NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用
阅读：550发布：2020-05-17
专利汇可以提供NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了NsNHX1 蛋白质 及其相关 生物 材料 在培育耐逆型杨树中的应用。本发明以西伯利亚白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因NsNHX1为研究对象，将其转入毛白杨84K，获得转NsNHX1毛白杨。选取其中N1、N2和N3三个转化子进行耐逆功能鉴定。以野生型毛白杨为对照，研究转NsNHX1毛白杨在逆境胁迫下的耐盐 碱 和抗 氧 化能 力 。结果发现在逆境胁迫处理条件下，转NsNHX1毛白杨的存活率、生物量、 叶片 叶绿素含量和 含 水 量 、株高以及抗氧化能力均显著高于野生型毛白杨。表明NsNHX1能显著提高转基因杨树的耐逆能力和抗氧化能力，NsNHX1作为耐盐基因可以被应用于培育耐逆性杨树品种。，下面是NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用专利的具体信息内容。
1.NsNHX1蛋白质在如下1)-10)中任一种中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)调控植物生长发育；
3)调控植物生物量；
4)调控植物株高；
5)调控植物叶绿素含量；
6)调控植物含水量；
7)调控植物抗氧化能力；
8)调控植物超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性；
9)调控植物脯氨酸含量；
10)调控植物丙二醛含量。
2.与NsNHX1蛋白质相关的生物材料在如下1)-12)中任一种中的应用：
1)调控植物耐逆性；
2)调控植物生长发育；
3)调控植物生物量；
4)调控植物株高；
5)调控植物叶绿素含量；
6)调控植物含水量；
7)调控植物抗氧化能力；
8)调控植物超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性；
9)调控植物脯氨酸含量；
10)调控植物丙二醛含量；
11)培育耐逆性提高的转基因植物或培育耐逆性植物品种；
12)植物育种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述NsNHX1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码NsNHX1蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1第149-1783位所示的cDNA分子或序列1所示的基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的NsNHX1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的NsNHX1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐碱性。
7.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中NsNHX1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述耐逆性为耐盐性和/或耐碱性；
或，所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下(1)-(9)中任一种：
(1)转基因植物的存活率高于受体植物；
(2)转基因植物的生物量或根部生物量高于受体植物；
(3)转基因植物叶片中的叶绿素含量高于受体植物；
(4)转基因植物叶片中的含水量大于受体植物。
(5)转基因植物的株高高于受体植物；
(6)转基因植物的抗氧化能力高于受体植物；
(7)转基因植物叶片中的超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性高于受体植物；
(8)转基因植物叶片中的脯氨酸含量高于受体植物；
(9)转基因植物叶片中的丙二醛含量低于受体植物。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中NsNHX1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达NsNHX1蛋白质；
或，所述过表达的方法为将NsNHX1蛋白质的编码基因导入受体植物；
或，所述NsNHX1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1第149-1783位所示的DNA分子。
10.根据权利要求1-6任一所述的应用或权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或，所述单子叶植物为杨树。
NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及NsNHX1蛋白质及其相关生物材料在培育耐逆型杨树中的应用。
背景技术
[0002] 植物根部是直接接触土壤中Na+的器官，因此根部的Na+外排和地上部分细胞对Na+的区隔化集中是决定植物耐盐性的重要机制。液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)将细胞质中的Na+逆浓度梯度运输到液泡中区隔化；细胞质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)能够将细胞质中的Na+逆向运送到细胞外的高Na+环境中。截止目前，所开发及应用的Na+/H+逆向转运蛋白基因，大多来自于拟南芥、番茄等甜土植物，而针对木本植物、特别是对盐生木本植物Na+/H+逆向转运蛋白基因的开发与研究较为匮乏。已有研究发现，盐芥ThSOS1的表达量约为拟南芥AtSOS1的8～10倍，而且在甜土植物水稻和盐生植物盐芥中发现了相似的SOS信号通路，表明高等植物可能共用一套耐盐调控机制。因此，开发利用盐生植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因具有十分重要的意义。
