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酵母 发酵产类胡萝卜素的方法

阅读：1038发布：2020-06-21

专利汇可以提供酵母发酵产类胡萝卜素的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种酵母发酵产类胡萝卜素的方法，其中，发酵上清液循环利用，是指发酵结束后，将发酵液分离，得到发酵上清液，作为培养基配料用水，重新利用；发酵菌渣循环利用，是指发酵结束后，收集得到含有大量产物的酵母菌体，对菌体进行破壁，提取产物后收集菌渣，作为培养基成分重新投入下批次发酵培养中，并以此重复循环收集、利用菌渣。本发明将发酵上清液及废渣都进行循环利用，降低了生产成本，能够大量减轻后处理工段对废水废渣的处理压力，促进工厂绿色环保可持续发展。，下面是酵母发酵产类胡萝卜素的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.酵母发酵产类胡萝卜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将产类胡萝卜素且由D-半乳糖诱导的酿酒酵母工程菌种子液接入发酵培养基进行发酵；
b、发酵结束后，发酵液经离心或过滤收集菌体，上清液或滤液即为发酵上清液，将发酵上清液作为培养基配料用水进行循环利用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中发酵培养基的组成如下：葡萄糖
30-50g/L，酵母膏50-80g/L；和/或
发酵条件如下：将OD600＝16-25的种子液按3-8％v/v接种量接入发酵培养基中，发酵罐的装液量为50-70％，培养温度为28-32℃，发酵110-130h；于发酵36-48h，加入D-半乳糖，使其终浓度为10-20g/L；于发酵42-64h开始流加无水乙醇，并保持乙醇在发酵液中的浓度在
20g/L以下，直至发酵结束。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵上清液循环利用的次数为1-6次。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤b中，每次循环将所得发酵上清液作为培养基配料用水；
优选地，经3-4次循环利用后，发酵上清液取50％-75％v/v，继续循环利用。
5.酵母发酵产类胡萝卜素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将产类胡萝卜素且由D-半乳糖诱导的酿酒酵母工程菌种子液接入发酵培养基进行发酵；
B、发酵结束后，发酵液经离心或过滤收集菌体，上清液或滤液即为发酵上清液，将发酵上清液作为培养基配料用水进行循环利用；
C、菌体破壁；
D、相分离，收集产物，弃水相，分离回收菌渣，作为发酵培养基中成分进行循环利用；
E、重复步骤A-D。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤A中发酵培养基的组成如下：葡萄糖
30-50g/L，酵母膏50-80g/L；和/或
发酵条件如下：将OD600＝16-25的种子液按3-8％v/v接种量接入发酵培养基中，发酵罐的装液量为50-70％，培养温度为28-32℃，发酵110-130h；于发酵36-48h，加入D-半乳糖，使其终浓度为10-20g/L；于发酵42-64h开始流加无水乙醇，并保持乙醇在发酵液中的浓度在
20g/L以下，直至发酵结束。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤B中，每次循环将所得发酵上清液作为培养基配料用水；和/或
步骤D中，每次循环将所得菌渣作为下批次发酵培养基中的成分。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C中破壁采用酶法破壁、酸法破壁和/或机械破壁；
酶法破壁使用的酶选自蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶中的至少一种；
酸法破壁包括：将体系pH调至2-3，保持18-40h，使菌体自溶；
机械破壁选自胶体磨、剪切机、球磨机、砂磨机、均质机中的至少一种；
优选地，采用酶法破壁和高压均质破壁，其中酶法破壁所用的酶为β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，三种酶的质量比为6-8:1-2:1-2，添加量为发酵液体积的0.01-0.1％，处理时间为0.5-2h，处理温度为40℃-45℃；进行高压均质破壁，条件为：50-100MPa，高压均质循环
1-3次。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，发酵上清液及菌渣循环利用的次数为1-6次；
优选地，经3-4次循环利用后，发酵上清液取50％-75％v/v，继续循环利用；
优选地，经3-4次循环利用后，菌渣取50％-75％w/w，继续循环利用。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述类胡萝卜素为番茄红素和/或β-胡萝卜素。

说明书全文

酵母 发酵产类胡萝卜素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及酵母发酵产类胡萝卜素的发酵上清液及菌渣循环利用的方法。

背景技术

[0002] 目前利用酵母发酵产类胡萝卜素/β-胡萝卜素的生产工艺包括：发酵得到菌体-破壁-提取番红，其中发酵阶段需要原料如D-半乳糖，酵母膏成本较高。在经过单批次发酵后得到菌体，而发酵残液将作为废水排放，菌渣同样直接废弃，在工厂生产高峰期使得环保压力较大。

