自繁殖的杂交植物
阅读：1发布：2020-12-15
专利汇可以提供自繁殖的杂交植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于产生自繁殖的杂交 植物 的组合物和方法。组合物包括编码多核苷酸的抑制盒和导致生成所述MiMe二倍体配子表型组合物的启动子、以及可用于受精卵中的父本二倍体配子的基因组消除的抑制盒和表达盒。所述方法包括将第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物包含负责生成所述MiMe二倍体配子表型的第一抑制盒和表达活性CENH3突变体的第一表达盒，所述第二植物包含降低野生型CENH3的 水 平的第二抑制盒和包含在所述胚珠中特异性表达CENH3的多核苷酸的第二表达盒。所得子代植物的自体受精导致受精卵中雌性二倍体基因组的消除和胚乳的正常发育。另外还提供了用本发明所述方法产生的植物和 种子 。，下面是自繁殖的杂交植物专利的具体信息内容。
1.一种产生自繁殖的杂交植物的方法，包括：
a)获得第一植物，所述第一植物的基因组中包含第一抑制盒和第一表达盒，i)其中所述第一抑制盒包含至少一个第一沉默元件，其中所述第一沉默元件被所述自繁殖的杂交植物表达时，降低至少一个靶序列的水平，其中所述靶序列包含选自下列的成员：
A)Osd1，
B)Spo11-1，以及
C)Rec8，
ii)其中所述第一表达盒包含编码活性着丝粒特异性突变型多肽的核酸分子，其中所述活性着丝粒特异性突变型多肽在所述自繁殖的杂交植物中表达；
b)获得第二植物，所述第二植物的基因组中包含第二抑制盒和第二表达盒，i)其中所述第二抑制盒包含至少一个第二沉默元件，其中所述第二沉默元件被所述自繁殖的杂交植物表达时，降低野生型着丝粒特异性多肽的水平；
ii)其中所述第二表达盒包含编码野生型着丝粒特异性多肽的核酸分子，其中所述野生型着丝粒特异性多肽在所述自繁殖的杂交植物中表达；以及
c)将所述第一植物与所述第二植物杂交，从而生成所述自繁殖的杂交植物，其中所述活性着丝粒特异性突变型多肽是指以下多肽：当它在野生型着丝粒特异性多肽被敲除或灭活的植物中表达时，形成活的植物，当该活的植物与野生型植物杂交时，以高于正常频率的频率产生单倍体子代。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一表达盒包含编码活性着丝粒特异性突变型多肽的核酸分子，其中所述活性着丝粒特异性突变型多肽选自：CENH3的片段或变体、CENH3-tailswap、CENPC、MCM21、MIS12、NDC80、NUF2，其中所述CENH3的片段或变体为活性CENH3突变体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一表达盒包含编码活性着丝粒特异性突变型多肽的核酸分子，其中所述活性着丝粒特异性多肽为CENH3-tailswap。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一表达盒还包含可操作连接到编码活性着丝粒特异性突变型多肽的所述核酸分子上的组织特异性启动子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组织特异性启动子为胚珠特异性启动子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述胚珠特异性启动子为用于BEL1基因的胚珠特异性启动子。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二抑制盒还包含可操作连接到所述第二沉默元件上的第一诱导型启动子，其中所述第一诱导型启动子驱动所述第二沉默元件在所述自繁殖的杂交植物中的表达。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一诱导型启动子选自：
a)T7启动子，
b)4X UAS启动子，和
c)LexA操纵子。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一诱导型启动子由反式激活因子A特异性诱导；
其中所述第一植物还包含第三表达盒，所述第三表达盒包含可操作连接到编码反式激活因子A的核酸分子上的第一反式激活因子启动子；并且
其中所述反式激活因子A诱导所述第一诱导型启动子并驱动所述第二沉默元件在所述自繁殖的杂交植物中的表达。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述反式激活因子A选自：
a)T7聚合酶，
b)Gal4DBD-VP16，和
