黄瓜中镰孢属抗性的QTL
阅读：91发布：2020-05-19
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1.一种在其基因组中携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型(Fusarium oxysporum
f.sp.radicis-cucumerinum)的抗性的QTL1的黄瓜植物，所述QTL1位于第3号染色体上标记序列SEQ ID No.1与SEQ ID No.2之间，其中SEQ ID No.1中位置65上的‘G’对应于公共黄瓜基因组的物理位置6,996,646bp，并且SEQ ID No.2中位置74和75上的‘TC’对应于公共黄瓜基因组的物理位置9,480,131和9,480,132bp。
2.权利要求1所述的黄瓜植物，其中QTL1是如同在代表性种子在保藏号NCIMB 42438和NCIMB 42439下保藏于NCIMB中的黄瓜植物的基因组中所包含的，并且具体地位于其中的标记序列SEQ ID No 1与SEQ ID No.2之间。
3.权利要求1或2所述的黄瓜植物，其中QTL1的存在可通过第3号染色体上具有SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的任何标记来鉴定。
4.权利要求1-3中任一项所述的黄瓜植物，其还包含位于第5号染色体上标记序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6之间的QTL2，其中SEQ ID No.5中位置87上的‘T’对应于所述公共黄瓜基因组的物理位置20,877,766bp，并且SEQ ID No.6中位置39位上的‘A’对应于所述公共黄瓜基因组的物理位置23,250,404bp。
5.权利要求4所述的黄瓜植物，其中QTL2是如同在其代表性种子在保藏号NCIMB 42439下保藏于NCIMB中的黄瓜植物的基因组中所包含的，并且具体地位于其中的标记序列SEQ ID No 5与SEQ ID No.6之间。
6.权利要求4或5所述的黄瓜植物，其中QTL2的存在可通过第5号染色体上具有SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10或这些SEQ ID No的任意组合的任何标记来鉴定。
7.权利要求1-6中任一项所述的黄瓜植物，其包含以杂合形式存在的QTL1；或包含以纯合形式存在的QTL1，或包含以杂合形式存在的QTL1和QTL2，或包含以纯合形式存在的QTL1和以杂合形式存在的QTL2，或包含以纯合形式存在的QTL2和以杂合形式存在的QTL1，或者包含均以纯合形式存在的QTL2和QTL1，其中优选地QTL1以纯合形式存在，所述植物对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性。
8.权利要求1-7中任一项所述的黄瓜植物，其中黄瓜植物对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性。
9.权利要求1-8中任一项所述的黄瓜植物，其通过以下操作能够获得：将不显示对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的黄瓜植物与其代表性种子在保藏号NCIMB 42438或NCIMB 42439下保藏于NCIMB的黄瓜植物杂交，任选地使来自所述杂交的后代自交，并在F1和/或F2中选择对尖镰孢黄瓜根专化型显示抗性和/或包含SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的标记的植物。
10.权利要求9所述的黄瓜植物，其中在F1和/或F2中选择还包含SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10的标记的植物。
11.一种适合于产生如权利要求1-10中任一项所述的植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合于有性繁殖，并特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞，或者适合于营养繁殖，并且特别地选自插枝、根、茎、细胞、原生质体，或者适合于可再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎，其中从所述繁殖材料产生的植物包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2。
12.一种用于鉴定QTL1的标记，所述QTL1当存在于黄瓜植物的基因组中时会导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性，所述标记选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的组中。
13.一种用于鉴定QTL2的标记，所述QTL2当与QTL1组合存在于黄瓜植物的基因组中时，导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性，所述标记选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的组中。