[0003] 尽管发酵上清液和菌渣理论上是能够被再次利用的，但是实际应用中根据不同的菌得到的发酵液，其中的必要元素和成分发生了较大变化，且含有大量的发酵代谢副产物，可能无法保证微生物正常的生产代谢环境，从而无法保证发酵达到正常的产量。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种能够使酿酒酵母生产类胡萝卜素后的发酵上清液及发酵菌渣循环利用而不影响发酵产量的方法。

[0005] 本发明中，一方面，发酵上清液循环利用，是指工程酵母菌发酵结束后，将发酵液分离，收集得到发酵上清液，也就是发酵结束后的发酵上清液，重新作为配料用水，重新利用，并在下次发酵重复利用发酵上清液作为配料用水，并将废水多次循环利用。另一方面，发酵菌渣循环利用，是指工程酵母菌发酵结束后，收集得到含有大量产物的酵母菌体，采用酶法、化学法或机械破壁法对菌体进行破壁，破壁完成经过相分离，收集菌渣层，作为培养基成分重新投入下批次发酵培养中，并以此重复循环利用菌渣。

[0006] 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供酵母发酵产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

[0007] a、将产类胡萝卜素且由D-半乳糖诱导的酿酒酵母工程菌种子液接入发酵培养基进行发酵；

[0008] b、发酵结束后，发酵液经离心或过滤收集菌体，上清液或滤液即为发酵上清液，将发酵上清液作为培养基配料用水进行循环利用。

[0009] 步骤a中发酵培养基的组成如下：葡萄糖30-50g/L，酵母膏50-80g/L，g/L。优选地，发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母膏80g/L。

[0010] 发酵条件如下：发酵条件如下：将OD600＝16-25的种子液按3-8％v/v接种量接入发酵培养基中，发酵罐的装液量为50-70％，培养温度为28-32℃，发酵110-130h；于发酵36-48h，加入D-半乳糖，使其终浓度为10-20g/L；于发酵42-64h开始流加无水乙醇，并保持乙醇在发酵液中的浓度在20g/L以下，直至发酵结束。

[0011] 本发明中，发酵上清液循环利用的次数为1-6次。

[0012] 前述的方法，步骤b中，每次循环将所得发酵上清液作为培养基配料用水。

[0013] 优选地，经3-4次循环利用后，发酵上清液取50％-75％v/v，继续循环利用。

[0014] 第二方面，本发明提供酵母发酵产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

[0015] A、将产类胡萝卜素且由D-半乳糖诱导的酿酒酵母工程菌种子液接入发酵培养基进行发酵；

[0016] B、发酵结束后，发酵液经离心(4000rpm离心5min)或过滤收集菌体，上清液或滤液即为发酵上清液，将发酵上清液作为培养基配料用水进行循环利用；

[0017] C、菌体破壁；

[0018] D、相分离，收集产物，弃水相，分离回收菌渣，作为发酵培养基中成分进行循环利用；

[0019] E、重复步骤A-D。

[0020] 步骤A中发酵培养基的组成如下：葡萄糖30-50g/L，酵母膏50-80g/L。优选地，发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母膏80g/L。

[0021] 发酵条件如下：发酵条件如下：将OD600＝16-25的种子液按3-8％v/v接种量接入发酵培养基中，发酵罐的装液量为50-70％，培养温度为28-32℃，发酵110-130h。；于发酵36-48h，加入D-半乳糖，使其终浓度为10-20g/L；于发酵42-64h开始流加无水乙醇，并保持乙醇在发酵液中的浓度在20g/L以下，直至发酵结束。

[0022] 前述的方法，步骤B中，每次循环将所得发酵上清液作为培养基配料用水。

[0023] 前述的方法，步骤D中，每次循环将所得菌渣取75％-90％w/w，作为下批次发酵培养基中的氮源。

[0024] 前述的方法，步骤C中破壁采用酶法破壁、酸法破壁和/或机械破壁。

[0025] 酶法破壁使用的酶选自蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶等中的至少一种。

[0026] 酸法破壁包括：将体系pH调至2-3，保持18-40h，使菌体自溶。

[0027] 机械破壁选自胶体磨、剪切机、球磨机、砂磨机、均质机等中的至少一种。

[0028] 优选地，采用酶法破壁和高压均质破壁，其中酶法破壁所用的酶为β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，三种酶的质量比为6-8:1-2:1-2，添加量为发酵液/菌悬液体积的0.01-0.1％，处理时间为0.5-2h，处理温度为40℃-45℃。其中高压均质破壁条件为：50-100MPa，高压均质循环1-3次。

