctccaccaca cacacgtgcc accctttaca tccgtgaatt ttctgagtcc agaaggatta 600
ataagtctac aagtatatct catctcagca aactgggaag cctatccatt aacggcaccg 660
aaaaattgca cgttttgctt cttttctcat cttataaata caccacacaa ctccatccct 720
catacaccaa acgcacacac aacttaagaa 750
<210>10
<211>537
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>10
atgaacagga ggaggggatg aaaaaaaaaa aagaagacat ggacaagttg gttcatcgaa 60
gaaatacaca tgtagtggca tatttgaaat acctattaaa ttaagcatgt ctaaaattcc 120
ataaattgta gtggtatatt ttagtattga agaagttaca atggcatgat ccaatgaatc 180
atatttatat ccacgttgca cattgtaaat ttgacctgta aaatgtttat taatcatatc 240
gttttctgca aatctgggca ccaagtggta tatgcagaag agtactacct taacaaattg 300
acactttctt tctctgacta gtagagtctc caccacacac acgtgccacc ctttacatcc 360
gtgaattttc tgagtccaga aggattaata agtctacaag tatatctcat ctcagcaaac 420
tgggaagcct atccattaac ggcaccgaaa aattgcacgt tttgcttctt ttctcatctt 480
ataaatacac cacacaactc catccctcat acaccaaacg cacacacaac ttaagaa 537
<210>11
<211>1060
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>11
gtgccgttaa tggataggct tcccagtttg ctgagatgag atatacttgt agacttatta 60
atccttctgg actcagaaaa ttcacggatg taaagggtgg cacgtgtgtg tggtggagac 120
tctactagtc agagaaagaa agtgtcaatt tgttaaggta gtactcttct gcatatacca 180
cttggtgccc agatttgcag aaaacgatat gattaataaa cattttacag gtcaaattta 240
caatgtgcaa cgtggatata aatatgattc attggatcat gccattgtaa cttcttcaat 300
actaaaatat accactacaa tttatggaat tttagacatg cttaatttaa taggtatttc 360
aaatatgcca ctacatgtgt atttcttcga tgaaccaact tgtccatgtc ttcttttttt 420
tttttcatcc cctcctcctg ttcatcttct gcaccattac catcagagat ggactcggcc 480
agttatcagc atggagctat agcttagagc agcactgcag caggcagcca aatccatcca 540
agcttgttgc cgctgcctgt taaatgcatc gaatagctaa gcactgacat atcactaatg 600
cttatttttg gttctaccat gattatggtt tcatttcctc tctgcgccac atagctacta 660
ctattattta gctcgaaatt aattaaatct tcctagctcc aaatgcgttt agaagaatta 720
attatactca gctctatatg tgcaaggttc atcgtcaaaa ttcaaatctg caacccacaa 780
gtagccacgc accatatggc caaatgtccc catgtccaaa tcgttgaata tgcatccaac 840
aaccccttta cacgtgggtg cacatgcatg aagattgaag cctatccact aatgactagt 900