14.一种用于鉴定QTL1的标记的用途，所述QTL1当存在于黄瓜植物的基因组中时，会导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性，所述标记选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的组中。
15.一种用于鉴定QTL2的标记的用途，所述QTL2当与QTL1组合存在于黄瓜植物的基因组中时，导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性，所述标记选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10的组中。
黄瓜中镰孢属抗性的QTL
[0001] 本发明涉及对镰孢属(Fusarium)具有抗性的黄瓜植物(黄瓜(Cucumis sativus L.))。本发明还涉及与抗性相关的标记以及标记用于鉴定抗性植物的用途。本发明还涉及这样的植物的种子和后代以及用于获得这样的植物的繁殖材料。
[0002] 很大一部分黄瓜植物生长在受保护的栽培中，例如在温室或塑料隧道中。这种生长环境可以保护植物免受某些环境条件的影响，并在一定程度上保护它们免受某些疾病或昆虫的侵袭。特别是当不在土壤中而是在人造基质诸如岩棉中培养植物时，可以减少各种土传病害的发生。
[0003] 然而，在土壤和基质条件下特别地感染在受保护的环境中生长的黄瓜植物的疾病之一是尖镰孢黄瓜根专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-cucumerinum)(Forc)。这种土传病也被称为“镰孢茎根腐病(Fusarium s tem and root rot)”，或“镰孢冠根腐病(Fusarium crown and root rot)”，特别地在温室种植的黄瓜中被发现。幼小植物很容易在20℃左右的温度下感染，但在这个阶段通常没有发现症状或者发现有限的症状。在许多情况下，症状只有在植物生长和结果时才可见。症状主要表现为缓慢枯萎，常伴有黄化。在白天枯萎的植物最初可在较凉的夜晚从枯萎恢复，但最终会死亡。茎根腐病也会经常发生，这是区分这种镰孢与相关的尖镰孢黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)(通常称为“镰孢枯萎病”，其仅显示枯萎但通常不显示茎或根腐病)的症状之一。
[0004] 尖镰孢黄瓜根专化型的控制相当复杂。通过良好的卫生措施进行预防是对抗包括Forc在内的许多病原体普遍采用的方法。土壤或基质消毒是预防或控制土传病害的好方法，但化学选择(诸如熏蒸)往往对环境产生不利影响，因此通常不再被允许。损害较小的非化学替代方法是例如土壤的热处理或蒸汽处理。
[0005] 对于黄瓜的另一种常用实践是使用抗性砧木，其通常来自不受Forc影响的作物物种，诸如箅瓜(Cucurbita maxima)与南瓜(Cucurbitamoschata)之间的种间杂交。尽管黄瓜中对Forc的抗性形式已被鉴定，但仍然没有具有抗性的商业性黄瓜蔬菜品种可供利用。
[0006] 本发明的一个目的是提供具有针对尖镰孢黄瓜根专化型的新抗性的黄瓜植物(黄瓜(Cucumis sativus))。
[0007] 本发明的一个目的是提供携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的遗传决定子的黄瓜植物(黄瓜)。
[0008] 本发明的一个目的是提供分子标记以鉴定携带本发明的遗传决定子的植物。
[0009] 在导致本发明的研究中，鉴定了遗传决定子，特别是QTL，当所述遗传决定子存在于黄瓜植物中时，其导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性。
[0010] 因此，本发明涉及携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL的黄瓜植物。
[0011] 在一个实施方案中，本发明涉及携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1的黄瓜植物，所述QTL1位于第3号染色体上标记序列SEQ IDNo.1与SEQ ID No.2之间。
[0012] 在一个实施方案中，导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1的存在可通过第3号染色体上具有SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的标记来鉴定。在一个具体的实施方案中，QTL1与第3号染色体上具有SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的任何标记连锁，或与这些标记的组合连锁。
[0013] 引起本发明的研究的一个目的是鉴定和表征对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的新来源，所述来源可方便地用于对于高端保护种植在商业上令人感兴趣的黄瓜品种。当抗性以隐性方式遗传时，杂交品种的两个亲本均需要在F1中表达其抗性。对于育种计划来说，这意味着对于其中所述疾病流行的某个市场，需要将该抗性渗入所有材料。因此，如果该抗性以显性、不完全显性或中间遗传性状遗传时，则这是有利的。
[0014] 在育种活动(breeding act ivi ty)执行期间，在具有用于高端商业品种的能力的育种品系中鉴定并渗入了针对尖镰孢黄瓜根专化型的新的抗性。这种材料在被测试的疾病压力下具有良好水平的抗性，并且不显示隐性类型的遗传。这意味着两个亲本(其中只有一个表现出高水平的抗性)之间的杂交将产生仍然具有一定水平的抗性的F1。然而，当两个亲本都有抗性并且所述抗性的遗传决定子以纯合状态存时，将获得最佳结果。因此，抗性的遗传可被称为中间或不完全显性。
