技术领域
[0001] 本
发明涉及一种
生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是一种转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技术
[0002] 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本
植物。其地上部分所提取的含有过
氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的
治疗疟疾的方法。随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗
肿瘤、抗癌以及免疫调节的功能。
[0003] 然而青蒿素在植物青蒿中的含量非常低，大规模商业化生产受到了限制，无法完全满足全球的市场需求。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具可行性。通过
酵母工程生产青蒿素，前期投入成本大，且产量有限不能满足需求。
现有技术表明植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一个可行的方法。
[0004] 青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿
叶片的
正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生
代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。
[0005]
水杨酸(Salicylic acid,SA)是重要的植物
激素,在植物的生长发育上起了非常重要的作用，并与植物的抗病防御密切相关。异分支酸合成酶(Isochorismate synthase,ICS)是植物水杨酸合成途径的其中一个关键酶,负责将分支酸转化为异分支酸，然后进一步合成最终产物水杨酸。ICS1基因水杨酸调控的抗逆有关联。对ics1突变体研究发现，缺失ICS1基因的植株内源水杨酸含量也极低。因此，克隆ICS1基因并转化青蒿，对探究水杨酸合成途径和青蒿素途径的代谢协调及基因工程育种具有重要意义。
[0006] 本发明致
力于采用基因工程手段，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本发明，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定了
基础。
[0008] 本发明提供一种转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)采用基因克隆方法获得ICS1基因；
[0010] (2)把所述ICS1基因连接于表达
调控序列，构建含ICS1基因的植物表达载体；
[0011] (3)将所述含ICS1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述ICS1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；
[0012] (4)利用所述含ICS1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因ICS1的转基因青蒿植株。
[0013] 进一步地，所述ICS1基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014] 进一步地，所述ICS1基因编码的
氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015] 进一步地，在所述步骤(1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，以所述第一链cDNA为模板，以上游引物和下游引物为引物对，进行PCR扩增，其中所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016] 优选地，在所述步骤(1)中，所述基因克隆方法包括以下步骤：提取青蒿基因组总RNA，将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA，根据SEQ ID NO.1所示的DNA序列，设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物，所述上游引物为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，所述下游引物为SEQ ID NO.4所示的DNA序列，以所述的第一链cDNA为模板，以所述上游引物和所述下游引物为引物对，经PCR扩增后进行测序。
[0017] 进一步地，在所述步骤(2)中，所述构建含ICS1基因的植物表达载体包括以下步骤：先构建中间载体PJET-ICS1，再酶切中间载体PJET-ICS1和表达载体pHB-n-flag，回收ICS1基因
片段和pHB-n-flag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证，得到含ICS1基因的植物表达载体。pHB-n-flag是对pHB201表达载体在35s启动子后插入flag改造获得并保存的表达载体。
[0018] 进一步地，在所述步骤(2)中，所述构建含ICS1基因的植物表达载体包括以下步骤：先通过连接酶将所述步骤(1)中基因克隆获得的ICS1基因片段连接到载体PJET中，得到中间载体PJET-ICS1；再设计引入酶切位点SacⅠ的上下游引物,所述引入酶切位点SacⅠ的上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述引入酶切位点SacⅠ的下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，以所述中间载体PJET-ICS1为模板，以所述引入酶切位点SacⅠ的上下游引物为引物对进行PCR扩增，得产物1；再用SacⅠ酶切所述产物1和表达载体PHB-n-flag，得到带酶切位点SacⅠ的ICS1基因片段和PHB-n-flag载体大片段；回收所述带酶切位点SacⅠ的ICS1基因片段和所述PHB-n-flag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证，得到含ICS1基因的植物表达载体。
[0019] 进一步地，在所述步骤(4)中，所述转化包括以下步骤：外植体的预培养；农杆菌与外植体的共培养；抗性再生植株的筛选；其中，
[0020] 所述预培养包括以下步骤：青蒿
种子用75％
乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基中，
25℃光照培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
[0021] 所述共培养包括以下步骤：将所述叶片外植体转到共培养培养基中，滴加含活化好的所述含ICS1基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分
接触，28℃暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；
[0022] 所述筛选包括以下步骤：将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选基上于25℃光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代培养后即可获得潮霉素(Hyg)抗性丛生芽，将所述生长良好的Hyg抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根，即可获得Hyg抗性再生青蒿植株。
[0023] 进一步地，在所述步骤(4)中，所述PCR检测包括以下步骤：根据目的基因所在表达盒p35s-ICS1-nos序列p35s和ICS1分别设计正向引物和反向引物；进行DNA扩增；紫外线下观察，若目的条带为阳性，则该株系即为所述转基因青蒿植株；所述正向引物的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
[0024] 进一步地，还包括步骤(5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行高效液相色谱法及
蒸发光散射检测器测定(HPLC-ELSD)测定，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。
[0025] 优先地，在所述步骤(5)中，所述HPLC-ELSD测定包括以下条件：所用色谱柱为C-18反相
硅胶柱，流动相选用体积比为70:30的甲醇和水，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量20μL，蒸发光散射检测器漂移管
温度40℃，放大系数为7，载气压力5bar。
[0026] 本发明的转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将异分支酸合成酶ICS1基因导入青蒿植株中，获得了青蒿素高含量显著提高的转基因青蒿株系，转ICS1基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的15.2mg/g，是非转化普通青蒿(8mg/g)的1.90倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。
附图说明
[0027] 图1是携带有转ICS1基因的青蒿与非转化普通青蒿的青蒿素含量检测结果图。
具体实施方式
[0028] 下面结合附图和
实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0029] 本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田
云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国
生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
[0030] 实施例1
[0031] 步骤一，青蒿ICS1基因的克隆
[0032] (1)青蒿基因组总RNA的提取