[0003] 白刺(Nirtaria L.)是蒺藜科(Zygophyllceae)白刺属的一种落叶小灌木，为盐生植物，主要分布在我国北部至西北部的内蒙古、宁夏、甘肃、青海和新疆等地，是干旱盐碱地带的建群种之一。白刺属植物的茎叶具有较厚的角质层、叶片被蜡质表皮毛、气孔内陷、栅栏组织和维管束发达、细胞内含物填充蜡质晶体，这些典型的旱生植物结构特征使其在抵御盐害中发挥作用。盐胁迫条件下较强的膜保护能力和膜修复能力，以及高效的胞内离子区隔化和渗透调节物质的积累能力赋予白刺属植物较强的耐盐性。内蒙古地区主要有四个种，即西伯利亚白刺(N.sibilica Pall)、唐古特白刺(N.tangutorum Bobr)、泡泡刺(N.sphaerocarpa Maxim)和齿叶白刺(N.roborowskii Kom)，其中西伯利亚白刺表现出更强的耐盐能力。西伯利亚白刺具有极其重要的生态价值，由于其在自然生境中受到盐、碱、旱的三重胁迫，导致其具有较强的耐盐碱和耐干旱能力，蕴含着丰富的抗逆基因资源。因此，研究其耐盐机理，鉴定耐盐相关基因并应用于牧草、农林作物的耐盐性遗传改良，具有十分重要的意义。
发明内容
[0004] 本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明首先提供了NsNHX1蛋白质的新用途。
[0006] 本发明提供了NsNHX1蛋白质在如下1)-10)中任一种中的应用：
[0007] 1)调控植物耐逆性；
[0008] 2)调控植物生长发育；
[0009] 3)调控植物生物量；
[0010] 4)调控植物株高；
[0011] 5)调控植物叶绿素含量；
[0012] 6)调控植物含水量；
[0014] 8)调控植物超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性；
[0015] 9)调控植物脯氨酸含量；
[0016] 10)调控植物丙二醛含量；
[0017] 上述应用中，所述NsNHX1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：
[0018] a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
[0019] b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
[0020] c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
[0021] d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
[0023] 表1、标签的序列
[0024]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0025] 上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0026] 上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0027] 上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1第149-1783位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0028] 上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。
[0029] 为了解决上述技术问题，本发明又提供了与NsNHX1蛋白质相关的生物材料的新用途。
[0030] 本发明提供了与NsNHX1蛋白质相关的生物材料在如下1)-12)中任一种中的应用：
[0031] 1)调控植物耐逆性；
[0032] 2)调控植物生长发育；
[0033] 3)调控植物生物量；
[0034] 4)调控植物株高；
[0035] 5)调控植物叶绿素含量；
[0036] 6)调控植物含水量；
[0037] 7)调控植物抗氧化能力；
[0038] 8)调控植物超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性；
[0039] 9)调控植物脯氨酸含量；
[0040] 10)调控植物丙二醛含量；
[0041] 11)培育耐逆性提高的转基因植物；
[0042] 12)植物育种。
[0043] 上述应用中，所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
[0044] A1)编码NsNHX1蛋白质的核酸分子；
[0045] A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
[0046] A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
[0047] A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
[0048] A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
[0049] A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
[0050] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
[0051] A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
