水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1、该基因编码的蛋白质及其用途
阅读：852发布：2020-05-08
专利汇可以提供水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1、该基因编码的蛋白质及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 植物 基因工程领域，公开了一种 水 稻 铁 氧 还蛋白编码基因OsFd1、该基因编码的 蛋白质 及其用途，该基因的核苷酸序列如Seq ID No：1、Seq ID No：2所示；其编码的蛋白质的 氨 基酸序列如Seq ID No：3所示。上述基因编码的蛋白能够从PSI处接受 电子 并将电子传递给FNR、亚 硝酸 还原酶和亚 硫酸 还原酶，参与水稻 碳 、氮、硫的同化。本发明可用于调节水稻光合电子传递效率，促进碳水化合物、氮，硫等大量元素的固定和同化及光合产物积累等。，下面是水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1、该基因编码的蛋白质及其用途专利的具体信息内容。
1.水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：
1、SEQ ID No：2所示。
2.如权利要求1所述的水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1，其特征在于，所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
3.权利要求1或2所述水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质具有如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，所述氨基酸序列还包括在SEQ ID No：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
5.含有权利要求1或2所述水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1的质粒、植物表达载体、原核表达载体和宿主细胞。
6.权利要求1或2所述水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1的用途，其特征在于：
1）使蛋白能够从PSI到FNR传递电子，用于改良水稻光合作用效率；
2）使蛋白能够从PSI到亚硝酸还原酶传递电子，用于促进水稻氮元素的积累；
3）使蛋白能够从PSI到亚硫酸还原酶传递电子，用于促进水稻硫元素的积累；
4）用于构建转基因水稻，使转基因水稻的叶片颜色改变。
7.水稻铁氧还蛋白编码基因Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1和FdC2，其特征在于：
Fd2的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；
Fd3的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；
Fd4的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示；
Fd5的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；
FdC1的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示；
FdC2的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
8.权利要求7所述水稻铁氧还蛋白编码基因编码的蛋白质Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1和FdC2，其特征在于：
Fd2的氨基酸序列如SEQ ID No：10所示；
Fd3的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示；
Fd4的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示；
Fd5的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示；
FdC1的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示；
FdC2的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示。
9.含有权利要求7所述水稻铁氧还蛋白编码基因Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1或FdC2的原核表达载体、宿主细胞，其特征在于：所述原核表达载体和宿主细胞包含如SEQ ID No：4-9所示的核苷酸序列。
10.利要求7所述水稻铁氧还蛋白编码基因Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1和FdC2的用途，其特征在于：使蛋白能够从PSI到FRN递电子，用于改良水稻光合作用效率。
水稻铁氧还蛋白编码基因OsFd1、该基因编码的蛋白质及其
用途
技术领域
背景技术
[0002] 铁氧还蛋白(Ferredoxin，Fd)是一种水溶性、低分子量酸性电子传递蛋白。在植物中 Fd主要是从PSI中获得电子，传给各种与之关联的酶，如铁氧还蛋白-NADP还原酶(FNR)，铁氧还蛋白亚硝酸还原酶、亚硫酸还原酶、谷氨酸合酶、铁氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶等，+参与许多光依赖的代谢和调节反应，其中尤以传递电子还原NADP 和硫氧还蛋白，参与碳同化，调节光周期的作用方式最为重要。Fd作为唯一的可溶性电子受体在光合电子传递过程中具有独特且重要的生理作用。不同的环境条件下，Fd对下游电子受体的选择直接决定着光合电子的最终去向，使生物适应环境及生长发育的变化。因此，揭示铁氧还蛋白参与光合作用的分子机理，在提高水稻光合效率，培育高产新品种方面具有广阔的应用前景。
发明内容
[0003] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种参与水稻光合电子传递的基因和其编码蛋白，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻光合电子传递进行改造的方法。
[0004] 本发明的具体技术方案为：一种水稻铁氧还蛋白OsFd1，该蛋白质具有如SEQ ID No： 3所示的氨基酸序列。
[0005] 作为本发明的水稻铁氧还蛋白OsFd1的改进，氨基酸序列还包括在SEQ ID No：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。
[0006] 本发明还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ IDNo：1、SEQ ID No：2所示的核苷酸序列。
[0007] 备注说明：SEQ ID NO：1为gDNA全长，SEQ ID NO：2为cDNA全长。
[0008] 作为本发明的基因的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1、2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。
[0009] 本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。
[0010] 本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。
[0011] 本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。细胞例如为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞等。
[0012] 本发明还同时提供了一个含有上述基因的原核表达载体。
[0013] 本发明还同时提供了上述基因的一个用途：1)该含有基因的蛋白能够从PSI到FNR传递电子，该基因可用于改良水稻光合作用效率。
[0014] 2)该含有基因的蛋白能够从PSI到亚硝酸还原酶传递电子，该基因可用于影响水稻氮元素的积累。
[0015] 3)该含有基因的蛋白能够从PSI到亚硫酸还原酶传递电子，该基因可用于调节水稻硫元素的积累。
[0016] 4)利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色(改变水稻叶片中的叶绿体及叶绿素含量，进而对叶片光合效率产生影响)。