[0033] 青蒿基因组总RNA的提取使用TIANGEN公司的RNA
试剂盒。取50-100mg青蒿幼嫩叶片在液氮中迅速
研磨成粉末，加入550μL裂解液RL(已加入巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。9800rpm离心5min，吸取450μL转移至过滤柱CS上，CS放在收集管中，12000rpm离心5分钟，小心吸取收集管中的上清400μL至RNase-free的离心管中，缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，转入
吸附柱CR3中，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中加入
350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中央加入80μL的DNase1工作液(10μLDNase1储存液+70μLRDD溶液，轻柔混匀)，室温静置15分钟。向CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将CR3放回收集管中。向CR3中加入500μL漂洗液RW(加入乙醇)，室温静置2分钟，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将CR3放回收集管中，重复一次。12000rpm离心5min。将CR3置于室温放置5min，将CR3放入新的RNase-free中，向吸附膜的中间部位悬空滴加70μLRNase-free dd H2O，室温静置2min，
12000rpm离心2min，得到RNA溶液。取10μL放于RNase-free小管中，用于跑胶和测浓度；剩余的60μL放于RNase-free离心管中-80℃保存。
[0034] (2)青蒿ICS1基因的克隆
[0035] 将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述青蒿ICS1基因的编码序列(SEQ ID NO.1所示的DNA序列)，设计合成出完整编码框的上游引物(SEQ ID NO.3所示的DNA序列)和下游引物(SEQ ID NO.4所示的DNA序列)。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海桑尼生物科技有限公司测序完成。测序结果表明，所克隆的序列(SEQ ID NO.1所示的DNA序列)与GenBank中所报道的青蒿ICS1基因的编码序列有无义点突变，但它们在氨基酸序列上完全一致。
[0036] 本实例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿查尔
酮异构酶ICS1基因，为通过转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量提供了一个重要基因。
[0037] 步骤二，含ICS1基因的植物双元载体的构建
[0038] (1)中间载体PJET-ICS1的构建
[0039] 选用PJET载体(大连Takara公司)为基本元件，构建中间载体PJET-ICS1。具体地，将步骤一获得的ICS1基因片段(其DNA序列如SEQ ID NO.1所示)通过连接酶连接到PJET载体上，由上海桑尼生物科技有限公司测序确认基因的正确性。
[0040] (2)含ICS1基因的植物表达载体的构建
[0041] 以pHB-n-flag为表达载体，将上述ICS1基因连入其对应的酶切位点
位置。具体地，设计合成引入酶切位点SacⅠ的上下游引物,其上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，并以此为引物对，以上述中间载体PJET-ICS1为模板进行PCR扩增，得产物1；再用SacⅠ酶切所述产物1和表达载体PHB-n-flag，得到带酶切位点SacⅠ的ICS1基因片段和PHB-n-flag载体大片段；回收所述带酶切位点SacⅠ的ICS1基因片段和所述PHB-n-flag载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证，得到含ICS1基因的植物表达载体。
[0042] 本实施例将水杨酸合成途径关键酶基因ICS1可操作性地连接于表达调控序列，形成含ICS1基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略提高青蒿中青蒿素的含量。
[0043] 步骤三，含ICS1基因双元植物表达载体根癌农杆菌的获得
[0044] 将上述含ICS1基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的
生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。
[0045] 步骤四，根癌农杆菌介导ICS1基因转化青蒿
[0046] (1)外植体的预培养
[0047] 青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
[0048] (2)农杆菌与外植体的共培养
[0049] 将所述叶片外植体，转到添加乙酰丁香酮(AS)的共培养培养基(1/2MS+AS100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含ICS1基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3天。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
[0050] (3)抗性再生植株的筛选
[0051] 将所述共培养3天的青蒿外植体转入到添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)、
萘乙酸(NAA)、卡那霉素(Kan)、羧苄青霉素(cb)的发芽筛选基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，每两周继代培养一次，经过
2-3次继代培养后即可获得Hyg抗性丛生芽，将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+cb 125mg/L)上培养至生根，即可获得Hyg抗性再生青蒿植株。
[0052] 步骤五，转基因青蒿植株的PCR检测
[0053] 根据目的基因所在表达盒p35s-ICS1-nos序列p35s和ICS1分别设计正向引物(如SEQ ID NO.5所示的DNA序列)和反向引物(如SEQ ID NO.4所示的DNA序列)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
[0054] 本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含ICS1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。
[0055] 步骤六，利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
[0056] (1)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
[0057] HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(Symmetry Shiled TM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇和水，甲醇:水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
[0058] ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
[0059] 精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
[0060] 本实施例中流动相为甲醇和水，体积比为70％:30％，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
[0061] (2)标准曲线的制作
[0062] 将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μL，4μL，6μL，8μL，10μL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究，本实施例中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为Y＝5.404e+0000X+1.858e+0000，R2＝0.999184。
[0063] (3)样品的制备和青蒿素含量的测定
[0064] 取新鲜的青蒿叶片于55℃烘箱烘干后
磨碎，取0.1g样品于2mL EP管中加入1mL甲醇超声30min，12000rpm离心10min后吸取上清于新的EP管；沉淀加入1mL甲醇继续超声30min，12000rpm离心10min后吸取上清，将两次上清混匀后抽滤1mL于新的EP管。
[0065] 采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线性回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
[0066] 本实施例中转ICS1基因显著提高青蒿中青蒿素含量。如图1所示，转ICS1基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的15.2mg/g，是非转化普通青蒿(8mg/g干重)的1.90倍。图中CK表示非转化普通青蒿；pHB-AaICS1-6、15、30和31表示不同的转基因株系。
[0067] 本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用转化ICS1基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。
[0068] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多
修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由
权利要求书所确定的保护范围内。