[0052] A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0053] A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0054] A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0055] A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0056] 上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0057] 1)其编码序列是序列1第149-1783位所示的cDNA分子或序列1所示的基因组DNA分子；
[0058] 2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码NsNHX1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0059] 3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码NsNHX1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
[0060] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0061] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码NsNHX1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码NsNHX1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码NsNHX1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0062] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0063] 上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
[0064] 上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；
或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0065] 上述应用中，A2)所述的含有编码NsNHX1蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达NsNHX1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动NsNHX1转录的启动子，还可包括终止NsNHX1转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。
[0066] 可用现有的表达载体构建含有所述NsNHX1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0067] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒可为pBI101-35::Gus-Hm。
[0069] 上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
[0070] 上述应用中，所述耐逆性可为耐盐性和/或耐碱性。
[0071] 所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性。具体体现在：在盐或碱胁迫下，与受体植物相比，转NsNHX1植物的存活率提高、生物量或根部生物量提高、叶片中的叶绿素含量提高、叶片中的含水量提高、株高提高、抗氧化能力提高、叶片中的超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性提高、叶片中的脯氨酸含量提高、叶片中的丙二醛含量降低。所述盐具体为NaCl，所述NaCl浓度具体可为50mM或100mM或150mM；所述碱具体可为NaHCO3；
所述NaHCO3浓度具体可为100mM或200mM或300mM。
所述NaHCO3浓度具体可为100mM或200mM或300mM。
[0072] 所述调控植物生长发育为促进植物生长发育或促进植物根系生长发育。
[0073] 所述调控植物生物量为提高植物生物量；所述生物量可为根部生物量或植株生物量。
[0074] 所述调控植物株高为提高植物株高。
[0075] 所述调控植物叶绿素含量为提高植物叶片中的叶绿素含量。
[0076] 所述调控植物含水量为提高植物叶片中的含水量。所述含水量为相对含水量。
[0077] 所述调控植物抗氧化能力为提高植物抗氧化能力。具体体现在：在盐胁迫条件下，与受体植物相比，转NsNHX1植物叶片中的超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性提高，脯氨酸含量增加，丙二醛含量减少。
[0078] 所述调控植物超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性为提高植物叶片中的超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性。
[0079] 所述调控植物脯氨酸含量为提高植物叶片中的脯氨酸含量。
[0080] 所述调控植物丙二醛含量为降低植物叶片中的丙二醛含量。
[0081] 为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。
[0082] 本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中NsNHX1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
[0083] 进一步的，所述耐逆性为耐盐性和/或耐碱性。
