[0002] 本发明在其一些
实施例中涉及瓜植株,所述瓜植株具有无籽小果实和提高的果实产量,和涉及产生所述瓜植株的方法。
[0003] 单性结实,即无籽果实的产生,可通过在多种作物中添加
植物生长调节剂生长素、细胞分裂素或赤霉素来实现。已显示在若干植物物种中,将生长素或赤霉素外源施加至未受精的花会在缺少
授粉的情况下诱导坐果,从而导致单性结实果实的产生。在先前产生无籽果实的努
力中,传统植物育种和
激素的外源施加已在使用上获得一些成功。然而,植物激素的外源施加是劳动密集型过程,并且传统植物育种是长期的过程。此外,先前产生某些无籽果实的尝试中的至少一些已导致低数量的无籽果实,和/或导致与正常有籽果实相比相对小的无籽果实。在大多数情况下,这导致在小果实品种中产量显著降低。
[0004] 甜瓜(Cucumis melo)展示出果实性状的极度多样性。瓜果实在大小、形状、外部
颜色、香气以及果肉特征如糖含量、酸度和色素淀积上变化。尽管如此,现代食品市场仍存在对新果实类型的日益增长的需求。在瓜中,坐果和果实数量是主要在激素
水平上受支配的性状。坐果受起因于在枝上的先前的雌花发育为果实的成功或失败的激素通话(talk)影响,然而一般单株果实数量是相当恒定的。通常,大多数瓜品种将在田间产生单株1-5个果实。
[0005] 本领域对用于无籽果实生产的有效和经济的手段和方法存在长期需要,尤其是与
现有技术无籽果实相比在良好的产量和品质上。
[0006] 背景技术包括美国
专利申请号20120324597和WO2011/018785。
发明内容
[0007] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供甜瓜植株或其部分,所述植株结出多于12个果实,所述果实是无籽的。
[0008] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供具有MELO3C009603/melo3c009603基因组的甜瓜植株,从而使得在自花授粉后,25%的F1结出多于12个果实,所述果实是无籽的。
[0009] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供甜瓜植株的插条,所述甜瓜植株属于本文所述植株。
[0010] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供具有MELO3C009603/melo3c009603基因组的甜瓜植株的
种子,从而使得在自花授粉后,25%的F1结出多于12个果实,所述果实是无籽的。
[0011] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供具有本文所述的植株中任一种的基因组的细胞。
[0012] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供包含多个本文所述的细胞的培养物。
[0013] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供培育第一甜瓜的方法,所述方法包括使本文所述的植株与第二甜瓜植株杂交,由此培育出所述甜瓜。
[0014] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供多种对MELO3C009603突变杂合的甜瓜种子,在种植后所述甜瓜种子在从其中衍生的25%植株中产生增强的果实作物(crop)表型。
[0015] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供通过本文所述方法产生的杂种种子。
[0016] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供杂种植株或其部分,所述杂种植株或其部分是通过使本文所述的杂种种子生长而产生的。
[0017] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供使本文所述的植株中的任一种生长的方法,所述方法包括使植株
营养繁殖,由此使植株生长。
[0018] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供分离多核苷酸,其包括如阐述于SEQ ID NO:9中的序列。
[0019] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供分离多肽,其包括如阐述于SEQ ID NO:8中的序列。
[0020] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供甜瓜植株的标记辅助选择的方法,所述甜瓜植株具有提高的果实产量或具有产量提高的子代,所述方法包括对在至少一个MELO3C009603等位基因中功能缺失突变的存在进行分析,其中所述突变的存在指示植株或其子代将结出多于5个无籽果实。
[0021] 根据本发明的一些实施方案的一个方面,提供包含本文所述的植株或其部分的食品或加工产品。
[0022] 根据本发明的一些实施方案,所述植株结出多于15个果实。
[0023] 根据本发明的一些实施方案,所述植株结出多于20个果实。
[0024] 根据本发明的一些实施方案,所述植株的总可溶性固形物(TSS)含量和β-胡萝卜素含量与野生型甜瓜植株相似。
[0025] 根据本发明的一些实施方案,所述植株的总果实重量大于野生型甜瓜植株的总果实重量。
[0026] 根据本发明的一些实施方案,所述植株属于品种硬皮甜瓜(C .melo Cantalupensis)。
[0027] 根据本发明的一些实施方案,所述植株的基因组中MELO3C009603的两个等位基因均具有导致无籽性状的功能缺失突变。
[0028] 根据本发明的一些实施方案,所述MELO3C009603的两个等位基因在其
位置97具有F/I突变。
[0029] 根据本发明的一些实施方案,所述MELO3C009603的多核苷酸序列如阐述于SEQ ID NO:7中的那样。
[0030] 根据本发明的一些实施方案,所述MELO3C009603的多肽序列如阐述于SEQ ID NO:8中的那样。
[0031] 根据本发明的一些实施方案,所述植株部分选自根、茎、叶、子叶、花、果实、胚和花粉。
[0032] 根据本发明的一些实施方案,所述杂交包括授粉。
[0033] 根据本发明的一些实施方案,所述甜瓜植株的亚种选自melo Cantalupensis、Noy Yizre'el、Ein Dor和Piel De Sapo。
[0034] 根据本发明的一些实施方案,第二甜瓜植株不是本文所述的植株中的任何种(例如,在MELO3C009603中不具有突变)。
[0035] 根据本发明的一些实施方案,25%的所述植株结出多于5个果实,所述果实是无籽的。
[0036] 根据本发明的一些实施方案,使用选自以下的测定法来进行标记辅助选择:单
碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、DNA测序、RNA测序、基于微阵列的分析、通用PCR、等位基因特异性延伸、杂交、质谱分析法、连接、延伸连接以及瓣状核酸内切酶介导的测定法。
[0037] 除非以其他方式定义,否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的方法和材料可在本发明的实施方案的实践或测试中使用,但下文描述了示例性方法和/或材料。在冲突的情况下,将以本专利