[0017] 本发明还提供一种用Fd1基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图 1A、图1B所示的pSK-gRNA-Fd1cas#1和pSK-gRNA-Fd1cas#2，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
[0018] 本发明还提供了其他6个水稻铁氧还蛋白编码基因Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1和FdC2，其中：Fd2的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示；
Fd3的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；
Fd4的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示；
Fd5的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；
FdC1的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示；
FdC2的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
Fd3的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；
Fd4的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示；
Fd5的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示；
FdC1的核苷酸序列如SEQ ID No：8所示；
FdC2的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。
[0019] 本发明还提供了上述6个基因编码的蛋白质Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1和FdC2，其中：Fd2的氨基酸序列如SEQ ID No：10所示；
Fd3的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示；
Fd4的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示；
Fd5的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示；
FdC1的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示；
FdC2的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示。
Fd3的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示；
Fd4的氨基酸序列如SEQ ID No：12所示；
Fd5的氨基酸序列如SEQ ID No：13所示；
FdC1的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示；
FdC2的氨基酸序列如SEQ ID No：15所示。
[0020] 上述水稻铁氧还蛋白编码基因Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1或FdC2的原核表达载体、宿主细胞，其特征在于：所述原核表达载体和宿主细胞包含如SEQ ID No：4-9所示的核苷酸序列。所述宿主细胞优选为大肠杆菌细胞。
[0021] 上水稻铁氧还蛋白编码基因Fd2、Fd3、Fd4、Fd5、FdC1和FdC2的用途：使蛋白能够从PSI到FRN递电子，用于改良水稻光合作用效率。
[0022] 实现本发明的具体技术步骤如下：一、水稻Fd1的序列分析及克隆：
1、Fd1光合电子传递能力鉴定
在前期的工作中发明人首次利用水稻黄叶晚抽穗突变体克隆了相关基因FdC2。Rice Genome Annotation Project网站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)注释该基因编码2Fe-2S簇结合蛋白，即铁氧还蛋白(Ferredoxin，Fd)。本发明通过在生物数据库 (https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi和http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中比对 FdC2保守结构域，发现水稻中共有7个基因编码铁氧还蛋白。多序列比对后发现，和其它5 个Fd相比，FdC2和FdC1的蛋白序列拥有一个延长的C末端(图1A)。高等植物的铁氧还蛋白根据其氧化还原电势、发挥功能的部位不同可以分为光合型、非光合型两大类。发明人对多个物种的Fd序列进行进化树分析后发现(图1B)，水稻中只有Fd1(LOC_Os08g01380) 可能属于光合型Fd。为了进一步确定Fd1是否确实为光合型Fd，采用Real time PCR技术检测了Fd1在NPB不同组织的表达情况发现，Fd1主要在叶片及绿色组织中表达(图2)。发明人还构建了如图3A所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明Fd1蛋白在叶绿体中发挥生物学功能(图3B)。
1、Fd1光合电子传递能力鉴定
在前期的工作中发明人首次利用水稻黄叶晚抽穗突变体克隆了相关基因FdC2。Rice Genome Annotation Project网站(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)注释该基因编码2Fe-2S簇结合蛋白，即铁氧还蛋白(Ferredoxin，Fd)。本发明通过在生物数据库 (https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi和http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中比对 FdC2保守结构域，发现水稻中共有7个基因编码铁氧还蛋白。多序列比对后发现，和其它5 个Fd相比，FdC2和FdC1的蛋白序列拥有一个延长的C末端(图1A)。高等植物的铁氧还蛋白根据其氧化还原电势、发挥功能的部位不同可以分为光合型、非光合型两大类。发明人对多个物种的Fd序列进行进化树分析后发现(图1B)，水稻中只有Fd1(LOC_Os08g01380) 可能属于光合型Fd。为了进一步确定Fd1是否确实为光合型Fd，采用Real time PCR技术检测了Fd1在NPB不同组织的表达情况发现，Fd1主要在叶片及绿色组织中表达(图2)。发明人还构建了如图3A所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明Fd1蛋白在叶绿体中发挥生物学功能(图3B)。
[0023] 在本申请人的在先申请201510553223.5中，我们利用一个晚抽穗突变体，通过图位克隆的方法克隆了FdC2编码基因，证明该基因突变后会造成水稻显著的抽穗延迟，同时伴随叶片颜色淡绿，叶绿素含量及光合速率下降等表型，，但基于当时的知识储备，发明人并不清楚FdC2与水稻光合电子传递之间具有关系，其他研究者或任何已公开的文件也均未提出过类似的证据。本发明是在201510553223.5的基础上，以FdC2保守序列为模板，在水稻基因序列库中进行比对，找到了水稻中另外6个可能的Fds编码基因，通过一系列生理、生化及遗传学分析证明了水稻中7个Fds蛋白在光合电子传递中的功能，及Fd1对水稻生长发育的影响。由上可知，根据在先申请所公开的内容，无法得知水稻中7个同源的Fd蛋白是否具有电子传递能力，更无法了解Fd1通过影响水稻光合电子传递调控水稻生长发育、参与水稻氮、硫同化等过程。因此，本领域技术人员根据在先申请公开的内容，无法获得本发明技术方案。
[0024] 2、OsFd1的克隆及电子传递能力检测为了验证OsFd1是否具有电子传递能力，利用PCR技术，分别以日本晴基因组DNA和mRNA 体外反转录产物cDNA为模板对Fd1基因进行的基因和转录水平的扩增，分别获得了如SEQ ID No：1所示的956bp的gDNA序列和SEQ ID No：2所示的420bp的cDNA序列。然后将 OsFd1 eDNA全长序列连入原核表达载体pGEX-6P-1，构建如图4所示的原核表达载体，通过蛋白纯化获得Fd1目的蛋白。以此蛋白为底物，利用细胞色素c和NADP+光还原实验证明 Fd1可以接受PSI传递的电子(图5)。上述结果说明，Fd1确实属于光合型Fd，主要在叶绿体中发挥光合电子传递的功能，参与水稻光合电子传递。
