具有黄瓜叶脉黄化病毒（CVYV）抗性的西瓜植物
阅读：510发布：2020-05-16
专利汇可以提供具有黄瓜叶脉黄化病毒（CVYV）抗性的西瓜植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 涉及 植物 育种的领域，特别是西瓜育种。提供了CVYV抗性西瓜植物(以及可从其生长出这些植物的 种子 )。还提供了CVYV抗性的QTL(cyv_3.1)，以及用于筛选存在所述QTL的植物的标记物和方法。，下面是具有黄瓜叶脉黄化病毒（CVYV）抗性的西瓜植物专利的具体信息内容。
1.物种普通栽培西瓜(Citrullus lanatus ssp.vulgaris)的二倍体栽培西瓜植物，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座并且其中所述基因渗入片段包含选自以下的标记物：
a)在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤；和
b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(SNP_03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶；和
c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、
2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
2.权利要求1的植物，其中所述基因渗入片段是包含起始于3号染色体的2.50Mb且终止于3号染色体的12.80Mb的区域的片段，或其部分，其中所述部分的大小为至少5kb。
3.权利要求1或2的植物，其中所述植物产生白利糖度为至少7.0的果实。
4.前述权利要求中任一项的植物，其中所述植物对于所述基因渗入片段而言是纯合的，并且所述植物为CVYV抗性的且任选地ZYMV抗性的。
5.通过加倍前述权利要求中任一项的植物的染色体而制备的四倍体西瓜植物。
6.权利要求5的四倍体西瓜植物，其中所述植物是近交株系。
7.通过用权利要求4的二倍体西瓜植物的花粉对权利要求5或6的的四倍体植物授粉而制备的三倍体西瓜种子。
8.权利要求7的种子生长出的三倍体植物。
9.可生长出权利要求1至6中任一项的植物的种子。
10.权利要求1至6或8中任一项的植物的营养繁殖体。
11.权利要求1至6或8中任一项的植物的细胞或组织培养物，其中所述细胞或组织包含所述基因渗入片段。
12.权利要求11的细胞或组织培养物，包含来自植物部位的细胞或原生质体或植物组织，所述植物部位选自：接穗、果实、胚、分生组织、子叶、花粉、胚珠、叶、花药、根、根尖、雌蕊、花、种子、茎。
13.权利要求1至10中任一项的植物的植物部位，其中所述部位选自接穗、果实、花粉、胚珠、茎、子叶、叶、细胞、胚、分生组织、花药、根、根尖、雌蕊、花、种子，其中所述植物部位的细胞包含所述基因渗入片段。
14.从权利要求11的细胞或组织培养物再生的西瓜植物。
15.用于筛选西瓜种子、植物或植物部位或来自所述种子、植物或植物部位的DNA中3号染色体上连锁至CVYV抗性的一种或多种标记物的存在的方法，所述方法包括确定以下标记物的存在：
a)在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤；和/或
b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(SNP_03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶；和/或
c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、
2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
16.用于产生三倍体杂种西瓜种子的方法，其中从所述种子生长出的植物具有CVYV抗性，所述方法包括：
a)提供权利要求1至4中任一项的二倍体西瓜植物和权利要求5或6的四倍体植物，
b)允许用所述二倍体植物的花粉对所述四倍体植物的花进行授粉，和
c)采收所述四倍体植物的果实中产生的种子。
17.用于无籽三倍体西瓜果实产生的方法，所述方法包括：
a)套种权利要求7或8的三倍体杂种种子或三倍体杂种植物与二倍体授粉植物，以及任选地
b)采收在a)的三倍体植物上产生的无籽西瓜果实。
具有黄瓜叶脉黄化病毒(CVYV)抗性的西瓜植物
技术领域
[0001] 本发明涉及植物育种和植物改良的领域。本发明提供了黄瓜叶脉黄化病毒(CVYV)抗性的西瓜植物以及与CVYV抗性基因座紧密连锁的SNP(单核苷酸多态性)标记物。这些标记物可用于选择这样的西瓜植物或植物部位，即其包含CVYV抗性基因座并且当所述抗性基因座在二倍体植物中是纯合形式时，或在三倍体或四倍体中分别为三拷贝或四拷贝时为CVYV抗性的。所述标记物也可用于区分包含CVYV抗性基因座的植物(或植物部位)与缺少CVYV抗性基因座的植物(或植物部位)。CVYV抗性基因座是单隐性基因座。所述基因座位于西瓜基因组的3号染色体上。在相同的染色体上，Ling等人(Cucurbitaceae 2008,Proceedings of the IXth Eucarpia Meeting，5月21日至24日)报道了eIF4E基因中连锁到ZYMV(西葫芦黄花叶病毒)抗性(由被称为zym的隐性基因赋予)的标记物。包含赋予CVYV抗性的来自野生西瓜的纯合型基因渗入的本发明的栽培西瓜植物不包含ZYMV抗性并且不包含Ling et al.2008(上文)所报道的eIF4E基因中的标记物。因此，可单独地使用本发明的CVYV抗性基因座，或可任选地将其与ZYMV抗性(隐性zym基因)结合以产生双抗性植物。在3号染色体上包含基因渗入片段的本发明的西瓜植物为普通栽培西瓜(C.lanatus
ssp.vulgaris)的栽培植物，其产生可市售的果实，该果实的白利糖度为至少8.0或9.0，优选至少10.0，或至少11.0。因此，所述植物或植物部位包含栽培西瓜(普通栽培西瓜)的基因组，其在3号染色体上包含野生西瓜(物种羊齿西瓜(C.lanatus ssp.lanatus)的植物或物种粘籽西瓜(C.lanatus ssp.mucosospermus)的植物)的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含CVYV抗性基因座。通过紧密连锁的标记物，即通过本文提供的一种或多种SNP标记物的SNP基因型(或SNP单体型)，可在细胞、植物、植物部位或其DNA中鉴定CVYV基因座和/或基因渗入片段。
ssp.vulgaris)的栽培植物，其产生可市售的果实，该果实的白利糖度为至少8.0或9.0，优选至少10.0，或至少11.0。因此，所述植物或植物部位包含栽培西瓜(普通栽培西瓜)的基因组，其在3号染色体上包含野生西瓜(物种羊齿西瓜(C.lanatus ssp.lanatus)的植物或物种粘籽西瓜(C.lanatus ssp.mucosospermus)的植物)的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含CVYV抗性基因座。通过紧密连锁的标记物，即通过本文提供的一种或多种SNP标记物的SNP基因型(或SNP单体型)，可在细胞、植物、植物部位或其DNA中鉴定CVYV基因座和/或基因渗入片段。
背景技术
[0002] CVYV是在瓜类(例如黄瓜、甜瓜、西瓜和西葫芦)中引起严重损伤的马铃薯Y病毒(potyvirus)(马铃薯Y病毒科)。该病毒可机械传播以及通过CVYV的天然载体(其为粉虱烟粉虱(Bemisia tabaci))传播。粉虱载体烟粉虱在许多世界上的主要西瓜种植区是地方性的。CVYV感染田间以及塑料大棚中的作物。
[0003] 已在甜瓜和黄瓜中鉴定了针对CVYV的抗性，但是尚未在西瓜中鉴定。例如，WO2010/025747记载了在源自地方品种Cuc6491的甜瓜中针对CVYV的抗性QTL。WO2011003440记载了黄瓜中的CVYV抗性。
[0004] 西瓜中CVYV的症状有时是轻度叶萎黄病，但是通常外部症状不显著或未表现。仅当发现果实发生了从外部看不见的内部坏死时才见到CVYV感染，但是所述内部坏死使果实不适于食用。
[0005] 可通过逆转录酶PCR(RT-PCR)和通过核酸杂交(例如2007 OEPP/EPPO Bulletin 37,pp554-559，题为“Cucumber vein yellowing virus(Ipomovirus)”)来鉴定CVYV。该文件也记载了向测试植物的机械和粉虱传播以鉴定CVYV。
[0006] 本发明的一个目的是提供包含3号染色体上的抗性基因座的栽培西瓜植物普通栽培西瓜和这类植物的部位，所述抗性基因座当在二倍体植物中为纯合形式时或当在三倍体或四倍体植物中分别为三拷贝或四拷贝时赋予针对CVYV的抗性。该基因座是在羊齿西瓜和粘籽西瓜的两种不同的野生种质(accession)中鉴定的数量形状基因座(QTL)，所述野生种质具有苦味且白利糖度非常低(例如白利糖度为3.0或更低)的白色果肉或黄色果肉的果实，并且该基因座被基因渗入到栽培西瓜(普通栽培西瓜)中，其具有可市售的果实，即白利糖度至少8.0或9.0或优选至少10.0、11.0或更高的良好品质的果实。这种赋予CVYV抗性的QTL在本文中被称为cyv_3.1。
[0007] 包含一个、两个、三个或四个拷贝的cyv_3.1的栽培西瓜植物包括包含cyv_3.1的二倍体植物或双单倍体植物、四倍体植物和三倍体植物(例如产生无籽果实的三倍体杂种植物)，以及从其中可生长出这些植物的种子，以及任何植物部位(果实、果实部位、根状茎、接穗、细胞、花粉、花药、胚珠、茎、叶、子叶、下胚轴、花、体外细胞或组织培养物、体外繁殖物等)。
[0008] 本发明的目的还为提供与赋予CVYV抗性的QTL cyv_3.1紧密连锁的分子标记物以及一种或多种这类分子标记物在以下过程中的用途：a)培育包含一个拷贝(例如二倍体中的杂合型)、两个拷贝(例如二倍体和双单倍体植物中的纯合型)、三个拷贝(三倍体中)或四个拷贝(四倍体中)的cyv_3.1的栽培西瓜植物；和/或b)筛选植物、植物部位、细胞或基因组DNA中一种或多种这些分子标记物的存在，从而筛选cyv_3.1的存在。这样的育种方法和筛选方法包含于本文中。
[0009] 一般性定义
[0010] 动词“包括”及其变化形式以其非限制意义使用，意指包括该词之后的项，但是不排除未具体提及的项。此外，通过不定冠词“一”或“一个”提及一个要素时不排除多存在于一个要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个所述要素。不定冠词“一”或“一个”因此通常意指“至少一个”，例如“一株植物”也指若干细胞植物等。类似地，“一个果实”或“一株植物”也指多个果实和多株植物。
[0011] 本文使用的术语“植物”包括完整的植物或其任何部分或衍生物，优选地具有与从中获得其的植物相同的遗传组成，例如植物器官(如采收的或未采收的果实、叶、花、花药等)、植物细胞、植物原生质体、可由其再生出完整植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物细胞团、植物移植体、幼苗、植物中完整的植物细胞、植物克隆或微繁殖体，或植物的部分，例如植物扦插、胚、花粉、花药、胚珠、果实(例如采收的组织或器官)、花、叶、种子、无性繁殖的植物、根、茎、根尖、嫁接物(接穗和/或根状茎)等。还包括任何发育阶段，例如生根之前或之后的幼苗、扦插等。当提及“植物的种子”时，这些指的是在自体授精或异体受精后可由其生长出的植物的种子或在植物上产生的种子。
[0012] 本文使用的术语“品种”或“栽培种”是指在已知最低等级的单一植物分类群中的一组植物，其可以通过源自给定基因型或基因型组合的特征的表达来定义。
[0013] 术语“等位基因”意指特定基因座处基因的一种或多种替代形式中的任一种，所有这些等位基因均与特定基因座处的一种性状或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或单个基因座(多个基因座)处。一个等位基因存在于一对同源染色体中的每条染色体上。二倍体植物物种可以在特定基因座上包含大量不同的等位基因。这些可以是所述基因的相同等位基因(纯合的)或两个不同的等位基因(杂合的)。
[0014] “F1、F2、F3等”是指两个亲本植物或亲本株系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或株系杂交产生的种子生长出的植物称为F1代。F1植物自交产生F2代等。
[0015] “F1杂种”植物(或F1杂种种子)是由两个近交的亲本株系杂交得到的世代。因此，F1杂种种子是由其生长出F1杂种植物的种子。由于杂种优势，F1杂种更有活力且具有更高的产量。近交系在基因组中大多数基因座处上是基本纯合的。
[0016] “植物株系”或“育种株系”是指植物及其后代。本文使用的术语“近交株系”是指已经被反复自交且几乎为纯合的植物株系。因此“近交株系”或“亲本株系”是指已经历过几代(例如至少5、6、7或更多代)近交的植物，产生具有高度均一性的植物株系。
[0017] 术语“基因”意指包含在细胞中被转录为信使RNA分子(mRNA)的区域(转录区)和可操作地连接的调控区域(例如启动子)的(基因组)DNA序列。因此，基因的不同等位基因是基因的不同替代形式，其可以是这样的形式：例如在基因组DNA序列(例如启动子序列、外显子序列、内含子序列等)的一个或多个核苷酸、mRNA和/或所编码的蛋白的氨基酸序列中的差异。
[0018] 术语“基因座”(多个基因座)意指染色体上的存在例如QTL、基因或遗传标记物的一个或多个具体位置或位点。因此，CVYV基因座(或赋予CVYV抗性的基因座)为西瓜基因组中的位置，其中存在被称为cyv_3.1的QTL。cyv_3.1基因座被渐渗到栽培西瓜3号染色体中(使用http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi的“西瓜：基因组”、“西瓜基因组(97103)-版本1”下出现的公开的西瓜基因组的染色体分配，以及如Guo S,Zhang J,Sun H,Salse J,Lucas W,Zhang H,Zheng Y,Mao L,Ren Y,Wang Z(2013)“The draft genome of watermelon(Citrullus lanatus)and resequencing of 20 diverse accessions”(Nature Genetics 45:51-58)所述)，即将cyv_3.1从野生西瓜渐渗到栽培西瓜基因组中(即到3号染色体上)。
[0019] “数量性状基因座”或“QTL”是编码影响连续分布(数量)表型的表现度的一个或多个等位基因的染色体基因座。在本文中，将赋予CVYV抗性的数量性状基因座(或“CVYV QTL”)命名为cyv_3.1。
[0020] “二倍体植物”指具有两套染色体(在本文中称为2n)的植物、营养植物部位或可从其生长出二倍体植物的种子。
[0021] “DH植物”或“双单倍体植物”是通过使用例如体外技术来使二倍体植物的单倍体基因组加倍而产生的二倍体植物。因此，DH植物在全部基因座上是纯合的。
[0022] “三倍体植物”指具有三套染色体(在本文中称为3n)的植物、营养植物部位或可从其生长出三倍体植物的种子。
[0023] “四倍体植物”指具有四套染色体(在本文中称为4n)的植物、营养植物部位或可从其生长出四倍体植物的种子。
[0024] “授粉植物”或“授粉者”指适用于作为在三倍体植物上诱导座果的授粉者的(近交或杂种)二倍体植物或其部位(例如其花粉或接穗)。因此，授粉植物能够通过在适合的日间和在适合的时期内产生适合量的花粉而实现三倍体植物的良好的座果(和良好的三倍体果实产量)。