[0029] 在本发明的一个具体实施方式中，向酿酒酵母菌悬液中加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，添加量为发酵液/菌悬液体积的0.1％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中β-葡聚糖酶、纤维素和磷脂酶的质量比为6:2:2，以80MPa高压均质一次。

[0030] 前述的方法，步骤D中相分离为水洗后离心分离。在本发明的一个具体实施方式中，向破壁后的混合液中加入水，混合液与水的体积比为1:5，搅拌均匀后离心分离去除渣相及水相；重复洗涤分离6次，得到类胡萝卜素油相。

[0031] 类胡萝卜素油相的处理方法为：将油相与碱液进行皂化反应，除去油脂，水洗除皂，得到类胡萝卜素湿晶体。具体如下：向油相中加入过量的质量浓度为18％的碱液，进行充分的皂化反应，除去油脂；将皂化反应液用水洗除皂，直至洗涤液中皂浓度小于10ppm，得到类胡萝卜素湿晶体。类胡萝卜素湿晶体于80℃真空干燥4h，即得类胡萝卜素晶体成品。

[0032] 本发明中，所述类胡萝卜素为番茄红素和/或β-胡萝卜素。所述产类胡萝卜素且由D-半乳糖诱导的酿酒酵母工程菌为保藏编号CGMCC NO.13013和/或CGMCC NO.10753的同源重组酿酒酵母，两株重组酵母菌CGMCC NO.13013、CGMCC NO.10753分别参见CN201610969721.2和CN201510435606.2。

[0033] 本发明使用的酿酒酵母为产类胡萝卜素的同源重组酿酒酵母，保藏编号为CGMCC NO.13013、CGMCC NO.10753。这两种酵母均属于同源重组酵母产类胡萝卜素，同源重组后的酿酒酵母细胞壁与普通的酿酒酵母相比其细胞壁产生了较大变化，由于类胡萝卜素为脂溶性营养素容易富集到细胞的膜结构上，发酵后期类胡萝卜素含量提高之后晶体大量聚集于细胞膜上，压迫细胞膜及细胞壁，为了保护其细胞膜及胞内类胡萝卜素产物，在重组过程中对酵母进行了细胞壁加固，因此与普通酿酒酵母相比，重组酿酒酵母菌的破壁难度更高，本发明中破壁方法更适合上述两种同源重组后的酿酒酵母。

[0034] 前述的方法，发酵上清液及菌渣循环利用的次数为1-6次。

[0035] 优选地，经3-4次循环利用后，发酵上清液取50％-75％v/v，继续循环利用。

[0036] 优选地，经3-4次循环利用后，菌渣取50％-75％w/w，继续循环利用。

[0037] 前述的方法，还包括菌种活化、种子培养及摇瓶发酵的步骤；

[0038] 菌种活化包括：菌种在斜面培养基中进行平板划线后，于30℃活化培养24-36h。所述斜面培养基可以为：葡萄糖18-22g/L，酵母膏50-80g/L，琼脂18-20g/L。

[0039] 种子培养包括：活化培养后的菌种转接到种子培养基中，于30℃250rpm培养12-16h后作为种子液。所述种子培养基可以为：葡萄糖18-22g/L，酵母膏50-80g/L。

[0040] 扩大发酵包括：将种子培养步骤中所得种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量为3-8％v/v，于28-32℃培养110-130h。所述摇瓶发酵培养基可以为：葡萄糖35-45g/L，酵母膏
50-80g/L，D-半乳糖10-20g/L。

[0041] 在本发明的具体实施方式中，可采用如下方案一进行发酵上清液及菌渣的循环利用：

[0042] 方案一：

[0043] 关于发酵上清液，每次循环发酵上清液(每次离心后获得上清液损失在10-20％之间)根据发酵规模加入清水，检测D-半乳糖含量后，使D-半乳糖含量到10-20g/L，用作配料用水继续进行下一次循环；