ccacgtaccg gcccgctttg aaacttcgtt atttacacac gttgctcgat gtattggtgt 960
gctgtgtttt tttttagacc aaattgctcc gttcatatgg tcctataaat gcacgcatat 1020
acgttacaca aatccaaatc catatccaca catcgcggtg 1060
<210>12
<211>939
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>12
ctactagtca gagaaagaaa gtgtcaattt gttaaggtag tactcttctg catataccac 60
ttggtgccca gatttgcaga aaacgatatg attaataaac attttacagg tcaaatttac 120
aatgtgcaac gtggatataa atatgattca ttggatcatg ccattgtaac ttcttcaata 180
ctaaaatata ccactacaat ttatggaatt ttagacatgc ttaatttaat aggtatttca 240
aatatgccac tacatgtgta tttcttcgat gaaccaactt gtccatgtct tctttttttt 300
ttttcatccc ctcctcctgt tcatcttctg caccattacc atcagagatg gactcggcca 360
gttatcagca tggagctata gcttagagca gcactgcagc aggcagccaa atccatccaa 420
gcttgttgcc gctgcctgtt aaatgcatcg aatagctaag cactgacata tcactaatgc 480
ttatttttgg ttctaccatg attatggttt catttcctct ctgcgccaca tagctactac 540
tattatttag ctcgaaatta attaaatctt cctagctcca aatgcgttta gaagaattaa 600
ttatactcag ctctatatgt gcaaggttca tcgtcaaaat tcaaatctgc aacccacaag 660
tagccacgca ccatatggcc aaatgtcccc atgtccaaat cgttgaatat gcatccaaca 720
acccctttac acgtgggtgc acatgcatga agattgaagc ctatccacta atgactagtc 780
cacgtaccgg cccgctttga aacttcgtta tttacacacg ttgctcgatg tattggtgtg 840
ctgtgttttt ttttagacca aattgctccg ttcatatggt cctataaatg cacgcatata 900
cgttacacaa atccaaatcc atatccacac atcgcggtg 939
<210>13
<211>753
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>13
tataccacta caatttatgg aattttagac atgcttaatt taataggtat ttcaaatatg 60
ccactacatg tgtatttctt cgatgaacca acttgtccat gtcttctttt ttttttttca 120
tcccctcctc ctgttcatct tctgcaccat taccatcaga gatggactcg gccagttatc 180
agcatggagc tatagcttag agcagcactg cagcaggcag ccaaatccat ccaagcttgt 240
tgccgctgcc tgttaaatgc atcgaatagc taagcactga catatcacta atgcttattt 300
ttggttctac catgattatg gtttcatttc ctctctgcgc cacatagcta ctactattat 360
ttagctcgaa attaattaaa tcttcctagc tccaaatgcg tttagaagaa ttaattatac 420
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acaaatccaa atccatatcc acacatcgcg gtg 753
<210>14
<211>381
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>14
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aacgcacaca caacttaaga a 381