[0025] “杂合三倍体植物”或“F1三倍体”或“三倍体杂种”是由交叉授粉雄性二倍体亲本与雌性四倍体亲本而获得的杂合三倍体种子生长出的三倍体植物。雄性亲本(授粉植物)用于在四倍体雌性亲本上诱导座果和种子产生，产生包含F1杂合三倍体种子。将用于产生F1三倍体种子的雄性亲本和雌性亲本近交，从而使得每个亲本系几乎均是纯合并且稳定的。
[0026] “无籽果实”是在授粉植物诱导座果之后在三倍体植物上产生的三倍体果实，该果实不包含成熟的种子。所述果实可包含一个或多个小的可食用白色胚珠。
[0027] “套种(interplanting)”指在同一田间播种或移植的两种或多种类型的种子和/或移植物的组合，尤其是在三倍体杂种植物的同一田间播种和/或移植授粉者(用于三倍体植物上的无籽果实产生和授粉植物上的二倍体果实产生)。例如，可将授粉者种植在单独的行中或与三倍体植物套种在相同的行中(例如在每行内的斜坡(hill)中)。还可将授粉者种植在三倍体的行之间。也可在播种之前混合授粉植物的种子和三倍体杂种的种子，产生随机播种。三倍体杂种植物和/或授粉植物的移植物也可包含不同植物的根茎。适合的根茎是本领域已知的。具有不同根茎的西瓜植物被称为“接枝的”。
[0028] “种植”或“种植的”指通过机器或手工播种(直接播种)或移植幼苗(小植株)到田间。
[0029] “无性繁殖”或“克隆繁殖”指例如通过体外繁殖或嫁接方法(使用接穗)从营养组织繁殖植物。体外繁殖包括体外细胞或组织培养以及从体外培养物再生整株植物。嫁接包括通过嫁接到根茎上进行的原始植物的繁殖。因此，可通过体外培养或嫁接来产生原始植物的克隆(即遗传上相同的营养繁殖)。“细胞培养”或“组织培养”指植物的细胞或组织的体外培养。“再生”指从细胞培养或组织培养的植物发育或营养繁殖。“非繁殖细胞”指无法再生成整株植物的细胞。
[0030] “隐性的”当没有显性等位基因存在于基因组中时表达其表型(例如CVYV抗性)的等位基因。本发明的cyv_3.1当以两个拷贝存在于二倍体植物中、以四个拷贝存在于四倍体植物中或以三个拷贝存在于三倍体植物中时产生CVYV抗性植物，从而显性等位基因不存在于这些植物中。所述显性等位基因在本文中被称为野生型(WT)等位基因，其存在于缺少cyv_3.1基因渗入的植物中。
[0031] “栽培的西瓜”在本文中指普通栽培西瓜，并且具有良好的农学特征，特别是产生具有良好果实品质和果实均一性的可市售果实。
[0032] “野生西瓜”在本文中指产生具有较差品质和较差均一性的果实的羊齿西瓜和粘籽西瓜。
[0033] “SNP标记物”指栽培西瓜和野生西瓜之间的单核苷酸多态性，并且本文提供的SNP标记物紧密连锁至CVYV抗性野生西瓜种质中存在的cyv_3.1。SNP_02在3号染色体的核苷酸7.664.093处包括‘G’(鸟嘌呤)而非‘A’(腺嘌呤)，SNP_03在3号染色体的核苷酸7.693.225处包括‘C’(胞嘧啶)而非‘T’(胸腺嘧啶)。术语“SNP基因型”指存在于特定SNP处的核苷酸。
当提及“抗性基因型”或“CVYV基因型”或“cyv_3.1基因型”时，指的是CVYV抗性野生种质的核苷酸。因此，SNP_02的“抗性基因型”是3号染色体的核苷酸7.664.093处的‘G’(鸟嘌呤)，SNP_03的“抗性基因型”是3号染色体的核苷酸7.693.225处的‘C’(胞嘧啶)。其他(替代的)核苷酸指缺少所述基因渗入的栽培西瓜中存在的核苷酸，并且可被称为WT基因型或易感基因型。
当提及“抗性基因型”或“CVYV基因型”或“cyv_3.1基因型”时，指的是CVYV抗性野生种质的核苷酸。因此，SNP_02的“抗性基因型”是3号染色体的核苷酸7.664.093处的‘G’(鸟嘌呤)，SNP_03的“抗性基因型”是3号染色体的核苷酸7.693.225处的‘C’(胞嘧啶)。其他(替代的)核苷酸指缺少所述基因渗入的栽培西瓜中存在的核苷酸，并且可被称为WT基因型或易感基因型。
[0034] 术语“SNP单体型”指若干SNP位置处存在的核苷酸。当提及“CVYV单体型”、“抗性单体型”或“cyv_3.1单体型”时，指的是连锁至cyv_3.1的若干SNP标记物的SNP基因型。例如，SNP_01、SNP_02和SNP_03的单体型A分别包含核苷酸G-G-C。SNP_01、SNP_02和SNP_03的单体型B分别包含核苷酸A-G-C。
[0035] “栽培西瓜基因组”和“栽培西瓜基因组上的物理位置”和“3号染色体”指栽培西瓜的物理基因组(万维网http://www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi的“西瓜：基因组”、“西瓜基因组(97103)-版本1”下)和物理染色体和所述染色体上的物理位置。因此，例如SNP_01位于物理定位在3号染色体的核苷酸7.586.752处的核苷酸(或碱基)处，SNP_02位于物理定位在3号染色体的核苷酸7.664.093处的核苷酸(或碱基)处，SNP_03位于物理定位在3号染色体的核苷酸7.693.225处的核苷酸(或碱基)处。3号染色体的物理大小为0至28.9Mb。
[0036] “基因渗入片段”或“基因渗入区段”或“基因渗入区域”是指已通过杂交或传统育种技术(例如回交)被引入相同或近缘物种的另一个植株中的染色体片段(或染色体部分或区域)，即基因渗入片段是用动词“渐渗”表示的育种方法(例如回交)的结果。在西瓜中，野生西瓜种质可用于将野生基因组的片段渐渗到栽培西瓜的基因组中。因此这类栽培西瓜植物具有“栽培的普通栽培西瓜的基因组”，但在基因组中包含了野生西瓜的片段，例如来自羊齿西瓜或粘籽西瓜的基因渗入片段。因此，例如，本文提供了包含栽培西瓜的基因组的栽培西瓜，并且在该基因组的3号染色体上包含来自野生西瓜的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的QTL(在本文中被称为cyv_3.1)。应理解术语“基因渗入片段”从不包括整条染色体，而仅包括染色体的一部分。所述基因渗入片段可以是大的，例如甚至是染色体的四分之三或一半，但优选地较小，例如约15Mb或更小，例如约10Mb或更小，约9Mb或更小，约8Mb或更小，约7Mb或更小，约6Mb或更小，约5Mb或更小，约4Mb或更小，约3Mb或更小，约2.5Mb或2Mb或更小，约1Mb(等于1,000,000个碱基对)或更小，或约0.5Mb(等于500,000个碱基对)或更小，例如约200,000bp(等于200个千碱基对)或更小，约100,000bp(100kb)或更小，约50,000bp(50kb)或更小，约30,000bp(30kb)或更小。
[0037] 在本文中，包含基因渗入片段(其包含赋予CVYV抗性的QTL cyv_3.1)的栽培西瓜的3号染色体也称为“重组3号染色体”。
[0038] “CVYV抗性”是指与易感的对照植物(例如易感品种Sugar Baby)相比，在成体叶上(还优选地在果实中)缺少CVYV症状或统计学上显著更少的症状。例如，可使用CVYV抗性测定或者在发生天然CVYV感染的生长区的田间或大棚中来评估CVYV抗性。可使用多种CVYV抗性测定，例如实施例中所述的，但是通常CVYV抗性测定可例如包括：多个幼苗的第一展开真叶的人工接种，任选地在例如四天或五天之后进行所述叶的第二次接种，在适当的条件下孵育幼苗和对照植物并持续适当的时段，接种后(例如，接种后20天、30天、40天、50天、60天)评估病毒症状一次或多次。对于成功的试验而言，易感对照植物应当具有严重症状。优选地，在每个重复中包括每种基因型的10、11、12、13、14或更多株植物，并且优选地进行若干个重复。在一方面，当测试抗性时，如果株系或品种的植物中70％、80％、90％或100％未显示出症状，则认为该株系或品种具有抗性，而易感对照株系或品种中至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的植物显示出症状。
[0039] “白利糖度”或“°白利糖度”指使用折射计在若干成熟果实上测量的平均总可溶性固体含量。优选地计算至少3个果实的平均值，每个在切开果实的中心和外皮之间进行测量。
[0040] 与果实品质相关的“可市售的”意指西瓜果实适于被出售用于新鲜食用，具有良好的气味(没有不新鲜的气味)，白利糖度至少9.0，优选地至少10.0或至少11.0，并且优选地还具有均一的果肉颜色，例如白色(例如品种Cream of Saskatchewan)、黄色(例如品种Yamato Cream 1)、橙色(例如品种Tendersweet)、粉色(例如品种Sadul)、粉红色(例如品种Crimson Sweet)、红色(例如品种Sugar Baby)或暗红色(例如品种Dixie Lee)。
[0041] “均一的果肉颜色”意指当从中间(中切面)切开时整个成熟果实的颜色均匀地分布在整个果实果肉中，即没有斑块。因此，红色果实在整个果实果肉中是红色并且不包含红色斑块。具有均一红色的果实的实例为二倍体品种Premium F1(Nunhems)。
[0042] 在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“物理距离”为实际距离，其用碱基或碱基对(bp)，千碱基或千碱基对(kb)或者兆碱基或兆碱基对(Mb)表示。
[0043] 通过交换频率或重组频率(RF)测量在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“遗传距离”，并且用厘摩(cM)表示。1cM相当于约1％的重组频率。如果没有发现重组体，则RF为零并且所述基因座在物理上非常紧密地在一起或它们是相同的。两个基因座的相距越远，RF越高。
[0044] “均一性”或“均一”涉及植物株系或品种的遗传和表型特征。由于近交株系是通过几代近交而产生，因此其在遗传上是高度均一的。同样地，由这种近交株系产生的F1杂种和三倍体杂种在其基因型和表型的特征和表现上也是高度均一的。
[0045] 术语“CVYV等位基因”或“CVYV抗性等位基因”指存在于基因座cyv_3.1上的等位基因，所述等位基因从野生西瓜被渐渗到栽培西瓜中(到栽培的普通栽培西瓜的3号染色体上)。因此，术语“CVYV等位基因”还包括可从不同的野生西瓜获得的CVYV等位基因。当没有显性易感(野生型，WT)等位基因存在于基因组中的所述基因座上时(即在二倍体西瓜中存在两个拷贝的CVYV等位基因，在三倍体西瓜中存在3个拷贝的CVYV等位基因，在四倍体西瓜中存在4个拷贝的CVYV等位基因)，植物株系或品种将具有CVYV抗性。在缺少基因渗入片段的栽培西瓜植物中，存在于3号染色体上相同基因座处的等位基因在本文中被称为“野生型”等位基因(WT)。由于cyv_3.1是隐性的，为表达CVYV抗性表型，不应当存在野生型等位基因。因此，需要存在两个重组的3号染色体(在二倍体西瓜株系或品种中)、3个重组的3号染色体(在三倍体西瓜株系或品种中)或四个重组的3号染色体(在四倍体西瓜株系或品种中)以表达CVYV抗性表型。本文提供的SNP基因型的SNP单体型指示了包含cyv_3.1的基因渗入片段的存在。
[0046] 如果可以使用传统的育种技术可将赋予性状(例如CVYV抗性)的遗传元件、基因渗入片段、或基因或等位基因从存在其的植物或种子中转移至不存在其的另一植物或种子(例如CVYV易感株系或品种)中，并且除增加所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因所赋予的性状之外不会导致受体植物的表型改变，则称所述遗传元件、基因渗入片段、或基因或等位基因为“可获自”或可以“获自”或“可源自”或可以“源自”或“存在于”或“出现于”植物或种子或组织或细胞。所述术语可互换使用，因此可将所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因转移至缺少所述性状的任何其他遗传背景中。不仅可使用保藏的并包含所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因的种子，也可使用经选择以保留所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因的这些种子的子代/后代，其被涵盖于本文中，例如从保藏的种子或从其后代或原种(ancestor)开发的商业品种。同样，可鉴定并使用包含所述遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因(例如cyv_3.1或其变体)的其他野生来源并将其转移到栽培西瓜中。使用本领域中已知的一种或多种技术(例如表型测定、全基因组测序、分子标记物分析、性状定位(mapping)、染色体涂染、等位性检验等)或这些技术的组合，本领域技术人员能够确定植物(或植物的基因组DNA、细胞或组织)是否包含与可从保藏的种子获得的遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因相同的遗传元件、基因座、基因渗入片段、基因或等位基因(或其变体)。
[0047] “变体”或“直系同源”序列或“变体cyv_3.1”是指赋予CVYV抗性的QTL(cyv_3.1)，或包含所述QTL的基因渗入片段，除NCIMB42449或NCIMB42450或NCIMB42666中存在的cyv_3.1以外，其源自不同的野生西瓜植物，但是其变体包含连锁到cyv_3.1的SNP标记物或SNP单体性的一种或多种抗性基因型，并且其中所述变体基因组序列与包含所述SNP的SEQ ID NO(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中任一种)具有基本序列同一性，即至少
85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列同一性或更多。在这类变体序列中的SNP之后被称为在“对应于原始SEQ ID NO中SNP位置的核苷酸处”或“对应于原始SEQ ID NO中SNP位置的核苷酸位置处”。因此，当原始序列和变体序列在全长上进行成对比对时，例如在原始序列中位置76处的SNP在变体中将存在于对应于原始序列中第76位核苷酸的核苷酸处。因此，当在本文中提及具体基因组序列(选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3)中某一SNP抗性基因型时，其也涵盖所述基因组序列的变体中的所述SNP抗性基因型，即在与所提及的序列(选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3)具有至少85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列同一性的基因组序列中的所述SNP抗性基因型。因此，在一方面，本文对SEQ ID NO:1至3中任一个的任何提及也涵盖SEQ ID NO:1至3中任一个的变体，所述变体与所述序列具有至少85％、
90％、95％、98％或99％的序列同一性。
85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列同一性或更多。在这类变体序列中的SNP之后被称为在“对应于原始SEQ ID NO中SNP位置的核苷酸处”或“对应于原始SEQ ID NO中SNP位置的核苷酸位置处”。因此，当原始序列和变体序列在全长上进行成对比对时，例如在原始序列中位置76处的SNP在变体中将存在于对应于原始序列中第76位核苷酸的核苷酸处。因此，当在本文中提及具体基因组序列(选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3)中某一SNP抗性基因型时，其也涵盖所述基因组序列的变体中的所述SNP抗性基因型，即在与所提及的序列(选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3)具有至少85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列同一性的基因组序列中的所述SNP抗性基因型。因此，在一方面，本文对SEQ ID NO:1至3中任一个的任何提及也涵盖SEQ ID NO:1至3中任一个的变体，所述变体与所述序列具有至少85％、