[0084] 所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物具体体现在：在盐或碱胁迫下，转基因植物的存活率高于受体植物；和/或，转基因植物的生物量或根部生物量高于受体植物；和/或，转基因植物叶片中的叶绿素含量高于受体植物；转基因植物叶片中的含水量(相对含水量)大于受体植物；转基因植物的株高高于受体植物；和/或，转基因植物的抗氧化能力高于受体植物；和/或，转基因植物叶片中的超氧化物岐化酶和/或过氧化物酶和/或过氧化氢酶活性高于受体植物；和/或，转基因植物叶片中的脯氨酸含量高于受体植物；和/或，转基因植物叶片中的丙二醛含量低于受体植物。所述盐具体为NaCl，所述NaCl浓度具体可为
50mM或100mM或150mM；所述碱具体可为NaHCO3；所述NaHCO3浓度具体可为100mM或200mM或
300mM。
50mM或100mM或150mM；所述碱具体可为NaHCO3；所述NaHCO3浓度具体可为100mM或200mM或
300mM。
[0085] 更进一步的，所述提高受体植物中NsNHX1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达NsNHX1蛋白质；
[0086] 所述过表达的方法为将NsNHX1蛋白质的编码基因导入受体植物。所述NsNHX1蛋白质的编码基因具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0087] 所述NsNHX1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1第149-1783位所示的DNA分子。
[0088] 在本发明的具体实施例中，所述NsNHX1蛋白质的编码基因通过重组载体pBI101-NsNHX1导入受体植物中，所述重组载体pBI101-NsNHX1为将pBI101-35::Gus-Hm载体的XbaI和SacI酶切位点间的片段替换为序列1第149-1783位所示的DNA片段，且保持pBI101-35::Gus-Hm载体的其他序列不变后得到的载体。
[0089] 上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述NsNHX1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0090] 上述方法或应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述单子叶植物可为杨树；更进一步的，所述杨树可为毛白杨。在本发明的一个具体实施例中，所述毛白杨可为毛白杨84K(Populus alba×Populus glandulose)。
[0091] 本发明以西伯利亚白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因NsNHX1为研究对象，将其转入毛白杨84K(Populus alba×Populus glandulose)，获得转NsNHX1毛白杨。选取其中N1、N2和N3三个转化子进行耐逆功能鉴定。以野生型毛白杨为对照，研究转NsNHX1毛白杨在逆境胁迫下的耐盐碱和抗氧化能力。结果发现在逆境胁迫条件下，转NsNHX1毛白杨的存活率、生物量、叶片叶绿素含量和含水量、株高以及抗氧化能力均显著高于野生型毛白杨。表明NsNHX1能显著提高转基因杨树的耐逆能力和抗氧化能力，NsNHX1可被应用于培育耐逆性杨树品种。附图说明
[0092] 图1为NsNHX1 ORF的扩增。
[0093] 图2为重组载体pBI101-NsNHX1的双酶切鉴定。
[0094] 图3为毛白杨的遗传转化。(A)外植体的切割及预培养；(B)浸染；(C)分化培养；(D)筛选；(E)生根培养；(F)移栽。
[0095] 图4为转NsNHX1毛白杨的PCR鉴定。M：200bp DNA Ladder；+：重组质粒pBI101-NsNHX1；-：野生型毛白杨；N1，N2，N3：转NsNHX1毛白杨。
[0096] 图5为转NsNHX1毛白杨的RT-PCR分析。WT：野生型毛白杨；N1，N2，N3：转NsNHX1毛白杨。
[0097] 图6为野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨株系在盐胁迫条件下的生长比较。(A)在含0mM、50mM、100mM、150mM和200mM NaCl的P5培养基中培养2周的植株；(B)根部的生长情况比较；(C)在含0mM、50mM、100mM、150mM和200mM NaCl的P5培养基中培养2周的植株；(D)野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨株系根部的生物量；(E)野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的存活率。WT：野生型毛白杨；N1、N2、N3：转NsNHX1毛白杨。误差线代表标准偏差(SD)，来自于三个独立的生物学重复实验；标记的不同小写字母分别代表每组样本之间的显著性差异(P<0.05)
[0099] 图8为转NsNHX1毛白杨的耐逆性分析。(A)胁迫处理；(B)转NsNHX1毛白杨叶片中的叶绿素含量；误差线代表标准偏差(SD)，来自于三个独立的生物学重复实验；标记的不同小写字母分别代表每组样本之间的显著性差异(P<0.05)。WT：野生型毛白杨；N1、N2、N3：转NsNHX1毛白杨。
[0100] 图9为NaCl胁迫下野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的表型分析。(A)盐胁迫对野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨全株的影响(比例尺＝10cm)；(B)盐胁迫对野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶片的影响。