[0025] 与此同时，还对另外6个Fds蛋白进行了原核表达、蛋白纯化及细胞色素c和NADP+光还原实验，结果证明另外6个Fds蛋白均具有电子传递能力，除FdC2外其余的5个Fds 和FdC1蛋白都能将电子传递到FNR，用于产生NADPH，为碳同化提供还原力(图5)。
[0026] 为了验证Fd1的生物学功能，发明人利用基因组编辑技术对水稻品种日本晴中Fd1基因进行定点突变，分析Fd1突变后水稻的生长发育状况。
[0027] 二、Fd1基因定点突变及水稻遗传转化：1、基因组编辑靶位点的设计：
为了验证Fd1的功能，利用定点突变的方法对Fd1基因进行定点敲除，同时利用农杆菌侵染法转化野生型品种日本晴，本发明首先利用基因组定点编辑软件(http：//
crispr.dbcls.jp/)分析和设计了突变靶位点。为了排除定点编辑载体脱靶造成的影响，选择Fd1外显子上两个不同的靶位点进行基因组编辑。分析结果表明位于外显子上的序列 GTTGCCGATGTCCCTGCGGG和CCTGCCTTACTCCTGCCGCG可作为靶位点用于基因组编辑。
为了验证Fd1的功能，利用定点突变的方法对Fd1基因进行定点敲除，同时利用农杆菌侵染法转化野生型品种日本晴，本发明首先利用基因组定点编辑软件(http：//
crispr.dbcls.jp/)分析和设计了突变靶位点。为了排除定点编辑载体脱靶造成的影响，选择Fd1外显子上两个不同的靶位点进行基因组编辑。分析结果表明位于外显子上的序列 GTTGCCGATGTCCCTGCGGG和CCTGCCTTACTCCTGCCGCG可作为靶位点用于基因组编辑。
[0028] 2、基因组编辑载体的构建：根据定点突变中间载体(pSK-gRNA)的结构(图6A)，设计了构建Fd1定点突变载体靶位点的引物。合成后的引物退火与AarI酶切的pSK-gRNA连接。获得连入Fd1靶序列的 pSK-gRNA-Fd1中间载体(图6C，E)。用BglII和KpnI双酶切pSK-gRNA-Fd1回收565bp 的目的片段，与BamHI和KpnI双酶切的表达载体pC1300-Cas9连接(图6B)，获得Fd1定点突变的两个最终表达载体pC1300-cas9-Fd1cas#1，pC1300-cas9-Fd1cas#2，(图6D，F)。
[0029] 3、Fd1定点突变载体的遗传转化及转基因株鉴定：Fd1外显子上两个不同的位点被选择用于定点突变靶点并构建载体(图7A)。将Fd1定点突变的最终表达载体pC1300-cas9-Fd1cas#1，pC1300-cas9-Fd1cas#2分别通过农杆菌侵染法，转化水稻对照品种日本晴(NPB)，经过侵染、筛选、分化、生根等培养过程，最终 pC1300-cas9-Fd1cas#1获得9株T0代转基因阳性株；pC1300-cas9-Fd1cas#2获得14株T0代转基因阳性株(图7B)。对突变转基因株中Fd1基因序列进行测序分析，发现 pC1300-cas9-Fd1cas#1的9株转基因阳性株中Fd1共有6种不同的突变方式； pC1300-cas9-Fd1cas#2的14株转基因阳性株中Fd1共有7种不同的突变方式(图7B)。
[0030] 表型观察结果显Fd1基因3种不同突变方式的T1代纯合突变株系在二叶期前没有明显表型，进入三叶期后开始迅速黄化并死亡(图7C，D)。为了明确Fd1定点突变转基因株中Fd1基因的表达情况，用Real time PCR技术检测了NPB和不同转基因株系中Fd1的表达情况，结果表明在转基因阳性株中Fd1的表达极低几乎检测不到(图7E)。
[0031] 由于Fd1能够将PSI传递的电子到FNR生成NADPH，为了验证Fd1定点突变转基因株中Fd1蛋白是否具有电子传递能力，利用光还原细胞色素c和NADP+实验验证三个突变的 Fd1蛋白(ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3)的电子传递能力。结果表明，Fd1定点突变转基因株中Fd1蛋白均没有电子传递能力(图7F，G)。
[0032] FNR接受Fd传递的电子生成NADPH，为了进一步验证Fd1定点突变转基因株是否丧失光合电子传递能力，检测了NPB和Fd1定点突变转基因株叶绿体中NADPH的含量，结果表明，3个独立的fd1突变体叶绿体中NADPH含量显著低于NPB(图7H)，说明Fd1定点突变转基因株丧失了电子传递能力。这些结果说明进一步表明Fd1是叶型Fd，参与水稻光合电子传递，对水稻生长发育至关重要。
[0033] 三、不同浓度糖处理Fd1证明Fd1突变后突变体内碳水化合物含量降低：光反应生成的NADPH主要用于卡尔文循环来合成葡萄糖。fd1突变体中Fd1丧失光合电子传递能力，且NADPH含量也显著减少。因此推测突变体中碳同化产物也会减少。对NPB和fd1 突变体中的葡萄糖、淀粉和可溶性总糖的含量检测结果表明，Fd1突变体中葡萄糖、淀粉和可溶性总糖的含量显著低于NPB(图8A-C)。
[0034] 为了进一步验证fd1突变体三叶期黄化死亡的表型是否是由于葡萄糖合成不足造成的，利用0％，2％和4％葡萄糖处理fd1突变体。结果表明，外施葡萄糖时fd1的生长得以部分恢复，在2％的浓度下可长至4叶期，而在4％的外施浓度下可长至第五叶，甚至长出分蘖芽(图8D-F)。说明突变体三叶期致死的表型确实是由于Fd1突变导致碳同化受阻引起的。上述的结果说明，Fd1参与水稻光合电子传递及碳同化。
[0035] 四、fd1突变体叶绿素含量测定及叶绿体显微结构观察由于fd1突变体在三叶期开始黄化死亡，为了验证黄化过程中是否伴随着叶绿素含量的减少。对NPB和fd1突变体的叶绿素含量进行测定发现，Fd1突变体叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)以及类胡萝卜素(Car)的含量均显著下降(图9A)。叶绿素含量的下降，预示着叶绿体的结构可能也发生了变化。利用透射电镜观察NPB和fd1突变体的显微结构发现，NPB叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层排列整齐，紧密，含有数目较多的淀粉粒(图9B)，而fd1突变体叶肉细胞的叶绿体数目较少，基粒片层，基本上没有肉眼可见的淀粉粒，同时含有较多的嗜锇颗粒(图9C)。突变体中减少的淀粉粒与上述 Fd1参与水稻光和电子传递，碳同化的结论一致。这些结果说明，Fd1突变后造成突变体叶绿体结构受损，使得突变体在三叶期出现迅速黄化的表型。
[0036] 五、铁氧还蛋白依赖的亚硝酸、亚硫酸还原酶实验证明Fd1可以将PSI电子传递到亚硝酸和亚硫酸还原酶参与氮、硫的同化既然Fd1能够从PSI中获得电子，并传给FNR，推测Fd1很可能就是水稻氮同化、硫同化过程中亚硝酸还原酶、亚硫酸还原酶所依赖的Fd蛋白。为了验证Fd1是否能够将电子传递到亚硝酸和亚硫酸还原酶参与氮、硫的同化，利用原核表达纯化的Fd1、ΔFd1-1、ΔFd1-1和ΔFd1-3 蛋白进行了铁氧还蛋白依赖的亚硝酸还原酶(NiR)、铁氧还蛋白依赖的亚硫酸还原酶(SiR) 实验。结果表明，随着Fd1蛋白浓度的增加，亚硝酸盐和亚硫酸盐的消耗也增加；而亚硝酸盐和亚硫酸盐的消耗并没有随着ΔFd1-1、ΔFd1-1和ΔFd1-3蛋白浓度的增加而增加(图 10，11)。这些结果说明，Fd1能够给亚硝酸还原酶和亚硫酸还原酶提供电子参与氮、硫的同化，而突变体则丧失了这一功能。
[0037] 综上所述，本发明首先检测了Fd1的光合电子传递能力，结合Fd1的表达模式及亚细胞定位指出Fd1是水稻中的光合型的Fd，参与水稻光合电子传递。在此基础上，通过定点突变技术首次在水稻中验证了Fd1基因的功能，该蛋白在水稻中作为PSI的电子受体，FNR的电子供体参与水稻碳同化。同时，Fd1还能将PSI的电子传递到亚硝酸还原酶和亚硫酸还原酶参与水稻氮、硫元素的固定。Fd1突变以后致使光合电子传递受损，NADPH合成减少，碳水化合物积累不足，进而导致fd1突变体在三叶期黄化死亡。Fd1能够将PSI的电子分配到三种不同的去向，结合Fd1突变体在三叶期黄化致死，表明Fd1是水稻中主要参与光合电子传递的铁氧还蛋白，在决定PSI处光合电子去向中起着重要作用。通过对Fd1基因的功能解读，不仅丰富了人们对水稻光合电子传递分子机理的认识，同时为利用分子生物学手段解决水稻高光效问题奠定了理论基础。
[0038] 即，本发明以基因定点编辑及遗传转化为基础进一步证实OsFd1基因在水稻光合电子传递过程中的作用；利用原核表达蛋白进行细胞色素c、NADP+光还原、铁氧还蛋白依赖的亚硝酸酶、铁氧还蛋白依赖的亚硫酸酶实验；以及利用不同浓度葡萄糖处理，来证明该基因编码蛋白参与水稻光合电子传递及光合产物的积累等，在影响水稻光合电子传递效率，促进碳水化合物及氮，硫等大量元素的固定和同化及光合产物积累等方面发挥作用。
[0039] 与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明公开了的水稻铁氧还蛋白编码基因编码的蛋白质，能够从PSI处接受电子并将电子传递给FNR、亚硝酸还原酶和亚硫酸还原酶，参与水稻碳、氮、硫的同化。本发明可用于调节水稻光合电子传递效率，促进碳水化合物、氮，硫等大量元素的固定和同化及光合产物积累等。附图说明
