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一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及其应用

阅读：419发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及应用。通过PCR扩增技术提取并扩增Hsp20蛋白基因，将目的基因扩增产物用于构建重组蛋白表达载体，并转化到宿主菌中，高效表达了酒酒球菌Hsp20蛋白基因。所述的Hsp20蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了Hsp20蛋白基因在不同胁迫条件下的应用，可有效提高宿主微生物在逆境下的生存能力。，下面是一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种热休克蛋白Hsp20，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.一种如权利要求1中所述热休克蛋白Hsp20，其特征在于，Hsp20的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。
3.一种如权利要求1或2中所述热休克蛋白Hsp20的基因克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用基因组DNA提取试剂盒从酒酒球菌中提取出总DNA；
(2)以提取的总DNA为模板，利用设计的克隆引物和表达引物，通过PCR扩增得到Hsp20蛋白基因片段；
所述PCR反应条件：①95℃预变性3min，②95℃变性15s，③50℃退火30s，④72℃延伸
30s，⑤重复35个循环，⑥72℃延伸5min⑦降温至4℃；
上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCAAATGAATTAATGGA-3’
下游引物：5’-CCGCTCGAGTTGGATTTCAATATGATGAGT-3’
(3)将克隆产物利用EcoRI，XhoI酶切后插入质粒载体中构建重组蛋白表达载体。
4.根据权利要求3中所述的一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆方法，其特征在于：所述酒酒球菌的菌株为酒酒球菌SD-2a。
5.一种重组蛋白表达载体，其特征在于，重组质粒中包含权利要求2中所述的Hsp20蛋白基因。
6.根据权利要求5中所述的一种重组蛋白表达载体，其特征在于：所述重组质粒为pTriEx-hsp20质粒。
7.一种热休克蛋白Hsp20的制备方法，其特征在于：包括权利要求6中所述重组蛋白表达载体的转化、重组Hsp20基因的表达及重组Hsp20蛋白的纯化，具体步骤如下：
(1)重组蛋白表达载体的转化：将重组质粒1μl加入100μl感受态宿主菌中，置冰上
20min，在42℃热激90s，迅速置冰中5min，加入600μlLB培养液，在37℃和220r/min下振摇
1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜；
所述的LB液体培养基由800mL蒸馏水、10g蛋白胨、5g 酵母浸粉、10gNaCl、10MNaOH、蒸馏水配制而成；所述的LB固体培养基是在LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉；
(2)重组载体的表达：挑取转化平板上的单克隆菌落接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃，220r/min振摇过夜；次日按体积比1:100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃，220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃，220r/min振摇4h，诱导重组蛋白表达，所述的IPTG由单蒸水，2gIPTG配制而成；
(3)蛋白的纯化：通过Ni柱亲和层析纯化蛋白，利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱，用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线，用Ni-IDA Washing-Buffer以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，5％glycerol，pH8.0进行透析过夜，然后进行12％SDS-PAGE分析；
所述的Ni-IDA Washing-Buffer含20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，DA Elution-Buffer含20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15mM NaCl。
8.根据权利要求7中所述的一种热休克蛋白Hsp20的制备方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌BL21菌株。
9.一种如权利要求1所述的重组Hsp20蛋白的基因应用于在不同胁迫条件下提高宿主菌环境耐受性。

说明书全文

一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程克隆蛋白质领域，特别涉及一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 微生物在培养过程及保存中，只有在适宜的外界条件和适当的营养物质下，微生物才能正常生长。如果外界条件不适宜，会受到底物不足、冷热、酸碱、渗透压等因素的影响，这些因素会抑制微生物生长甚至引起死亡，菌株的生长会受到影响，而且还会抑制或减少代谢产物的生产。酸胁迫，高温胁迫、氧胁迫等是常见的微生物细胞所面临的胁迫，提高微生物的胁迫抗性，将有利于微生物在逆境环境下生存，保护细胞的正常生命活动。

[0003] 酒酒球菌在冷冻干燥环境中，诱导了热休克Hsp20蛋白的表达，使得菌体对冷冻干燥有了抗性，并且Hsp20蛋白的表达量更高，差异表达最明显，酒酒球菌抗冷冻干燥的能力越强。酒酒球菌中的Hsp20蛋白基因，可以增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞正常的代谢功能，与生物在逆境下的生存能力关系密切。因此，可以利用转基因技术将酒酒球菌中Hsp20蛋白基因转入其他菌株中表达，提高该菌体的抗冷冻干燥能力和对不利环境的耐受性。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题：将酒酒球菌中Hsp20蛋白基因克隆并构建表达载体，表达载体转入其他宿主菌菌株中表达Hsp20蛋白，以提高该重组菌株对不同胁迫条件的抗性能力。同时可在宿主菌对Hsp20蛋白表达后纯化提取Hsp20蛋白。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