[0101] 图10为转NsNHX1毛白杨的耐逆性分析。(A)生物量；(B)植株高度；(C)叶片叶绿素含量；(D)叶片相对含水量；(E)SOD活性；(F)POD活性；(G)CAT活性；(H)脯氨酸含量；(I)MDA含量。WT：野生型毛白杨；N1、N2、N3：转NsNHX1毛白杨。误差线代表标准偏差(SD)，来自于三个独立的生物学重复实验；标记的不同小写字母分别代表每组样本之间的显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
[0102] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0103] 下述实施例中所涉及的植物材料毛白杨84K(Populus alba×Populus -2 -1glandulose)无菌组培苗的培养条件：温度为24±2℃，光照强度为200μmol·m ·s ，光照周期为16h光照/8h黑暗。
[0104] 下述实施例中pBI101-35::Gus-Hm载体记载于文献“WANG L,MA Y K,LI N N,et al.Isolation and characterization of a tonoplast Na+/H+ antiporter from the halophyte Nitraria sibirica[J].BIOLOGIA PLANTARUM,2016,60(1):113-122,2016”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0105] 下述实施例中所涉及的培养基配方如下：
[0106] 预培养培养基P1：MS(4.33g/L)+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.05mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(0.7％)。
[0107] 共培养培养基P2：MS(4.33g/L)+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(0.7％)+AS(200μmol/mL)。
[0108] 分化培养基P3：MS(4.33g/L)+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(0.7％)+Cef(300mg/L)。
[0109] 筛选培养基P4：MS(4.33g/L)+6-BA(1.0mg/L)+NAA(0.1mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(0.7％)+Cef(200mg/L)+Kan(50mg/L)或Gent(40mg/L)。
[0110] 生根培养基P5：1/2MS(2.17g/L)+IBA(0.4mg/L)+Sucrose(30g/L)+Agar(0.7％)。
[0111] 霍格兰培养基(霍格兰营养液)和MS培养基均是Phytotechnology Laboratories(https://phytotechlab.com)的产品。
[0112] 下述实施例中的西伯利亚白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因(简称NsNHX1基因)序列如序列1所示，包含一个1635bp的开放阅读框(序列1第149-1783位)，NsNHX1基因编码的西伯+ +利亚白刺Na/H逆向转运蛋白(简称NsNHX1蛋白)的氨基酸序列如序列2所示。
[0113] 实施例1、转NsNHX1毛白杨的获得及其耐逆性分析
[0114] 一、转NsNHX1毛白杨的获得
[0115] 1、重组载体的构建
[0116] (1)目的基因的扩增
[0117] 根据西伯利亚白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因(简称NsNHX1)序列(基因序列登陆号：AB859847)设计一对引物(NHX-pBI-F：5’-GCTCTAGAATGGATCAATTAAGTT-3’，5’端包括XbaI识别序列；NHX-pBI-R：5’-CGAGCTCTCACTGCCATTGGGGGAT-3’，5’端包括SacI识别序列)，以西伯利亚白刺Nitraria sibirica Pall的RNA为模板，采用NHX-pBI-F和NHX-pBI-R引物，利用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒扩增NsNHX1 ORF区域，得到PCR产物。反应条件为：94℃3min；94℃30s，52℃30s，72℃1min，35cycles；72℃5min。PCR产物的电泳结果如图1所示。
[0118] (2)目的基因与表达载体连接
[0119] 利用XbaI和SacI将双元表达载体pBI101-35::Gus-Hm及上述PCR产物分别进行双酶切，然后利用T4连接酶进行连接后获得重组载体pBI101-NsNHX1。并对重组载体pBI101-NsNHX1进行测序和酶切鉴定。
[0120] 测序结果表明：重组载体pBI101-NsNHX1为将pBI101-35::Gus-Hm载体的XbaI和SacI酶切位点间的片段替换为序列1第149-1783位所示的DNA片段，且保持pBI101-35::Gus-Hm载体的其他序列不变后得到的载体。
[0121] 重组载体pBI101-NsNHX1的酶切鉴定结果如图2所示。经双酶切和测序鉴定后的重组载体pBI101-NsNHX1用于杨树的遗传转化。
[0122] 2、毛白杨的遗传转化及转基因植物的筛选鉴定
[0123] 将重组载体pBI101-NsNHX1以农杆菌菌株GV3101介导的叶盘法转化毛白杨，得到转基因毛白杨。毛白杨遗传转化的流程如图3所示，具体步骤如下：
[0124] (1)选取生长旺盛的毛白杨84K(Populus alba×Populus glandulose)无菌组培苗叶片，垂直叶片主叶脉切3-4刀，然后将叶片背面朝上平铺在P1培养基中，预培养4天。
[0125] (2)将重组载体pBI101-NsNHX1导入GV3101农杆菌中，得到含有pBI101-NsNHX1的GV3101农杆菌。