[0040] 图1A为OsFdC2同源蛋白的序列比对分析；图1B为多个物种的Fd进化树分析；
图2为Fd1在水稻不同组织的表达量分析；
图3为Fd1亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；其中：
(A)为OsFd1：：GFP融合载体图；
(B)为Fd1在细胞中的亚细胞定位图；GFP为绿色荧光观察结果；Chlorophyll为叶绿体自发荧光观察；Merged为绿色荧光与叶绿体自发荧光合并后的观察结果；Bright field为明场观察结果；
图4为七个FdC2同源蛋白和三个突变的Fd1蛋白原核表达载体示意图；以Fd1原核表达载体示意图为例，其余载体示意图用相应CDS替换Fd1 CDS序列即可；
图5为水稻中7个同源的Fd蛋白电子传递能力检测；其中：
A为OsFdC2同源蛋白光氧化细胞色素c能力检测；
B为OsFdC2同源蛋白光氧化NADP+能力检测；
图6A-6F为水稻定点突变所用原始中间载体、最终表达载体及构建完成后载体的骨架示意图；其中：
图6A为水稻定点突变所用原始中间载体结构说明；
图6B为水稻定点突变所用原始最终表达载体结构说明；
图6C为水稻pSK-gRNA-Fd1cas#1定点突变中间载体骨架示意图；
图6D为水稻pSK-gRNA-Fd1cas#1定点突变最终表达载体骨架示意图。
图2为Fd1在水稻不同组织的表达量分析；
图3为Fd1亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；其中：
(A)为OsFd1：：GFP融合载体图；
(B)为Fd1在细胞中的亚细胞定位图；GFP为绿色荧光观察结果；Chlorophyll为叶绿体自发荧光观察；Merged为绿色荧光与叶绿体自发荧光合并后的观察结果；Bright field为明场观察结果；
图4为七个FdC2同源蛋白和三个突变的Fd1蛋白原核表达载体示意图；以Fd1原核表达载体示意图为例，其余载体示意图用相应CDS替换Fd1 CDS序列即可；
图5为水稻中7个同源的Fd蛋白电子传递能力检测；其中：
A为OsFdC2同源蛋白光氧化细胞色素c能力检测；
B为OsFdC2同源蛋白光氧化NADP+能力检测；
图6A-6F为水稻定点突变所用原始中间载体、最终表达载体及构建完成后载体的骨架示意图；其中：
图6A为水稻定点突变所用原始中间载体结构说明；
图6B为水稻定点突变所用原始最终表达载体结构说明；
图6C为水稻pSK-gRNA-Fd1cas#1定点突变中间载体骨架示意图；
图6D为水稻pSK-gRNA-Fd1cas#1定点突变最终表达载体骨架示意图。
[0041] 图6E为水稻pSK-gRNA-Fd1cas#2定点突变中间载体骨架示意图；图6F为水稻pSK-gRNA-Fd1cas#2定点突变最终表达载体骨架示意图。
[0042] 图7为Fd1基因定点突变载体示意图及转基因株鉴定及分析；其中：A为Fd1基因定点突变位置示意图；
B为转基因株突变方式及突变频率分析；
C为NPB和fd1突变体二叶期表型图；fd1-1，fd1-2，fd1-3为3株T1代纯合突变表型，Bar＝2cm；
D为NPB和fd1突变体三叶期表型图；fd1-1，fd1-2，fd1-3为3株T1代纯合突变表型，Bar＝2cm；
E为NPB及fd1-1，fd1-2，fd1-3转基因株中Fd1基因表达量分析；
F为Fd1及fd1-1，fd1-2，fd1-3对应的三个突变体蛋白ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3的光氧化细胞色素c能力检测；
G为Fd1及fd1-1，fd1-2，fd1-3对应的三个突变体蛋白ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3的光氧化NADP+能力检测；
H为NPB及fd1-1，fd1-2，fd1-3转基因株叶绿体中NADPH含量比较；
图8为NPB与fd1突变体糖含量比较及不同浓度葡萄糖处理NPB与fd1突变体的表型；其中：
A为NPB和突变体fd1葡萄糖含量比较；
B为NPB和突变体fd1淀粉含量比较；
C为NPB和突变体fd1可溶性总糖含量比较；
D-F为利用0％，2％和4％浓度葡萄糖处理NPB和突变体fd1的表型对比；
图9为NPB和突变体fd1叶绿素含量及透射电镜分析NPB和突变体fd1叶绿体形态的变化；
其中：
A为NPB和突变体fd1叶绿素含量比较；
B为NPB叶片中叶绿体的发育情况；
C为突变体fd1叶片中叶绿体的发育情况；
图10为Fd1，ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3铁氧还蛋白依赖的亚硝酸还原酶结果比较；
图11为Fd1，ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3铁氧还蛋白依赖的亚硫酸还原酶结果比较。
B为转基因株突变方式及突变频率分析；
C为NPB和fd1突变体二叶期表型图；fd1-1，fd1-2，fd1-3为3株T1代纯合突变表型，Bar＝2cm；
D为NPB和fd1突变体三叶期表型图；fd1-1，fd1-2，fd1-3为3株T1代纯合突变表型，Bar＝2cm；
E为NPB及fd1-1，fd1-2，fd1-3转基因株中Fd1基因表达量分析；
F为Fd1及fd1-1，fd1-2，fd1-3对应的三个突变体蛋白ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3的光氧化细胞色素c能力检测；
G为Fd1及fd1-1，fd1-2，fd1-3对应的三个突变体蛋白ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3的光氧化NADP+能力检测；
H为NPB及fd1-1，fd1-2，fd1-3转基因株叶绿体中NADPH含量比较；
图8为NPB与fd1突变体糖含量比较及不同浓度葡萄糖处理NPB与fd1突变体的表型；其中：
A为NPB和突变体fd1葡萄糖含量比较；
B为NPB和突变体fd1淀粉含量比较；
C为NPB和突变体fd1可溶性总糖含量比较；
D-F为利用0％，2％和4％浓度葡萄糖处理NPB和突变体fd1的表型对比；
图9为NPB和突变体fd1叶绿素含量及透射电镜分析NPB和突变体fd1叶绿体形态的变化；
其中：
A为NPB和突变体fd1叶绿素含量比较；
B为NPB叶片中叶绿体的发育情况；
C为突变体fd1叶片中叶绿体的发育情况；
图10为Fd1，ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3铁氧还蛋白依赖的亚硝酸还原酶结果比较；
图11为Fd1，ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3铁氧还蛋白依赖的亚硫酸还原酶结果比较。
具体实施方式
[0043] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0044] 实施例1：水稻Fd1定点突变载体的构建：水稻原始野生材料为粳稻品种“日本晴(NPB，WT)”。
[0045] 1)、基因组编辑靶位点的设计：CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术，该技术体系自首先在人类与动物细胞系中建立后，一系列经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于各种动植物如小鼠、斑马鱼、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦等不同植物基因组的定向编辑研究中(Shan et al.2013；Anders et al.2014；Hu et al.2016)。由于CRISPR/Cas9技术具有突变诱导率高、成本低及可以多重基因编辑等特点，已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。为了获得Fd1定点突变转基因株，本发明根据生物信息学数据库中已知的NPB全基因组信息(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，首先利用基因组定点编辑软件分析和设计了两个突变靶位点(http：//crispr.dbcls.jp)。分析结果表明位于外显子上的序列 GTTGCCGATGTCCCTGCGGG和CCTGCCTTACTCCTGCCGCG可作为靶位点用于基因组编辑。该序列包括在Fd1的cDNA序列SEQ ID No：1中。