[0015] 进行QTL作图研究以鉴定该性状起因的遗传区域。在该研究中，在第3号染色体上鉴定了命名为QTL1的QTL，其位于可用标记序列SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2鉴定的位置之间。当这些标记被定位在公共可获得的基于黄瓜品种中国龙9930的黄瓜基因组序列上时，SEQ ID No.1中所示的SNP([G/C]多态性)对应于物理位置6,996,646bp，SEQ ID No.2中所示的多态性[TC/*]对应于物理位置9,480,131和9,480,132bp。因此，QTL1的位置也可从该公共图谱推导出来，并且与所述物理位置相关。可在ht tp://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/(其为本文使用的“公共黄瓜基因组”的参考文献)访问基于中国龙9930的黄瓜基因组序列。
[0016] 进一步的基因定型得到了可用于鉴定QTL1的各种SNP标记的作图，所述SNP标记由SEQ ID No.3和4表示。与QTL1相关的SEQ ID No.1-4的序列可见于图1中。
[0017] 在SEQ ID No.1的位置65上存在‘G’，但可选择地可存在‘C’，从而导致位置65上的可能的[G/C]多态性；在SEQ ID No.2的位置74和75上存在‘TC’，但是这些可变通地可被缺失，从而导致位置74和75上的可能的[TC/*]多态性，其中‘*’意指‘TC’被缺失。从两个SEQ ID No，都可使用两个形式来鉴定QTL1区域的位置。
[0018] 在SEQ ID No.3的位置74上，‘C’作为来自变通性‘T’的SNP存在，由此‘C’的存在指示QTL1的存在；在SEQ ID No.4的位置120上存在‘G’，作为变通性‘A’的SNP，由此‘G’的存在指示QTL1的存在(图3)。
[0019] 在QTL作图研究中还鉴定了第二QTL，命名为QTL2。该QTL位于第5号染色体上标记序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.6之间。当这些标记位于公共可获得的基于黄瓜品种中国龙9930的黄瓜基因组序列上时，SEQ ID No.5中所示的SNP([T/C]多态性)对应于物理位置20,
877,766bp，SEQ ID No.6中所示的SNP([A/G]多态性)对应于物理位置23,250,404bp。因此，QTL2的位置也可从该公共图谱推导出来，并且与所述物理位置有关。
877,766bp，SEQ ID No.6中所示的SNP([A/G]多态性)对应于物理位置23,250,404bp。因此，QTL2的位置也可从该公共图谱推导出来，并且与所述物理位置有关。
[0020] 在一个实施方案中，本发明涉及携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2的黄瓜植物，所述QTL2位于第5号染色体上标记序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.6之间。
[0021] QTL2的进一步基因定型获得了可用于鉴定QTL2的各种SNP标记的作图，所述SNP标记由SEQ ID No.7-10表示。可在图2中找到与QTL2相关的SEQ ID Nos.5-10的序列。
[0022] 在SEQ ID No.5的位置87上存在‘T’，但可变通地可以存在‘C’，从而导致位置87上的可能的[T/C]多态性；在SEQ ID No.6的位置39上存在‘A’，但可变通地可以存在‘G’，从而导致位置39上的可能的[A/G]多态性。从这两个SEQ ID No，两种形式都可用来鉴定QTL2区域的位置。
[0023] 在SEQ ID No.7的位置45上，‘T’作为此变通性‘G’的SNP存在，由此‘T’的存在指示QTL2的存在；在SEQ ID No.8的位置41上，‘A’作为此变通性‘G’的SNP存在，由此‘A’的存在指示QTL2的存在；在SEQ ID No.9的位置219上，‘A’作为此变通性‘G’的SNP存在，由此‘A’的存在指示QTL2的存在；在SEQ ID No.10的位置136上，‘A’作为此变通性‘G’的SNP存在，由此‘A’的存在指示QTL2的存在(图3)。
[0024] 在一个实施方案中，导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL2的存在可通过第5号染色体上具有SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10或者这些SEQ ID No.的任意组合的任何标记来鉴定。在一个具体的实施方案中，QTL2与染色体5上具有SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10的任何标记或者与这些标记的任意组合连锁。
[0025] 在一个实施方案中，本发明涉及包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1的黄瓜植物，所述QTL1是如包含在其代表性种子在保藏号NCIMB 42438和NCIMB 42439下保藏于NCIMB中的黄瓜植物中的一样。因此，本发明的这种植物具有与存在于保藏物NCIMB 42438和/或保藏物NCIMB 42439中的QTL1相同的QTL1。