<210>15
<211>381
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>15
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gaaacttcgt tatttacaca cgttgctcga tgtattggtg tgctgtgttt ttttttagac 300
caaattgctc cgttcatatg gtcctataaa tgcacgcata tacgttacac aaatccaaat 360
ccatatccac acatcgcggt g 381
<210>16
<211>68
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>16
caccgcgatg tgtggatatg gatttggatt tgtgtaacgt atatgcgtgc atttatagga 60
ccatatga 68
<210>17
<211>92
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>17
ttcttaagtt gtgtgtgcgt ttggtgtatg agggatggag ttgtgtggtg tatttataag 60
atgagaaaag aagcaaaacg tgcaattttt cg 92
图示说明：上图圆形部分为将水稻cDNA文库单克隆铺板并转膜，以健康稻叶的 mRNA为探针杂交；选取未杂交上的克隆(上图中空心圆点表示)作为候选诱导 性cDNA克隆。下图表示候选诱导性cDNA克隆分别阵列于两张尼龙膜上，分别 以健康稻叶和接种稻叶的mRNA为探针杂交进行反向Northern确认；图中左为 接种叶mRNA(R)探针，右为健叶mRNA(H)探针。其中，具有杂交信号(图中 黑色圆点)的确定为诱导性cDNA克隆。
附图2，稻瘟菌诱导性水稻cDNA克隆的反向Northern实际确认。图示说明：经 过的候选cDNA经PCR扩增后，等量阵列于两张尼龙膜上，分别以水稻健叶 mRNA(左)和稻瘟菌接种稻叶mRNA(右)为探针杂交，绝大多数阳性克隆仅 在右侧膜上有杂交信号，为诱导性克隆。
附图3，水稻枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂基因 OsSci2和 OsSci3在染色体上 的结构。图示说明：上为结构示意，右向的兰色箭头表示 OsSci2基因转录的cDNA 及其方向，左向的兰色箭头表示 OsSci3基因转录的cDNA及其方向；红色实心框 表示内含子；ATG为翻译起始密码子；TSS为转录起始位点。黑线表示DNA。 两个基因分别位于该段DNA的互补序列上；下为水稻品种爱知旭的基因组 Southern杂交图，左、右侧它针分别为OsSci2和OsSci3的编码区，泳道内样品 自左至右分别为DNA分子量标准、Hind III酶切基因组和EcoRV酶切基因组。
附图4，稻瘟菌侵染后 OsSci2和 OsSci3基因的表达动态的Northem分析。图示 说明：0、4、8、12、36、48、72为接种时间，单位为小时(h)，接种稻瘟菌分 别为非亲和小种131与亲和小种MS220，ribosomal RNA为上样量内标。
附图5，稻瘟菌诱导性水稻双向基因启动子区域及其衍生变体与报告基因GUS嵌 合的双元载体构建的示意图。图示说明：上为启动子及其衍生变体与报告基因 GUS融合的示意图；下为去除了CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体，载体 上标注的限制性酶切位点 EcoRI和 NcoI为启动子片段的连接位点。
附图6，稻瘟菌诱导性水稻双向基因启动子(灰色)与感兴趣基因(红褐色基因 1与紫色基因II)嵌合的双元表达载体的结构示意图。
附图7，稻瘟菌诱导性水稻双向基因启动子区域及其从5’端渐变缺失的衍生变体 所需PCR引物对。图示说明：引物对名称与启动子或其变体名称相对应，下划线 为增加的酶切位点，上游引物增加的位点是 EcoRI，下游引物增加的是 NcoI。
附图8，接种稻瘟菌的转基因水稻叶片中本发明发现的启动子pSCI2和pSCI3与 广泛利用CaMV35S启动子驱动的报告基因GUS表达的活性比较。图示说明：左 为pSCI2和pSCI3与GUS基因连接的示意图，图中绿色的(对应于右图的WP) 为报告基因，数字标示以转录起始位点为+1。右为GUS表达活性，Inoculation 为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的样品，Untreated 为不经任何处理的样品，CaMV 35S为花椰菜花叶病毒的35S启动子。pSCI2和 pSCI3驱动的报告基因GUS表达的活性分别是CaMV 35S驱动的报告基因GUS 表达的活性28和12倍。