[0126] (3)挑取经涂板活化的含有pBI101-NsNHX1的GV3101农杆菌单菌落，加入到含20mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和200μmol/L乙酰丁香酮的LB液体培养基中，28℃恒温振荡培养约8h，至OD600为0.6-0.8，加入0.01％的Silwet L-77作为浸染液。
[0127] (4)将预培养的叶片置于浸染液中浸泡10min，取出叶片后用滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶片背面朝上平铺在P2培养基中，24℃暗培养2-3天。
[0128] (5)待观察到P2培养基上出现农杆菌菌落后，用含300mg/L头孢噻夫钠和200mg/L特美汀的灭菌ddH2O清洗叶片，并吸干水分，将叶片转移到P3培养基中继续培养，约两周后，叶片上出现分化的不定芽。
[0129] (6)待不定芽长至1-2cm，将其切下转移到含50mg/L卡那霉素的P4培养基中进行筛选，三周后，挑选抗性苗进行PCR鉴定。
[0130] (7)将经过组织PCR鉴定的阳性转NsNHX1毛白杨植株转移到含100mg/L头孢噻夫钠的P5培养基中进行生根培养，生根后的转基因植株移栽到营养土，置于温室中培养并用于耐逆性检测。
[0131] 3、转NsNHX1毛白杨的PCR鉴定
[0132] 使用全式金公司的TransDirect Plant Tissue PCR Kit，使用引物35S-F：5’-AGGAAGGTGGCTCCTACAAATG-3’和NHX1-pBI-R：5’-CGAGCTCTCACTGCCATTGGGGGA-3’进行毛白杨抗性植株的PCR鉴定。
[0133] 反应条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min30s，35cycles；72℃5min；12℃Forever。
[0134] PCR产物经凝胶电泳检测发现，三个抗性植株N1、N2、N3和重组载体pBI101-NsNHX1均可扩增出大小约为1.9kb(252bp的35S启动子序列+1635bp的NsNHX ORF序列+6bp酶切序列)的NsNHX1的特异性条带，而野生型毛白杨没有该条带，表明外源基因NsNHX1已被成功地转入毛白杨。
[0135] 4、转NsNHX1毛白杨的RT-PCR分析
[0136] 将经过组织PCR鉴定确认为转NsNHX1毛白杨的植株转移到含100mg/L头孢噻夫钠的P5培养基中进行生根培养，待植株叶片长大后进行RT-PCR检测。用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒(操作过程见说明书的程序Protocol-I)提取阳性株系的RNA，用 First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit合成cDNA第一链，NHX-pBI-F和NHX1-pBI-R引物检测NsNHX1基因的表达。以毛白杨Actin基因为内参，引物为Actin(Populus)-F：5’-AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG-3’，Actin(Populus)-R：5’-GCATCATCACAATCACTCTCCGA-3’，反应条件：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃20s，30cycles；72℃5min。
[0137] 结果如图5所示。结果表明：在三个转NsNHX1毛白杨株系N1、N2、N3中均能扩增出NsNHX1表达产物。说明NsNHX1基因在转NsNHX1毛白杨中稳定表达。
[0138] 二、转NsNHX1毛白杨的耐逆性检测
[0139] 1、转NsNHX1毛白杨在无菌培养条件下的耐逆性检测
[0140] 选取生长旺盛的野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨无菌组培苗，截取5～6cm的插穗(保留顶芽及三片叶子)。野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨株系N1、N2、N3各选取20株，分别扦插到含有不同浓度NaCl(0、50、100、150和200mM)的P5培养基中进行盐胁迫处理。处理两周后，测定植株的存活率和根部的生物量(根部的鲜量)。
[0141] 结果如图6A所示。结果表明：在0mM、50mM和100mM NaCl条件下，野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨株系的表型无显著差别(图6A)，存活率均为100％，但是三个转NsNHX1毛白杨株系根部的生物量均显著高于野生型毛白杨(图6B、D)；在150mM NaCl条件下，野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨株系均出现黄化、坏死、生长抑制等现象，但是三个转NsNHX1毛白杨株系的存活率(N1-83.33％，N2-50％，N3-66.67％)显著高于野生型毛白杨的存活率(25％)(图6E)；在200mM NaCl条件下，野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨株系经过两周盐胁迫已全部死亡，表明超表达NsNHX1的转基因杨树能够在NaCl浓度不高于150mM的培养基中生存(图6A)。另一方面，超表达NsNHX1转基因毛白杨的根系发育较野生型毛白杨好，无论是在正常生长还是盐胁迫条件下，三个转NsNHX1毛白杨株系根部的生物量均显著高于野生型毛白杨(图6B、C、D)。以上结果表明，NsNHX1的过量表达不仅提高了转基因杨树的耐盐性，而且促进了根系的生长发育(图6)。
[0142] 2、移栽到土壤中的转NsNHX1毛白杨的耐逆性检测
[0143] 选取生长旺盛的野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨无菌组培苗，截取5～6cm的插穗，保留顶芽及三片叶子，扦插到P5培养基中进行生根培养。在光照培养箱中培养两周后转移到光照培养架上继续培养3天(此时植株已长出根)，将植株从培养基中取出，洗净根部残余培养基并擦干。然后移栽到土壤中(泥炭土和蛭石的比例为5：1)炼苗，浇灌霍格兰营养液，覆盖保鲜膜保湿，每天早晚各用霍格兰营养液喷洒叶片一次。一周后去掉保鲜膜，得到长势基本一致的植株。