c)LexA-激活因子融合体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一反式激活因子启动子为胚珠特异性启动子，其中所述胚珠特异性启动子驱动所述反式激活因子A在所述自繁殖的杂交植物的胚珠中的表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胚珠特异性启动子为用于BEL1基因的胚珠特异性启动子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一抑制盒还包含可操作连接到所述第一沉默元件上的第二诱导型启动子，其中所述第二诱导型启动子驱动所述第一沉默元件在所述自繁殖的杂交植物中的表达。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二诱导型启动子选自：
a)T7启动子，
b)4X UAS启动子，和
c)LexA操纵子。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二诱导型启动子由反式激活因子B特异性诱导；
其中所述第二植物还包含第四表达盒，所述第四表达盒包含可操作连接到编码反式激活因子B的核酸分子上的第二反式激活因子启动子，并且
其中所述反式激活因子B诱导所述第二诱导型启动子并驱动所述第一沉默元件在所述自繁殖的杂交植物中的表达。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述反式激活因子B选自：
a)T7聚合酶，
b)Gal4DBD-VP16和
c)LexA-激活因子融合体。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述野生型着丝粒特异性多肽选自：CENH3、CENPC、MCM21、MIS12、NDC80和NUF2。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述野生型着丝粒特异性多肽为CENH3。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二表达盒还包含可操作连接到编码野生型着丝粒特异性多肽的所述核酸分子上的组织特异性启动子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组织特异性启动子为中央细胞特异性启动子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述中央细胞特异性启动子选自：AT-DD7 PRO、AT-DD9 PRO、AT-DD22 PRO、AT-DD25 PRO、AT-DD36 PRO、AT-DD41 PRO、AT-DD66 PRO和AT-DD65 PRO。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一植物通过同时或依次将所述第一抑制盒和所述第一表达盒引入植物中而获得。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一植物通过将包含所述第一抑制盒的植物与包含所述第一表达盒的植物杂交而获得。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二植物通过同时或依次将所述第二抑制盒和所述第二表达盒引入植物中而获得。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二植物通过将包含所述第二抑制盒的植物与包含所述第二表达盒的植物杂交而获得。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述自繁殖的杂交植物为双子叶植物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述双子叶植物为芸苔属植物(Brassica)、向日葵、棉花、低芥酸菜子、红花、烟草、拟南芥(Arabidopsis)或苜蓿。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述自繁殖的杂交植物为大豆。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述自繁殖的杂交植物为单子叶植物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。
自繁殖的杂交植物
技术领域
[0001] 本发明涉及植物的遗传操作领域，特别是自繁殖的杂交植物的产生。
背景技术
[0002] 尽管全球植物育种计划已在开发抗病性、产量和其他有用性状有所提高的新品种方面取得了长足的进步，但育种作为一个整体，依赖于大量的植物筛选，以确定新的有利的特征。通常必须要用若干年种植和评估数量非常大的杂交子代，以便选择具有所需性状组合的一种或几种植物。