附图9，接种稻瘟菌的转基因水稻叶片中pSCI2与其衍生变体驱动GUS基因表 达的活性比较。图示说明：左为pSCI2及其衍生变体与GUS基因连接的示意图， 图中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活 性，Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的 样品，Untreated为不经任何处理的样品。
附图10，接种稻瘟菌的转基因水稻叶片中 pSCI3与其衍生变体驱动 GUS基因表 达的活性比较。图示说明：左为 pSCI3及其衍生变体与 GUS基因连接的示意图， 图中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活 性，Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的 样品，Untreated为不经任何处理的样品。
附图11，接种稻瘟菌后转基因水稻叶片中pSCI2与pSCI2+I驱动的GUS基因表 达强度的比较。图示说明：左为pSCI2与pSCI2+I与GUS基因连接的示意图，图 中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活性， Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的样品， Untreated为不经任何处理的样品。
附图12，接种稻瘟菌后转基因水稻叶片中 pSCI3与 pSCI1+I驱动的 GUS基因表 达强度的比较。图示说明：左为 pSCI3与 pSCI3+I与 GUS基因连接的示意图，图 中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动子的空载体；右为GUS表达活性， Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样品，Mock为水处理后36小时的样品， Untreated为不经任何处理的样品。
附图13， pSCISP2与 pSCISP3驱动的 GUS基因表达的转基因水稻叶片在接种稻 瘟菌等处理后GUS表达活性分析。图示说明：上为 pSCISP2与 pSCISP3驱动的 GUS基因表达载体的示意图，图中数字标示以转录起始位点为+1，WP为无启动 子的空载体；右为GUS表达活性，Inoculation为稻瘟菌接种处理后36小时的样 品，Mock为水处理后36小时的样品，Untreated为不经任何处理的样品。
图14、水稻双向基因启动子 pSCI2、pSCI3区域驱动的 GUS基因在转基因水稻根 部表达的组织染色照片。图示说明：WP为无启动子空载体的转基因水稻 GUS 染色照片，左侧列示主根根尖，中间列示侧根萌发部位，右侧列示侧根。
具体实施方案
为了更好地理解本发明，以下结合具体的实例作以说明，但并非用来限制本发明。 实施例1、稻瘟菌侵染诱导型水稻基因cDNA的克隆
为了克隆病原菌诱导性、具有双向驱动基因表达能力的基因启动子，本发明首先 通过负向扣除筛选-反向Northern确认的方法，从稻瘟菌侵染稻叶的cDNA文库中筛 选获得了诱导性的cDNA克隆1642个。具体实施为：种植爱知旭品种水稻，待4-5 叶抽出时，一部分取健康水稻叶片，立即液氮冷冻后保存，提取叶片总RNA并纯化 mRNA(记为HmRNA)；另一部分活体接种稻瘟菌，分别在接种后0、8、24、48、 72小时取发病叶片，立即液氮冷冻后保存，分别提取叶片总RNA，分别取各时间点 适量RNA等量混合并纯化mRNA(记为PmRNA)。同时将稻瘟菌侵染稻叶的cDNA 文库铺成单克隆平板并印记到尼龙膜上。用Superscrip II反转录酶对HmRNA进行放 射性同位素α-32p标记，以α-32p标记的cDNA为探针杂交上述尼龙膜。杂交后挑取 阴性克隆进行PCR扩增，扩增产物分别阵列于两张尼龙膜上。分别以α-32p标记的 HmRNA和PmRNA的cDNA探针进行反向Northern杂交(附图1和附图2)。将仅 与PmRNA的cDNA探针杂交为阳性的克隆作为候选克隆并进行测序。
实施例2、诱导性cDNA序列的生物信息学分析
将经负向扣除筛选-反向Northern确认的1790个cDNA序列与水稻基因组数据 库(http：//ricegaas.dna.affrc.go.jp)进行比对分析，结果发现其中1642个序列来源于 水稻。进一步对来源于水稻的cDNA进行相互比较、BLAST查询和基因组数据库分 析，发现它们分别属于1075个独立的水稻基因。同时发现：两个基因与已报道的其 它生物来源的枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶抑制剂基因同源，分别命名为 OsSci2和 OsSci3(GenBank登录号分别为AY878694和AY878695)；且这两个cDNA位于同 一个BAC克隆上，两者分别以头对头方式与一段DNA片段的互补链匹配，两cDNA 间相距1152bp，两基因所在的染色体位置如图3所示。