[0026] 在一个实施方案中，导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1从包含所述QTL1、其代表性种子在保藏号NCIMB 42438和NCIMB 42439下保藏于NCIMB的黄瓜植物渐渗而来。
[0027] 在一个实施方案中，包含在NCIMB 42438和/或NCIMB 42439中的QTL1位于第3号染色体上标记序列SEQ ID No.1与SEQ ID No.2之间。
[0028] 在一个实施方案中，包含在NCIMB 42438和/或NCIMB 42439中的QTL1与标记SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4中的任一个连锁。
[0029] 在一个实施方案中，本发明涉及除了QTL1以外还包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL2的黄瓜植物，所述QTL2是如同包含在其代表性种子在保藏号NC42439下保藏于NCIMB中的黄瓜植物中一样。因此，本发明的这种植物具有与存在于保藏物NCIMB 42439中的QTL2相同的QTL2。
[0030] 在一个实施方案中，导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL2从包含所述QTL2、其代表性种子在保藏号NCMB42439下保藏于NCIMB中的黄瓜植物中渐渗而来。
[0031] 在一个实施方案中，如同包含在NCIMB 42439中一样的QTL2位于第5号染色体上标记序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.6之间。
[0032] 在一个实施方案中，如同包含在NCIMB 42439中一样的QTL2与第5号染色体上具有SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10的任何标记或这些SEQ ID No的任意组合连锁。
[0033] 在保藏物NCIMB 42438和/或NCIMB 42439中，QTL1与具有SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的标记中的至少一个标记或其组合连锁。
[0034] 在保藏物NCIMB 42439中，QTL2与具有SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10的标记中的至少一个标记或其组合连锁。
[0035] 本发明的对尖镰孢黄瓜根专化型(Forc)的抗性是当本发明的QTL1以及任选地QTL2以杂合或纯合形式存在时所表达的抗性。当QTL纯合地存在时，抗性水平较高。在一个具体的实施方案中，当QTL1纯合地存在时，抗性水平较高。
[0036] 抗性的表型存在可使用生物测定来测试。Forc的症状可以以不同的方式表达，因此可以观察到疾病的各个方面。确定本发明的抗性的生物测定优选在幼小植物上进行。该生物测定的最适温度在21℃与25℃之间；白天和夜晚可能的温度方案是25℃。植物播种后六七天，当它们处于子叶阶段时，将它们进行接种。接种后约一周(6或7天)，应该进行第一次观察。表1给出了与易感黄瓜植物相比可被观察以确定抗性存在的特征的综述。
[0037] 表1：确定Forc抗性的特征
[0038]
[0039] 为了得到可靠的观察，对每个观察品种应该使用至少18株植物，所述植物被分成至少两个重复组。第一次观察在接种后约一周进行，任选地3-4天后再次观察，3-4天后再次观察，以及6-7天后至少再进行一次观察。因此在两周内进行总共至少3次、优选4次观察，直至接种后大约3周，但观察期也可以根据测试的严重程度而延长。
[0040] 对于Forc易感的植物在接种后第10天对于所有特征已显示清楚的症状，由此大多数植物具有下胚轴腐烂(1分)并且枯萎(1分)。在接种两周后，至少80％的易感植物得分在最高类别中(即子叶或叶子的得分为‘3’，下胚轴腐烂或枯萎得分为‘1’)，接种后3周至少90％、但通常是100％的易感植物得分在最高的类别中。这也是确定生物测定已被正确执行的检查。作为易感的对照，例如可以使用Ventura F1品种或Kaspian F1品种。
[0041] 具有本发明的抗性的黄瓜品系在接种10天后可显示一定至中等程度的黄化(1或2分)，但是至少80％的植物对其他特征没有任何症状，即对于叶片黄化、下胚轴腐烂和枯萎，它们仍然得分为0。在接种后两周，与易感对照相比，可以观察到症状严重程度的明显差异，由此大部分抗性植物对于下胚轴腐烂或枯萎具有0分。
[0042] 作为易感与抗性亲本之间的杂交的黄瓜材料在接种后10天对于大多数特征表现与抗性亲本相当。对于枯萎，当然对于其他特征而言取决于生物测定条件也会如此，杂交的植物可以显示比抗性亲本在这个阶段更多的枯萎，所以更多的植物对于该特征将具有为1的评分，然而其将会小于易感亲本。在接种两周后也是如此，由此，特别是对于下胚轴腐烂和枯萎的特征，杂交的植物趋于显示出更多的症状，因此相较于抗性亲本的植物，更多的植物对于这些特征具有1分。显示抗性中等水平的这种黄瓜材料也是本发明的一部分。
[0043] 实施例1更详细地描述了可用于确定本发明的Forc抗性的生物测定法。必须认识到，生物测定的结果受诸如环境因素和接种条件的因素的影响很大，不能总是完全一致地重复，因此所给出的分数不能被视为绝对数字。因此，在观测中包括足够大量的植物并且使用适当的易感对照来进行比较是必要的。从实施例1中呈现的数字可以看出，正如Forc的典型情况一样，一些植物确实在较早的阶段表现出枯萎，但在稍后的观察日期暂时恢复。