[0046] 2)、基因组编辑载体的构建：根据定点突变中间载体pSK-gRNA(Wang et al.2015)的结构(图1A)，设计了构建Fd1定点突变载体靶位点的引物Fd1cas#1-F：ggcaGTTGCCGATGTCCCTGCGGG，和Fd1cas#1-R： aaacCCCGCAGGGACATCGGCAAC；Fd1cas#2F：ggcaCCTGCCTTACTCCTGCCGCG， Fd1cas#2R：
CGCGGCAGGAGTAAGGCAGG。具体步骤如下：
步骤一：oligo二聚体(oligoduplex)的形成
将合成的oligo分别稀释成100μM，按如下比例混合：
Fd1cas#1-F 5μL，Fd1cas#1-R 5μL；Fd1cas#2-F 5μL，Fd1cas#2-R 5μL
最终体系10μL；
混匀后，在PCR仪中99℃保温5min，然后自然冷却至室温。
CGCGGCAGGAGTAAGGCAGG。具体步骤如下：
步骤一：oligo二聚体(oligoduplex)的形成
将合成的oligo分别稀释成100μM，按如下比例混合：
Fd1cas#1-F 5μL，Fd1cas#1-R 5μL；Fd1cas#2-F 5μL，Fd1cas#2-R 5μL
最终体系10μL；
混匀后，在PCR仪中99℃保温5min，然后自然冷却至室温。
[0047] 步骤二：oligo二聚体插入到中间载体(pSK-gRNA)中1.pSK-gRNA酶切：
pSK-gRNA载体5μL；10×AarI buffer 5μL；50×oligonucleotide(0.025mM)1μL；AarI 酶1μL；无菌水：38μL；最终体系50μL；37℃酶切两小时。除pSK-gRNA载体外，其余组分均购自Thermo Scientific公司。酶切后回收pSK-gRNA载体，具体方法详见Axygen DNA凝胶回收试剂盒操作说明。
pSK-gRNA载体5μL；10×AarI buffer 5μL；50×oligonucleotide(0.025mM)1μL；AarI 酶1μL；无菌水：38μL；最终体系50μL；37℃酶切两小时。除pSK-gRNA载体外，其余组分均购自Thermo Scientific公司。酶切后回收pSK-gRNA载体，具体方法详见Axygen DNA凝胶回收试剂盒操作说明。
[0048] pSK-gRNA载体在Wang C，Shen L，Fu Y，Yan C，Wang K.A Simple CRISPR/Cas9 System for Multiplex Genome Editing in Rice.J Genet Genomics.2015，42(12)：703-706中有明确告知。
[0049] 2.oligo二聚体插入到pSK-gRNA载体中：回收的pSK-gRNA载体2μL；10×T4DNA连接酶buffer 1μL；步骤一的oligo二聚体6.5 μL；T4 DNA连接酶0.5μL；最终体系10μL；16℃连接4小时后，65℃10min灭活。T4 DNA 连接酶购自Promega公司。
[0050] 取上述连接产物10μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻微混匀，冰浴 30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μL无抗LB，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂氨苄抗性(Amp，浓度为100μg/mL)的平板。挑5个白色菌落，用通用引物T7测序(taatacgactcactataggg)，鉴定阳性克隆pSK-gRNA-Fd1cas#1， pSK-gRNA-Fd1cas#2；即，测序结果中靶序列已正确连入pSK-gRNA载体的为阳性克隆 pSK-gRNA-Fd1cas#1，pSK-gRNA-Fd1cas#2。
[0051] 步骤三：pSK-gRNA-Fd1cas#1，pSK-gRNA-Fd1cas#2中目的片段插入到最终表达载体pC1300-Cas9。
[0052] 1.pSK-gRNA-Fd1cas#1，pSK-gRNA-Fd1cas#2和pC1300-Cas9载体(图1B)酶切 pSK-gRNA-Fd1cas#1，pSK-gRNA-Fd1cas#2载体5μL；10×T buffer 5μL；BglII酶2μL； KpnI酶2μL；无菌水：36μL；最终体系50μL；37℃酶切两小时，回收565bp的目的片段。pC1300-Cas9载体5μL；10×K buffer 2.5μL；BamHI酶2μL；KpnI酶2μL；无菌水：38.5μL；最终体系50μL；30℃酶切三小时，回收14.6Kb的目的载体。所有内切酶及对应buffer均购自TAKARA公司，DNA回收同前。
[0053] 2.pSK-gRNA-Fd1cas#1，pSK-gRNA-Fd1cas#2酶切回收产物插入到pC1300-Cas9载体。
[0054] 上述酶切回收的565bp片段1.9μL；14.6Kb的目的载体6.6μL；10×T4 DNA连接酶buffer 1μL；T4 DNA连接酶0.5μL；最终体系10μL；16℃连接4小时后，65℃10min 灭活。T4DNA连接酶购自Promega公司。
[0055] 连接产物10μL加入到刚解冻的50μL DH5a感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μL无抗LB，置于37℃恒温摇床中， 170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(Kan)的平板。挑5个白色菌落，用pC1300-Cas9载体1300F引物测序(caatacgcaaaccgcctctcc)，鉴定阳性克隆pC1300-Cas9-Fd1cas#1和 pC1300-Cas9-Fd1cas#2。该阳性克隆的测序结果中靶序列已正确连入pC1300-Cas9载体的为阳性克隆pSK-gRNA-Fd1cas#1和pSK-gRNA-Fd1cas#2。
[0056] 实施例2、七个Fds同源蛋白(Fd1，Fd2，Fd3，Fd4，Fd5，FdC1，FdC2)和三个突变的Fd1蛋白(ΔFd1-1，ΔFd1-2和ΔFd1-3)原核蛋白表达纯化。
[0057] 步骤一、原核表达载体的构建1、Fd1目的片段的扩增
日本晴总RNA反转录的cDNA为扩增模板1μL，2×Kod FX DNA聚合酶buffer 25μL；2mM dNTP 8μL；Kod FX DNA聚合酶(Toyobo)1μL；10mM Fd1-GEXF (cccctgggatccccggaattcATGGCGGCGACGGCACTGAGC)3μL；10mM Fd1-GEXR (ctcgagtcgacccgggaattcTTAGATGAGGTCGTCCTCCTT)3μL；无菌水9μL；最终体系50 μL；混匀后，在PCR仪运行如下程序：
98℃10min；
98℃30s；60℃30s；72℃2min；35个循环；
72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后分别回收420bp的目的片段(SEQ IDNo：2)。
日本晴总RNA反转录的cDNA为扩增模板1μL，2×Kod FX DNA聚合酶buffer 25μL；2mM dNTP 8μL；Kod FX DNA聚合酶(Toyobo)1μL；10mM Fd1-GEXF (cccctgggatccccggaattcATGGCGGCGACGGCACTGAGC)3μL；10mM Fd1-GEXR (ctcgagtcgacccgggaattcTTAGATGAGGTCGTCCTCCTT)3μL；无菌水9μL；最终体系50 μL；混匀后，在PCR仪运行如下程序：
98℃10min；
98℃30s；60℃30s；72℃2min；35个循环；
72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后分别回收420bp的目的片段(SEQ IDNo：2)。
[0058] 对于其余六个Fds同源蛋白利用表1对应引物，使用与Fd1相同的扩增体系和PCR仪运行程序扩增：Fd2回收得到如SEQ ID No：4所示的459bp的序列，Fd3回收得到如SEQ ID No：5所示的447bp的序列，Fd4回收得到如SEQ ID No：6所示的462bp的序列，Fd5回收得到如SEQ ID No：7所示的498bp的序列，FdC1回收得到如SEQ ID No：8所示的444bp 的序列，Fdd2回收得到如SEQ ID No：9所示的552bp的序列。
[0059] 2、目的载体酶切目的载体pGEX-6P-1用EcoR I(Takara)单酶切，酶切体系如下：10×H buffer 5μL； pGEX-6P-1载体10μL；EcoR I 2μL；无菌水33μL；最终体系50μL；37℃酶切2小时。 1％琼脂糖胶分离，回收酶切产物。
[0060] 3、Fd1原核表达载体的构建将上述步骤1回收的片段通过同源重组的方式，连入上述步骤2回收的目的载体，重组体系如下：PCR产物8μL；酶切回收的pGEX-6P-1载体2μL；5×CE II Buffer 4μL； II