实施例3、 OsSci2和 OsSci3受稻瘟菌侵染诱导表达的特异性和时间动态分析。
采用Northem blot分析 OsSci2和 OsSci3受稻瘟菌侵染诱导表达特性和时间动 态。具体实施方法为：种植水稻品种爱知旭，待4-5叶抽出时，一部分水稻叶片活 体接种稻瘟菌亲和性小种MS220，另一部分活体接种稻瘟菌小种P131，分别在接种 后0、8、24、48、72小时取发病叶片，立即液氮冷冻后保存，提取总RNA。按《分 子克隆》(Sambrook et al，1998)的方法进行并行凝胶电泳，每样品上样量约为20μ g。杂交探针分别为放射性同位素α-32p标记的 OsSci2和 OsSci3的编码区。杂交后 安常规方法洗膜、压磷屏，并在CycloneTM磷屏扫描系统成像，结果如图3所示。 结果表明： OsSci2和 OsSci3的诱导表达无小种特异性，且两基因表达的时间动态相 似：均在接种后8小时开始表达，到48小时达到高峰。
实施例4双向启动子 pSCI2和 pSCI3及其与内含子相连的双向启动子 pSCI2+I和 pSCI3+I的克隆
根据生物信息学分析的结果，在水稻基因组中，这两个基因分别位于同一DNA 片段互补链上并以头对头方式分布，两cDNA间相距1152bp，且两基因的5’非翻 译区均含有一内含子。首先根据基因组序列设计特异引物对pSCI2+I和pSCI3+I， 扩增水稻品种爱知旭的基因组DNA。扩增片段经克隆到pMD-18T载体并测序，获 得了如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的DNA片段的核苷酸序列。在此 基础上，设计引物对pSCI2和pSCI3，以上述克隆的片段为模板进行扩增，扩增产 物克隆到pMD-18T载体并测序确认，获得如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示的DNA序列。
实施例5、稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子的一系列衍生变体的获得。
对上述克隆的稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子pSCI2和pSCI3序列进行数据 库检索和软件分析，推测其潜在的顺式元件位置，然后在这些位置之前设计携带合 适酶切位点的PCR引物(附图7)，以克隆的原始序列为模板扩增出5’端上游调控 片段的一系列衍生变体(附图5)。扩增产物分别克隆到pMD-18T载体并测序确认。
实例6、稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子pSCI2和pSCI3及其一系列衍生变体与 GMS基因嵌合的双元载体构建。
上述克隆到pMD-18T载体上的稻瘟菌侵染诱导性双向基因启动子 pSCI2和 pSCI3及其一系列衍生变体在其5’端均含有EcoRI位点，在其3’端均含 NcoI位点 (图5)。因此，分别对双元载体pCAMBIA1301和克隆到pMD-18T上的衍生变体 用限制性内切酶 EcoRI和 NcoI进行双酶切。两组双酶切后的产物经葡聚糖凝胶电泳 分开后，切取目标DNA片段的凝胶块，分别用回收试剂盒回收：(1)双元载体 pCAMBIA1301缺失35S启动子的剩余部分，(2)pMD-18T载体切出的 pSCI2和 pSCI3 及其衍生变体部分。最后按一定比例分别将回收的(1)(2)两部分混合并用T4DNA 连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，并经酶切鉴定和测序确认。这样 获得的启动子和衍生变体为： pSCI2、pSCI3、pSCI2+I、pSCI3+I、pSCI2-1、pSCI2-2、 pSCI2-3、pSCI2-4、pSCI3-1、pSCI-2和pSCI-3(见附图8，9，10，11和12的左图)。 为获得衍生变体 pSCISP2和pSCISP3，分别在 pSCI2和pSCI3基础上，利用限制性 内切酶SpeI酶切、回收大片段，自连(见附图13左图)。
实施例7、双向基因启动子 psCI2和pSCI3及其一系列衍生变体与 GUS基因表达双 元载体转化水稻。
1.双元载体转化根癌农杆菌
分别将上述双元载体质粒DNA用电激法导入EHA105感受态细胞，28℃培养 到形成单菌落。挑取转化的农杆菌接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基 中，28℃，220rpm摇培16hr，直接对菌液进行PCR鉴定。