[0044] 黄瓜中导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的本发明的QTL1和QTL2似乎并不促进针对尖镰孢黄瓜根专化型(Forc)的抗性。
[0045] 如本文中所用，QTL的渐渗意指通过标准育种技术将来自包含所述QTL的供体植物的QTL引入不携带所述QTL的受体植物，其中可通过观察对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性来在表型上进行选择，或者可通过使用标记(通过标记辅助育种)或这些标记的组合来完成选择。选择始于F1或来自受体植物与供体植物之间的杂交的任何后续代，适宜地通过使用如本文鉴定的标记。然而，技术人员熟悉产生和使用可鉴定对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性或与所述抗性连锁的新的分子标记。用于鉴定和选择本发明植物的这类标记的开发和使用也是本发明的一部分。
[0046] 在一个实施方案中，本发明的黄瓜植物包含QTL1与QTL2的组合。在一个实施方案中，本发明涉及包含如本文定义的QTL1和QTL2的黄瓜植物，所述QTL1和QTL2在黄瓜植物的基因组中的存在导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性。
[0047] 在一个实施方案中，具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的本发明的黄瓜植物包含以纯合形式存在的QTL1和任选的QTL2。在一个实施方案中，具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的本发明的黄瓜植物包含以纯合形式存在的QTL1和以杂合形式存在的QTL2，或者包含以杂合形式存在的QTL1和以纯合形式存在的QTL2，或者包含均以杂合形式存在的QTL1和QTL2二者。
[0048] 本发明还涉及仅携带QTL1或QTL2的一个等位基因的黄瓜果实或黄瓜植物，所述植物或果实可用作来源用于开发本发明的包含QTL1和QTL2中的至少一个的至少两个等位基因的植物。
[0049] 如本文中所用，术语“QTL1和/或QTL2的等位基因”是导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL的形式。野生型等位基因不会导致抗性。QTL1或QTL2的等位基因的存在可使用如本文所述的标记来适当地鉴定。例如至少两个等位基因的存在意味着QTL1可以纯合地存在，或者QTL2可以纯合地存在，或者两个QTL可以杂合地存在。任选地，一个或两个另外的等位基因可存在于对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性的本发明的植物中。在一个优选实施方案中，至少QTL1以纯合形式存在。
[0050] 在保藏号NCIMB 42438中，QTL1以纯合形式存在。在保藏号NCIMB42439中，QTL1和QTL2均以杂合形式存在。
[0051] 本发明还涉及包含QTL1以及任选地QTL2的本发明植物作为繁殖材料来源的用途。
[0052] 本发明还涉及包含QTL1以及任选地QTL2的本发明植物在植物育种中的用途。
[0053] 本发明还涉及所请求保护的植物的细胞。这样的细胞可以以分离形式存在，或者可为完整植物或其部分的一部分，其仍构成本发明的细胞，因为这种细胞含有导致黄瓜植物对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的遗传信息。本发明植物的每个细胞携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的遗传信息。本发明的这种细胞也可以是可用于再生本发明的新植物的可再生细胞。如本文中所用的遗传信息的存在是如本文所定义的QTL1以及任选地QTL2的存在。
[0054] 本发明还涉及所请求保护的植物的组织。组织可以是未分化的组织或已分化的组织。未分化的组织是例如茎尖、花药、花瓣、花粉，可以用于微繁殖以获得生长成本发明的新植物的新的小植株。组织也可以从本发明的细胞生长而来。
[0055] 根据其另一个方面的本发明涉及种子，其中可以从种子生长的植物是本发明的植物，其包含在黄瓜植物中导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2。本发明还涉及所请求保护的植物的种子。种子具有QTL1以及任选地QTL2，当植物从种子生长时，所述QTL使得该植物成为本发明的植物。
[0056] 本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织和种子的后代，所述后代包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2。这种后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。
[0057] 如本文中所用，术语“后代”旨在表示来自与本发明的植物杂交的第一个和所有进一步的后代，所述本发明的植物包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2。
[0058] “后代”还包括携带本发明的QTL1和/或QTL2并具有本发明的性状的植物，其通过营养繁殖或增殖而从其它植物或本发明的植物的后代获得。本发明的后代适宜地包含QTL1和/或QTL2以及对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性。