说明书(包括定义)为准。另外,所述材料、方法和实施例仅是示例性的,不意图为必然限制性的。
[0039] 本文仅以举例方式参考附图来描述本发明的一些实施方案。现在具体参考详细附图,要强调所示详情是以举例方式并且是为了本发明实施方案的示例性论述的目的。在这点上,描述以及附图使得本领域的那些技术人员对可如何实践本发明的实施方案显而易见。
[0040] 在附图中:
[0041] 图1是在田间结出果实的‘超级果树(superfruiter)’(‘sf’)植株的照片。
[0042] 图2是各种‘sf’果实类型内部的照片。
[0043] 图3是代表性单个‘sf’植株的所有果实的照片。
[0044] 图4A-C是说明衍生自四种独立杂交的‘sf’和野生型F2分离子的田间性能的条形图。水平实线和虚线分别表示所有野生型和‘sf’的平均值。A-平均果实数量;B-平均果实重量;C-平均单株果实重量(产量)。
[0045] 图5A-B是说明来自CEZבsf’杂交的‘sf’和野生型F2分离子的品质的条形图。A-CEZ、‘sf’和野生型分离子的10个果实的平均白利糖度(TSS);B-CEZ、‘sf’和野生型分离子的10个果实的平均β-胡萝卜素含量。
[0046] 图6是从(从左至右)‘sf’、‘CEZ’和它们的F1植株的DNA扩增的213个碱基对(bp)PCR产物的ApoI酶切产物的照片。DNA
片段的碱基对(bp)大小在左侧呈现。正向引物TAGACATGAGCCGCATCTGA(SEQ ID NO:3)和反向引物GAACGTGGCAACAACAACAA(SEQ ID NO:4)用于PCR扩增。
[0047] 图7是‘sf’(MELO3C009603)的‘锌指(Zing Finger)’(ZF)基序的比对,显示‘F97’至‘I’的
氨基酸变化(红框)。C2H2的两个半胱氨酸和组氨酸氨基酸是加粗的。CHYCCRNFPTSQALGGHQNAH(SEQ ID NO:5);CHYCCRNIPTSQALGGHQNAH(SEQ ID NO:6)。
[0048] 图8A-B是说明MELO3C009603(sf基因)表达量的图表。图8A-在’sf’和野生型集群(bulks)中MELO3C009603(sf基因)的基于RNA测序的数字表达量;图8B-在包含各集群的组织中MELO3C009603的相对表达量(APR1基因作为参考)的定性RTPCR分析。
[0049] 图9是显示在三种分离种群和重叠的种群中所有差异表达基因(DEG)的维恩图。
[0050] 图10A是说明在等基因‘sf’和野生型(CEZ)集群中MELO3C021150(种子珠心基因)的基于RNA测序的数字表达量的图表。
[0051] 图10B是说明在包含等基因集群的组织中、由qRTPCR分析(APR1基因作为参考)的MELO3C021150的相对表达量的图表。
[0052] 图11A-B提供MELO3C009603的野生型互补DNA序列(图11A-SEQ ID NO:7)和在突变植株中MELO3C009603的突变氨基酸序列(图11B-SEQ ID NO:8)。图11A。第一个ATG以黄色突出显示,并且TAA终止密码子以红色突出显示。野生型中编码‘F’的‘TTC’是加粗的,并且‘sf’中突变至‘A’的‘T’为红色;图11B-‘sf’基因的
蛋白质序列。锌指结构域为蓝色,C2和H2为绿色并且突变氨基酸‘I’为红色。ZF结构域内的QAALGH基序是加下划线的。
具体实施方式
[0053] 本发明在其一些实施例中涉及:瓜植株,其具有提高的果实产量,并且涉及产生所述瓜植株的方法。
[0054] 在对本发明的至少一个实施方案进行详细解释之前,应理解本发明在其应用上不必受限于在以下描述中阐述或由实施例示例的细节。本发明能够具有其他实施方案或以各种方式实践或实施。
[0055] 在葫芦科中,甜瓜是最重要的栽培瓜类中的一种。甜瓜主要因它们的果实被种植,果实一般在大小(500g至5kg)、果肉颜色(橙色、绿色和白色)、
果皮颜色(绿色、黄色、白色、橙色和灰色)、形状(圆形、卵形和细长形)以及尺寸(5cm至25cm宽;10cm至50cm长)上具有巨大多样性。
[0056] 当尝试创建瓜植株的新型变种时,本发明者使用化学诱变剂甲磺酸乙酯(EMS)处理了CEZ(‘charantais’型瓜,由ARO开发)瓜种子,并且选择了具有提高的果实数量和产量的‘超级果树’瓜植株(本文称作“sf”植株)(图1和3)。对来自这些植株的果实进行检查,揭示出它们的果实是无籽的,或具有微小的空的未发育种子(图2)。通过HPLC对在突变果实中的类胡萝卜素分析揭示出与非突变等基因对应物CEZ相比相似的β胡萝卜素含量。此外,总可溶性固形物(TSS)含量揭示出突变果实具有与在非突变等基因对应物内相比相似的糖含量。
[0057] ‘CEZ’的野生型植株单株会发育平均四个果实,并且在一个枝上仅会发育一个果实,而‘sf’能够在各个枝上产生多个果实。在野生型植株中,雌花的成功受精和果实发育的起始将抑制相同枝上来自下一朵雌花的额外果实发育。在‘sf’中这种抑制机制失活。使用‘sf’制造的正反交指示‘sf’的花粉是完全受精的,将仅在受精后果实发育,然而在‘sf’的小果实中将不含有种子或含有小的空种子。因此,‘sf’遭受不阻止果实发育并且不抑制在相同枝上多个额外果实产生的种子败育。
[0058] 如由在四种独立的F2分离种群中‘sf’的分离分析证明的,这种独特的产量增长被显示是由单隐性基因(MELO3C009603,编码Cys2His2(C2H2)型锌指蛋白)支配的。
[0059] 因此,根据本发明的一个方面,提供甜瓜植株或其部分,所述植株结出多于12个果实,所述果实是无籽的。
[0060] 如本文所使用的术语“植株”包括整个植株,植株的祖先和子代,和植株部分(包括种子、果实、
幼苗、茎、根(包括
块茎)),以及植株细胞、组织和器官。植株可以是任何形式的,包括愈伤组织、悬浮培养物、胚、分生组织区、叶、配子体、孢子体、花粉、胚珠以及小孢子。
[0061] 如本文所使用的术语“瓜”指的是物种甜瓜(Cucumis melo L.),包括亚种
马泡瓜(agrestis)(越瓜(conomon)、香瓜(makuwa)、momordica和acidulous)以及melo(硬皮甜瓜(cantalupensis)、网纹甜瓜(reticulatus)、adana、chandalok、ameri、冬甜瓜(inodorus)、菜瓜(flexuosus)、chate、tibish、看瓜(dudaim)和柠檬瓜(chito)。
[0062] 本文使用的术语“栽培种”用来表示具有不同于“野生”状态的
生物状态的植株,其中“野生”状态指的是植株或增加物(accession)的原始非栽培或天然状态。术语“栽培种”(针对栽培的品种)包括但不限于半天然的、半野生的、
杂草似的、传统栽培种、地方品种、育种材料、研究材料、育种者的系、合成种群、杂种、建立者原种(founder stock)/基本种群、近交系(杂种栽培种的亲本)、分离种群、突变/遗传原种以及高级/改良栽培种。栽培种的实例包括属于以下分类群的此类栽培品种:硬皮甜瓜(Charantais和意大利哈密瓜(Italian cantaloupe)果实类型),网纹甜瓜(Galia和Ananas果实类型),以及冬甜瓜(包括Piel De Sapo、黄金丝雀(Yellow Canary)、Branco和蜜瓜(Honeydew)果实类型)。因此,本发明中的植株是属于任何甜瓜变种(var.)的植株。术语“变种”指的是变种(在如上文详述的物种之下的分类水平)。