2.根癌农杆菌介导的水稻转化
准备水稻未成熟种子，经表面消毒后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB) 上，暗培养诱导俞伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配置的继代培养基 (NB)上，在相同条件下继代培养5天左右；或者准备水稻成熟胚愈伤组织，挑选 继代培养5-7天，色泽淡黄的愈伤组织共培养。挑选状态较好的愈伤组织与适量农 杆菌悬浮液(OD0.3-0.5)共培养15-20分钟，转入固体人工培养基上，26℃黑暗培 养2-3天。将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/L Hygromycin的分化培养基上， 先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件上培养，经过15-25天左右，长出绿点。 30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移 到生根培养基上，培养两周左右，在室温内移栽入土。各结构获得T0代转基因水 稻株系数如表1所示。
实施例8、转基因水稻活性的鉴定及分析
1.材料的准备：将收获的T0代转基因种子(即T1代)每株系取30～50粒清 水浸泡48小时，待种子萌动后转入0.6％琼脂平板(内含50μg/毫升的潮霉素)上 发芽。3～4天后调查种子生根情况，并将在潮霉素板上正常生根(即具潮霉素抗性) 的幼苗移入大田，即为T1代转基因苗。待T1带幼苗长至4叶一心时进行处理。处 理时每个结构随机选取10个株系，每株系15株苗，分为3组：第一组接种稻瘟菌 菌株MS220，用0.025％的Tween20水溶液将分生孢子制成浓度为105/毫升的悬浮液， 均匀喷雾于幼苗上部叶片，接种后27℃黑暗保湿24小时，之后持续光照，至接种 后36小时，取接种叶片，液氮速冻，存于-80℃冰箱备用(样品记为Inoculation)；第 二组幼苗仅喷雾0.025％的Tween20水溶液，其它处理和取样同第一组(样品记为 Mock)；第三组幼苗不经任何处理，与第一、第二组同时取田间健康幼苗的上部叶 片，液氮速冻，存于-80℃冰箱备用(样品记为untreated)。上述样品用于GUS表达 活性的定量分析。GUS组织染色材料为直接选取健康幼苗的根、茎、叶和叶鞘。
表1不同结构获得的转基因T0代株系
转基因结构 T0代株系数 转基因结构 T0代株系数 pSCI2 15 pSCI3-1 11 pSCI2+1 18 pSCI3-2 49 pSCI3 26 pSCI3-3 67 pSCI3+1 17 pSCISp2 17 pSCI2-1 108 pSCI3Sp3 15 pSCI2-2 13 WP 20 pSCI2-3 40 CaMV35S 12 pSCI2-4 14
2.GUS表达活性的定量分析：GUS活性检测根据Yang等的方法(Yinong Yang et al，the plant journal，2000，22(6)：543-551)。具体为：取叶片在液氮中迅速研磨至 碎，加入适量的抽提缓冲液，冰浴中磨成匀浆，12000g4℃离心10分钟；取5μ l上清加入45μl2mM的4-MUG(4-methylμmbelliferyl-D-glucuronide)，并快速 吸取5μl混合液加入到100μl0.2M的Na2CO3终止反应作为对照。剩余混合液 37℃保温30min后，吸取5μl加入到入到100μl0.2M的Na2CO3终止反应。反 应结束后在TECAN GENios Plus荧光酶标仪测定产物4-MU的荧光值。同时，取5μ l上清按Bradford法利用TECAN GENios Plus荧光酶标仪测定总蛋白含量。然后按 稀释比例折算每毫克蛋白中每分钟所产生4-MU的物质量，记单位为nmol/min/mg protein，并计算10个株系(5株/株系)的平均值。
根据GUS活性的测定结果，可以得出以下结论：1)pSCI2和pSCI3在转基因水 稻叶片中均具有很强稻瘟菌诱导性启动子活性，其在接种稻瘟菌36小时的活性分 别为CaMV35S启动子的28倍和12倍，与0.025％Tween水喷雾对照相比，分别 增加了约20倍(附图8，9，10，11和12)。2)pSCI2的5’端缺失69bp后(pSCI2-1) 其受稻瘟菌侵染诱导的表达活性显著降低(附图9)；类似地，pSCI3的5’端缺失 98bp后(pSCI3-1)其受稻瘟菌侵染诱导的表达活性也显著降低(附图10)。这一 结果说明5’端序列是其完全启动子活性所必需的。由于pSCI2和pSCI3为同一DNA 片段的两条互补单链，因此可以根据以上结果判定：pSCI2或pSCI3是具有双向驱 动基因表达能力的、在水稻叶片中受病原菌侵染诱导性的启动子。