90％、95％、98％或99％的序列同一性。
[0048] 术语“标记物测定法”指可用于测试在栽培西瓜的3号染色体上是否存在来自野生西瓜的基因渗入的分子标记物测定法，所述基因渗入片段包含CVYV抗性QTL(cyv_3.1或其变体)(或者野生西瓜种质是否在其基因组中包含cyv_3.1或其变体)，这通过下述方法进行：确定任意一种或多种连锁到cyv_3.1的标记物的基因型，例如选自SNP_02和SNP_03的一种或多种SNP标记物的基因型，以及(任选地)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小距离内的任意野生西瓜基因组特异性标记物的基因型。“确定基因型”的步骤也可被称为“基因分型”。任选地，标记物测定法也可包括SNP_01和/或SNP_04和/或在SNP_01和/或SNP_04的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、
0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小距离内的任意野生西瓜基因组特异性标记物的基因分型。
0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小距离内的任意野生西瓜基因组特异性标记物的基因分型。
[0049] 本文中“平均值”(average或mean)是指算术平均值，并且这两个术语可以互换使用。因此，术语“平均值”是指数个测量值的算术平均值。本领域技术人员应理解植物株系或品种的表型在一定程度上依赖于生长条件，因此优选地在随机实验设计中(采用数个重复以及在相同实验中于相同条件下生长的适合的对照植物(例如品种Sugar Baby或任何其他CVYV易感品种或株系的植物))，对至少10、15、20、30、40、50或更多株植物(或植物部分)的算术平均值进行测量。“统计学上显著的”或“统计学上显著地”差异或“显著地”差异是指这样的植物株系或品种的特征，即当与适合的对照比较时，所述植物株系或品种在该特征方面表现出与对照(的平均值)的统计学上显著性差异(例如，使用ANOVA时，p值小于0.05，p<0.05)。
[0050] 在本文中，术语“传统育种技术”包含全部都是育种者已知的杂交、回交、自交、选择、双单倍体产生、染色体加倍、胚胎拯救、原生质融合、标记物辅助选择、突变育种等(即除遗传修饰/转化/转基因方法以外的方法)，通过这些方法，例如，可获得、鉴定和/或转移重组的3号染色体。
[0051] “回交”是指一种育种方法，通过其可将(单一)性状(例如CVYV抗性QTL)从一个(通常是劣等)遗传背景(例如野生西瓜；也称为“供体”)转移到另一个(通常是优良)遗传背景(也称为“轮回亲本”)，例如栽培西瓜中。将杂交的子代(例如通过杂交如野生西瓜与栽培西瓜获得的F1植物；或由自交F1获得的F2植物或F3植物等)“回交”到具有例如优良遗传背景的亲本中，例如到栽培亲本中。在反复回交后，一个(通常是劣等)遗传背景的性状将被掺入到另一个(通常是优良)遗传背景中。
[0052] “标记物辅助选择”或“MAS”是一种利用分子标记物(例如SNP标记物)(其被遗传连锁到特定基因座或特定染色体区域(例如基因渗入片段))的存在来选择存在特定基因座或区域(基因渗入片段)的植物的方法。例如，遗传连锁到CVYV抗性QTL的分子标记物可用于检测和/或选择在3号染色体上包含所述QTL的西瓜植物或植物部位。分子标记物与基因座的遗传连锁越近，则所述标记物通过减数分裂重组而被从基因座中解离的可能性就越小。同样地，两个标记物彼此连锁得越近，则所述两个标记物彼此分离的可能性就越小(并且它们将作为一个单元共分离的可能性就越大)。
[0053] 另一个标记物或基因座的5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的分子标记物指物理上定位于所述标记物侧翼(即所述标记物的任意一侧)的基因组DNA区域的5Mb、3Mb、2.5Mb、2Mb、1Mb、
0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的标记物。参见例如图1的图，其示出了从包含cyv_3.1的野生西瓜渐渗的区域，从而示出了图中放大的所述区域的5Mb内的标记物。
0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的标记物。参见例如图1的图，其示出了从包含cyv_3.1的野生西瓜渐渗的区域，从而示出了图中放大的所述区域的5Mb内的标记物。
[0054] “LOD评分”(可能性的对数(以10为底))是指通常用于动物和植物种群中的连锁分析的统计学检验。所述LOD评分比较了如果两个基因座(分子标记物基因座和/或表型性状基因座)的确连锁时，获得的检验数据的可能性与纯粹偶然观察到相同数据的可能性。正的LOD评分支持连锁的存在，并且大于3.0的LOD评分被认为是连锁的证据。+3的LOD评分表明所观察到的连锁并非偶然出现的可能性为1000:1。
[0055] “转基因”或“嵌合基因”是指包含DNA序列的遗传基因座，例如重组基因，其已通过转化(例如农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化)被引入到植物的基因组中。将包含被稳定整合至其基因组中的转基因的植物称为“转基因植物”。
[0056] “分离的核酸序列”或“分离的DNA”是指这样的核酸序列，即其不再处于从中分离出其的天然环境中，例如在细菌宿主细胞中或在植物核或质体基因组中的核酸序列。当本文中提及“序列”时，应理解为提及具有所述序列的分子，例如核酸分子。
[0057] “宿主细胞”或“重组的宿主细胞”或“转化的细胞”是这样的术语，即其指由于至少一个已经被引入到所述细胞的核酸分子而产生的新的个体细胞(或生物体)。所述宿主细胞优选地为植物细胞或细菌细胞。所述宿主细胞可包含作为染色体外(附加型)复制分子的核酸，或包含整合至宿主细胞的核或质体基因组中的核酸，或作为引入的染色体(例如微型染色体)的核酸。
[0058] 可通过使用全局或局部比对算法进行的两个肽或两个核苷酸序列的比对来确定“序列同一性”或“序列相似性”。然后，当通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)对序列进行最佳比对时，序列共有至少某一最小的序列同一性百分比(如下文进一步定义的)时，所述序列可以被称作“基本相同”或“基本相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在全长上比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位生成(gap creation)罚分＝10，空位延伸(gap extension)罚分＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对均如此)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff,1992,PNAS 89,10915-10919)。例如可以使用计算机程序(例如可在万维网上http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得的EMBOSS)来确定用于百分比序列同一性的序列比对和评分。或者，可以通过搜索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定序列相似性或同一性，但是应检索命中并进行成对比对以比较序列同一性。如果百分比序列同一性为至少85％、90％、92％、95％、98％、99％或更多(例如至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、
99.7、99.8、99.9或更多)(如通过使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝
0.5)Emboss“Needle”所确定的，对于核酸，使用评分矩阵DNAFULL，对于蛋白质，使用评分矩阵Blosum62)，则两个蛋白质或两个蛋白质结构域或两个核酸序列具有“基本序列同一性”。
99.7、99.8、99.9或更多)(如通过使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝
0.5)Emboss“Needle”所确定的，对于核酸，使用评分矩阵DNAFULL，对于蛋白质，使用评分矩阵Blosum62)，则两个蛋白质或两个蛋白质结构域或两个核酸序列具有“基本序列同一性”。
[0059] 当提到这样的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)时，即所述核酸序列与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少80％，例如，至少85％、90％、92％、95％、98％、99％、99.2％、99.5％、99.9％核酸序列同一性的序列同一性，则在一个实施方案中，所述核苷酸序列被认为是与给定的核苷酸序列基本上相同的，并且可以使用严格杂交条件进行鉴定。在另一个实施方案中，与给定的核苷酸序列相比，所述核酸系列包含一个或多个突变，但是仍然可以使用严格杂交条件进行鉴定。
[0060] “严格杂交条件”可用于鉴定核甘酸序列，其与给定的核苷酸序列基本相同。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。通常，所选择的严格条件为在确定的离子强度和pH下，低于具体序列的热熔解温度(Tm)约5℃。所述Tm为50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常选择其中在pH 7下盐浓度为约0.02摩尔且温度为至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或增加温度均会提高严格度。RNA-DNA杂交(使用例如100nt探针的RNA印迹法)的严格条件为，例如包括在63℃下于0.2X SSC中至少一次洗涤(持续20分钟)的那些，或等同条件。DNA-DNA杂交(使用例如100nt探针的DNA印迹法)的严格条件为，例如包括在至少50℃(通常约55℃)温度下于0.2X SSC中至少一次(通常2次)的洗涤(持续20分钟)的那些，或等同条件。也可参见Sambrook et al.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。
[0061] “等位性检验”指可用于检验在两种植物株系或品种中观察到的表型(例如CVYV抗性)是否由相同的基因或基因座决定，或者由不同的基因或基因座决定。例如，将待被检验的植物彼此杂交(优选在自交之后以确保它们是纯合的)，确定F1或者进一步自交或回交子代中的表型分离。分离的比例表明基因或基因座是否是等位的，或它们是否是不同的。因此，例如，如果等位基因是相同基因的等位基因，(通过杂交两株纯合植物产生的)F1植物将全部(100％)具有相同表型，而如果等位基因是不同基因的等位基因就不是这种情况。同样，在F2植物中，表型分离将表明是否涉及相同或不同的基因。
[0062] “精细定位”(fine-mapping)指这样的方法，即通过该方法能够更准确地(缩小范围)确定QTL的位置。例如，可分析按性状分离的大种群中所述性状(例如CVYV抗性)的分离，并且可选择3号染色体上的DNA标记物以及在包含CVYV抗性基因座的3号染色体的区域中包含重组事件的植物(参见例如图1的条形区域)，以确定所述QTL位于哪对SNP标记物之间。还可在最为连锁的标记物对之间寻找另外的标记物以缩小QTL定位位置的间隔。附图说明
[0063] 图1在左侧图中示出了包含来自野生西瓜的基因渗入片段(条形区)的重组的3号染色体，所述基因渗入片段在SNP标记物的任意一侧跨越5Mb区域。栽培西瓜区域是非条纹的(白色)。在两个放大图(中图和右图)，示出了CYCV抗性和ZYMV易感植物的SNP标记物SNP_01至SNP_04(中图)以及CYCV抗性和ZYMV抗性植物的SNP标记物SNP_01至SNP_04(右图)，包括SNP基因型和位置(染色体位置以Mb表示，例如SNP_01的7.5Mb和SNP_04的7.7Mb)：根据单体型，SNP_01可以是AA或GG；SNP_02具有抗性基因型GG；SNP_03具有抗性基因型CC；SNP_04具有TT基因型(表明对ZYMV易感)或GG基因型(表明对ZYMV的抗性，即存在包含纯合形式的zym基因座的区域(阴影区))。
具体实施方式
[0064] 本发明人发现了野生西瓜种质的3号染色体上的隐性QTL，所述3号染色体包含赋予CVYV抗性的基因座。他们发现连锁到赋予抗性的QTL的两种不同的单体型，单体型A在SNP_01、SNP_02和SNP_03处分别包含核苷酸G-G-C，单体型B在SNP_01、SNP_02和SNP_03处分别包含核苷酸A-G-C。
[0065] 此外，SNP_02和SNP_03(两种抗性单体型的两种共有的SNP)紧密连锁到cyv_3.1基因座，并且用于将QTL cyv_3.1回交到来自两种不同的野生西瓜种质的CVYV易感栽培西瓜，从而将CVYV抗性引入到产生可市售果实的栽培西瓜中。
[0066] 两种包含纯合形式的cyv_3.1的二倍体近交株系的种子由Nunhems B.V.保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 42449和NCIMB42450。这两种株系包含纯合形式的SNP_02和SNP_03并且具有SNP单体型B。果实为结籽的红色果肉果实，白利糖度为11.0，并且为可市售果实。植物为CVYV抗性和ZYMV易感的(并且还缺少Ling et al.，2008(见上文)的eIF4E标记物)。
所述株系之一的果实具有Crimson Sweet型外皮(NCIMB 42449)，另一种(NCIMB42450)的果实具有Jubilee外皮(如同在Premium F1中)。平均果实重量分别为7kg和8kg。此外，已产生许多包含cyv_3.1基因座的栽培近交株系，其平均果实重量的范围为约2kg至约12kg。
所述株系之一的果实具有Crimson Sweet型外皮(NCIMB 42449)，另一种(NCIMB42450)的果实具有Jubilee外皮(如同在Premium F1中)。平均果实重量分别为7kg和8kg。此外，已产生许多包含cyv_3.1基因座的栽培近交株系，其平均果实重量的范围为约2kg至约12kg。
[0067] 另一个包含纯合形式的cyv_3.1的二倍体良种近交株系的种子由Nunhems B.V.保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 42666。该株系包含纯合形式的SNP_02和SNP_03并且具有SNP单体型A。果实为可市售的结籽、红色果肉果实。
[0068] 表1——连锁到cyv_3.1的SNP标记物和栽培西瓜基因组(其公开于万维网icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi的“西瓜：基因组”、“西瓜基因组(97103)-版本1”下)的3号染色体上的SNP位置
[0069]
[0070]
[0071] 包含cyv 3.1的二倍体栽培西瓜植物、种子和植物部位