[0144] (1)叶盘法检测转NsNHX1毛白杨的耐盐碱和抗氧化能力
[0145] 将扦插培养三周的野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨无菌组培苗移栽到泥炭土中，在温室培养两个月后，选取相同位置健壮舒展的叶片，用打孔器避开主叶脉将叶片打成直径1cm的叶圆盘。将叶圆盘分别放进含不同浓度的NaCl溶液(0mM、50mM、100mM和150mM)、NaHCO3溶液(0mM、100mM、200mM和300mM)和H2O2溶液(0％、1.0％、1.5％和2.0％)，置于光照周期为16h光照/8h黑暗的环境，24℃孵育72h后利用苏州科铭生物技术有限公司植物叶绿素含量试剂盒测定叶片中的叶绿素含量。
[0146] 结果如图8所示，结果表明：在0mM和50mM NaCl的条件下，野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的叶圆盘没有显著性差异；但是在100mM和150mM NaCl的条件下，野生型毛白杨的绝大部分叶圆盘因高盐溶液引起的强烈渗透作用而使细胞失水发生皱缩，致使叶圆盘软化。同时，在100mM和150mM NaCl的条件下，三个转NsNHX1毛白杨株系的叶圆盘的叶绿素含量均比野生型毛白杨高。说明超表达NsNHX1转基因毛白杨的叶圆盘具有更强的耐盐性。在100mM、200mM和300mM NaHCO3的条件下，虽然野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶圆盘的叶绿素含量没有显著性差异；但野生型毛白杨的叶圆盘表现出较为严重的损伤，说明转NsNHX1毛白杨的叶圆盘具有更强的耐碱性。在1.0％和1.5％H2O2的条件下，转NsNHX1毛白杨株系N2和N3与野生型和N1相比，表现出更强的抗氧化性：叶圆盘白化的数量更少，叶绿素含量更高。在2.0％H2O2的条件下，野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的叶圆盘均受到严重损伤。
以上结果表明，NsNHX1基因的超表达能够在一定程度上提高转基因毛白杨的耐盐性、耐碱性和抗氧化能力。
以上结果表明，NsNHX1基因的超表达能够在一定程度上提高转基因毛白杨的耐盐性、耐碱性和抗氧化能力。
[0147] (2)转NsNHX1毛白杨的耐盐性和表型分析
[0148] 选取野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨株系的预处理苗，分为两组，一组用霍格兰营养液浇灌，作为对照；另一组用含NaCl的霍格兰营养液浇灌，进行盐胁迫处理：第一周，每隔两天浇灌一次含25mM NaCl的霍格兰营养液；第二周，NaCl的浓度每隔两天增加25mM，逐渐提高到150mM；第三周，用含150mM NaCl的霍格兰营养液每隔两天浇灌一次，继续胁迫一周。每次每株植株浇灌相同体积的霍格兰营养液或者含NaCl的霍格兰营养液，并放置在一个托盘，以保持土壤含盐量。3周后，测定其生长状况(生物量M、株高h、叶片叶绿素含量和叶片相对含水量)；脯氨酸(Proline，PRO)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量；超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)的活性。
[0149] 1)生长状况的测量
[0150] A、生物量：用电子天平分别测量植株处理前后的生物量M。
[0151] B、株高：用直尺测量处理后的植株高度h。
[0152] C、叶片叶绿素含量：盐胁迫处理后，选取植株相同位置的叶片，使用SPAD-502便携式叶绿素测定仪测量叶绿素含量。
[0153] D、叶片相对含水量：盐胁迫处理后，选取植株相同位置的叶片，测量鲜重Wf。然后将叶片用蒸馏水在室温黑暗条件下浸泡24h，测量吸胀重量Wt。最后将样品在80℃条件下烘干48h，测量其干重Wd。叶片相对含水量(RWC)的计算公式为：RWC＝(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100％。
[0154] 2)脯氨酸含量测定
[0155] 称取约0.1g样品(叶片)，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；置于沸水浴中振荡提取10min；常温下10000g离心10min，取上清，冷却后待测。向EP管中依次加入0.25mL样本、
0.25mL试剂一和0.25mL试剂二，盖紧管口，置于沸水浴中保温30min，每隔10min振荡一次。
冷却后，加入0.5mL试剂三，振荡30s，静置片刻以使色素转至试剂三中；吸取0.2mL上层溶液于96孔板中，用酶标仪(预热30min以上)测定520nm波长处的吸光值A520，计算公式为：
0.25mL试剂一和0.25mL试剂二，盖紧管口，置于沸水浴中保温30min，每隔10min振荡一次。
冷却后，加入0.5mL试剂三，振荡30s，静置片刻以使色素转至试剂三中；吸取0.2mL上层溶液于96孔板中，用酶标仪(预热30min以上)测定520nm波长处的吸光值A520，计算公式为：
[0156] Pro含量(μg/g鲜重)＝38.4×(A520+0.0021)÷W鲜重。
[0157] 其中W鲜重：样本鲜重(g)。
[0158] 3)丙二醛(MDA)含量测定
[0159] 称取约0.1g样品(叶片)，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，8000g、4℃离心10min，取上清，置于冰上待测。向1.5mL离心管中加入0.3mL试剂一和0.1mL样品，混匀，在90℃水浴中保温30min(盖紧管口)后冰浴冷却，室温10000g离心10min。向96孔板中加入200μL上清液，用酶标仪(预热30min以上)测定532nm和600nm处的吸光度A532和A600，计算公式为：