3)OsSCI2和 OsSCI3基因的5’非翻译区，其序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6(分别含一 内含子区域)所示，当将SEQ ID NO：5融合在pSCI2下游(pSCI2+I)、将SEQ ID NO：6融合在pSCI3下游(pSCI3+I)后驱动报告基因GUS，其受稻瘟菌诱导表达 活性均明显增强(附图11和附图12)。这一结果说明5’非翻译区具有增强基因表 达的能力，为增强子。4)通过对双向基因启动子的各种衍生变体驱动GUS基因表 达的定量分析发现：pSCI3-3转基因植株的GUS活性显著高于pSCI3-2转基因植株 (附图10)，说明pSCI3-2和pSCI3-3之间存在一个正调控的顺式元件，该元件位 于序列SEQ ID NO：2中从213到400bp之间。5)将pSCI2(其序列如SEQ ID NO： 1所示)序列从162位到932位缺失后驱动GUS报告基因(pSCISP2)或者将将pSCI3 (其序列如SEQ ID NO：2所示)序列从162位到932位缺失后驱动GUS报告基 因(pSCISP3)，它们的转基因植株既表现了GUS叶片组成性表达的特点，也具有 稻瘟菌侵染诱导增强的特性(附图13)。由于pSCISP2和pSCISP3的序列为反向互 补序列，所以判定：pSCISP2/pSCISP3具有双向驱动基因表达的能力，其在水稻叶 片中组成性表达且具有病原菌侵染诱导增强的特性。
3.GUS组织染色：GUS组织染色法按Jefferson等的方法进行(Jefferson，EMBO J.，1987，6：3901-3907)，首先将选取的转基因材料进行无菌水表面清洗，用无菌 吸水纸吸干后浸入GUS染色液，抽气5分钟后放28℃，200rpm摇床上反应30分 钟到过夜，然后在70％或100％的乙醇内脱色漂洗至显色。结果表明：双向基因启 动子及其衍生变体均可驱动GUS基因在健康转基因水稻根部表达，但表达强弱略 有差异。其在根部表达的特征为主要在根尖分生组织和侧根萌发的部位表达(附图 14)。
实施例9抗病双元载体的构建
该双元载体是在实施例4的基础上构建的。此处仅以由pSCI2而来的抗病双元 载体的构建过程为例，其他一系列启动子的衍生变体均可按此法获得。将pSCI2质 粒用BstE II酶切6小时，然后同T4DNA polymerase补平，酚仿抽提后溶于双蒸无菌 水中用Nco I酶切，回收载体片段，连接将要嵌合的基因II，其在5’端可以带有既有 的或后来增加的Nco I位点接头，其3’端应该是平滑末端。为连接基因I，可将pSCI2 质粒用EcoRI酶切后，补平，然后连入平端的目的基因，并鉴定连接方向。另外， 为了可以嵌合各类基因，可以用BstEII和Nco I双酶切后补平，连入平端的、即将 嵌合的基因II，并鉴定连入方向，然后将质粒用EcoRI酶切后，补平，然后连入平 端的目的基因I(附图6)。
序列表
<110>中国农业大学
<120>
<130>彭友良2003-2
<160>17
<210>1
<211>1152
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>1
caccgcgatg tgtggatatg gatttggatt tgtgtaacgt atatgcgtgc atttatagga 60
ccatatgaac ggagcaattt ggtctaaaaa aaaacacagc acaccaatac atcgagcaac 120
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acaacttaag aa 1152
<210>2
<211>1152
<212>DNA
<213> Oryzae sativa japonica
<400>2
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ctgcaccatt accatcagag atggactcgg ccagttatca gcatggagct atagcttaga 600
gcagcactgc agcaggcagc caaatccatc caagcttgtt gccgctgcct gttaaatgca 660
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tgaagattga agcctatcca ctaatgacta gtccacgtac cggcccgctt tgaaacttcg 1020
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atgagaaaag aagcaaaacg tgcaattttt cg 92
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