[0059] 如本文中所用，术语“本发明的性状”是指对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性的性状。该性状不包含针对尖镰孢黄瓜专化型(Foc)的抗性。
[0060] 本发明还涉及所请求保护的植物的适合有性繁殖的部分。这样的部分例如选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞组成的组。另外，本发明涉及所要求保护的植物的适合于营养繁殖的部分，其特别地是插条、根、茎、细胞、原生质体。如上所述的植物部分被认为是繁殖材料。由繁殖材料产生的植物包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2。
[0061] 根据本发明的另一方面，本发明提供了携带本发明的QTL1以及任选地QTL2的植物的组织培养物，其也是繁殖材料。组织培养物包含可再生细胞。这种组织培养物可选自或来源于植物的任何部分，特别是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎。组织培养物可以再生成携带本发明的QTL1以及任选地QTL2的植物，所述再生植物表达本发明的性状，并且也是本发明的一部分。
[0062] 本发明还涉及杂交种子和用于生产这种杂交种子的方法，所述方法包括使第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得到的杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物具有本发明的QTL1以及任选地QTL2。包含本发明的QTL1以及任选地QTL2并显示出对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的所得杂交植物也是本发明的植物。
[0063] 在一个实施方案中，纯合或杂合地包含本发明的QTL1和/或QTL2的本发明的植物是近交系、杂交品种、加倍的单倍体的植物，或者是分离群体的植物。杂交品种是作为亲本的两个自交系之间的杂交的杂种。适宜地，亲本植物是自交系的植物。
[0064] 本发明还涉及用于产生具有导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2的黄瓜植物的方法，其中使用包含QTL1和任选地QTL2的种子来生长所述黄瓜植物。所述种子适宜地是其代表性样品在保藏号42438或42439下保藏于NCIMB的种子。
[0065] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的黄瓜植物，所述植物携带导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的本发明QTL1和任选地QTL2，并且已通过常规育种或遗传修饰，特别是通过同源转基因(cisgenes is)或异源转基因(transgenes is)，从合适来源获得了所述QTL1和/或QTL2。同源转基因是用来自作物植物本身或来自性相容性供体植物的编码(农业)性状的天然基因对植物进行的遗传修饰。异源转基因是用来自不可杂交的物种的基因或合成基因对植物进行的遗传修饰。
[0066] 在一个实施方案中，从其获得本发明的QTL1和/或QTL2的来源是由从其代表性样品在登录号NCIMB 42438或NCIMB 42439下保藏的种子，或从保藏的种子NCIMB 42438和/或NCIMB 42439，或从其有性或无性繁殖后代，或从包含本文所定义的QTL1和/或QTL2(所述QTL导致对本发明尖镰孢黄瓜根专化型的抗性)的另一来源或从这些来源的组合生长的植物形成。
[0067] 在一个优选实施方案中，本发明涉及非转基因黄瓜植物。用于获得本发明的QTL1和/或QTL2以获得具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的本发明植物的来源，适宜地为这样的黄瓜植物(所述植物携带如在NCIMB42438中纯合地包含的或如在NCIMB 42439中杂合地包含的QTL1，或如在NCIMB 42439中杂合地包含的QTL2)，或可选地携带所述QTL之一或二者并且可与黄瓜杂交的黄瓜属物种的植物。当使用除黄瓜外的黄瓜属物种作为本发明的QTL的来源时，任选地，可以进行诸如胚挽救、回交的技术或技术人员已知的其他技术来获得种间杂交的种子，所述种子可用作来源用于进一步开发显示出对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的非转基因黄瓜植物。
[0068] 为了从其中QTL杂合地存在的来源获得所述QTL，可以生长这种植物的种子，并且可用来自同一植物或来自也具有杂合QTL的植物的花粉对花进行授粉，以获得具有种子的果实。当播种这些种子时，所得到的植株会按照正常的分离比例分离，这意味着约25％的植物将具有纯合的所述QTL，约50％将具有杂合的所述QTL，以及约25％不具有所述QTL。用于选择具有纯合或杂合的QTL的优选植物中QTL的存在可使用本文所述的标记来适当地确定。或者，可对植物进行表型观察并通过目视选择对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的存在。本领域技术人员知道如何使用已知的育种和选择程序来以杂合和纯合形式组合QTL。