[0044] 关于菌渣，测定酵母膏中的氮含量，测定得到菌渣中的氮含量，根据每次得到的菌渣量，按照等氮量的原则来确定添加菌渣的量或酵母膏的补充量。继续下一次循环。

[0045] 在上述方案的基础上，作为一种更为优选的方案二：

[0046] 方案二：

[0047] 关于发酵上清液，每3-4次循环后(每次离心后获得上清液损失在10-20％之间)，发酵上清液弃掉25-50％。余下废水根据发酵规模加入清水，检测D-半乳糖含量后，使D-半乳糖含量到10-20g/L，用作配料用水继续进行下一次循环；

[0048] 关于菌渣，测定酵母膏中的氮含量，测定得到菌渣中的氮含量，根据每次得到的菌渣量，按照等氮量的原则来确定添加菌渣的量或酵母膏的补充量。每3-4次循环后，菌渣弃掉25-50％，继续下一次循环。

[0049] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0050] (一)发酵上清液循环利用，能够回收上批次投入的大量D-半乳糖，并且意外发现本发明酿酒酵母发酵得到的上清液再次利用能够给菌体生长带来较大益处。

[0051] (二)发酵菌渣循环利用，能够回收大量酵母菌体碎片，能够替代培养基酵母膏，为下批次发酵提供所需的氮源及其他营养物质。

[0052] (三)将发酵上清液废渣都进行循环利用，回收D-半乳糖，获得能够作为培养基成分的菌渣，不仅能够大量减轻后处理工段对废水废渣的处理压力，促进工厂绿色环保可持续发展，还能够降低生产成本，并且重要的是本发明提供的方案能够提高番茄红素的产量。附图说明

[0053] 图1为本发明实施例2中分别采用发酵上清液及菌渣循环方法一、发酵上清液及菌渣循环方法二的番茄红素产量。

具体实施方式

[0054] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0055] 实施例1酵母发酵产类胡萝卜素的发酵上清液循环利用的方法

[0056] 本实施例以保藏编号为CGMCC NO.13013的重组酿酒酵母为例，提供酵母发酵产类胡萝卜素(番茄红素)的发酵上清液及菌渣循环利用的方法。应理解的是，产β-胡萝卜素的酿酒酵母CGMCC NO.10753同样适用于本发明方法。

[0057] 本实施例中发酵罐体积为7L，发酵液装液体积为4L。

[0058] I、发酵工艺

[0059] 1、菌种活化

[0060] 菌种在斜面培养基中进行平板划线后，于30℃活化培养24-36h。

[0061] 所述斜面培养基为：葡萄糖20g/L，酵母膏30g/L，琼脂20g/L。

[0062] 2、种子培养

[0063] 活化培养后的菌种转接到种子培养基中，于30℃250rpm培养16h后作为种子液。

[0064] 所述种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母膏30g/L。121℃灭菌20min。

[0065] 3、摇瓶扩大发酵

[0066] 将步骤2所得种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量为5％v/v，于30℃250rpm培养120h。

[0067] 所述摇瓶发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母膏30g/L，D-半乳糖10g/L。121℃灭菌20min。

[0068] 4、发酵罐发酵

[0069] 将步骤3摇瓶发酵所得OD600＝20的种子液按5％v/v接种量接入发酵培养基中，发酵罐的装液量为4L/7L，发酵培养基成分为，葡萄糖40g/L，酵母膏80g/L，培养温度为30℃，转速为250rpm，发酵120h；于发酵48h，加入D-半乳糖，使其终浓度为10g/L。并于发酵52开始流加无水乙醇，并保持乙醇在发酵液中的浓度在10g/L以下。

[0070] II、发酵上清液回收工艺

[0071] 发酵结束后，发酵液离心(4000rpm，5min)收集上清，即为发酵上清液。

[0072] III、酿酒酵母酶解、破壁及类胡萝卜素提取工艺

[0073] 菌体用清水稀释至OD600＝1500，得到菌悬液。向菌悬液中加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，添加量为菌悬液体积的0.1％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中β-葡聚糖酶、纤维素和磷脂酶的质量比为6:2:2，以80MPa高压均质一次。

[0074] 向破壁后的混合液中加入水，混合液与水的体积比为1:5，搅拌均匀后离心分离去除水相，回收菌渣；用水重复洗涤分离6次，得到类胡萝卜素油相。向油相中加入过量的质量浓度为18％的碱液，进行充分的皂化反应，除去油脂；将皂化反应液用水洗除皂，直至洗涤液中皂浓度小于10ppm，得到类胡萝卜素湿晶体。类胡萝卜素湿晶体于80℃真空干燥4h，即得类胡萝卜素晶体成品。