[0072] 在本发明的一方面，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物(的种子)，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座并且任选地可通过选自以下的标记物来检测(或包含选自以下组的标记物)：
[0073] a)在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤；和/或
[0074] b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(SNP_03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶；和/或(任选地)
[0075] c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0076] 因此，上述西瓜植物在3号染色体上包含基因渗入片段(包含cyv_3.1)，其可通过SNP_02和/或SNP_03和/或任选的另一种SNP_02或SNP_03的5Mb内的野生西瓜基因组特异性标记物的抗性基因型来检测。尽管SNP_02和SNP_03紧密连锁至QYL，仍可以产生丧失SNP_02和/或SNP_03、但保留QTL和一种或多种紧密连锁至cyv_3.1的不同的野生西瓜基因组特异性标记物的基因渗入片段，如上文c)中提及的。对本领域的重要贡献在于，所述基因渗入片段包含CVYV抗性基因座，其在本文中被称为cyv_3.1。所述植物不需要在表型上具有CVYV抗性，因为CVYV抗性基因座可以是杂合形式(可以仅存在一条重组的3号染色体)。因此，SNP_02的二倍体基因型可以是杂合的GA(鸟嘌呤/腺嘌呤)或纯合的GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)，SNP_03的二倍体基因型可以是杂合的CT(胞嘧啶/胸腺嘧啶)或纯合的CC(胞嘧啶/胞嘧啶)。换言之，对于所述基因渗入片段(以及QTL)而言，植物可以是杂合的，在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处仅具有一个鸟嘌呤(G)(SNP_02)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:2的至少
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:2的第76位核苷酸的核苷酸处仅具有一个鸟嘌呤(G)，并且在SEQ ID NO:3的第
76位核苷酸处仅具有一个胞嘧啶(SNP_03)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:3的第76位核苷酸的核苷酸处仅具有一个胞嘧啶；或者对于所述基因渗入片段(以及QTL)而言，它可以是纯合的，在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处具有两个鸟嘌呤(SNP_
02)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:2的第76位核苷酸的核苷酸处具有两个鸟嘌呤，并且在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处具有两个胞嘧啶(C)(SNP_
03)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:3的第76位核苷酸的核苷酸处具有两个胞嘧啶(C)。相同的情况适用于上文c)中所述的连锁到cyv_3.1的野生西瓜基因组特异性标记物，即该标记物可以是杂合或纯合的。可例如通过对所述区域进行测序来鉴定c)中的标记物。这些标记物可以是连锁至cyv_3.1的任意标记物，并且其在野生西瓜基因组DNA和栽培西瓜基因组DNA之间是多态的，例如SNP标记物、一种或多种核苷酸的插入或缺失(例如INDEL标记物)、AFLP标记物等。
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:2的第76位核苷酸的核苷酸处仅具有一个鸟嘌呤(G)，并且在SEQ ID NO:3的第
76位核苷酸处仅具有一个胞嘧啶(SNP_03)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:3的第76位核苷酸的核苷酸处仅具有一个胞嘧啶；或者对于所述基因渗入片段(以及QTL)而言，它可以是纯合的，在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处具有两个鸟嘌呤(SNP_
02)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:2的第76位核苷酸的核苷酸处具有两个鸟嘌呤，并且在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处具有两个胞嘧啶(C)(SNP_
03)，或在变体序列中(即在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)对应于SEQ ID NO:3的第76位核苷酸的核苷酸处具有两个胞嘧啶(C)。相同的情况适用于上文c)中所述的连锁到cyv_3.1的野生西瓜基因组特异性标记物，即该标记物可以是杂合或纯合的。可例如通过对所述区域进行测序来鉴定c)中的标记物。这些标记物可以是连锁至cyv_3.1的任意标记物，并且其在野生西瓜基因组DNA和栽培西瓜基因组DNA之间是多态的，例如SNP标记物、一种或多种核苷酸的插入或缺失(例如INDEL标记物)、AFLP标记物等。
[0077] 在一方面，所述基因渗入片段是纯合的，并且包含CVYV基因座cyv_3.1的基因渗入片段是纯合的，从而所述植物具有CVYV抗性，例如可在CVYV抗性测定和/或分子标记物测定中测定的。因此，在一方面，SNP_02、SNP_03和/或野生西瓜基因组特异性标记物是纯合的，即SNP_02和SNP_03分别具有抗性基因型GG和CC，并且所述植物具有CVYV抗性，例如，当在CVYV抗性测定中检验时，以及优选地还在天然CVYV胁迫下在田间或大棚中生长时。
[0078] 所提及的野生西瓜基因组特异性标记物可以是存在于包含cyv_3.1的基因渗入片段上的任何类型的分子标记物，并且使所述基因渗入片段区别于栽培西瓜3号染色体区域(缺少cyv_3.1的WT基因型)，例如一种或多种SNP标记物、CAPS标记物、RFLP标记物、AFLP标记物、微卫星标记物、小卫星标记物、一种或多种核苷酸的插入或缺失(例如INDEL)等。因此，“野生西瓜基因组特异性分子标记物”是这样的标记物，其为多态的，或在包含cyv_3.1的野生西瓜基因组基因渗入片段和缺少所述基因渗入片段的栽培西瓜基因组之间是不同的。本文已经提供了多态的SNP标记物，但是技术人员也可容易地开发出其他标记物，例如通过定位或精细定位或测序3号染色体上包含所述基因渗入片段的区域。例如，可对所保藏的包含纯合形式基因渗入片段的植物3号染色体区域进行测序并与栽培西瓜3号染色体的相同区域进行比较以鉴定SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、2kb、1kb或更小范围内的其他野生西瓜基因组特异性分子标记物，即其他连锁至SNP_02和/或SNP_03并因此指示包含cyv_3.1的基因渗入片段的野生西瓜基因组特异性标记物。
[0079] 因此，在一方面，所述基因渗入片段可通过选自以下的标记物来检测(或包含选自以下组的标记物)：
[0080] a)在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)；和/或[0081] b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)(SNP_
03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)；和/或[0082] c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、
5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物，所述分子标记物为纯合形式。
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)；和/或[0081] b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)(SNP_
03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)；和/或[0082] c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、
5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物，所述分子标记物为纯合形式。
[0083] 当本文中提及具体位置(例如SEQ ID NO:2“或包含与SEQ ID NO的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列”的第76位核苷酸处)的SNP基因型时，意指所述SNP基因型存在于变体序列中，位于对应于变体序列中(即包含与所提及的SEQ ID NO的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中)的相同核苷酸(例如对应于SEQ ID NO:2的第76位核苷酸)的核苷酸处。例如，变体序列可以短一个或若干个核苷酸，但是当成对比对变体序列与所提及的SEQ ID NO时，能够看到变体序列中的哪个核苷酸对应于相同的核苷酸。在所述变体序列中，例如可以是该变体序列的第75或77位核苷酸，其对应于所提及的序列的第76位核苷酸。
[0084] 因此，上述植物在其表型中也是CVYV抗性的，如CVYV抗性测定(例如实施例中所述)中或在CVYV天然出现的区域中的田间或大棚中所确定的。应当理解，在CVYV抗性测定中，检验株系或品种的多株植物(例如至少10、11、12、13或14或更多)，优选地进行若干次重复(例如2、3、4或更多次)，任选地在若干位置，并且在相同测定中包括易感对照品种的多株植物。可包括保藏的种系的种子作为阳性对照。所有目前的西瓜品种都是CVYV易感的，因此任何品种或任意这类品种的亲本株系均可用作易感对照，例如可使用老的二倍体品种Sugar Baby或可使用Dumara(Nunhems)。
[0085] 在本发明的具体实施方案中，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座并且可通过以下标记物来检测(或包含以下标记物)：
[0086] a)在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0087] b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)。
[0088] 所述植物包含纯合形式或杂合形式的CVYV抗性基因座。
[0089] 在一方面，所述植物包含纯合形式的基因渗入片段，即所述基因渗入片段可通过以下标记物来检测(或包含以下标记物)：
[0090] a)在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)；和/或[0091] b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)(SNP_
03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)。
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)；和/或[0091] b)在SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)(SNP_
03)或在包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)。
[0092] 在一个实施方案中，上述二倍体植物具有SNP单体型A或SNP单体型B。因此，在一方面所述植物包含SNP单体型A，其对于SNP_01、SNP_02和SNP_03分别具有G-G-C(例如在二倍体形式中，SNP单体型A为纯合形式的GG-GG-CC或杂合形式的GG-GA-CT)。在另一方面，所述植物包含SNP单体型B，其对于SNP_01、SNP_02和SNP_03分别具有A-G-C(例如在二倍体形式中，SNP单体型B为纯合形式的AA-GG-CC或杂合形式的AG-GA-CT)。因此，在SEQ ID NO:1的第76位核苷酸处(SNP_01)或包含与SEQ ID NO:1的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处，SNP基因型可以是鸟嘌呤或腺嘌呤。SNP_01能够区分两种不同的抗性单体型。
96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处，SNP基因型可以是鸟嘌呤或腺嘌呤。SNP_01能够区分两种不同的抗性单体型。
[0093] 任何上述二倍体西瓜植物可以是任何类型，即可将cyv_3.1抗性基因座引入到任何栽培西瓜中以产生包含CVYV基因座的株系或品种。栽培西瓜产生多种果实大小(例如，非常小，如WO2012069539所述；例如，小于0.9kg或甚至等于或小于0.65kg；个体大小约3-7磅，即约1.4至3.2kg；icebox大小约6-12磅，即约2.7至5.5kg；更大的大小最大达35磅，即约15.9kg)、果实果肉颜色和果实形状，并且具有不同的外皮颜色。因此，例如通过育种可将cyv_3.1基因座引入到栽培西瓜中，所述栽培西瓜产生任意果实形状(例如长形、椭圆、椭圆长形、块状、长块状、球形或圆形)、果实表面(有皱纹的、光滑的)、果肉颜色(例如红、暗红、猩红、珊瑚红、橙、橙红或粉、黄、淡黄或白色)、外皮颜色(例如浅绿，深绿，具有窄纹、中纹或宽纹的绿色条纹，灰色类型；具有或不具有斑点；金黄；Crimson型外皮，Jubilee型外皮；
Allsweet型外皮；黑/暗绿)、外皮厚度、外皮韧度、外皮图案(例如条纹，非条纹，网格)、果肉结构/果肉硬度、番茄红素和/或维生素含量、不同的糖:酸比例、非常好的果实气味等。参见Guner and Wehner 2004,Hort Science 39(6):1175-1182，具体为1180-1181页，其描述了果实特征的基因。通常，重要的育种目的为：早熟性、高果实产率、高内部果实品质(良好的均一颜色、高糖、适合的糖:酸比例、良好的气味、高维生素和番茄红素含量、坚实的果肉质地、非纤维性果肉质地，免于以下缺陷如空心、外皮坏死、蒂腐病或cross stitch，以及良好的外皮特征和抗裂性)。
Allsweet型外皮；黑/暗绿)、外皮厚度、外皮韧度、外皮图案(例如条纹，非条纹，网格)、果肉结构/果肉硬度、番茄红素和/或维生素含量、不同的糖:酸比例、非常好的果实气味等。参见Guner and Wehner 2004,Hort Science 39(6):1175-1182，具体为1180-1181页，其描述了果实特征的基因。通常，重要的育种目的为：早熟性、高果实产率、高内部果实品质(良好的均一颜色、高糖、适合的糖:酸比例、良好的气味、高维生素和番茄红素含量、坚实的果肉质地、非纤维性果肉质地，免于以下缺陷如空心、外皮坏死、蒂腐病或cross stitch，以及良好的外皮特征和抗裂性)。
[0094] 由二倍体株系或品种产生的果实优选地为可市售的果实。