[0063] 根据一个实施方案,本发明的这个方面的植株与在相同条件下种植的、遗传背景相同的野生型植株相比具有提高的果实产量(即,在一特定时间结出多于10个果实、12个果实、15个果实、20个果实、25个果实或甚至多于30个果实)。通常,所述果实中每个的平均重量是350gm,取决于遗传背景具有100-600gm的范围(图4B)。在一特定时间,所述植株可包含单枝至少2个、至少3个、至少5个果实。
[0064] 植株上的大多数果实处在相同成熟阶段,这取决于果实成熟的呼吸跃变(climacteric)/非呼吸跃变模式的程度。
[0065] 将理解所述植株的总果实重量(即,作物)大于野生型甜瓜植株的总果实重量。
[0066] 如本文所使用的短语“野生型甜瓜植株”指的是具有非突变、天然存在的基因组的甜瓜植株。
[0067] 本发明者已显示本发明的这个方面的植株的瓜的糖含量和β胡萝卜素含量与它们的非突变(野生型)对应物相似。将理解野生型对应物不具有在影响β胡萝卜素含量的其他基因如CRTISO中的突变,如公开于美国专利申请号20120324597中的。因此,本发明的这个方面的植株的瓜可在各种遗传背景下培育为可食用的并且具有高品质。它们适合作为新鲜产品、作为鲜切产品,或用于例如像罐头制造的加工。
[0068] 如所提及的,本发明的这个方面的植株的瓜是无籽的。
[0069] 如本文所使用的,术语“无籽瓜”指的是不含有受精成熟种子的瓜。尽管本发明的瓜不含有受精成熟种子,但所述瓜可能含有小的并且白色的未受精子房。这些未受精子房不被认为是真种子。在所述果实中的种子含量与遗传背景和种植条件相同的野生型瓜的相比降低至少80%。
[0070] 根据本发明的这个方面,无籽性状由遗传决定因子控制,并且不依赖于使用诱导单性结实的植物激素的外源处理。因此,无籽性状是由焦核(stenospermocarpy)而不是由单性结实得到的。
[0071] 根据一个实施方案,至少80%的给定植株果实的种子含量降低至少80%、至少90%至约99%或甚至100%。
[0072] 根据另一个实施方案,至少85%的给定植株果实的种子含量降低至少80%、至少90%至约99%或甚至100%。
[0073] 根据另一个实施方案,至少90%的给定植株果实的种子含量降低至少80%、至少90%至约99%或甚至100%。
[0074] 根据另一个实施方案,至少55%的给定植株果实的种子含量降低至少80%、至少90%至约99%或甚至100%。
[0075] 根据另一个实施方案,至少99%的给定植株果实的种子含量降低至少80%、至少90%至约99%或甚至100%。
[0076] 本发明的这个方面的瓜植株特征在于含有具有功能缺失突变的MELO3C009603基因(野生型cDNA序列-SEQ ID NO:7)的两个等位基因,所述具有功能缺失突变的MELO3C009603基因导致果实作物性状增强(和任选地无籽性状)。MELO3C009603可具有产生所述性状两者的单突变,或具有两个突变——其中一个产生增强的果实作物性状,并且另一个产生无籽性状。根据一个具体实施方案,突变的MELO3C009603氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:8中。
[0077] MELO3C009603可以是纯合形式或杂合形式。根据这个实施方案,纯合性是MELO3C009603基因座处的两个等位基因由相同核苷酸序列来表征的情况。杂合性指的是MELO3C009603基因座处基因的不同情况。
[0078] 如本文所使用的术语“等位基因”指的是基因座的一种或多种交互(alternative)形式中的任一种,所述等位基因中的所有涉及性状或特征。在二倍
体细胞或有
机体中,给定基因的两个等位基因在一对同源
染色体上占据对应的基因座。
[0079] 如本文所使用的术语“基因”指的是决定有机体(即,瓜植株)的生物学特征的遗传因子,“等位基因”是存在于(二倍体)瓜植株中的基因对中的单个基因。
[0080] 当植株含有所述基因的相同等位基因时,植株被称作对基因“纯合的”,和当植株含有所述基因的两个不同等位基因时,称作对基因“杂合的”。大写字母的使用指示显性(a形式)基因,并且小写字母的使用表示隐性基因:因此,“X,X”表示对基因或特性X的纯合子显性基因型;“X,x”和“x,X”表示杂合子基因型;并且“x,x”表示纯合子隐性基因型。如通常已知的,除非其他基因和/或因子如多个等位基因、抑制因子、共显性等(还)在表型决定中起作用,否则仅纯合子隐性基因型一般将提供对应的隐性表型(即,导致显示特性或性状“x”的植株),而杂合的和纯合子显性基因型一般将提供对应的显性表型(即,导致显示特性或性状“X”的植株)。
[0081] “功能缺失突变”是在基因序列中的突变,其引起基因产物(通常为蛋白质)的功能降低或完全缺乏。功能缺失突变可例如由由于移码或无义突变的基因产物平截或由单个或多个氨基酸的变更造成。与具有功能缺失突变的等位基因相关的表型通常是隐性的,还可以是显性的。
[0082] 根据一个具体实施方案,在瓜基因组的
支架11上的位置3,450,971处,MELO3C009603的两个等位基因携带A至T突变,从而导致在预测MELO3C009603蛋白的位置97处的F/I氨基酸变化。突变MELO3C009603的示例性多核苷酸序列阐述于SEQ ID NO:9中。突变MELO3C009603的示例性多肽序列阐述于SEQ ID NO:8中。
[0083] 将理解本发明还包括通过从‘sf’瓜植株取插条并且进行营养繁殖来产生甜瓜果实。
[0084] 可使用本领域众所周知的方法实现营养繁殖,例如体外植物组织培养、侧枝(side shoot)生根或原生质体融合。在一个实施方案中,使本发明植株营养繁殖的方法包括:a)收集本发明植株的组织;b)培养所述组织以获得增殖幼苗(proliferated shoots);c)使所述增殖幼苗生根以获得生根小植株;以及d)使植株从所述生根小植株生长。
[0085] 根据本发明的这个方面的插条可包括根、茎、叶、子叶、花、果实、胚和花粉。优选地,所述插条包括茎和顶端(epical)分生组织或侧枝分生组织。
[0086] 根据一个实施方案,本发明的植株属于杂种品种—即,在两种非等基因植株杂交(即,交配)之后产生。杂种可以是F1杂种或自由授粉的品种。
[0087] 如本文所使用的“F1杂种”指的是两种非等基因植株杂交的第一代子代。
[0088] 本发明的瓜杂种的开发需要稳定亲本系的开发,而亲本系中的至少一种是对sf基因杂合的。在育种程序中,使来自两个或多个种质源或基因库的期望性状结合以开发优良育种品种。通过连续自花授粉和最佳育种系的选择来开发所期望的近交或亲本系,其中有时利用分子标记以
加速选择过程。
[0089] 一旦给出最佳杂种性能的亲本系已被鉴定例如在MELO3C009603中均携带突变,则只要维持亲本的同质性,就能无限(indefinitely)产生杂种种子。根据一个实施方案,本发明的瓜植株是稳定亲本植株系(以杂合形式在MELO3C009603基因中携带功能缺失突变)。
[0090] 如本文所定义的,短语“稳定亲本系”指的是自由授粉的近交系,其跨自花授粉和种植的周期对所需植株稳定。通常,在本发明的亲本系中95%的基因组是纯合形式的。
[0091] 根据另一个方面,本发明提供用于产生第一代(F1)‘sf’杂种瓜小植株的方法。
[0092] 根据一个实施方案,本发明提供用于产生第一代‘sf’杂种小植株(以及种子)的方法,所述方法包括使第一稳定亲本瓜植株与第二稳定‘sf’杂合亲本瓜植株杂交(例如授粉),所述第一稳定亲本瓜植株是无籽的并且具有增强的果实作物(例如,对MELO3C009603突变的纯合子或杂合子)。