[0069] 本发明还涉及本发明植物的种质。种质由有机体的所有遗传特征构成，并且根据本发明至少包含本发明的性状。该种质可用于开发具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的黄瓜植物的育种程序。包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和/或QTL2的种质在育种中的用途也是本发明的一部分。
[0070] 本发明还涉及导致本发明的性状的QTL1和/或QTL2用于开发具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的黄瓜植物的用途。
[0071] 如本文中所用，当标记与QTL之间，即标记与性状之间的重组在由包含QTL的植物与不存在QTL的植物之间的杂交产生的分离群体中低于5％时，标记与QTL遗传是“连锁”的，可用于鉴定该QTL。
[0072] 在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1的标记，所述标记选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL2的标记，所述标记选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。在一个优选实施方案中，用于鉴定的标记对于QTL1是SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的标记，对于QTL2是SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID No.10的标记。所有标记都可用于开发QTL的其他标记。
[0073] 在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1的标记的用途，所述标记选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL2的标记的用途，所述标记选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。在一个优选实施方案中，SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的标记被用于鉴定QTL1，SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和/或SEQ ID NO.10的标记被用于鉴定QTL2。
[0074] 一方面，本发明涉及用于产生对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性的黄瓜植物的方法，所述黄瓜植物包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2，所述方法包括：
[0075] a)将包含QTL1和/或QTL2、其代表性种子以NCIMB42438和/或NCIMB42439保藏的植物与不包含相同QTL的植物杂交，以获得F1群体；
[0076] b)任选地进行一轮或多轮自交和/或将来自F1的植物杂交以获得下一代群体；
[0077] c)适宜地通过使用与所需QTL之一或两者连锁的分子标记选择包含QTL1以及任选地QTL2并对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性的植物。还可就具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性来从表型选择所述植物。
[0078] 本发明另外提供了将另一种所需性状引入包含对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的黄瓜植物的方法，所述方法包括：
[0079] a)将包含QTL1以及任选地QTL2(所述QTL导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性)、其代表性种子以NCIMB 42438和/或NCIMB 42439保藏在NCIMB的黄瓜植物与包含另一种所需性状的第二黄瓜植物杂交，以产生F1子代；
[0080] b)选择包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1以及任选地QTL2并且包含所述另一种所需性状的F1子代；
[0081] c)将选择的F1子代与任一亲本杂交，以产生回交后代；
[0082] d)选择包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2以及所述另一种所需性状的回交后代；和
[0083] e)任选连续重复步骤c)和d)一次或多次，以产生包含所述另一种所需性状并且具有对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的选择的第四或更高代回交后代。本发明包括由该方法生产的黄瓜植物和从其获得的黄瓜果实。
[0084] 任选地，自交步骤在任何杂交或回交步骤之后进行。包含本发明的QTL1和任选地QTL2以及所述另一种所需性状的植物的选择可变通地在本方法的任何杂交或自交步骤之后进行。
[0085] 本发明还提供了用于产生具有如本文所述的对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用加倍的单倍体生成技术来产生纯合地包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2的加倍的单倍体品系。