[0095] 在一方面，平均白利糖度为至少6.0、7.0、8.0，或至少9.0，优选至少10.0，更优选至少11.0或更高。
[0096] 果实颜色可以是任何颜色，例如红、暗红、猩红、珊瑚红、橙、橙红、粉、粉红、黄、淡黄或白色。优选地，果实果肉颜色是均一的。
[0097] 所述二倍体可以是由杂交两个近交株系而产生的近交株系或二倍体杂种。在一方面，两个近交亲本系是cyv_3.1纯合型，因此杂种也是纯合型。所述二倍体植物可以是近交株系、品种、二倍体F1杂种、OP(开放授粉的)品种、授粉植物(例如产生可市售果实的专用授粉植物，如WO2012069539所述)，或任何其他的栽培二倍体，包括任何无性繁殖的植物。由于CVYV抗性表型优选地是在表型上表达，在一方面，所述基因渗入片段在二倍体中是纯合的，所述一种或多种连锁至cyv_3.1的标记物也是纯合的。
[0098] 包含cyv_3.1的野生西瓜基因渗入片段可以为多种大小，例如约15Mb或更小、约10Mb或更小、约9Mb或更小、约8Mb或更小、约7Mb或更小、约6Mb或更小、约5Mb或更小、约4Mb或更小、约3Mb或更小、约2.5Mb或2Mb或更小、约1Mb(等于1,000,000碱基对)或更小、或约
0.5Mb(等于500,000碱基对)或更小，例如约200,000bp(等于200千碱基对)或更小、约100,
000bp(100kb)或更小、约50,000bp(50kb)或更小、约30,000bp(30kb)或更小。通常优选更小的基因渗入片段，因为负性(negative)性状可位于相同的片段上。使用例如本文所述的表型测定和/或分子标记物测定，通过减数分裂重组(例如通过自交所述植物)和选择具有更小的基因渗入片段但是保留cyv_3.1的重组子代植物，可减小基因渗入片段的大小。如果SNP_01和/或SNP_02和/或SNP_03在重组过程中丧失，但是所述植物保留cyv_3.1基因座，则可使用表型选择来选择保留cyv_3.1的植物，和/或使用另一种方法来检测基因渗入片段，例如测序存在QTL的3号染色体的区域(例如3号染色体的约2.50Mb和约12.8Mb之间的区域，参见图1)或其他连锁至cyv_3.1的野生西瓜基因组特异性标记物。可使用技术人员已知的方法(例如精细定位、测序等)来开发这类其他野生西瓜基因组特异性标记物。
0.5Mb(等于500,000碱基对)或更小，例如约200,000bp(等于200千碱基对)或更小、约100,
000bp(100kb)或更小、约50,000bp(50kb)或更小、约30,000bp(30kb)或更小。通常优选更小的基因渗入片段，因为负性(negative)性状可位于相同的片段上。使用例如本文所述的表型测定和/或分子标记物测定，通过减数分裂重组(例如通过自交所述植物)和选择具有更小的基因渗入片段但是保留cyv_3.1的重组子代植物，可减小基因渗入片段的大小。如果SNP_01和/或SNP_02和/或SNP_03在重组过程中丧失，但是所述植物保留cyv_3.1基因座，则可使用表型选择来选择保留cyv_3.1的植物，和/或使用另一种方法来检测基因渗入片段，例如测序存在QTL的3号染色体的区域(例如3号染色体的约2.50Mb和约12.8Mb之间的区域，参见图1)或其他连锁至cyv_3.1的野生西瓜基因组特异性标记物。可使用技术人员已知的方法(例如精细定位、测序等)来开发这类其他野生西瓜基因组特异性标记物。
[0099] 在一方面，本发明的基因渗入片段(包含cyv_3.1或其变体，其中所述基因渗入片段从野生西瓜植物渐渗)是包含(或跨越)始于3号染色体的2.50Mb和终止于3号染色体的12.80Mb的区域的片段，并且包含cyv_3.1基因座或其变体。
[0100] 在另一方面，本发明的基因渗入片段(包含cyv_3.1或其变体，其中所述基因渗入片段从野生西瓜植物渐渗)是这样的片段，其包含始于3号染色体的2.50Mb和终止于3号染色体的12.80Mb的区域的更短片段(部分)，例如大小为如9Mb、8Mb、7Mb、6Mb、5Mb、4Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、100kb、50kb、35kb、30kb、20kb或更小(如上文所述)并且包含cyv_3.1基因座或其变体。在一方面，所述部分的大小至少5kb、10kb、20kb或更大。
[0101] 在另一方面，本发明的基因渗入片段(包含cyv_3.1或其变体，其中所述基因渗入片段从野生西瓜植物渐渗)由始于3号染色体的2.50Mb和终止于3号染色体的12.80Mb的区域的更短片段(亚片段)构成，例如大小为如9Mb、8Mb、7Mb、6Mb、5Mb、4Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、100kb、50kb、35kb、30kb、20kb或更小(如上文所述)并且包含cyv_3.1基因座或其变体。在一方面，所述部分的大小至少5kb、10kb、20kb或更大。
[0102] 在另一方面，本发明的基因渗入片段(包含cyv_3.1或其变体，其中所述基因渗入片段从野生西瓜植物渐渗)包含始于3号染色体的7.50Mb和终止于3号染色体的7.75Mb的区域，或始于3号染色体的7.60Mb和终止于3号染色体的7.70Mb的区域，其中所述片段包含cyv_3.1基因座或其变体。在一方面，所述部分的大小至少5kb、10kb、20kb或更大。
[0103] 本文还提供了可由其生长出本发明的植物的种子。
[0104] 同样，本文包括本发明的植物的植物部位，例如细胞、根、叶、果实、果实部位、花粉、胚珠、花、根茎、接穗、扦插、茎、从这类部位或细胞提取的DNA等。这类植物部位在它们的基因组中包含至少一条重组的3号染色体，其包含可通过所述的一种或多种标记物来检测的基因渗入片段。同样，从这类细胞或植物部位提取的基因组DNA在其基因组中包含至少一条重组的3号染色体，其包含可通过所述的一种或多种标记物来检测的基因渗入片段。
[0105] 粘籽西瓜CVYV抗性来源是从US GRIN保藏中心获得的野生种质。它具有小的(约13cm x 13cm)白色果肉的果实，白利糖度约3.0。羊齿西瓜种质也是从US GRIN保藏中心获得的野生种质。它具有约16cm x 24cm的黄色苦涩果实，白利糖度低于3.0。
[0106] 将抗性cyv_3.1从这两种二倍体野生种质回交到CVYV易感西瓜良种株系，从而产生二倍体栽培西瓜，其包含cyv_3.1并且当所述基因渗入片段以纯合形式存在时具有针对CVYV的抗性。
[0107] 如上文所提及的，包含纯合形式的cyv_3.1的两种二倍体近交栽培西瓜的种子被保藏在NCIMB，登录号为NCIMB42449和NCIMB42450。这两种株系包含纯合形式的SNP_02和SNP_03并且具有SNP单体型B。果实是结籽的、红色果肉果实，白利糖度为11.0，因此是可市售的果实。所述植物具有CVYV抗性但是易感ZYMV(还缺少Ling et al.2008(上文)的eIF4E标记物)。所述株系之一的果实具有Crimson sweet外皮，另一种的果实具有Jubilee外皮。使用表型选择或标记物选择或二者，通过传统育种可将cyv_3.1从这两种株系中转移到任何其他栽培西瓜株系或品种。
[0108] 另一种包含纯合形式的cyv_3.1的二倍体良种近交株系的种子也由Nunhems B.V.保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 42666。该株系包含纯合形式的SNP_02和SNP_03并且具有SNP单体型A。果实是可市售的结籽的红色果肉果实。所述植物具有CVYV抗性。
[0109] 在一方面，cyv_3.1可获自(可获自/存在于)以NCIMB42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子，例如通过杂交从这类种子生长出的植物(或其子代)与另一种西瓜植物并选择包含所述基因渗入片段的子代。在一方面，另一种西瓜植物是缺少cyv_3.1的栽培西瓜。
[0110] 或者，粘籽西瓜或羊齿西瓜的其他野生种质可包含cyv_3.1(或其变体)并且可用于将cyv_3.1(或其变体)渐渗到栽培西瓜中。为了鉴定这类其他野生种质，可使用本文提供的一种或多种标记物，任选地结合CVYV抗性测定。例如，当使用本文提供的SNP标记物来筛选US GRIN保藏中心的野生西瓜种质的子代时，发现野生西瓜种质PI189318的种子包含cyv_3.1，如实施例6中所示。PI189318产生硬的白色果肉果实，所述果实是苦的并且具有非常低的白利糖度(约3.0)。cyv_3.1基因座可从该种质或其他野生西瓜种质渐渗到栽培西瓜中，如本文所述，任选地使用本文提供的一种或多种SNP标记物。因此，在一方面，本发明的栽培西瓜植物包含来自例如PI189318或其子代，或来自其他野生西瓜的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含cvy_3.1抗性基因座并且可通过一种或多种本文所述的连锁至cvy_3.1的标记物来检测。野生西瓜可以是SNP单体型A或B。例如，PI189318具有纯合形式的SNP单体型A。
[0111] 在本发明的一个实施方案中，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物(的种子)，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，其中所述基因渗入片段包含：
[0112] a)栽培西瓜植物基因组3号染色体的核苷酸7.664.093处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)；和/或
[0113] b)栽培西瓜植物基因组3号染色体的核苷酸7.693.225处的胞嘧啶(C)(SNP_03)；和/或任选地
[0114] c)SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0115] 在本发明的另一个实施方案中，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物(的种子)，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，其中所述基因渗入片段可通过选自以下的标记物来检测(或包含选自以下的标记物)：
[0116] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核酸分子的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0117] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或在严格条件下与SEQ ID NO:3杂交的核酸分子的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和/或任选地
[0118] c)SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0119] 在本发明的不同的实施方案中，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物(的种子)，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，其中所述基因渗入片段可通过选自以下的标记物来检测(或包含选自以下的标记物)：
[0120] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0121] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和/或任选地
[0122] c)SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0123] 在一方面，所述基因渗入片段和标记物是纯合的。
[0124] 在一方面，本发明的植物在3号染色体上缺少赋予ZYMV抗性的基因座。然而，CVYV抗性也可在3号染色体上与ZYMV抗性结合，如下文所述。
[0125] 本文还包括植物部位，例如上述植物的果实或其部位、细胞、叶、花等。如前文所提及的，果实是可市售的二倍体果实。
[0126] 在一个实施方案中，栽培西瓜植物或植物部位包含赋予CVYV抗性的基因座，所述基因座存在于以登录号NCIMB 42449或NCIMB42450或NCIMB 42666保藏的种子中，或存在于野生西瓜PI189318或其他野生西瓜中。因此，在一方面，cyv_3.1是通过以下方法可获得(或可通过以下方法获得)：杂交其种子以登录号NCIMB42449或NCIMB42450或NCIMB42666保藏的西瓜植物或任意这些植物的子代(例如通过自交和/或杂交获得的并且所述子代保留了cyv_3.1)与另一种西瓜植物(例如栽培西瓜良种株系或品种)。在另一方面，可通过将来自野生西瓜(例如PI189318或其他野生西瓜)的抗性渐渗到栽培西瓜中来获得cyv_3.1基因。
[0127] 在另一方面，栽培西瓜植物或植物部位包含赋予CVYV抗性的基因渗入片段(所述基因渗入片段存在于以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子中)或其更短部分(保留了cyv_3.1)。因此，在一方面，包含cyv_3.1的基因渗入片段是通过以下方法可获得(或可通过以下方法获得)：杂交其种子以登录号NCIMB42449或NCIMB42450或NCIMB42666保藏的西瓜植物或任意这些植物的子代(例如通过自交和/或杂交获得的并且所述子代保留了cyv_3.1)与另一种西瓜植物。
[0128] 因此，在一方面，3号染色体上的CVYV抗性基因是存在于以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子或其子代中的基因，但是其同样可以是另一种野生西瓜(特别是包含一种或多种SNP标记物的野生西瓜)的抗性基因，即连锁至cyv_3.1的SNP标记物的抗性基因型。实例为野生种质如PI189318或其他。除了标记物分析或作为备选，技术人员可容易地进行例如等位性检验以确定这样的CVYV抗性是否确实是由同一抗性基因(即cyv_3.1)赋予。同样可使用其他方法或方法组合，例如定位、精细定位、测序、基因遗传性等，以确定同一基因cyv_3.1导致CVYV抗性表型。
[0129] 结合cyv_3.1赋予的CVYV抗性与ZYMV抗性
[0130] 本发明人发现，cyv_3.1与隐性zym基因位于相同的染色体上，所述zym基因赋予针对ZYMV的抗性。因此，cyv_3.1可在3号染色体上与zym结合以提供包含处于互引相的赋予CVYV和ZYMV抗性的基因座的染色体。
[0132] zym抗性的来源为例如PI595203，如Ling et al.2008(上文)所述。本发明人将Ling et al.2008所述的CAPS标记物转化为SNP标记物(称为SNP_04)，参见表2。
[0133] 表2——连锁至ZYMV抗性的eIF4E基因中的SNP标记物以及栽培西瓜基因组(其公开于万维网icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi的“西瓜：基因组”、“西瓜基因组(97103)-版本1”下)的3号染色体上的SNP位置
[0134]
[0135] 因此，上文所述的本发明的二倍体西瓜植物可在3号染色体上还包含zym基因。
[0136] 因此，在一方面，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物(的种子)，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，其中所述基因渗入片段可通过选自以下的标记物来检测(或包含选自以下的标记物)：