[0093] 将理解25%或50%的F1杂种瓜种子对MELO3C009603突变是纯合的,这取决于是否仅一个或两个亲本系是杂合的‘sf’。
[0094] 根据另一个实施方案,本发明还提供能够选择F‘1 sf’小植株的DNA标记。
[0095] 因此,根据本发明的另一个方面,提供具有MELO3C009603/melo3c009603基因组的甜瓜植株,从而使得在自交后,25%的F1结出多于5个果实,所述果实是无籽的。
[0096] 本发明还涉及从这些F1杂种瓜植株
收获的种子以及从这些种子生长出的植株。
[0097] 植物育种中的常见做法是使用回交方法以通过单性状转换来开发新品种。
[0098] 如本文所使用的短语“单性状转换”指的是将新的单基因并入亲本系,其中恢复亲本系的除所转移的单基因以外基本上所有所需形态和生理特征。
[0099] 如本文所使用的术语“回交”指的是杂种子代返回至亲本瓜植株其中之一的重复杂交。为所需特征贡献基因的亲本瓜植株被称为非轮回亲本或供体亲本。该术语指的是非轮回亲本在回交方案中使用一次并且因此不轮回的事实。将来自非轮回亲本的基因转移至的亲本瓜植株被称为轮回亲本,因它在回交方案中使用数轮。
[0100] 在典型的回交方案中,将来自目标原始品种(轮回亲本)的植株杂交至选自携带待转移的目标单基因的第二品种(非轮回亲本)的植株。然后,将从该杂交所得的子代再次杂交至轮回亲本,并且重复所述过程直至得到瓜植株,其中在转换植株中恢复除从非轮回亲本转移的单基因以外轮回亲本的基本上所有所需形态和生理特征。
[0101] 因此,可通过多次回交创建
近等基因系(NIL)以产生个体阵列,所述个体在遗传组成上除了在询问下的性状或基因组区域(在这个情况下是MELO3C009603中的‘sf’突变)外几乎相同。
[0102] 本发明可使用回交方法以改善或引入特征至亲本系。
[0103] 可进行甜瓜小植株的标记辅助选择,所述甜瓜小植株将结出多于5个无籽果实(或其部分能够产生结出多于5个无籽果实的植株)。这尤其有利于选择插条或回交过程期间。所述方法包括对A/T突变的存在进行分析,所述A/T突变导致在MELO3C009603预测蛋白的位置97处的F/I氨基酸变化,其中突变的存在指示植株将结出多于5个无籽果实或其部分将产生结出多于5个无籽果实的植株。
[0104] 本领域已知用于对突变进行分析的多种方法,包括例如单碱基延伸(SBE)、等位基因特异性引物延伸测序(ASPE)、DNA测序、RNA测序、基于微阵列的分析、通用PCR、等位基因特异性延伸、杂交、质谱分析法、连接、延伸-连接、瓣状核酸内切酶介导的测定法、限制性片段长度多态性(RFLP)、
电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)以及随机扩增多态性DNA(RAPD)。
[0105] 因此,本发明包括可用于MELO3C009603的突变和非突
变形式之间的区分的寡核苷酸(例如,引物)。一组示例性引物描述于实施例部分-SEQ ID NO:3和4。
[0106] 本发明者考虑用于本发明的瓜植株的产生的化学诱变和重组技术两者。
[0107] 因此,本发明的瓜植株可通过将瓜植株或其部分暴露于化学诱变剂而产生。化学诱变剂的实例包括但不限于亚
硝酸,烷化剂如甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、
硫酸二乙酯(DES),以及碱基类似物如5-溴-脱
氧尿苷(5BU)。用于使用化学诱变来产生本发明的瓜植株的示例性方法包括在水中浸泡瓜种子12个小时,接着在EMS(例如,1%)中浸泡额外12个小时。然后种植经处理的种子(M1)并且自花授粉以制备M2族。
[0108] 如所提及的,还可以使用其他技术来产生本发明的瓜植株,所述技术包括但不限于:(a)MELO3C009603基因的缺失;(b)MELO3C009603基因的转录失活(c)MELO3C009603基因转录物的反义RNA介导的失活;(d)MELO3C009603基因转录物的翻译失活;以及(e)MELO3C009603基因的基因组编辑。
[0109] 因此,例如,包括与MELO3C009603基因同源的序列的基因敲入或基因敲除构建体可被产生,并且用于将辅助序列插入酶编码基因的编码序列内,以由此使该基因失活。
[0110] 这些构建体优选地包括正选择和负选择标记,并且因此可用于对同源重组事件进行选择。本领域普通技术人员可容易设计敲入/敲除构建体,所述构建体包括用于有效选择转化植物细胞的正选择和负选择基因两者,所述转化植物细胞经受与所述构建体发生同源重组的事件。然后可使此类细胞生长成完整植株。本领域已知的标准方法可用于实施敲入/敲除程序。此类方法阐述于例如,美国专利号5,487,992、5,464,764、5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5,175,385、5,175,384、5,175,383、4,
736,866以及Burke和Olson,Methods in Enzymology,194:251-270,1991;Capecchi,Science 244:1288-1292,1989;Davies等,Nucleic Acids Research,20(11)2693-2698,
1992;Dickinson等,Human Molecular Genetics,2(8):1299-1302,1993;Duff和Lincoln,“Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells”,Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders,1995;Huxley等,Genomics,9:742-750
1991;Jakobovits等,Nature,362:255-261 1993;Lamb等,Nature Genetics,5:22-29,
1993;Pearson和Choi,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:10578-82;Rothstein,Methods in Enzymology,194:281-301,1991;Schedl等,Nature,362:258-261,1993;Strauss等,Science,259:1904-1907,1993中,WO 94/23049、WO93/14200、WO 94/06908和WO 94/28123也提供信息。
[0111] 因此,根据本发明的一个具体实施方案,通过核酸构建体引入至瓜植株来产生瓜植株,所述核酸构建体包含:核酸序列,其编码上调MELO3C009603表达量的多核苷酸介质(agent),MELO3C009603具有产生提高的作物产量性状(和任选地无籽性状)的突变;以及顺式作用调节元件,其能够指导植株中多核苷酸介质的表达量。
[0112] 在根据本发明的方法中有用的构建体可使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术来构建。可将基因构建体插入载体内,所述载体可商购获得,适合于转化入植株内并且适合于在转化细胞中目标基因的表达。基因构建体可以是表达载体,其中核酸序列可操作地连接至一个或多个允许在植物细胞中表达的调节序列。