[0160] MDA含量(nmol/g鲜重)＝＝51.6×ΔA÷W鲜重。
[0161] 其中ΔA＝A532-A600；W鲜重：样本鲜重(g)。
[0162] 4)SOD活性检测
[0163] 向96孔板中依次加入45μL试剂一，100μL试剂二，2μL试剂三，18μL样品(叶片)或18μL蒸馏水，35μL试剂四，充分混匀在室温放置30min后，用酶标仪(预热30min以上)测定560nm处的吸光值A560，计算公式为：
[0164] SOD活性(U/g鲜重)＝11.11×A抑制百分率÷(1-A抑制百分率)÷W鲜重×样本稀释倍数。
[0165] 其中A抑制百分率＝(A对照管-A测定管)÷A对照管×100％；W鲜重：样本鲜重(g)。
[0166] 5)POD活性检测
[0167] 向96孔板中依次加入10μL样品(叶片)、60μL蒸馏水、120μL试剂一、30μL试剂二、30μL试剂三，立即充分混匀并计时，用酶标仪(预热30min以上)测定470nm处30s的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2，计算公式为：
[0168] POD(U/g鲜重)＝5000×ΔA÷W鲜重
[0169] 其中ΔA＝A2-A1；W鲜重：样本鲜重(g)。
[0170] 6)CAT活性检测
[0171] 向试剂二中加入25mL试剂一并充分混匀，在UV板中加入10μL样品(叶片)和190μL工作液，立即混匀并计时，用酶标仪(预热30min以上)测定240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算公式为：
[0172] CAT(U/g鲜重)＝918×ΔA÷W鲜重
[0173] 其中ΔA＝A1-A2；W鲜重：样本鲜重(g)。
[0174] 经过三周的盐胁迫处理，野生型毛白杨和三个转NsNHX1毛白杨的表型和生理指标(生物量、株高、叶片叶绿素含量和叶片相对含水量)检测结果如图9和图10所示。结果表明：与在正常条件下生长的野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨相比，盐胁迫下的植株更矮小，生长更缓慢，但无论是在正常生长条件下还是在盐胁迫条件下，转NsNHX1毛白杨株系N1和N3的长势均比野生型和N2好，N2的长势略强于野生型毛白杨(图9A)。对比观察正常条件下和盐胁迫条件下植株的第七片叶子(从顶芽数起)，发现盐胁迫条件下野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的叶片均出现黄化、干枯、萎蔫等现象，野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨株系N2的叶片甚至出现坏死性的枯斑，但野生型毛白杨叶片受到的损伤更严重(图9B)。
[0175] 通过测量野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的生物量发现，在正常生长条件下和盐胁迫条件下，转NsNHX1毛白杨的生物量均显著高于野生型毛白杨(图10A)。测量野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的株高发现，无论是在正常生长条件下还是盐胁迫条件下，转NsNHX1毛白杨株系N1和N3的株高均显著高于野生型和N2，而野生型毛白杨和N2之间无显著性差异(图10B)。测量野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨第五片叶子(从顶芽数起)的叶绿素含量发现，在正常生长条件下野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶片中的叶绿素含量无显著性差异；而在盐胁迫条件下，转NsNHX1毛白杨叶片中的叶绿素含量增加且显著高于野生型毛白杨(图10C)。测量野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨第4枚叶片(从顶芽数起)的相对含水量发现，在正常条件下野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶片中的相对含水量无显著性差异；而在盐胁迫条件下，野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶片中的相对含水量均下降，但转NsNHX1毛白杨株系叶片中的相对含水量略高于野生型毛白杨(图10D)。以上结果表明，超表达NsNHX1不仅提高转基因毛白杨对盐胁迫的耐受性，而且促进了其生长。
[0176] 由于盐胁迫会对植物造成氧化胁迫，使植物体内产生活性氧，因此，为了确定盐胁迫条件下NsNHX1在毛白杨抗氧化系统中是否发挥功能，还检测了野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶片中的SOD、POD、CAT的活性，脯氨酸和丙二醛的含量。
[0177] 结果如图10所示。结果表明：在盐胁迫条件下，三个转NsNHX1毛白杨株系的SOD、POD和CAT活性均显著升高，且显著大于野生型毛白杨(图10E、F、G)；在盐胁迫条件下，野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨的脯氨酸含量均显著升高，转NsNHX1毛白杨株系N1和N3的脯氨酸含量显著高于野生型毛白杨和N2(图10H)；野生型毛白杨和转NsNHX1毛白杨叶片中的MDA含量在盐胁迫下显著升高，但野生型毛白杨叶片中的MDA含量显著高于转NsNHX1毛白杨株系(图10I)。以上结果表明，NsNHX1的超表达能够提高转基因毛白杨抗氧化酶的活性，增加脯氨酸的含量，减少活性氧的积累，降低生物膜的损伤，进而提高转基因毛白杨的抗氧化能力。
[0178] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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