[0137] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0138] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和/或任选地
[0139] c)SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物；和
[0140] d)其中所述植物在3号染色体上还包含zym基因。
[0141] 任选地，zym基因(包含zym基因的基因渗入片段)的存在是通过检测SEQ ID NO:4的第70位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_04)或检测包含与SEQ ID NO:4的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第70位核苷酸处的鸟嘌呤(G)。然而，SNP_04不可能非常紧密地连锁至zym，因此可优选表型选择或开发更紧密连锁的标记物以确保zym存在。
[0142] 因此，重组的3号染色体包含基因渗入片段，所述基因渗入片段包含CVYV抗性基因座cyv_3.1，并且可在相同的染色体上还包含zym基因(包含zym基因的基因渗入片段)。所述植物不需要在表型上具有CVYV抗性和ZYMV抗性，因为CVYV抗性基因座和zym基因可能是杂合形式(可能仅存在一条重组的3号染色体)。在一方面，所述植物对于重组的3号染色体而言是纯合的，因此具有针对CVYV和ZYMV的抗性。
[0143] 因此，在一方面，包含CVYV抗性基因座cyv_3.1的基因渗入片段是纯合形式，并且zym基因(包含zym基因的基因渗入片段)是纯合形式，从而所述植物具有针对CVYV和ZYMV的抗性。在一方面，SNP_02和/或SNP_03和/或连锁至cyv_3.1的野生西瓜基因组特异性标记物是纯合的，并且zym是纯合的(zym/zym)，任选地SNP_04(如果存在)是纯合的GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
[0144] 在本发明的一个具体实施方案中，提供了物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜植物(的种子)，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座(称为cyv_3.1)，其中所述基因渗入片段可通过以下标记物来检测(或包含以下标记物)：
[0145] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和
[0146] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和
[0147] c)其中所述3号染色体还包括zym基因。
[0148] 在一方面，所述植物在3号染色体上包含纯合形式的基因渗入片段，即所述基因渗入片段可通过以下标记物来检测(或包含以下标记物)：
[0149] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型GG(鸟嘌呤/鸟嘌呤)；和
[0150] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的二倍体基因型CC(胞嘧啶/胞嘧啶)；和
[0151] c)其中所述3号染色体还包含纯合形式的zym基因(zym/zym)；和
[0152] d)其中所述植物具有CVYV和ZYMV抗性。
[0153] 在一个实施方案中，上述二倍体植物具有与zym基因结合的CVYV SNP单体型A或SNP单体型B。因此，在一方面，所述植物包含SNP单体型A，其对于SNP_01和SNP_02和SNP_03而言分别具有G-G-C(例如在二倍体形式中，SNP单体型A为纯合形式的GG-GG-CC或杂合形式的GG-GA-CT)；以及在与cyv_3.1相同的染色体上连锁的zym基因(任选地，SNP_04具有杂合的二倍体基因型GT或纯合的二倍体基因型GG)。在另一方面，所述植物包含SNP单体型B，其对于SNP_01和SNP_02和SNP_03而言分别具有A-G-C(例如在二倍体形式中，SNP单体型A为纯合形式的AA-GG-CC或杂合形式的AG-GA-CT)；以及在与cyv_3.1相同的染色体上连锁的zym基因(任选地，SNP_04具有杂合的二倍体基因型GT或纯合的二倍体基因型GG)。因此，在SEQ ID NO:1的第76位核苷酸处(SNP_01)或包含与SEQ ID NO:1的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处，所述SNP基因型可以是鸟嘌呤或腺嘌呤。SNP_01能够区分所述两种不同的CVYV抗性单体型，但是任一种单体型可以在相同的3号染色体上与zym基因结合。
[0154] 因此，二倍体CVYV和ZYMV抗性植物可包含以下两种基因型之一：
[0155]
[0156] 为了结合CVYV抗性基因座cyv_3.1与zym基因，技术人员将杂交包含cyv_3.1的本发明的植物与包含zym基因的植物，并且选择在重组的3号染色体上同时包含CVYV基因座cyv_3.1和zym基因的重组子代植物。
[0157] 在一个实施方案中，栽培西瓜植物或植物部位包含以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子中存在的赋予CVYV抗性的基因座cyv_3.1，并且还包含zym基因。
[0158] 在一个实施方案中，栽培西瓜植物或植物部位包含以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子中存在的基因渗入片段(包含cyv_3.1)或其更短片段(其保留了cyv_3.1基因座)，并且还包含zym基因。
[0159] 在一方面，本发明的二倍体西瓜植物(以及可从其生长出所述植物的种子)是通过自交若干次而产生的近交株系。
[0160] 在另一方面，本发明的二倍体西瓜植物(以及可从其生长出所述植物的种子)是通过杂交两种本发明的二倍体近交株系并收集来自杂交的种子而产生的F1杂种。
[0161] 还检验了从保藏的种子生长出的植物的CGMMV(黄瓜绿斑病毒)抗性，但是所述植物是CGMMV易感的，表明cyv_3.1未赋予CGMMV抗性。
[0162] 包含cyv_3.1(或其变体)的四倍体栽培西瓜植物和植物部位
[0163] 无籽三倍体西瓜产生包括使用来自二倍体雄性亲本植物的花粉以使四倍体(2n＝4x＝44)母本植物的花受精。用二倍体花粉来授粉四倍体花，产生的F1种子是三倍体(Kihara,1951,Proceedings of American Society for Horticultural Science 58:
217-230；Eigsti 1971,Hort Science 6:1-2)。从这些F1种子生长出的三倍体杂种植物是自交不育的，因为它们由于染色体不平衡而产生不育的花粉(Fehr,1987)。因此，所述三倍体杂种需要通过二倍体授粉植物来授粉以产生西瓜果实。因此，将三倍体植物与授粉植物套种以产生果实。在三倍体杂种植物上授粉之后产生的“无籽”果实通常并非真正无籽，但是可包含一些可食用的未发育的小的灰白色种子。
217-230；Eigsti 1971,Hort Science 6:1-2)。从这些F1种子生长出的三倍体杂种植物是自交不育的，因为它们由于染色体不平衡而产生不育的花粉(Fehr,1987)。因此，所述三倍体杂种需要通过二倍体授粉植物来授粉以产生西瓜果实。因此，将三倍体植物与授粉植物套种以产生果实。在三倍体杂种植物上授粉之后产生的“无籽”果实通常并非真正无籽，但是可包含一些可食用的未发育的小的灰白色种子。
[0164] 因此，为了产生这类无籽三倍体品种，将四倍体雌性亲本株系(优选近交株系)与二倍体雄性亲本株系(优选近交株系)杂交。通过异花授粉在四倍体亲本的果实中产生的种子是三倍体，具有两个来自四倍体母本的染色体组和一个来自二倍体父本的染色体组。采收这些种子并将其作为三倍体品种售卖。从这些种子生长出的三倍体植物仍然需要授粉以产生座果(由授粉植物提供)，但是产生的果实是无籽西瓜果实。
[0165] 在一方面，提供了包含四条重组的3号染色体(即每条染色体包含来自野生西瓜的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含cyv_3.1)的四倍体西瓜植物。因此，所述四倍体植物包含四个拷贝的cyv_3.1。当它与包含两个拷贝的cyv_3.1的二倍体雄性亲本株系杂交时，所得的三倍体种子包含三个拷贝的cyv_3.1。
[0166] 为了制备这类四倍体植物，可使用上述任何CVYV抗性二倍体植物(其对于所述基因渗入片段而言是纯合的)作为起始材料以产生四倍体植物。技术人员已知的染色体加倍技术可用于从这类二倍体植物产生四倍体植物。例如，Noh et al.(2012)Hort.Environ.Biotechnol.53(6):521-529评估了产生四倍体西瓜的不同方法。在全部方法中，使用抗有丝分裂剂，例如秋水仙碱、二硝基苯胺(dinitoalanine)或黄草消(oryzalin)以诱导染色体加倍。任选地，组织培养物可用于从植物部位产生四倍体植物。为了验证该植物是四倍体，可确认染色体数目。通过染色体计数或流式细胞术或其他已知方法可容易地确定倍性(Sari et al.1999,Scientia Horticulturae 82:265-277，以引用的方式纳入本文)。
[0167] 因此，在本发明的一方面，提供了物种普通栽培西瓜的CVYV抗性的四倍体栽培西瓜植物，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段由于存在cyv_3.1基因座而赋予CVYV抗性，并且其中重组的3号染色体以四个拷贝存在。
[0168] 所述基因渗入片段可通过选自以下的标记物来检测(或包含选自以下的标记物)：
[0169] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0170] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和/或
[0171] c)SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0172] 如所提及的，所述四倍体植物包含四个拷贝的所述重组3号染色体。
[0173] 因此，在一个实施方案中，上述四倍体西瓜植物包含：
[0174] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的四倍体基因型GGGG(鸟嘌呤/鸟嘌呤/鸟嘌呤/鸟嘌呤)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的四倍体基因型GGGG(鸟嘌呤/鸟嘌呤/鸟嘌呤/鸟嘌呤)；和/或
[0175] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的四倍体基因型CCCC(胞嘧啶/胞嘧啶/胞嘧啶/胞嘧啶)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的四倍体基因型CCCC(胞嘧啶/胞嘧啶/胞嘧啶/胞嘧啶)；和/或
[0176] c)SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物的四倍体基因型。
[0177] 可以用与二倍体相同的方式，例如使用KASP测定法区分SNP基因型，来进行四倍体植物或植物部位(细胞、叶、DNA等)的基因分型，例如包含SNP_02的GGGG的植物或植物部位可以与在其基因组中包含SNP_02的GGGA、GGAA、GAAA或AAAA的植物或植物部位相区分。
[0178] 由于通过加倍上文另外所述的CVYV抗性二倍体的染色体来制备四倍体，上文针对二倍体所述的方面同样适用于四倍体。例如，所述四倍体也可在重组的3号染色体上包含互引相的zym基因，因此可包含4个拷贝的cyv_3.1(或其变体)和4个拷贝的zym。同样，单体型A或单体型B也可以以4个拷贝存在。
[0179] 因此，从上述二倍体可衍生出以下四倍体：
[0180]
[0181]
[0182] CVYV抗性四倍体优选地多次自交以产生近交四倍体，其在四倍体种子产生中可被用作雌性亲本。
[0183] 在一方面，其种子以登录号NCIMB 42449和NCIMB 42450保藏的二倍体CVYV抗性植物或其子代(例如包含更短的基因渗入片段)用于制备四倍体。这些植物不包含zym基因并且是ZYMV易感的。
[0184] 在一方面，其种子以登录号NCIMB 42666保藏的二倍体CVYV抗性植物或其子代(例如包含更短的基因渗入片段)用于制备四倍体。
[0185] 在另一方面，包含来自不同的野生西瓜(例如来自PI189318或其他)的cyv_3.1基因的栽培西瓜植物用于制备四倍体CVYV抗性植物。
[0186] 此外，包含cyv_3.1(或其变体)和zym基因的植物可用于制备四倍体。通过传统育种技术并选择重组体，可容易地将cyv_3.1(或其变体)与zym基因(例如存在于PI595203中的zym基因)结合，任选地在本文所述的标记物的辅助下，所述标记物在3号染色体上包含cyv_3.1和zym。PI595203可在USDA，ARS，国家遗传资源计划，种质资源信息网络(GRIN)获得。
[0187] 因此，在一方面，本文提供了四倍体西瓜植物(以及可从其生长出所述植物的种子)，其包含存在于NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB42666中或存在于PI189318或其他野生西瓜中的赋予CVYV抗性的基因座并任选地包含zym基因。
[0188] 在一方面，本发明的四倍体西瓜植物(以及可从其生长出所述植物的种子)是通过自交若干次而产生的近交株系。在一方面，所述植物适于作为亲本株系，用于产生四倍体种子，如下文所述。
[0189] 本文包括可从其生长出所述四倍体植物的种子。本文还包括本发明的四倍体植物的植物部位，例如细胞、花粉、花、果实、叶、茎等。果实优选地为可市售的果实。白利糖度优选地为至少6.0、7.0、8.0或至少9.0，优选地至少10.0，更优选地至少11.0或更高。果实颜色可以是任何颜色，例如红、暗红、猩红、珊瑚红、橙、橙红、粉、粉红、黄、淡黄或白色。优选地，果实果肉颜色是均一的。
[0190] 在一方面，本发明的四倍体植物是营养繁殖体。
[0191] 所述四倍体植物可以自交一次或多次，但是它们也可与另一种四倍体西瓜植物杂交。如果另一种四倍体西瓜植物缺少cyv_3.1，则由杂交产生的F1仅包含两个拷贝的cyv_3.1。如果所述植物再次与缺少cyv_3.1的四倍体植物杂交，可产生仅包含一个拷贝的cyv_
3.1的子代。类似地，如果所述植物自交，可产生包含一个或三个拷贝的cyv_3.1的子代。因此，本文还包括仅包含3、2或1个拷贝的cyv_3.1的四倍体西瓜。
3.1的子代。类似地，如果所述植物自交，可产生包含一个或三个拷贝的cyv_3.1的子代。因此，本文还包括仅包含3、2或1个拷贝的cyv_3.1的四倍体西瓜。
[0192] 包含cyv_3.1(或其变体)的三倍体栽培西瓜植物和植物部位
[0193] 在一方面，上述CVYV抗性四倍体植物可作为雌性亲本使用，并且用CVYV抗性二倍体雄性亲本(也如上文所述)的花粉进行授粉，并采收来自杂交的种子。这些种子是三倍体，即它们包含三个拷贝的本发明的cyv_3.1基因座。从这些种子生长出的植物具有CVYV抗性并产生无籽西瓜果实(三倍体果实)。任选地，所述植物也具有ZYMV抗性，即包含zym基因。