[0113] 根据本发明的这个方面的多核苷酸可编码在位置97处具有例如F/I突变的MELO3C009603。在位置97处具有F/I突变的示例性MELO3C009603的多肽序列通常与阐述于SEQ ID NO:8中的序列至少90%同源、至少91%同源、至少92%同源、至少93%同源、至少94%同源、至少95%同源、至少96%同源、至少97%同源、至少98%同源、至少99%同源或
100%同源。编码此类蛋白的示例性多核苷酸的核酸序列可与阐述于SEQ ID NO:9中的核酸序列至少90%同源、至少91%同源、至少92%同源、至少93%同源、至少94%同源、至少95%同源、至少96%同源、至少97%同源、至少98%同源、至少99%同源或100%同源。
[0114] 在本发明的一个具体实施方案中,调节序列是植物可表达启动子。
[0115] 如本文所使用的短语“植物可表达的”指的是启动子序列,所述启动子序列包括添加至其或其中所含的任何额外调节元件,至少能够在瓜细胞、组织或器官中诱导、赋予、激活或增强表达。
[0116] 启动子可以是可调节启动子、组成型启动子或组织相关性启动子。
[0117] 如本文所使用的,术语“可调节启动子”指的是任何启动子,其活性受特定环境条件或发育条件影响。
[0118] 如本文所使用的,术语“组成型启动子”指的是任何启动子,其在大多数时间在植物转化体的多种或所有组织中指导RNA产生。
[0119] 如本文所使用的,术语“组织相关性启动子”指的是任何启动子,其在特定类型的细胞和组织中指导较高水平的RNA合成(例如,果实相关性启动子)。
[0120] 可用于表达可操作连接的核酸序列(即,转基因)的示例性启动子包括花椰菜花叶病毒启动子CaMV和
烟草花叶病毒TMV启动子。
[0121] 可用于本发明情形中的其他启动子包括描述于美国专利号20060168699中的和由Hector G.Numez-Palenius等[Critical Reviews in Biotechnology,第28卷,第1期,2008年3月,第13-55页]描述的那些,两者均通过引用并入本文。
[0122] 可用本发明核酸构建体稳定或瞬时地转化植物细胞。在稳定转化中,本发明核酸分子整合入植物基因组内,并且因而它表示稳定和遗传的性状。在瞬时转化中,核酸分子由转化的细胞表达,但它不整合入基因组内,并且因而它表示瞬时性状。
[0123] 存在各种将外源基因引入单子叶和双子叶植物两者的方法(Potrykus,I.,Annu.Rev.Plant.Physiol.,Plant.Mol.Biol.(1991)42:205-225;Shimamoto等,Nature(1989)338:274-276)。
[0124] 使外源DNA稳定整合入植物基因组DNA的原理方法包括两种主要方法:
[0125] (i)农杆菌介导的基因转移:Klee等(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38:467-486;Klee和Rogers在Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,第6卷,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes,编辑Schell,J.和Vasil,L.K.,Academic Publishers,SanDiego,Calif.(1989)第2-25页中;Gatenby在Plant Biotechnology,编辑Kung,S.和Arntzen,C.J.,Butterworth Publishers,Boston,Mass.(1989)第93-112页中。
[0126] (ii)直接DNA摄取:Paszkowski等,在Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,第6卷,Molecular Biology of Plant Nuclear Genes编辑Schell,J.和Vasil,L.K.,Academic Publishers,SanDiego,Calif.(1989)第52-68页中;包括用于将DNA直接摄取入原生质体的方法,Toriyama,K.等(1988)Bio/Technology 6:1072-1074。由植物细胞的短暂电击诱导的DNA摄取:Zhang等Plant Cell Rep.(1988)7:379-384。Fromm等Nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击将DNA注射入植物细胞或组织,Klein等Bio/Technology(1988)6:559-563;McCabe等Bio/Technology(1988)6:923-926;Sanford,Physiol.Plant.(1990)79:206-209;通过微量移液管系统的使用:Neuhaus等,Theor.Appl.Genet.(1987)75:30-36;Neuhaus和Spangenberg,Physiol.Plant.(1990)79:213-217;细胞培养物、胚或愈伤组织的玻璃
纤维或
碳化
硅晶须转化,美国专利号5,464,765或者通过使用萌发的花粉的DNA直接孵育,DeWet等在Experimental Manipulation of Ovule Tissue,编辑Chapman,G.P.和Mantell,S.H.和Daniels,W.Longman,London,(1985)第197-209页中;以及Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:715-719。
[0127] 农杆菌系统包括含有整合入植物基因组DNA的限定DNA区段的质粒载体的使用。植物组织的接种方法根据植物物种和农杆菌输送系统而变化。广泛使用的方法是可用任何组织外植体进行的叶圆盘程序,组织外植体提供用于整个植株分化起始的良好来源。Horsch等在Plant Molecular Biology Manual A5,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht(1988)第1-9页中。补充方法采用与
真空渗入组合的农杆菌输送系统。农杆菌系统在转基因双子叶(dicotyledenous)植物的产生中尤其可行。
[0128] 存在各种将DNA直接转移入植株细胞内的方法。在电穿孔中,原生质体短暂地暴露于强
电场。在显微注射中,使用极小微量移液管将DNA直接机械注射入细胞内。在微粒轰击中,DNA被
吸附在微粒如
硫酸镁晶体或钨颗粒上,并且微粒被物理加速进入细胞或植株组织内。
[0129] 在稳定转化之后执行植株繁殖。植株繁殖的最常见方法是通过种子。然而,因为种子是由植株根据受孟德尔法则支配的遗传变异而产生的,所以通过种子繁殖的再生具有由于杂合性而在作物上缺乏均匀性的
缺陷。基本上,每个种子在遗传上不同,且各自将以其自有特异性性状生长。因此,优选转化植株如此产生以致再生植株具有亲本转基因植株的相同性状和特征。因此,优选通过提供转化植株的迅速一致的繁殖的微繁殖来再生转化植株。
[0130] 微繁殖是从已从
选定亲本植株或栽培种
切除的单片组织生长出新一代植株的方法。这种方法允许含有表达融合蛋白的优选组织的植株的大规模繁殖。产生的新一代植株与原始植株在遗传上相同,并且具有原始植株的所有特征。微繁殖允许在短时段内优质植物材料的大规模生产,并且在原始转基因或转化植株的特征保存下提供选定栽培种的迅速增殖。克隆植株的优点是植株增殖的速度以及所产生植株的品质和均匀性。