2μL；无菌水4μL；最终体系20μL；37℃连接1小时后。除目的片段及表达载体pGEX-6P-1 外，其他试剂均购自南京诺唯赞公司(ClonExpress-II One Step Cloning Kit)。
2μL；无菌水4μL；最终体系20μL；37℃连接1小时后。除目的片段及表达载体pGEX-6P-1 外，其他试剂均购自南京诺唯赞公司(ClonExpress-II One Step Cloning Kit)。
[0061] 连接产物10μL加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30 分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μL无抗LB，置于37℃恒温摇床中， 200转/min，复苏一小时后涂布氨苄(Amp，浓度为100μg/mL)平板。挑5个白色菌落，用 OsFd1-6P-1F/R为引物，菌落PCR鉴定阳性克隆，PCR产物大小约420bp，选2个阳性克隆摇菌送测序，测序引物为pGEX-55′-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3′和pGEX-3 5′-CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3，获得Fd1原核表达载体pGEX-6P Fd1(图6)。
[0062] 步骤二、Fd1原核表达及纯化将构建好的OsFd1原核表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，取4个容量为1L 的锥形瓶，每个锥形瓶中加入400mL已添加100μg/mL Amp抗生素的液体LB培养基；将转化好的BL21菌种加1mL入4个锥形瓶中，37℃恒温摇床振荡培养至OD600值约为0.4，而后转移至18℃恒温摇床振荡培养至OD600值约为0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.2mM诱导原核表达，时长约为20个小时；离心集菌(5000rpm，离心5分钟)，每个锥形瓶集菌于1个
50mL离心管。
50mL离心管。
[0063] 使用PBS冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)重悬每个离心管中的菌块(每管加入缓冲液20mL和浓度为100mM的PMSF 200μL，PMSF的配制需要用异丙醇溶解)，直至悬浮均匀，在冰浴的烧杯中进行超声破菌25分钟(超声3秒，间歇3秒，功率300W)；将破碎好的菌液在4℃条件下，13000rpm离心10分钟，取上清收集于一个50mL离心管中。
[0064] 将收集到的上清流过PurKineTM GST-Tag Glutathione Packed Column，GST标签蛋白纯化预装柱，向预装柱中加入含有80U/mL的PreScission蛋白酶，密封柱子，4℃孵育16h，收集流出液，纯化后，得到如SEQ ID No：3所示的139个氨基酸的OsFd1原核表达蛋白。
利用BCA法测定纯化后的蛋白浓度。
利用BCA法测定纯化后的蛋白浓度。
[0065] 对于其余六个Fds同源蛋白和三个突变的Fd1蛋白，使用表1所示引物扩增回收对应大小的片段，采用与Fd1相同的载体构建及原核表达纯化步骤，分别纯化得到：如SEQ ID No： 10所示的152个氨基酸的Fd2原核表达蛋白，如SEQ ID No：11所示的148个氨基酸的Fd3 原核表达蛋白，如SEQ ID No：12所示的153个氨基酸的Fd4原核表达蛋白，如SEQ ID No： 13所示的165个氨基酸的Fd5原核表达蛋白，FdC1的氨基酸序列如SEQ ID No：14所示的 147个氨基酸的FdC1原核表达蛋白，如SEQ ID No：15所示的183个氨基酸的FdC2原核表达蛋白。
[0066] 表1、七个Fds同源蛋白和三个突变的Fd1蛋白原核表达载体构建所用引物序列实施例3：植物转化测序正确的菌株包括定点突变载体pSK-gRNA-Fd1cas#1和pSK-gRNA-Fd1cas#2及其对应的空载体pC1300-Cas9，分别提取质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 株系EHA105中转化水稻。利用野生型日本晴成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养 3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/L潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L潮霉素预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行PCR鉴定和连 T载体(TAKARApMD19)测序鉴定找到转基因阳性植株。最终pSK-gRNA-Fd1cas#1获得9 株T0代转基因阳性株；pSK-gRNA-Fd1cas#2获得14株T0代转基因阳性株。对突变转基因株中Fd1基因序列进行测序分析，我们发现pSK-gRNA-Fd1cas#1的9株转基因阳性株中Fd1 共有6种不同的突变方式；pSK-gRNA-Fd1cas#2的14株转基因阳性株中Fd1共有7种不同的突变方式。表型观察结果显示3株纯合的T1代突变体在二叶期前没有明显表型，在三叶期开始迅速黄化死亡。通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使野生型水稻定点突变为突变体表型的转基因水稻突变体。
[0067] 即，该案例是通过转基因将正常的绿色转为黄色，从而证明目的基因有调控叶片颜色的功能。
[0068] 说明：上文中所涉及的各种培养基的配方可参考Toki S.，Hara N.，Ono K.，Onodera H.， Tagiri A.，Oka S.，Tanaka H.(2006)Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The Plant Journal 47：969-976。
[0069] 实施例4、水稻原生质体的转化及OsFd1绿色荧光融合蛋白的定位观察：步骤一、OsFd1绿色荧光融合载体的构建
1、目的片段的扩增
日本晴总RNA反转录的cDNA为扩增模板1μL，2×Kod FX DNA聚合酶buffer 25μL；2mM dNTP 8μL；Kod FX DNA聚合酶(Toyobo)1μL；10mM ESL1-GFPF (tatttacaattacagtcgacATGGCGGCGACGGCACTGAG)3μL；10mM ESL1-GFPR (atggatcctctagagtcgacGATGAGGTCGTCCTCCTTGT)3μL；无菌水9μL；最终体系50μL；混匀后，在PCR仪运行如下程序：
98℃10min；
98℃30s；60℃30s；72℃2min；35个循环；
72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后回收420bp的目的片段。
1、目的片段的扩增
日本晴总RNA反转录的cDNA为扩增模板1μL，2×Kod FX DNA聚合酶buffer 25μL；2mM dNTP 8μL；Kod FX DNA聚合酶(Toyobo)1μL；10mM ESL1-GFPF (tatttacaattacagtcgacATGGCGGCGACGGCACTGAG)3μL；10mM ESL1-GFPR (atggatcctctagagtcgacGATGAGGTCGTCCTCCTTGT)3μL；无菌水9μL；最终体系50μL；混匀后，在PCR仪运行如下程序：
98℃10min；
98℃30s；60℃30s；72℃2min；35个循环；
72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后回收420bp的目的片段。
[0070] 2、目的载体酶切目的载体pCAMBIA1301-S65T用SalI(Takara)单酶切，酶切体系如下：10×H buffer 5μL； pCAMBIA1301-S65T载体10μL；SalI 2μL；无菌水33μL；最终体系50μL；37℃酶切2 小时。
1％琼脂糖胶分离，回收酶切产物。
1％琼脂糖胶分离，回收酶切产物。
[0071] 3、OsFd1绿色荧光融合载体构建将上述步骤1回收的片段通过同源重组的方式，连入上述步骤2回收的目的载体，重组体系如下：PCR产物8μL；酶切回收的pCAMBIA1301-S65T载体2μL；5×CE II Buffer 4μL；
II 2μL；无菌水4μL；最终体系20μL；37℃连接1小时后。除目的片段及表达载体pCAMBIA1301-S65T外，其他试剂均购自南京诺唯赞公司(ClonExpress-II One Step Cloning Kit)。