[0194] 因此，上文针对本发明的二倍体植物和四倍体植物所述的所有方面适用于三倍体种子和从这类种子生长出的植物。因此，例如，在一方面，所述cyv_3.1基因座是存在于以NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子中的cyv_3.1基因座。但是，它也可以是存在于野生西瓜(例如PI189318或其他)中的cyv_3.1基因。在另一方面，本文包括存在于以NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子中的基因渗入片段(包含cyv_3.1基因座)或其更短片段，所述更短片段保留了cyv_3.1基因座。但是本文还包括cyv_3.1的其他变体，例如来自其他野生西瓜种质。
[0195] 可从其生长出三倍体CVYV抗性植物的种子是本文的一个实施方案，从所述种子生长出的植物部位，以及由这些植物产生的无籽西瓜果实同样是本文的实施方案。
[0196] 三倍体无籽果实优选地为可市售的。优选地，它们的平均白利糖度为至少6.0,7.0,8.0或优选至少9.0，优选至少10.0，更优选至少11.0。
[0197] 果实可以为任何大小、形状、颜色和外皮图案。优选地，果实果肉颜色在成熟时是均一的。在一方面，果实果肉是红色或暗红色。
[0198] 包含3个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的三倍体杂种的平均果实重量可等于或大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14kg。在另一个实施方案中，包含3个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的三倍体杂种的平均果实重量可等于或小于5kg，例如4、3、2、1.5或1kg或甚至更小。
[0199] 无籽果实可以是任意形状(例如长形、椭圆、块状、球形或圆形)、果实表面(有皱纹的、光滑的)、果肉颜色(例如红、暗红、猩红、珊瑚红、橙、橙红、粉、粉红、黄、淡黄或白色)、外皮颜色(例如浅绿，深绿，具有窄纹、中纹或宽纹的绿色条纹，灰色类型；具有或不具有斑点；金黄)、外皮厚度、外皮韧度、外皮图案(例如条纹，非条纹，网格)、果肉结构/果肉硬度、番茄红素和/或维生素含量、不同的糖:酸比例、果实气味等。
[0200] 因此，通过传统育种，赋予CVYV抗性的cyv_3.1基因座(或变体)可用于培育一系列无籽品种，产生各种形状和大小的果实等。参见Guner and Wehner 2004,Hort Science 39(6):1175-1182，具体为1180-1181页，其描述了果实特征的基因。通常，重要的育种目的为：早熟性、高果实产率、高内部果实品质(良好的均一颜色、高糖、适合的糖:酸比例、良好的气味、高维生素和番茄红素含量、坚实的果肉质地、非纤维性果肉质地，没有以下缺陷如空心、外皮坏死、蒂腐病或cross stitch，以及良好的外皮特征和抗裂性)。
[0201] 在一方面，本发明的三倍体植物是营养繁殖体。
[0202] 营养繁殖体和细胞或组织培养物
[0203] 上述二倍体植物、四倍体植物或三倍体植物还可进行营养(无性)繁殖，并且这类营养繁殖的植物或“营养繁殖体”是本发明的一个实施方案。通过一种或多种(或全部)连锁至cyv_3.1(或其变体)的标记物和/或在表型上可容易地将它们与其他西瓜植物区分。
[0205] 其他方法包括体外细胞或组织培养方法以及从这类培养物再生营养繁殖体。这类细胞或组织培养物包含多种细胞或组织或由多种细胞或组织组成。在一方面，这类细胞或组织培养物包含营养细胞或营养组织或由营养细胞或营养组织组成。
[0206] 在另一方面，细胞或组织培养物包含生殖细胞或组织(例如花药或胚珠)或由其组成。可将这类培养物用染色体加倍试剂处理以制备例如双单倍体植物，或者它们可用于制备单倍体植物(例如，以从四倍体制备二倍体或从二倍体制备单倍体)。
[0207] 因此，体外细胞或组织培养物可包含来自植物部位的细胞或原生质体或植物组织或由来自植物部位的细胞或原生质体或植物组织组成，所述植物部位选自：果实、胚、分生组织、子叶、花粉、胚珠、叶、花药、根、根尖、雌蕊、花、种子、茎。还包括这些中任意一种的部分，例如仅有种皮(母体组织)。
[0208] 因此，在本发明的一方面，提供了包含一个、两个、三个或四个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的植物细胞的细胞培养物或组织培养物，其全部如上文所述。如所提及的，细胞培养物或组织培养物包含来自含有cyv_3.1的植物的植物部位的细胞或原生质体或植物组织，其可包含选自以下的细胞或组织或由选自以下的细胞或组织组成：胚、分生组织、子叶、花粉、叶、花药、根、根尖、雌蕊、花、种子、茎；或这些中任意一种的部分。
[0209] 还提供了从所述细胞培养物或组织培养物再生的西瓜植物，其中所述再生的植物(或其子代，例如在自交所述再生植物之后获得的子代)包含cyv_3.1基因座(或其变体)。因此，在一方面，包含一个或多个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的西瓜植物是营养繁殖的西瓜植物。
[0210] 在一个不同的方面，包含一个或多个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的本发明的细胞和组织(以及任选的细胞或组织培养物)是非繁殖的细胞或组织。
[0211] QTL cyv_3.1(或其变体)和/或连锁至cyv_3.1(或其变体)的标记物的方法和用途[0212] 通过例如以下方法，可将本发明的隐性cyv_3.1基因座(或其变体)(即包含所述基因座的基因渗入片段)转移至或引入任何其他栽培西瓜植物中：通过与本发明的植物(例如从所述保藏的种子生长出的植物)，或与本发明的营养繁殖的植物杂交，或通过鉴定包含cyv_3.1(或其变体)的野生西瓜植物并且将cyv_3.1(或其变体)从这类野生种质中渐渗到本文所述的栽培西瓜中。
[0213] 例如，可用一种或多种连锁至cyv_3.1基因座的标记物(例如SNP_02和/或SNP_03和/或一种或多种连锁至cyv_3.1的其他标记物)来筛选西瓜的野生种质以鉴定推定的包含cyv_3.1或其变体的野生种质。可任选地或替代地在CVYV抗性测定中对所述种质进行表型筛选和/或可将所述种质与栽培西瓜植物杂交并筛选杂交子代中的CVYV抗性标记物基因型和/或CVYV抗性表型。因此，技术人员能够在其他野生西瓜种质中鉴定QTL cyv_3.1或其变体，将其转移到栽培西瓜的3号染色体上(例如通过回交4、5、6、7或更多次至栽培西瓜株系)以产生本发明的二倍体西瓜植物。之后这些可用于产生本文所述的四倍体和二倍体。
[0214] 因此，通过例如以下方法，可将cyv_3.1或其变体赋予的CVYV抗性杂交到栽培西瓜的不同遗传背景中：通过使用本文中保藏的种子作为cyv_3.1来源，如本文别处所述，或通过在野生西瓜种质中鉴定cyv_3.1(或其变体)并将其(回交)杂交至栽培西瓜。
[0215] 使用已知的育种技术，可将cyv_3.1(或其变体)引入到缺少cyv_3.1(或其变体)的西瓜植物中。已知的育种技术可以单独使用或与以下组合使用，例如(但不限于)轮回选择、谱系育种、回交育种、近交发育、杂种试验、标记物辅助育种等。之后使用一种或多种本文提供的标记物和/或CVYV抗性(当没有显性WT等位基因存在时)来选择保留cyv_3.1(或其变体)的子代。因此，通过在自交一次或多次的植物中进行CVYV抗性的表型选择并通过抛弃CVYV易感的植物，可选择具有cyv_3.1(或其变体)的子代植物。例如，如果将因CVYV抗性而分离的子代接种或种植在CVYV感染区，可容易地鉴定CVYV抗性植物。
[0216] 因此，在一方面，提供了产生物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜的方法，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，所述方法包括以下步骤：
[0217] 杂交在3号染色体上包含赋予CVYV抗性的基因座的野生西瓜植物与二倍体栽培西瓜植物，并选择所述杂交的子代，其包含栽培西瓜的基因组和来自野生西瓜植物植物的3号染色体上的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座。
[0218] 野生西瓜植物和/或子代中赋予CVYV抗性的基因座的存在可使用CVYV抗性测定法在表型上确定，和/或通过检测本文所述的一种或多种连锁至cyv_3.1(或其变体)的标记物的存在，在分子水平上确定，所述标记物选自：
[0219] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0220] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和/或(任选地)
[0221] c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0222] 所述基因渗入片段也可被转移到其他二倍体栽培西瓜植物，例如以结合CVYV抗性和其他性状。因此，在另一方面，提供了产生物种普通栽培西瓜的二倍体栽培西瓜的方法，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，所述方法包括以下步骤：
[0223] 杂交在3号染色体上包含赋予CVYV抗性的基因座的二倍体栽培西瓜植物(如上文所述)与另一种二倍体栽培西瓜植物，特别是在3号染色体上缺少赋予CVYV抗性的基因座的植物，以及选择所述杂交的子代(例如F1、F2、F3或进一步自交子代或回交子代)，其包含栽培西瓜的基因组和来自野生西瓜植物的3号染色体上的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座。子代还可以是一次或多次回交产生的(任选地与一次或多次自交结合果)，例如BC1、BC1S1、BC1S2、BC2、BC2S1、BC3等。同样，可使用所述的一种或多种标记物和/或CVYV抗性测定来确定子代中所述基因渗入片段的存在。
[0224] 还提供了选择或鉴定这样的西瓜种子、植物或植物部位或来自所述种子、植物或植物的DNA的方法，即所述西瓜种子、植物或植物部位在它们的基因组中在3号染色体上包含基因渗入片段，所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，所述方法包括：
[0225] 筛选西瓜种子、植物或植物部位(例如细胞)或来自所述种子、植物或植物部位的DNA中连锁至cyv_3.1(或其变体)的本文所述的一种或多种标记物的存在，例如选自以下的一种或多种标记物：
[0226] a)SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)(SNP_02)或包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的鸟嘌呤(G)；和/或
[0227] b)SEQ ID NO:3的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)(SNP_03)或包含与SEQ ID NO:3的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处的胞嘧啶(C)；和/或(任选地)
[0228] c)在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0229] 所述西瓜种子、植物或植物部位可以是单倍体、双单倍体、二倍体、三倍体或四倍体。显然，筛选一种或多种标记物的存在可包括筛选(检测)若干拷贝的所述标记物，例如四倍体中SNP_02的四个拷贝的鸟嘌呤(G)。同样，替代地或额外地，本文包括筛选WT(易感)SNP基因型的不存在。因此，当提及在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处包含鸟嘌呤(G)(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处包含鸟嘌呤(G)的二倍体植物、植物部位或DNA时，所述标记物测定替代地或额外地可检测在SEQ ID NO:2的第76位核苷酸处(SNP_02)或在包含与SEQ ID NO:2的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的第76位核苷酸处腺嘌呤(A)的存在或不存在。
[0230] 任选地，所述方法还包括选择一种或多种包含一个拷贝(例如对于单倍体或二倍体而言)、两个拷贝(例如对于二倍体或双单倍体而言)、三个拷贝(例如对于三倍体而言)或四个拷贝(例如对于四倍体而言)的基因渗入片段的种子、植物或植物部位。
[0231] 可根据标准方法来检测本文所述的分子标记物。例如，使用KASP测定(参见www.kpbioscience.co.uk)或其他SNP基因分型测定，可容易地检测SNP标记物。为了进行KASP测定，例如可选择SNP上游的70碱基对和SNP下游的70碱基对，并且可设计两种等位基因特异性正向引物和一种等位基因特异性反向引物。参见，例如Allen et al.2011,Plant Biotechnology J.9,1086-1099，特别是p097-1098的KASP测定法。
[0232] 因此，在一方面，使用KASP测定来确定与cyv_3.1连锁的标记物的存在/不存在，但是同样可以使用其他SNP基因分型测定。例如，同样可以使用TaqMan SNP基因分型测定、高分辨率熔解(HRM)测定、SNP基因分型测定(例如Fluidigm,Illumina等)或DNA测序。
[0233] 在一个不同的方面，提供了产生物种普通栽培西瓜的四倍体栽培西瓜的方法，其中所述植物在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含赋予CVYV抗性的基因座，所述方法包括以下步骤：
[0234] 加倍二倍体栽培西瓜或其部位的染色体，所述二倍体具有CVYV抗性，这是因为在3号染色体上存在包含纯合形式的赋予CVYV抗性的基因座的基因渗入片段(如别处所述)，以及鉴定(或选择)四倍体植物或植物部位，以及任选地从其产生整株植物。
[0235] 所述四倍体植物任选地进一步自交一次或多次以产生近交四倍体株系，其包含四个拷贝的cyv_3.1或其变体。
[0236] 关于通过秋水仙素处理加倍染色体和四倍体鉴定，参见，例如http://cuke.hort.ncsu.edu/cucurbit/wmelon/seedless.html。
[0237] 同样，可通过检测一种或多种或全部连锁的标记物来确定cyv_3.1或其变体的存在。
[0238] 提供了产生具有CVYV抗性的四倍体近交植物的方法，包括以下步骤：
[0239] a)提供在3号染色体上包含来自野生西瓜植物的基因渗入片段的二倍体近交株系，所述基因渗入片段包含纯合形式的赋予CVYV抗性的基因座，和
[0240] b)加倍所述近交株系或所述株系的植物部位的染色体，以产生四倍体株系或四倍体植物部位，并再生所述株系的四倍体植物，和
[0241] c)自交所述四倍体株系若干代。
[0242] 在步骤a)中，所述二倍体植物可以是上文所述的本发明的任何二倍体植物，例如它可以是来自以NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏的种子的植物或任意这些的子代，或者可以是通过杂交将来自种子保藏物NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666的cyv_3.1转移至其中的二倍体植物。所述二倍体还可以是通过将来自野生CVYV抗性西瓜的cyv_3.1或其变体渐渗到栽培西瓜中而产生的新二倍体植物。所述基因渗入可以例如来自PI189318或其他野生西瓜种质。