[0131] 微繁殖是多阶段程序,其需要在阶段之间变更培养基或生长条件。因此,微繁殖方法包括四个基本阶段:阶段一,初始组织培养;阶段二,组织培养物增殖;阶段三,分化和植株形成;以及阶段四,
温室培养和硬化。在阶段一初始组织培养期间,组织培养物被形成并且检定无污染。在阶段二期间,使初始组织培养物增殖,直至产生足够数量的组织样本以达到生产目标为止。在阶段三期间,在阶段二中生长出的组织样本被分开并且生长成单个小植株。在阶段四,将转化的小植株转移至温室用于硬化,在温室中植株对光的耐性逐渐增加,从而使得它可以在自然环境中生长。
[0132] 尽管目前优选稳定转化,但本发明还设想了叶细胞、分生细胞或整个植株的瞬时转化。
[0133] 可通过上述DNA直接转移方法中的任一种或通过使用经修饰的植物病毒的
病毒感染来实现瞬时转化。
[0134] 已显示对植物宿主的转化有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒的植株转化描述于美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A 67,553(TMV),日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA194,809(BV)、EPA 278,667(BV);以及Gluzman,Y.等,Communications in Molecular Biology:Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,第172-189页(1988)中。用于在多种宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒颗粒描述于WO 87/
06261中。
[0135] 如本文所使用的术语“约”指的是±10%。
[0136] 术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”以及它们的变化形式意指“包括但不限于”。
[0137] 术语“由...组成”意指“包括且限于”。
[0138] 术语“基本上由...组成”意指组合物、方法或结构可包括额外成分、步骤和/或部分,但只有当额外成分、步骤和/或部分实质上不改变要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新型特征时才成立。
[0139] 如本文所使用的,除非上下文明显以其他方式规定,否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用。例如,术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物,包括它们的混合物。
[0140] 如本文所使用的术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序,所述方法包括但不限于化学、药理学、生物学、生化学和医学领域的从业者已知的或由所述从业者容易从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
[0141] 要理解的是,为清楚起见,描述于单独实施方案的情形中的本发明的某些特征,还可以在单个实施方案中以组合形式提供。相反地,为简洁起见,描述于单个实施方案的情形中的本发明的各种特征,还可以单独地或以任何适合的亚组合形式或如果合适的话在本发明的任何其他描述的实施方案中来提供。不应认为描述于各种实施方案的情形中的某些特征是那些实施方案的必要特征,除非实施方案在没有那些要素的情况下不生效。
[0142] 如上文中描写和如在以下
权利要求书部分中要求保护的本发明的各种实施方案和方面在下列实施例中找到实验支持。
[0143] 实施例
[0144] 现参考下列实施例,实施例以及上文的描述以非限制性形式说明本发明的一些实施方案。
[0145] 一般而言,本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子技术、生化技术、
微生物学技术和重组DNA技术。此类技术充分说明于文献中。参见例如,“Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook等,(1989);“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷Ausubel,R.M.编(1994);Ausubel等,“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988);Watson等,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York;Birren等(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,第1-4卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998);方法学如阐述于美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中的;“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,第I-III卷Cellis,J.E.编(1994);Freshney的“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版;“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.编(1994);Stites等(编),“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(编),“Selected Methods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980);可得的
免疫测定法广泛描述于专利和科学文献中,参见例如,美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,
850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,
345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521;“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.编(1984);“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985);“Transcription and Translation”Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1984);