[0006] 一种热休克蛋白Hsp20，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

[0007] 上述热休克蛋白Hsp20的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

[0008] 一种上述热休克蛋白Hsp20的基因克隆方法，包括如下步骤：

[0009] (1)利用基因组DNA提取试剂盒从酒酒球菌中提取出总DNA；

[0010] (2)以提取的总DNA为模板，利用设计的克隆引物和表达引物，通过PCR扩增得到Hsp20蛋白基因片段；

[0011] 所述PCR反应条件：①95℃预变性3min，②95℃变性15s，③50℃退火30s，④72℃延伸30s，⑤重复35个循环，⑥72℃延伸5min⑦降温至4℃；

[0012] 上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCAAATGAATTAATGGA-3’

[0013] 下游引物：5’-CCGCTCGAGTTGGATTTCAATATGATGAGT-3’

[0014] (3)将克隆产物利用EcoRI，XhoI酶切后插入质粒载体中构建重组蛋白表达载体。

[0015] 优选地，所述酒酒球菌的菌株为酒酒球菌SD-2a。

[0016] 一种重组蛋白表达载体，重组质粒中包含上述的Hsp20蛋白基因。

[0017] 优选地，所述重组质粒为pTriEx-hsp20质粒。

[0018] 一种热休克蛋白Hsp20的制备方法，包括上述重组蛋白表达载体的转化、重组Hsp20基因的表达及重组Hsp20蛋白的纯化，具体步骤如下：

[0019] (1)重组蛋白表达载体的转化：将重组质粒1μl加入100μL感受态宿主菌中，置冰上20min，在42℃热激90s，迅速置冰中5min，加入600μlLB培养液，在37℃和220r/min下振摇
1h，离心后全部涂布于含50μg/mlAmp的LB平板，37℃倒置培养过夜；

[0020] 所述的LB液体培养基由800mL蒸馏水、10g蛋白胨、5g 酵母浸粉、10gNaCl、10MNaOH、蒸馏水配制而成；所述的LB固体培养基是在LB液体培养基中加入1.5％琼脂粉；

[0021] (2)重组载体的表达：挑取转化平板上的单克隆菌落接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃，220r/min振摇过夜；次日按体积比1:100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃，220r/min振摇至菌体OD600为0.6～0.8；取出1ml培养物，10000r/min室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃，220r/min振摇4h，诱导重组蛋白表达，所述的IPTG由单蒸水，
2gIPTG配制而成；

[0022] (3)蛋白的纯化：通过Ni柱亲和层析纯化蛋白，利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDABinding-Buffer预平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B亲和层析柱，用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线，用Ni-IDA Washing-Buffer以1ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，5％glycerol，pH8.0进行透析过夜，然后进行12％SDS-PAGE分析；

[0023] 所述的Ni-IDA Washing-Buffer含20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，DA Elution-Buffer含20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15mM NaCl。

[0024] 优选地，所述宿主菌为大肠杆菌BL21菌株。

[0025] 一种上述的重组Hsp20蛋白的基因应用于在不同胁迫条件下提高宿主菌环境耐受性。

[0026] 本发明获得的有益效果：

[0027] 本发明通过克隆酒酒球菌中的Hsp20蛋白基因，构建pTriEx-hsp20表达载体，转化到大肠杆菌中，用IPTG诱导pTriEx-hsp20载体融合蛋白表达，再用Ni柱亲和层析纯化蛋白，Hsp20蛋白基因在大肠杆菌中高效表达。本发明获得的基因工程重组菌在不同的胁迫条件下抗性增加，本发明具有目的蛋白产率高，容易纯化，能够提高微生物在逆境下的生存能力的优点。附图说明

[0028] 图1为酒酒球菌Hsp20蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列；

[0029] 图2为目的蛋白SDS-PAGE电泳结果图；

[0030] 图3为重组Hsp20蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果图；

[0031] 图4为大肠杆菌在最适温度和高温下的生长曲线图；

[0032] 图5为大肠杆菌在不同pH下的生长曲线图；

[0033] 图6为大肠杆菌在不同浓度氧化冲击试验的生长曲线图；

[0034] 图7为大肠杆菌在不同盐离子浓度下的生长曲线图。

具体实施方式

[0035] 下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

[0036] 实施例1：酒酒球菌热休克蛋白Hsp20基因的克隆：

[0037] (1)利用基因组DNA提取试剂盒从酒酒球菌中提取出总DNA；所述酒酒球菌为经过反复冷冻干燥保存菌种的SD-2a菌株。

[0038] (2)以提取的总DNA为模版，利用设计的克隆引物和表达引物，通过PCR扩增得到Hsp20蛋白基因片段。反应条件：：①95℃预变性3min，②95℃变性15s，③50℃退火30s，④72℃延伸30s，⑤重复35个循环，⑥72℃延伸5min⑦降温至4℃。