[0243] 在另一方面，提供了产生物种普通栽培西瓜的三倍体杂种西瓜植物的方法，所述方法包括：
[0244] 杂交包含四个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的四倍体母本株系与包含两个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的二倍体父本株系，并收集母本株系上产生的种子。任选地，可干燥所采收的种子。
[0245] 四倍体雌性株系的授粉可在隔离区中通过手工或通过昆虫(例如蜜蜂)进行。为了确保用来自雄性二倍体的花粉来授粉四倍体雌花，可使用不同的方法，例如手工收集雄花和手工授粉雌花，然后覆盖被授粉的花。或者，可去掉所有在四倍体植物上发育的雄(具有雄蕊的)花，以确保用二倍体花蕊来授粉四倍体植物上的具有雌蕊的花。当四倍体植物上的果实成熟时，采收果实并收集三倍体F1杂种种子(由异花授粉产生的)。然后可将这些种子分类(例如通过大小)、干燥、任选地进行处理并包装用于售卖。因此，包含通过上述方法获得的种子或由通过上述方法获得的种子组成的包装或容器是本文的一个实施方案。
[0246] 在一个实施方案中，提供了用于产生无籽三倍体果实的方法，包括：
[0247] a)套种包含三个拷贝的cyv_3.1或其变体的三倍体杂种西瓜植物和二倍体授粉植物，
[0248] b)允许三倍体杂种植物上的雌花授粉发生，以及任选地
[0249] c)从三倍体杂种植物采收果实。
[0250] 因此，对于无籽果实生产，可将本发明的三倍体CVYV抗性杂种与适合的二倍体授粉植物(例如可使用Jenny或Polimax，或Super-pollenizers(SP-1,SP-2,SP-3,SP-4,SP-5)、Sidekick、Escort-4、Companion或其他)套种。任选地，所述授粉植物可以是双目标的授粉植物，如WO2012/069539A1所述。二倍体授粉植物应当在一天中的适当时间产生足够的花粉并持续适当的时间段以在三倍体杂种中诱导座果。所述授粉植物可以是杂种二倍体(F1二倍体)或开放授粉的(OP)授粉植物。之后从本发明的三倍体植物采收果实。
[0251] 可将三倍体植物移植到不同的根茎上。所述方法优选地在开放田间进行。在一个田地中的套种可以通过播种或移植授粉植物和三倍体进行。可使用本领域已知的多种套种方法并且可使用授粉植物:三倍体杂种的多种比例。例如，至少每2行、至少每3行、或至少每4行三倍体中可存在一行授粉植物，但是也可使用其他套种方法。通常通过蜜蜂来进行授粉，并且可在田间提供蜂箱，除非天然存在足够的野生蜜蜂。也可通过手工或机械方法来进行授粉。成熟时的采收可通过手工或机械方法来进行。
[0252] 包含三个拷贝的cyv_3.1(或其变体)的三倍体果实是无籽的。可采收果实，用于新鲜食用或用于加工。包含多个这类果实或果实部位或由多个这类果实或果实部位组成的容器是本发明的另一个实施方案。因此，可将采收的果实分类，包装在容器中等。包含三倍体果实或由三倍体果实组成的容器优选地包含可市售的果实或由可市售的果实组成，所述果实在它们的基因组中包含三个拷贝的cyv_3.1(或其变体)。本文还包括包含果实部位的容器以及包含果实部位的食品或饲料产品。
[0253] 本发明的用途
[0254] 本发明的一方面是cyv_3.1(或其变体)用于产生CVYV抗性栽培西瓜植物(所述植物产生可市售的果实)的用途。同样，包括连锁至cyv_3.1(或其变体)的任意标记物在鉴定和/或选择包含或保留cyv_3.1(或其变体)的植物或植物部位或子代中的用途。
[0255] 在一方面，还提供了本发明的二倍体植物或双单倍体植物作为父本或母本的用途，其中所述植物与另一株西瓜植物杂交或使其自受精以产生子代。
[0256] 在一方面，提供了本发明的四倍体植物作为父本或母本的用途，其中所述植物与另一株西瓜植物(例如与二倍体父本)杂交或使其自受精以产生子代。尤其包括四倍体作为母本在杂种三倍体西瓜种子产生(即F1种子产生)中的用途。
[0257] 在另一方面，提供了本发明的三倍体植物在三倍体无籽果实产生中的用途。
[0258] 种子和植物部位和子代
[0259] 应理解，本发明的目的是提供可生长出本文所述的二倍体、三倍体或四倍体植物的种子。本文还包括本发明的二倍体、双单倍体、三倍体或四倍体植物的幼苗、接穗和根茎，以及细胞和组织。这类植物部位包含本发明的cyv_3.1(或其变体)。所述植物的植物部位可例如选自接穗、果实、花粉、胚珠、茎、子叶、叶、细胞、胚、分生组织、花药、根、根尖、雌蕊、花和/或种子。
[0260] 本文还提供了本发明的任意植物的子代，例如可通过杂交本文所述的包含cyv_3.1(或其变体)的植物与另一种西瓜植物和/或通过自交本发明的植物以产生F1种子而获得的种子，以及其他世代的子代(F2、F3等)。子代中cyv_3.1(或其变体)的存在可通过CVYV抗性测定和/或标记物分析来确定。
[0261] 获自(源自)或可获自(可源自)本发明的植物(例如包含cyv_3.1或其变体的植物)包括通过育种方法(例如自交、杂交、回交、轮回选择、双单倍体产生、标记物辅助选择、克隆繁殖、转化体等)获得的植物，其中获得的植物包含至少一条重组的3号染色体，所述染色体包含本发明的cyv_3.1(或变体)。
[0262] 在一方面，提供了西瓜植物，其代表性数量的种子以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏，或任何这类植物的子代，例如通过杂交和/或自交获得的子代。
在一方面提供了西瓜种子，其代表性数量的种子以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏。还提供了从这些植物或从其子代获得的花粉、胚珠、细胞、组织、营养繁殖体。在一方面，子代保留了所述植物的cyv_3.1，所述植物的种子以NCIMB 42449或NCIMB
42450或NCIMB 42666保藏。在一方面，子代保留了植物的3号染色体上的基因渗入片段(包含cyv_3.1)或所述基因渗入片段的更短片段，其中所述更短片段保留了赋予CVYV抗性的基因座(cyv_3.1)，所述植物的种子以NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏。
在一方面提供了西瓜种子，其代表性数量的种子以登录号NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏。还提供了从这些植物或从其子代获得的花粉、胚珠、细胞、组织、营养繁殖体。在一方面，子代保留了所述植物的cyv_3.1，所述植物的种子以NCIMB 42449或NCIMB
42450或NCIMB 42666保藏。在一方面，子代保留了植物的3号染色体上的基因渗入片段(包含cyv_3.1)或所述基因渗入片段的更短片段，其中所述更短片段保留了赋予CVYV抗性的基因座(cyv_3.1)，所述植物的种子以NCIMB 42449或NCIMB 42450或NCIMB 42666保藏。
[0263] 精细定位、测序和等位性检验
[0264] cyv_3.1基因座存在于3号染色体的约2.50Mb和约12.8Mb之间的区域，参见图1。使用本领域已知的方法可进行精细定位以确定所述基因座的精确位置。例如，可产生包含基因渗入区域的更短部分的重组株系，然后使用CVYV测定来确定哪个片段仍赋予针对CVYV的抗性(因此保留了所述基因座)。或者，还可对所述区域进行测序以鉴定备选的抗性基因。使用这类方法或类似方法，可鉴定更紧密连锁至cyv_3.1基因座(或变体)的标记物，例如，在SNP_02或SNP_03的5Mb、3Mb、2Mb、1Mb、0.5Mb、0.1Mb、74kb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小的物理距离内可鉴定连锁至cyv_3.1基因座(或变体)的野生西瓜基因组特异性分子标记物。
[0265] 类似地，任何CVYV抗性野生西瓜种质(例如PI189318或其他)可以与栽培的CVYV易感西瓜杂交以产生新的定位种群，并且确定CVYV抗性是否由cyv_3.1或其变体赋予，即如果CVYV抗性QTL被定位在3号染色体的相同区域，则野生种质明显包含cyv_3.1基因座或其变体。
[0266] 如果两种西瓜植物都具有CVYV抗性并且不清楚所述抗性是否由相同的QTL引起，则可使用不同的方法来确认是否涉及相同的基因座(即cyv_3.1或变体)。如所提及的，标记物检验和/或测序和/或QTL定位或精细定位可用于确定来自野生西瓜的赋予抗性的基因渗入片段是否存在于3号染色体的区域中。替代地或额外地，可进行等位性检验，即两株植物可杂交并且可分析子代植物中表型(CVYV抗性)的分离。
[0267] 以下非限制性实施例描述了本发明的包含cyv_3.1的植物。除非在实施例中另外说明，使用传统西瓜育种方法，例如Maynard 2001,Watermelons–Characteristics,Production and Marketing,ASHS Press；Mohr H.C.Watermelon Breeding in Mark J.Bassett(editor)1986 Breeding Vegetable Crops,AVI Publishing Company中描述的方法。
[0268] 保藏信息
[0269] Nunhems.V.已经保藏了二倍体栽培西瓜株系的种子，其包含纯合形式的cyv_3.1并且产生具有Crimson Sweet型外皮的果实，登录号为NCIMB 42449；以及二倍体栽培西瓜株系的种子，其包含纯合形式的cyv_3.1并且产生具有Jubilee型外皮的果实，登录号为NCIMB 42450。所述种子由Nunhems.V.于2015年8月18日保藏于NCIMB Ltd.(英国，阿伯丁郡AB219YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦)。在本申请未决期间，由专利和商标局主任确定的有资格的人员可请求并获得所述保藏物。
[0270] Nunhems.V.已经保藏了二倍体栽培西瓜良种株系的种子，其包含纯合形式的cyv_3.1并且产生红色果肉果实，登录号为NCIMB 42666。所述种子由Nunhems.V.于2016年9月26日保藏于NCIMB Ltd.(英国，阿伯丁郡AB219YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦)[0271] 所有种子均保藏根据布达佩斯条约进行，并且利用Expert solution。
[0272] 受37C.F.R.§1.808(b)的制约，在专利授权时，因允许获得保藏物，保藏者针对一种或多种保藏物的公众可获得性而提出的所有限制都会被永久性地取消。所述保藏物将被维持30年，或在最近一次请求之后5年的时间，或被维持到专利的有效寿命期，以较长时间为准，在此期间如果所述保藏物一旦不能存活，都要将其替换。申请人不会放弃任何本专利申请或植物品种保护法(7USC 2321et seq.)所授予的任何权利。
[0273] 实施例
[0274] 实施例1：CVYV抗性——QTL定位
[0275] 从野生西瓜种质和CVYV易感近交专用株系之间的杂交产生两个F2定位种群。所述种群的基因型>3000SNP。
[0276] 在意大利，在气候试验室中使用CVYV测定进行F3株系的表型分析。手工接种第一展开真叶(播种之后15至20天)，第二次接种在第一次接种之后4-5天。对照植物仅用缓冲剂接种。
[0277] 将每种基因型的共14株植物用包含CVYV(Almeria型毒株)的接种物接种，设两个重复样品，并包括作为易感对照的Sugar Baby。使用随机区块设计。将CVYV维持在冷冻的感染的叶组织中。为了制备接种物，在易感黄瓜品种Sheila上进行病毒的预增殖。然后将品种Sheila的新鲜、具有症状的幼叶用于制备接种物(在冰床上用研杵和研钵压碎1克鲜叶/5ml 0.03M磷酸盐缓冲剂，以及活性炭和硅藻土)。
[0278] 孵育接种的植物，12-14小时光照，日间温度25℃，夜间温度18℃。以固定的间隔(例如接种后20天(dpi)、35dpi、50dpi、65dpi)对叶的CVYV症状进行评分。30dpi之后易感对照Sugar Baby必须出现严重症状。将个体植物在三个类别中计分：a)易感——叶上存在症状，b)抗性——叶上没有症状，c)存疑。对于被认为是抗性的株系而言，至少90％的该株系的植物必须被记录为“抗性”。
[0279] QTL定位揭示了在两个定位种群中3号染色体上CVYV抗性的主要QTL，其被称为cyv_3.1。
[0280] 为了更好地定位QTL，在置信区间中鉴定更多SNP标记物。鉴定了三种紧密连锁至所述QTL的标记物，参见表1(见上文)，称为SNP_01、SNP_02和SNP_03。
[0281] 表3：
[0282]SNP 染色体 3号染色体上的碱基位置
SNP_01 Chr_03 7,586,752
SNP_02 Chr_03 7,664,093
SNP_03 Chr_03 7,693,225
SNP_01 Chr_03 7,586,752
SNP_02 Chr_03 7,664,093
SNP_03 Chr_03 7,693,225
[0283] 实施例2：cyv_3.1回交至良种株系
[0284] 使用标记物辅助回交，将cyv_3.1回交(4至6次回交)至若干良种株系，两种良种株系的种子以登录号NCIMB 42449和NCIMB 42450保藏。
[0285] 在穆尔西亚，以与实施例1中所述的方式相同的方式，在气候试验室中连续两年评估NCIMB 42449和NCIMB 42450的植物及其自交子代中针对CVYV的抗性(表型分析)。
[0286] 结果示于以下表4中：
[0287]
[0288] 实施例3标记物验证
[0289] 在不同西瓜材料集合中对这些标记物的验证发现了CVYV抗性的两种单体型，从而SNP_01能够区分所述单体型。所测试的全部商用杂种具有与Sugar Baby相同的基因型，并且全部为CVYV易感的。
[0290] 表5：
[0291]
[0292] 实施例4：ZYMV抗性是3号染色体上的独立基因座
[0293] 从文献中可知，ZYMV抗性也位于3号染色体上，本发明人想知道CVYV抗性植物是否也具有ZYMV抗性。他们用ZYMV的欧洲毒株或美国毒株接种了NCIMB 42449和NCIMB 42450。对于被公开为连锁至zym基因的SNP(本文中称为SNP_04)，他们还重新分析了SNP标记物数据。
[0294] 表6：
[0295]
[0296] 结果表明，cyv_3.1和zym是3号染色体上的独立基因座，并且SNP_04可用于区分ZYMV抗性植物和ZYMV易感植物。
[0297] 实施例5：四倍体株系
[0298] 使用秋水仙素处理，NCIMB 42449和NCIMB 42450用于产生CVYV抗性的四倍体株系。对于NCIMB 42449，制备5种推定的四倍体株系，而对于NCIMB 42450，制备10种推定的四倍体株系。
[0299] 实施例6：野生西瓜种质的筛选
[0300] 筛选源自例如US GRIN保藏中心的野生二倍体西瓜种质的子代中的CVYV抗性以及它们的SNP基因型中的SNP_01、SNP_02和SNP_03。
[0301] 发现源自PI189318的一个株系具有以下SNP基因型和以下抗性表型：
[0302] 表7：
[0303] SNP_01 SNP_02 SNP_03 CVYV抗性
PI189318 GG GG CC 抗性
PI189318 GG GG CC 抗性
[0304] 因此，该野生西瓜可用于将cyv_3.1渐渗到栽培西瓜中，例如通过回交。
[0305] 任选地，可通过杂交PI189318与由本文保藏的种子生长出的植物来进行等位性检验以确认PI189318包含cyv_3.1基因。
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