II 2μL；无菌水4μL；最终体系20μL；37℃连接1小时后。除目的片段及表达载体pCAMBIA1301-S65T外，其他试剂均购自南京诺唯赞公司(ClonExpress-II One Step Cloning Kit)。
[0072] 连接产物10μL加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30 分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μL无抗LB，置于37℃恒温摇床中， 170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(Kan)的平板。挑5个白色菌落，用Fd1-GFPF/R为引物，菌落PCR鉴定阳性克隆，PCR产物大小420bp，选2个阳性克隆摇菌送测序，测序引物为s65t-1F：
GAGGACAGGCTTCTTGAG和s65tR：GGTGGTGCAGATGAACTT，获得OsFd1 绿色荧光融合表达载体pCAMBIA1301-S65T-Fd1(图6A)。pCAMBIA1301-S65T载体原始出处为：
Ren D，Li Y，Zhao F，Sang X，Shi J，Wang N，Guo S，Ling Y，Zhang C，Yang Z，He G. MMLTI-FLORET SPIKELET1，which encodes an AP2/ERF protein，determines spikelet meristem fate and sterile lemma identity in rice.Plant Physiol.2013；162(2)：
872-884。
GAGGACAGGCTTCTTGAG和s65tR：GGTGGTGCAGATGAACTT，获得OsFd1 绿色荧光融合表达载体pCAMBIA1301-S65T-Fd1(图6A)。pCAMBIA1301-S65T载体原始出处为：
Ren D，Li Y，Zhao F，Sang X，Shi J，Wang N，Guo S，Ling Y，Zhang C，Yang Z，He G. MMLTI-FLORET SPIKELET1，which encodes an AP2/ERF protein，determines spikelet meristem fate and sterile lemma identity in rice.Plant Physiol.2013；162(2)：
872-884。
[0073] 步骤二、水稻原生质体提取及载体转化：(1)生长15天左右的水稻NPB苗用锋利的刀片在塑料培养皿板上切碎幼苗茎叶，移到
200mL洗净的锥形瓶中(一般20mL酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28℃摇床，60-80rpm，4-6小时。
200mL洗净的锥形瓶中(一般20mL酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28℃摇床，60-80rpm，4-6小时。
[0074] (2)在酶解时间完成之前，配置PEG400040％溶液，置于65℃水浴锅中或室温溶解， 65℃溶解，中间取出来振荡一次。
[0075] (3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入约15mL左右的W5。用300目(或400 目)的钢制滤网将碎叶片过滤掉，用干净的塑料培养皿收集酶解后的原生质体。然后将原生质体缓慢倒入(或用去枪尖的枪头吸取)50mL离心管中，天平称重平衡后，放入水平离心机，150×g，5min，充分收集原生质体，离心完成后，缓慢吸走上清。
[0076] (4)向原生质体沉淀中加入1mL W5溶液，缓慢轻轻倾斜混匀重悬，然后用去枪尖的枪头吸移到2mL离心管中。此时50mL离心管中可能还有少量未重悬的原生质体，可再加入1mL W5溶解，吸移到之前的2mL离心管中，150g，3min，移除上清液。
[0077] (5)用MMG重悬，具体加多少根据原生质体的量和要转的质粒个数来定，一般最后每个质粒中加入100μL稀释的原生质体。或者用显微镜稍微观察下产量和酶解后完整个体的数目比例，然后根据原生质体的状态来确定MMG用量。
[0078] (6)准备转化用质粒(pCAMBIA1301-S65T、pCAMBIA1301-S65T-Fd1)10-15μg左右约10μL，于2mL离心管中。
[0079] (7)加入100μL的重悬好的原生质体，然后加入PEG 40％110μL，混匀。
[0080] (8)28度避光静置15min。
[0081] (9)加入足量的W5稀释，混匀，然后离心150g，3min，缓慢移除上清，再用W5洗一次(中间会有损失，但不影响结果)。最后得到的沉淀，用W5重悬(用2mL的管子装满)，轻轻混匀，移到细胞培养板中。用锡箔纸包裹，避光28度静置培养，14小时。
[0082] (10)培养时间完成后，将培养板各孔中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸移到2mL管中，然后离心150g，3min，去除上清，保留100μL左右上清液，重悬原生质体。
[0083] (11)共聚焦显微镜观察拍照。
[0084] 结果显示阳性对照在细胞各个部位均有表达，说明实验的表达系统工作正常， OsFd1GFP融合蛋白特异的在叶绿体中表达，其他部位未见表达，说明OsFd1是定位于叶绿体中的蛋白(图6B)。
[0085] 说明：上文中所涉及的各种溶液的配方可参考Zhang et a1.A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light chloroplast-related processes.Plant Methods 2011，7：30。
[0086] 实施例5、光合色素含量测定：使用三叶期的叶片测定叶绿素及类胡萝卜素含量。分别取突变体和NPB叶片，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10L 80％丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(DU800，BECKMAN COMLTER)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)的含量，按照Wellburn(1994)计算类胡萝卜素(Car)的含量，计算公式如下：
Chl a＝(12.7×OD663-2.69×OD645)×V/W
Chl b＝(22.9×OD645-4.68×OD663)×V/W
Car＝(1000×OD470×V/W-3.27×Chl a-104×Chl b)/198
其中：V为提取液体积(10mL)，w为叶片质量0.2g，OD663、OD645及OD470为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。
Chl a＝(12.7×OD663-2.69×OD645)×V/W
Chl b＝(22.9×OD645-4.68×OD663)×V/W
Car＝(1000×OD470×V/W-3.27×Chl a-104×Chl b)/198
其中：V为提取液体积(10mL)，w为叶片质量0.2g，OD663、OD645及OD470为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。
[0087] 结果显示，与野生型相比，突变体中苗期叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量显著下降(图7)。由此推断，突变体的表型变化是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起。
[0088] 实施例6、叶绿体透射电镜的制备和观察：(1)样品：取突变体苗期叶片和对照野生型三叶期叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；
(2)固定：将切好的样品块放入2mL离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；
(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1∶1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理
20分钟；
(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3∶1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1∶1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；