[0039] 上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCAAATGAATTAATGGA-3’

[0040] 下游引物：5’-CCGCTCGAGTTGGATTTCAATATGATGAGT-3’

[0041] (3)将克隆产物和pTriEx-hsp20质粒(即空载体)利用限制性内切酶EcoRI，XhoI分别酶切后采用T4 DNA连接酶酶连，酶连时质粒和克隆产物的摩尔比为5:1，酶连反应总体积20μL，基因克隆片段插入质粒载体后获得构建重组蛋白表达载体。将重组质粒测序后可知目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

[0042] 实施例2：热休克蛋白Hsp20基因的表达及纯化

[0043] (1)将构建好的重组蛋白表达载体1μl加入100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌中，置冰上20min；42℃热激90sec，迅速置冰中5min；加入600μl LB培养液；37℃，220r/min振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。

[0044] (2)挑取转化平板上的单克隆菌落接种于含50μg/ml Amp的3ml LB培养液的试管中，37℃220r/min振摇过夜；次日按1:100接种于50μg/ml Amp的30ml LB培养液中，37℃220r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8；取出1ml培养物，10000r/mim室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220r/min振摇4h，诱导融合蛋白表达。

[0045] (3)通过Ni柱亲和层析纯化蛋白，利用低压层析系统，上清溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱，用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线，用Ni-IDA Washing-Buffer以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液，上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，5％glycerol，pH8.0进行透析过夜，然后进行12％SDS-PAGE分析。所述的Ni-IDA Washing-Buffer含20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，DA Elution-Buffer含20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15mM NaCl。经过Ni柱和SDS-PAGE分析(图2和图3)，Hsp20蛋白得到高效表达，且纯度较高。酒酒球菌Hsp20蛋白质氨基酸序列测定结果见SEQ ID NO.1。

[0046] 酒酒球菌Hsp20蛋白基因在宿主菌中表达后在不同胁迫条件下提高宿主菌环境耐受性，具体实验操作如下：

[0047] 实施例3：重组Hsp20蛋白对温度的抗性测试分析

[0048] 挑取转入重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)/Ctrl及BL21(DE3)/HSP20菌落，接种到LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养12h，含质粒菌株培养基中添加卡那霉素。将活化的菌株培养液以2％浓度转接到新的LB培养基中，37℃，220r/min，振荡培养24h。在波长为600nm的条件下，测定菌液的OD600值。对照的温度为37℃，温度梯度42℃胁迫30min，42℃胁迫60min；温度梯度52℃胁迫30min，52℃胁迫60min。重组的大肠杆菌对高温的适应性明显高于对照菌株，对温度有较高的抗性。

[0049] 实施例4：重组蛋白对pH的抗性测试分析

[0050] 在实施例3的步骤上，设置了pH梯度为2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。对两组大肠杆菌在不同pH的结果表明，重组大肠杆菌对高温的适应性明显高于对照菌株。

[0051] 实施例5：重组蛋白对氧化冲击试验的抗性测试分析

[0052] 在实施例3的步骤上，设置了0.1％H2O2胁迫5min，0.1％H2O2胁迫10min，0.2％H2O2胁迫5min，0.2％H2O2胁迫10min，对两组大肠杆菌在不同浓度氧化冲击试验的结果表明，重组大肠杆菌对H2O2的适应性明显高于对照菌株。

[0053] 实施例6：重组蛋白对盐离子胁迫的抗性测试分析

[0054] 在实施例3的步骤上，设置了NaCl浓度梯度为172mM，430mM，860mM，对两组大肠杆菌在盐离子胁迫试验的结果表明，重组大肠杆菌对盐离子明显高于对照菌株。

[0055] 综上所述，本发明通过克隆酒酒球菌中的Hsp20蛋白基因，构建pTriEx-hsp20表达载体，转化到大肠杆菌中，用IPTG诱导pTriEx-hsp20载体融合蛋白表达，再用Ni柱亲和层析纯化蛋白，Hsp20蛋白基因在大肠杆菌中高效表达。本发明获得的基因工程重组菌在不同的胁迫条件下抗性增加，本发明具有目的蛋白产率高，容易纯化，能够提高微生物在逆境下的生存能力的优点。

[0056] 以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

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