[0086] 本发明还涉及产生包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用在其基因组中包含导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2的种子产生所述黄瓜属植物。所述种子适宜地是其代表性样品在保藏号NCIMB42438和NCIMB 42439下保藏于NCIMB的种子。
[0087] 本发明还涉及用于种子生产的方法，包括从本发明的种子生长黄瓜植物，通过使授粉发生而使植物产生种子，以及收获那些种子。种子的生产适宜通过杂交或自交来进行。优选地，如此生产的种子具有生长成对尖镰孢黄瓜根专化型具有抗性的植物的能力。
[0088] 在一个实施方案中，本发明涉及产生具有导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用在其基因组中携带QTL1和任选地QTL2的植物材料的组织培养来进行。
[0089] 本发明还涉及产生具有导致对尖镰孢黄瓜根专化型的抗性的QTL1和任选地QTL2的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用在其基因组中携带QTL1和任选地QTL2的植物材料的营养繁殖来进行。
[0090] 保藏
[0091] 在2015年7月21日将包含以纯合形式存在的QTL1的黄瓜(Cucumis sativus)EX 5.008的种子和包含以杂合形式存在的QTL1和QTL2的黄瓜(Cucumis sativus)EX 5.009的种子分别以保藏登录号NCIMB 42438和NCIMB 42439保藏于NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK。
[0093] 图1：第3号染色体上与QTL1相关的SEQ ID No.1-4的SNP标记序列。在SEQ ID No.之后指示了是否给出了所述序列的形式A或B。给出的形式是与本发明的QTL1相关的形式，但SEQ ID No.1和2除外，它们的两种形式可用于定位QTL1区域(也参见图3)。还提及了多态性或SNP的位置，所述位置处的核苷酸是粗体。使用图3，可确定与本发明植物的QTL区域相比的标准黄瓜/对照植物的单元型。
[0094] 图2：第5号染色体上与QTL2相关的SEQ ID No.5-10的SNP标记序列。关于进一步描述，参见图1的解释。为了定位QTL2区域，可使用SEQ ID No.5和6的两种形式。
[0095] 图3：QTL1和QTL2的SNP标记的单元型。单元型指示标记的哪些形式的组合可指示QTL。核苷酸变化表示为[X/Y]，其中X是形式A，Y是形式B。对于SEQ ID No.2，形式B具有2个核苷酸[TC]的缺失，其中第一个核苷酸对应于公共黄瓜基因组的标示的物理位置。同样地，在该图中还标示了对应于基于中国龙9930品种的公共黄瓜基因组的SNP的物理位置。实施例
[0096] 实施例1
[0097] 对尖镰孢黄瓜根专化型(Forc)的抗性的表型分析
[0098] 将对Forc易感的亲本品系、对Forc有抗性的亲本品系和这两个亲本之间的F1的种子播种在装满盆栽土的幼苗盘中，并保持在26℃的气候室中。对于每个保藏品种，播种足够的植物以能够获得两个12株植物的重复。播种后6天，通过根浸渍法接种幼苗。从根部切下数厘米，随后使用含有5x106个孢子/ml的悬浮液将幼苗在制备的接种物中浸泡至少2分钟。易感亲本品系具有相当差的萌发率，只有11株可用于第二次重复。
[0099] 随后将接种的幼苗移植到装满潮湿土壤的盘中，并进一步保持在昼夜温度为25℃的温室中。
[0100] 根据表1中所述的特征，在接种后7天开始评分。没有记录3-4-2015的第二次重复的分数(NA)。表2给出了该生物测定的分数。
[0101] 表2-对尖镰孢黄瓜根专化型(Forc)的抗性的生物测定评分
[0102]
[0103]
[0104] 对于每个观察日期的子叶和叶，给出评分类别0、1、2和3中的植物数目，其中0表示无症状，1表示一定的黄化，2表示中度至重度黄化，3表示植物死亡。
[0105] 对于下胚轴腐烂和枯萎，在每个观察日期都指示植物显示症状(Y)还是不显示症状(N)。当整株植物(不仅仅是少数叶)枯萎时，将所述植物评分为“Y”。
[0106] 在第一个观察日期，差异还不是很大，但是易感亲本品系显示已有相当一些枯萎的植物。在第二个观察日期，易感亲本品系的大多数植物显示下胚轴腐烂并完全枯萎，叶片开始黄化。抗性亲本品系仍然强壮，只显示一定至中等程度的子叶黄化。中间或F1品系具有一定的子叶黄化，以及还有一些枯萎的植物，但不显示下胚轴腐烂。
[0107] 第3次的观察(在接种后约2周)显示易感亲本品系的大部分植物在类别‘3’中，它们具有下胚轴腐烂和枯萎。抗性亲本品系有一些枯萎的或有下胚轴腐烂的植物，但超过50％还未表现出这些症状。在一些植物中，还观察到子叶和叶的黄化。F1显示一些起初枯萎的植物的恢复，表明这些植物明显比易感亲本更强壮。在这个阶段，子叶和叶的黄化与抗性亲本相当。
[0108] 最后的观察结果尤其显示了抗性与易感亲本之间在下胚轴腐烂和枯萎方面的差异，因此抗性亲本品系的部分植物对这些特征仍然评分为“N”，而所有易感植物的评分为“Y”。中等或F1植物不如抗性亲本强壮，但仍然表现优于易感亲本。
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