“Animal Cell Culture”Freshney,R.I.编(1986);“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press,(1986);“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal,B.,(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷,Academic Press;“PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”,Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak等,“Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996);上述所有好像完全阐述于本文中的那样通过引用并入本文。其他一般参考提供于该文件各处。于其中的程序被认为是本领域众所周知的,并且为了读者的便利性而提供。所有于其中含有的信息通过引用并入本文。
[0146] 材料和方法
[0147] 植物材料
[0148] 使‘CEZ’,’Charentais’型瓜(甜瓜亚种meloCantalupensis属)的种子经受EMS诱变,对M1植株自花授粉,对M2族进行视觉表型并且如先前所述地选择突变体系(Tadmor等,2007)。在田间和在温室中在常规条件下种植植株。
[0149] 果实类胡萝卜素分析
[0150] 对五个成熟果实进行收获、去皮、切片,并且将中心切片切成小立方体并立即在液氮中冷冻。将冷冻果实样本在液氮存在下通过A11分析
研磨机(Ika)磨至细粉。如描述于Tadmor等,(2005)中的从在己烷:丙
酮:
乙醇(50:25:25,v/v/v)混合物中的0.5g
磨碎的组织提取类胡萝卜素,并且使用配备有Waters 996PDA检测器和Millennium
软件(Waters)的Waters(Milford,MA)2695HPLC装置如先前描述地(Tadmor等,2000)进行分析、鉴定和量化。
[0151] RNA提取
[0152] 根据Portnoy等2011如下文描述地进行用于RNA序列分析的RNA提取。用于RT-PCR的额外RNA提取使用相同方案,缩小1/20,从于1.5ml管中的约100mg冷冻组织开始。
[0153] 于液氮中使用研钵和研杵将冷冻果皮组织(约5g的1.5mm宽果皮)粉化。于50ml管中通过涡旋将粉化的组织与10mL的提取缓冲液(含0.2M Tris-HCl(pH 9.0)、0.2M
乙二胺四乙酸(EDTA)、0.4M NaCl和2%(w/v)SDS)良好混合,并且在65℃下孵育5min。然后,添加30%(w/v)月桂酰肌氨酸钠至2%(v/v)终浓度,并且涡旋混合物并在65℃下孵育2min至3min。将等体积
苯酚添加至溶液,进行涡旋,并且以5000g离心5min。将水相转移至在
冰上的新50ml管,接着是三轮三氯甲烷-异戊醇(24:1,v/v)萃取。用1/10体积的3M乙酸钠(NaAc)(pH 5.3)和2体积的95%(v/v)EtOH沉淀核酸。将所得核酸颗粒(pellet)溶解于10mL 2M LiCl中,在4℃下过夜。通过在4℃下以15,000g离心10min来沉淀总RNA,并且将总RNA溶解于0.5mL焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。在用1/10体积的3M NaAc(pH 5.3)和2体积的95%EtOH再沉淀之后,将颗粒溶解于50μl至100μl DEPC水中。用DNaseI(Thermo scientific)根据制造商的方案进一步处理RNA。在DNase反应之后,样本通过三氯甲烷-异戊醇萃取
净化、用1/10体积的3M NaAc和2体积的95%EtOH沉淀、用70%EtOH净化、
风干5min并且于水中稀释。通过ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE)、SB 1%琼脂糖凝胶中的电泳来分析RNA的
质量,并且在琼脂糖凝胶上观察用来检查是否存在DNA污染的内含子侧翼引物的PCR。
[0154] 使用triReagent(Sigma)根据制造商的说明书提取叶RNA。根据制造商的方案应用DNaseI(Thermo scientific),并且通过三氯甲烷-异戊醇的添加来净化、使用异丙醇沉淀、使用70%EtOH洗涤、放置5分钟以风干并且溶解于ddH2O中。通过NanoDrop测定RNA浓度。
[0155] RNA序列
[0156] 在DNase处理后,在1%琼脂糖凝胶上检查RNA样本的完整性,在NanoDrop中检查RNA样本的纯度(大约2的260/280比率,大约2.4的260/230比率),并且通过使用EF1α-内含子引物的PCR分析确定不存在DNA污染。
[0157] F-AGGCTGATTGTGCTGTCCTT-SEQ ID NO:1;
[0158] R-GATGGGAACGAAGGGAATTT-SEQ ID NO:2。
[0159] 当在琼脂糖凝胶上分离(fractionated)时,与303bp cDNA相比,含DNA污染的样本应产生391bp的
扩增子。使用二体积的EtOH和1/10体积的3M NaAc使含约30μg RNA的样本沉淀,并且储存在-20℃下。使用TruSec RNA Samp Prep
试剂盒FC-121-1031(Illumina Inc)根据制造商的说明书进行链特异性文库的构建。在
干冰上船运用于使用Illumina HiSeq2000进行测序的十二个文库。将每个文库单独地编
条形码,并且在每个文库产生平均17×106个50bp读数(reads)的一个Illumina泳道中对所有文库进行测序。将Illumina读数分拣至它们的文库并且去除条形码。在RNA测序的结尾针对低质量碱基修整原始读数,并且使用FASTX-工具盒去除低质量读数。然后,使用TopHat版本v2.0.10(Kim等,2011)将所得高质量读数对映至瓜基因组,并且使用HTseq v0.5.3p3进行计数。在R环境下的Bioconductor DESeq程序包(Anders,2010)用于鉴定‘sf’与‘野生型’样本之间的差异表达基因。显示FDR<
0.05的基因被认为是差异表达的。使用变体识别程式GATK Unified Genotyper程序(版本
2.5-2)(DePristo等,2011)进行SNP分析,并且过滤以实现高可信度SNP组。
[0160] RT-PCR
[0161] 1μg RNA用于使用‘Verso系统’(Thermo scientific)根据制造商的说明书进行的cDNA合成。在Eco RT-PCR系统(Illumina)中进行反应。每个样本含有:1μl cDNA、0.2μl各引物(10mM)、5μl FastSYBR green master mix反应混合物(Applied Biosystems)和3.6μl ddH2O。将机器如酶制造商
指定的设定程序。相对于持家基因ARP1进行各分析,并且在Eco版本4软件中分析。
[0162] DNA提取
[0163] 于液氮中使用研钵和研杵研磨幼嫩的植物分生组织(约1gr)。通过以1:1:0.4的比率混合提取缓冲液(0.35M山梨醇、0.1M Tris、5mM EDTA,pH7,在使用前加入0.02M亚硫酸氢钠):核酸裂解缓冲液(0.35M山梨醇、0.1M Tris、5mM EDTA,pH7,在使用前加入2%CTAB):5%肌氨酰来制备DNA提取溶液。由Sigma供应所有化学药品。在65℃下孵育DNA提取溶液。将
600μl DNA提取溶液添加至称重至1.5ml管内的100μg组织,进行混合并且在65℃下孵育10分钟。添加600μl三氯甲烷:异戊醇(比率24:1),以200RPM混合5分钟,以15,000g离心10分钟,并且将上清液移入新管内。添加冷的异丙醇(上清液体积的2/3),进行混合,在-20℃下孵育30分钟至过夜,以20,000g离心10分钟,移除液相,用70%EtOH洗涤颗粒,再次沉淀并且移除EtOH,将颗粒风干5分钟,用50-200μl水溶解,添加2μl RNase,在37℃下孵育样本