(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；
(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用Hitachi H-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。
(2)固定：将切好的样品块放入2mL离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；
(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1∶1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理
20分钟；
(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3∶1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1∶1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；
(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；
(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用Hitachi H-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。
[0089] 结果显示野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层层次丰富，排列紧密，含有较多的淀粉粒。相比野生型，突变体中叶绿体数目显著减少 (图8)，嗜锇颗粒数目增多，基本没有淀粉粒。(图8)。观察结果表明基因突变造成了突变体中叶绿体数目减少，突变体不能进行正常的光合作用。
[0090] 实施例7、细胞色素c光还原实验一、菠菜类囊体膜提取
新鲜菠菜叶片洗净后去中脉，置于研钵中，加入冰冷的STN提取液(0.4M蔗糖，0.05M Tris-HCl(PH 7.6)，0.01M NaCl)。缓慢研磨叶片至碎米粒大小，经4层纱布过滤，滤液先以
200×g离心1分钟，取上清。上清再以1000×g离心3分钟，弃上清。用少量的STN提取液悬浮沉淀，得到菠菜类囊体。
新鲜菠菜叶片洗净后去中脉，置于研钵中，加入冰冷的STN提取液(0.4M蔗糖，0.05M Tris-HCl(PH 7.6)，0.01M NaCl)。缓慢研磨叶片至碎米粒大小，经4层纱布过滤，滤液先以
200×g离心1分钟，取上清。上清再以1000×g离心3分钟，弃上清。用少量的STN提取液悬浮沉淀，得到菠菜类囊体。
[0091] 二、细胞色素c光还原实验200μL的反应体系中包含，10μg/mL类囊体膜，200μM细胞色素c，25mM HEPES-KOH (pH7.6)，1mM MgCl2，100mM NaCl和利用实施例2所述方法纯化的指定浓度的Fd1，Fd2， Fd3，Fd4，Fd5，FdC1，FdC2，ΔFd1-1，ΔFd1-2，ΔFd1-3原核表达蛋白。在300μmol photons m-2s-1的光照下反应30分钟。测定在550nm处的吸收值，计算还原态细胞色素c含量。结果表明，随着七个Fd原核蛋白浓度的增加，细胞色素c的消耗量也增加(图5A)；而ΔFd1-1，ΔFd1-2，ΔFd1-3浓度的增加并没有引起细胞色素c的消耗量增加(图9)。表明，水稻中七个Fd蛋白都是PSI的电子受体，而Fd1突变以后不能够接受PSI的电子。
[0092] 实施例8、NAPD+光还原实验一、菠菜类囊体膜提取
新鲜菠菜叶片洗净后去中脉，置于研钵中，加入冰冷的STN提取液(0.4M蔗糖，0.05M Tris-HCl(PH 7.6)，0.01M NaCl)。缓慢研磨叶片至碎米粒大小，经4层纱布过滤，滤液先以
200×g离心1分钟，取上清。上清再以1000×g离心3分钟，弃上清。用少量的STN提取液悬浮沉淀，得到菠菜类囊体。
新鲜菠菜叶片洗净后去中脉，置于研钵中，加入冰冷的STN提取液(0.4M蔗糖，0.05M Tris-HCl(PH 7.6)，0.01M NaCl)。缓慢研磨叶片至碎米粒大小，经4层纱布过滤，滤液先以
200×g离心1分钟，取上清。上清再以1000×g离心3分钟，弃上清。用少量的STN提取液悬浮沉淀，得到菠菜类囊体。
[0093] 二、NADP+光还原实验200μL的反应体系中包含，10μg/mL类囊体膜，200μM NADP+，25mM HEPES-KOH(pH7.6)，1 mM MgCl2，100mM NaCl和利用实施例2所述方法纯化的指定浓度的Fd1，Fd2，Fd3，Fd4， Fd5，-2 -1
FdC1，FdC2，ΔFd1-1，ΔFd1-2，ΔFd1-3原核表达蛋白。在300μmol photons m s 的光照下反应30分钟。测定在340nm处的吸收值，计算NADPH的含量。
FdC1，FdC2，ΔFd1-1，ΔFd1-2，ΔFd1-3原核表达蛋白。在300μmol photons m s 的光照下反应30分钟。测定在340nm处的吸收值，计算NADPH的含量。
[0094] 结果表明，除FdC2，ΔFd1-1，ΔFd1-2，ΔFd1-3外，随着其余六个Fd原核蛋白浓度的增加，NADPH的量也增加(图5B)；而FdC2，ΔFd1-1，ΔFd1-2，ΔFd1-3外浓度的增加并没有引起NADPH的量增加(图10)。表明，水稻中除了FdC2蛋白外，其余的六个Fd蛋白均是FNR的电子供体，而Fd1突变以后不能够向FNR供体电子。
[0095] 实施例9、铁氧还蛋白依赖的亚硝酸还原酶实验取0.1克2-3周的野生型日本晴叶片用液氮磨成粉末，加入0.3mL亚硝酸还原酶提取液(50mM PBS，1mM EDTA，10mM巯基乙醇，100μM PMSF，1.65g PVP)。4℃离心取上清，得到水稻亚硝酸还原酶溶液。向1.5mL离心管加入45μL水稻亚硝酸还原酶溶液，195μL亚硝酸还原酶缓冲液(50mM PBS，1mM NaNO2，1mM甲基紫精)，利用实施例2所述方法纯化的指定浓度的Fd1、ΔFd1-1、ΔFd1-1和ΔFd1-3原核表达蛋白，再加入60μL反应缓冲液(57.4 mmNa2S2O4，
290mM NaHCO3)以启动反应。30℃孵育5分钟。孵育结束后，取20μL反应液，加入480μL ddH2O。
使用格里斯试剂测定反应液中亚硝酸盐含量。
290mM NaHCO3)以启动反应。30℃孵育5分钟。孵育结束后，取20μL反应液，加入480μL ddH2O。
使用格里斯试剂测定反应液中亚硝酸盐含量。
[0096] 结果表明，随着Fd1原核蛋白浓度的增加，亚硝酸盐的消耗量增加；而ΔFd1-1、ΔFd1-1 和ΔFd1-3浓度的增加并没有引起亚硝酸盐的消耗增加(图11)。表明，Fd1是亚硝酸还原酶的电子供体。
[0097] 实施例10、铁氧还蛋白依赖的亚硫酸还原酶实验取1克2-3周的野生型日本晴叶片用液氮磨成粉末，加入1mL亚硫酸还原酶提取液(50mM HEPES，10mM KCl，1mM EDTA，1mM EGTA，10mM DTT，10％甘油，500μM PMSF，20mM Zn(OAc)2，KOH调节pH至7.4)，4℃离心取上清，得到水稻亚硫酸还原酶溶液。向1.5mL 离心管加入100μL水稻亚硫酸还原酶溶液，100μL亚硫酸还原酶缓冲液(50mM HEPES， 1mM Na2SO3，KOH调节pH至7.8)，利用实施例2所述方法纯化的指定浓度的Fd1、ΔFd1-1、ΔFd1-1和ΔFd1-3原核表达蛋白，以启动反应。30℃孵育10分钟。孵育结束后，加入100μL 30mM FeCl3(溶于1.2M HCl)和100μL20mMN，N-二甲基对苯二胺二盐酸盐(溶于7.2M HCl 中)以终止反应，室温静止
15分钟后测定670nm处OD值，计算生成的H2S含量。
15分钟后测定670nm处OD值，计算生成的H2S含量。
[0098] 结果表明，随着Fd1原核蛋白浓度的增加，亚硫酸盐的消耗量增加；而ΔFd1-1、ΔFd1-1 和ΔFd1-3浓度的增加并没有引起亚硫酸盐的消耗增加(图11)。表明，Fd1是亚硫酸还原酶的电子供体。
[0099] 说明：上文中所涉及的H2S含量测定的原理可参考Li Z G.Quantification of Hydrogen Sulfide Concentration Using Methylene Blue and 5，5′-Dithiobis(2-Nitrobenzoic Acid)Methods in Plants[J].Methods in enzymology，2015，554C：101-110.
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
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