[0075] IV、发酵上清液循环

[0076] 方法一：每次循环发酵离心后，平均约得到3.3L发酵上清液，下一轮发酵前以上清液进行配料，并以清水补齐至4L，补加7g的D-半乳糖，继续进行下一次循环。

[0077] 方法二：每次循环发酵离心后，约得到3.3L发酵上清液，下一轮发酵前以上清液进行配料，以清水补齐至4L；补加7g的D-半乳糖，继续进行下一次循环。每三次循环后，发酵上清液弃掉1.6L，余下约1.7L发酵上清液加入清水补齐至4L，添加23g的D-半乳糖，再进行下一轮循环。

[0078] 实验结果：

[0079] 在600nm处检测其生物量，结果见表1和表2。

[0080] 表1不同处理组的发酵液OD600值

[0081] 循环次数方法一方法二1 368.92 369.90
2 382.80 383.23
3 385.62 383.74
4 376.50 392.17
5 374.33 386.42
6 356.06 380.3
7 332.82 345.83
8 300.38 315.08

[0082] 表2不同处理组的番茄红素产量(g/L)

[0083]循环次数方法一方法二
1 6.01 6.13
2 6.73 6.79
3 6.94 6.52
4 6.62 6.98
5 6.02 6.70
6 5.38 6.18

[0084] 本发明意外地发现，利用发酵上清液进行再次利用时能够小幅度提高其生物量，循环次数1为正常发酵，可以看到在多次的循环中，菌体生物量和番茄红素产量均出现了升高。

[0085] 但是如果在没有对废水进行替换处理的方案一中，其生物量在第4次时就开始出现下降趋势，整体番茄红素产量也低于方案二。两种方案到第7次循环时出现明显的生物量异常，可能是由于上清液中含有发酵中含有大量发酵代谢副产物会对细胞产生毒性，多次循环累积后会严重影响酵母的生长活动。可见，循环并不是无限循环，大概循环6次以内能够维持菌浓及产量正常。

[0086] 实施例2酵母发酵产类胡萝卜素的方法

[0087] 本实施例中发酵罐体积为7L，发酵液装液体积为4L。

[0088] 发酵工艺(步骤I)、发酵上清液回收工艺(步骤II)、酿酒酵母酶解及破壁工艺(步骤III)同实施例1，区别在于步骤IV。

[0089] IV、发酵上清液及菌渣循环

[0090] 方法一：每次循环发酵离心后，平均约得到3.3L发酵上清液，下一轮发酵前以上清液进行配料，并以清水补齐至4L，补加7g的D-半乳糖，继续进行下一次循环。

[0091] 测得酵母膏的总N量为9.95％，测得菌渣中的总N量为4.60％，酵母每次循环发酵后得到的菌渣580-640g/4L，根据每次得到的菌渣量计算添加的酵母膏，例如，首次酵母膏的添加量为80g/L，发酵完后得到600g菌渣，则需要补充42.6g的酵母膏进行配料，再进行第二次循环发酵。每次循环完后，按照前述方法补充酵母膏，再进行下一次的循环。

[0092] 方法二：每次循环发酵离心后，约得到3.3L发酵上清液，下一轮发酵前以上清液进行配料，以清水补齐至4L；补加7g的D-半乳糖，继续进行下一次循环。每三次循环后，发酵上清液弃掉1.6L，余下约1.7L发酵上清液加入清水补齐至4L，添加23g的D-半乳糖，再进行下一轮循环。

[0093] 测得酵母膏的总N量为9.95％，测得菌渣中的总N量为4.60％，酵母每次循环发酵后得到的菌渣580-640g/4L，根据每次得到的菌渣量计算添加的酵母膏，例如，首次酵母膏的添加量为80g/L，发酵完后得到600g菌渣，则需要补充42.6g的酵母膏进行配料，再进行第二次循环发酵。每三次循环后，菌渣弃掉35％，按照前述方法进行酵母膏的补充，再进行下一轮循环。

[0094] 番茄红素的产量如表3所示。

[0095] 从结果能够看出采用菌渣作为部分氮源是完全可行的，方法一和方法二虽然均有提高番茄红素产量的影响，但是方案二能使番茄红素的产量均能够维持在比较稳定的状态。

[0096] 表3不同处理组的番茄红素产量(g/L)

[0097]

[0098]