30min,以15,000g离心3min,并且将上清液移至新管。在NanoDrop中测定DNA的浓度和纯度,在0.8%琼脂糖凝胶上检查DNA完整性。
[0164] 结果
[0165] 超级果树的鉴定
[0166] 进行衍生自育种系‘CEZ’的诱变种子的2,000个M2族的视觉表型分析。每个M2族在田间由12个植株表示。针对独特表型分离一个族;与平均带有3个果实的野生型植株相比,种植在田间的所述12个植株中的3个带有单株多于15个果实(图1和2)。突变体果实中的每个重大约300gr,而野生型果实重约900gr。有趣的是,突变体果实无种子或含有极微小的空种子。这种突变在本文中被称为‘超级果树’(图3)。当稀疏‘sf’植株的果实时,果实仍为小的。
[0167] 超级果树的遗传
[0168] 一旦发育了足够多的根,就将超级果树(‘sf’)植株的插条转移至温室。从插条发育的‘sf’植株不能自花授粉。然而,它们的花粉用于‘CEZ’、‘NoyYizre'el’、‘Ein Dor’和‘Piel De Sapo’系的成功授粉,并且得到了可存活的F1种子。种植这些种子,并且F1植株成功自花授粉以产生F2种子。F2种群中每种的150-200个植株被种植在田间,使其在商业生产条件下生长并且由
蜜蜂自由授粉。一旦果实产生,则本发明者可视觉区分‘sf’与野生型表型。在所有四种F2种群中,’sf’作为单隐性基因分离(表1)。
[0169] 表1
[0170]
[0171]
[0172] 卡方值是分离子与1:3预期孟德尔比率的偏差。‘n’-种群大小;P值大于0.05指示存在观测偏差可能仅仅由于随机几率的高概率。
[0173] 为了评估‘sf’的产量,本发明者测量了所有‘sf’植株的果实数量和重量,将果实总数除以植株数以得到平均单株果实数量,将果实重量总数除以植株数以得到平均单株产量,并且将果实重量总数除以果实数量以得到平均果实重量。对野生型植株进行相似的测量和计算。在所有测试的遗传背景下,‘sf’带有显著更多的果实(图4A)、显著更小的果实(图4B)和显著更高的单株产量(图4C)。
[0174] 为了测定‘sf’对果实品质的效应,本发明者随机摘取CEZ的10个成熟果实和CEZבsf’野生型和‘sf’表型分离子的10个成熟果实。对果实进行品尝,对作为糖含量指标的总可溶性固形物(TSS)进行分析,对β-胡萝卜素含量进行HPLC分析。未检测出‘sf’对主要由糖含量决定的瓜果味的效应。未检测出在‘sf’、野生型分离子或‘CEZ’之间的品质(包括TSS或β-胡萝卜素含量)差异(图5A-B)。
[0175] 为了鉴定决定’sf’表型的基因,选择了10个植株的两个复制(replications):在’sf’×NY中和在‘sf’×ED分离F2种群中显示‘sf’或野生型表型,从‘sf’×CEZ分离F2种群和‘sf’起源系CEZ中显示‘sf’表型。在授粉后2-4天的年龄时对来自这些植株中每个的芽分生组织、茎、雌花和幼嫩果实进行
采样。自每个组织×表型组合的集群提取RNA。使来自所有组织的等量RNA结合以开发两个复制:‘sf’×NY的和‘sf’×ED分离F2种群的‘sf’和野生型表型(八个库),来自‘sf’×CEZ分离F2种群和‘sf’起源系CEZ的‘sf’表型(四个库)。对十二个文库使用对每个文库产生平均17x106个读数的Illumina HiSeq2000进行RNA测序分析。通过比较表型库(衍生自’sf’×NY和’sf’×ED分离F2种群)的RNA测序数据鉴定的单核苷酸多态性(SNP)沿瓜基因组散布,然而它们中的大多数
定位在支架11上。然后,本发明者寻找了在‘CEZ’中纯合的、在所有‘sf’表型中携带交互等位基因以及在所有野生型表型中主要携带‘CEZ’等位基因的SNP。定位在4号染色体的支架11上的MELO3C009603中的单SNP相比于‘CEZ’(‘T’)在所有‘sf’材料(‘A’)中固定,并且在所有‘野生型’表型中是次要等位基因。
[0176] 设计PCR扩增213bp片段的引物,所述片段在野生型等位基因中含有ApoI限制性位点,而在sf中是突变的。
[0177] F TAGACATGAGCCGCATCTGA-SEQ ID NO:3
[0178] R GAACGTGGCAACAACAACAA-SEQ ID NO:4
[0179] 在PCR扩增片段上进行ApoI酶切,在野生型中产生140bp和73bp片段,当酶切纯合子‘sf’突变体时产生213bp片段,并且在杂合子中产生所有三种条带(图6B)。这种标记在各由至少300个植株组成的四种独立F2种群中显示出与‘sf’表型完全共分离。
[0180] MELO3C009603编码Cys2His2锌指(ZF)蛋白。‘T’至‘A’的颠换将编码位置97处高度保守的氨基酸苯丙氨酸(F97)的TTC变化为在ZF基序中编码异亮氨酸(I)的ATC(图7)。
[0181] RNA测序数据指示MELO3C009603的数字表达量低,在各集群中仅40-60个读数,并且在两个集群中相似。这些集群包括若干组织的混合物。对在这些组织中每个中的MELO3C009603相对表达量使用定量RTPCR进行分析,并且发现在叶中MELO3C009603具有相似的低表达量,且在所有其他受分析组织中具有相似的极低表达量(图8A-B)。
[0182] 对差异表达基因(DEG)的RNA测序数据分析鉴定出103个基因,所述103个基因在‘CEZ’与‘sf’之间等基因比较显示出多于两倍的变化。在所有三种受分析分离种群中,在‘sf’与‘野生型’集群之间,这些103个基因中仅55个基因显示显著差异,而使用调整的P值这些55个基因中仅14个基因显示显著差异表达量(图9与表2,本文下方)。这些14个基因中,仅编码种子珠心特异性蛋白同源物的MELO3C021150在所有三个受分析种群中的‘sf’中下调,并且编码推测的花色素苷5-芳香酰基转移酶同源物的MELO3C003230在受分析种群中的‘sf’中上调。其他十二个基因在‘CEZ×sf’中和在‘ED×sf’中显示相似的变化方向,但在‘NY×sf’F2种群中显示相反的方向(表2,本文下方)。在不同器官中MELO3C021150的定量RT-PCR分析指示在集群之间发现的数字表达量是由幼嫩果实组织贡献的,并且MELO3C021150在所有其他组织中不转录(图10)。
[0183] 表2
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193] 尽管已结合本发明的特定实施方案对本发明进行描述,但明显的是,多种替代、
修改和变型将对本领域的那些技术人员显而易见。因此,本发明意图包括所有此类属于随附权利要求书精神和宽范围内的替代、修改和变型。
[0194] 在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在仿佛各个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示通过引用并入本文的相同程度上以它们的全文通过引用入说明书并入本文。另外,在本申请中对任何参考的引用或辨识不应解释为承认此类参考是可作为本发明的现有技术得到的。在使用章节标题的程度上,标题不应解释为必然限制性的。
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