[0099] 采用发酵上清液及菌渣循环方法一、发酵上清液及菌渣循环方法二的番茄红素产量见图1。

[0100] 实施例3酵母发酵产类胡萝卜素的发酵上清液及菌渣循环利用的方法[0101] 本实施例中发酵罐体积为70L，发酵液装液体积为40L。

[0102] 发酵工艺(步骤I)、发酵上清液回收工艺(步骤II)、酿酒酵母酶解及破壁工艺(步骤III)同实施例1，区别在于步骤IV。

[0103] IV、发酵上清液及菌渣循环

[0104] 方法一：每次循环发酵离心后，平均约得到30L发酵上清液，下一轮发酵前以上清液进行配料，并以清水补齐至40L，补加D-半乳糖，继续进行下一次循环。

[0105] 测得酵母膏的总N量为9.95％，测得菌渣中的总N量为4.60％，酵母每次循环发酵后得到的菌渣6-6.5kg/40L，根据每次得到的菌渣量计算添加的酵母膏，例如，首次酵母膏的添加量为80g/L，发酵完后得到6.5kg菌渣，则需要补充195g的酵母膏进行配料，再进行第二次循环发酵。每次循环完后，按照前述方法补充酵母膏，再进行下一次的循环。

[0106] 方法二：每次循环发酵离心后，约得到30L发酵上清液，下一轮发酵前以上清液进行配料，以清水补齐至40L；补加D-半乳糖，继续进行下一次循环。每三次循环后，发酵上清液弃掉15L，余下约15L发酵上清液加入清水补齐至40L，添加D-半乳糖，再进行下一轮循环。

[0107] 测得酵母膏的总N量为9.95％，测得菌渣中的总N量为4.60％，酵母每次循环发酵后得到的菌渣6-6.5kg/40L，根据每次得到的菌渣量计算添加的酵母膏，例如，首次酵母膏的添加量为80g/L，发酵完后得到6.5kg菌渣，则需要补充195g的酵母膏进行配料，再进行第二次循环发酵。每三次循环后，菌渣弃掉50％，按照前述方法进行酵母膏的补充，再进行下一轮循环。

[0108] 番茄红素的产量如表4所示。

[0109] 从结果能够看出采用菌渣作为部分氮源是完全可行的，方法一和方法二虽然均有提高番茄红素产量的影响，但是方案二能使番茄红素的产量均能够维持在比较稳定的状态。

[0110] 表4不同处理组的番茄红素产量(g/L)

[0111]

[0112]

[0113] 实施例4不同的破壁、产物分离方法对体系的影响

[0114] 实例1与实施例2中方法二的区别在于，酿酒酵母不是采用在破壁之后离心的方法进行相分离得到番茄红素并获得菌渣，而是破壁后进行干燥，干燥后采用乙酸丁酯萃取的方式获得番茄红素并过滤得到菌渣，具体操作步骤如下：

[0115] 收集破壁后的菌液干燥控制含水量在5％以下、粉碎至80目。将粉碎后的干菌体用乙酸丁酯溶剂萃取，萃取温度为90℃，每次萃取时间为3min，干菌体与萃取剂的质量体积比为1g:30L。萃取后过滤得到菌渣，萃取液经过结晶、洗涤后得到番茄红素晶体。

[0116] 实例2与实施例2中方法二的区别在于，酿酒酵母破壁并非采用酶解结合高压均质的方法进行破壁，而是将pH调至2，维持20h，使酿酒酵母细胞自溶，再通过高压均质进行破壁，通过加水离心得到菌渣。

[0117] 实例3与实施例2中方法二的区别在于，酿酒酵母破壁并非采用酶解结合高压均质的方法进行破壁，而是将pH调至2，维持20h，使酿酒酵母细胞自溶，再通过高压均质进行破壁通过加水离心得到菌渣，并且注意下次配料前调pH值至6.5。

[0118] 实例1-3的番茄红素产量见表5。

[0119] 表5番茄红素产量(g/L)

[0120]序号实例1 实例2 实例3
1 6.07 6.01 6.24
2 6.52 6.69 6.47
3 6.02 6.02 6.25
4 5.43 5.20 5.09
5 4.62 4.86 4.39
6 4.35 4.52 4.00

[0121] 可以看出，虽然菌渣是重相，容易被分离，但是依然会引入各种残留物质，经过几次循环的积累，会使残留物变多，影响发酵。实例1引入了有机溶剂，实例2引入了酸，实例3虽然注意进行pH调节，但中和后会生成盐，多次循环积累使得渗透压变高，同样对发酵造成影响。

[0122] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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