[0003] 植物育种者的持续目标是开发适合农艺的稳定、高产的品种。二倍体植物的标准育种通常需要对大量的植物进行筛选和回交，以获得所需的基因型。筛选大量子代的问题的一个解决方案是生成消除基因组异质性、从而消除任何性状分离的双单倍体植物。当经济和生物上可行时，通过采用与两个自交亲本的杂交体的杂种优势通常获得额外的收益。
[0004] 对于大豆的杂种优势研究，估计用杂交体可以使产量提高大约10％。然而，从来没有开发过杂交大豆，因为从雄性到雌性自交系的花粉流动非常贫乏。花粉引导是一个几乎没有(如果有的话)可用于大豆高批量杂交生产的解决方案的问题。然而，手工杂交可产生有限数量的杂交体数，借助自繁殖才可开始杂交大豆的批量生产。
[0005] 此外，目前的转基因渗入需要维护自交系和品种的转基因纯合性，这大大限制了天然和转基因性状堆叠的可能。然而，使用杂交植物可使通过提供来自每个亲本的单一副本来进行转基因堆叠容易得多。系统在生成自繁殖杂交体方面的可用性在植物育种和开发方面均具有价值。
[0006] 因此，通过自繁殖杂交生产可以在育种经济学方面获得显著改善，因为选择和其他工序的效率可以得到大幅度的提高。目前用于亲本特异性基因组消除的方法使植物几乎全部雄性不育，并且雌性繁殖力也非常低，从而难以进行杂交植物的繁殖。
发明内容
[0007] 本发明提供了用于产生自繁殖杂交植物的组合物和方法。组合物包括编码多核苷酸的抑制盒和导致产生MiMe二倍体配子表型的启动子。还提供了包含抑制盒和表达盒的方法和组合物，它们导致受精卵中的父本二倍体配子的基因消除，从而产生自繁殖杂交植物。
[0008] 产生自繁殖的杂交植物的方法包括使第一植物与第二植物杂交，其中第一植物包含负责产生MiMe二倍体配子表型的第一抑制盒和表达活性CENH3突变体的第一表达盒，第二植物包含减少野生型CENH3水平的第二抑制盒和包含在胚珠中特异性表达CENH3的多核苷酸的第二表达盒。所得子代植物的自体受精导致受精卵中雌性二倍体基因组的消除和胚乳的正常发育。另外还提供了用本发明方法产生的植物和种子，特别是杂交植物和杂交种子。附图说明
[0009] 图1示出了设计用于激活杂交体中的无性繁殖、但仍保持父本自交系品种的正常有性繁殖的转基因系统。
[0010] 图2示出了设计用于激活杂交体中的无性繁殖、但仍保持父本自交系品种的正常有性繁殖的转基因系统的一个例子。T7聚合酶和Gal4DBD-VP16(或LexA)双组分激活系统是作为可能的反式激活因子的例子示出的，它们只有在一起引入到含这两种转基因盒的杂交体中激活amiRNA沉默元件时，才能激活自繁殖系统。
[0011] 图3示出了用于产生自繁殖的杂交植物的机制。
[0012] 图4示出了(左)来自拟南芥(Arabidopsis)转基因PHP47078的胚珠在发育的卵细胞阶段的四重标记的胚囊。这些标记的胚囊细胞允许对细胞发育和生存能力进行监测。(右)来自拟南芥转基因PHP42551的胚珠中的三重标记的胚囊。该胚囊处于球形胚阶段之前的早期胚胎发育阶段。可以看到许多胚乳核为青色，显示了遵循早期胚乳发育的能力。
[0013] 图5。显示MiMe表型的PHP51198 T1小孢子(5A)和T2根细胞压片(5B)。显示的MiMe表型为DYAD小孢子发育，而不是四分孢子，并且是T2代中的四倍体，而不是二倍体。
[0014] 图6。4593的替代策略-自繁殖杂交体携带盒和2。
[0015] 在6A中，T7聚合酶(例如)驱动减数分裂基因的组成型抑制，产生未减数配子体。然后，Gal4DBD-VP16(例如)驱动性母细胞中CENH3的抑制，设定CENH3 GFP-tailswap表达的阶段。然后，卵细胞启动子驱动卵细胞中CENH3 GFP-tailswap的表达，导致第一次受精卵有丝分裂中雌性基因组的消除。
[0016] 在6B中，AT-DD65 PRO和花粉PRO驱动中央细胞和花粉中的WT CENH3，其允许胚乳中的正常有丝分裂并防止胚乳中的基因组消除。
[0018] 图8。MiMe T2拟南芥幼苗的有丝分裂传播的例子，显示多个阶段染色体的四倍体数目(4N＝20)。染色体是DAPI-染色的。8A-晚后期，8B-早末期和8C-末期。
具体实施方式
[0019] 下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。事实上，这些发明可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；相反，这些实施例提供的目的是使本发明满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。
[0020] 借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。
[0021] I.单性生殖
[0022] 单性生殖或通过种子进行的无性繁殖产生为母本遗传克隆体的子代。单性生殖需要来自一个父本配子的染色体的非减数分裂以及后续胚胎的孤雌发育。单性生殖可以提供保持作物中的杂种优势的机制。本发明涉及用于产生自繁殖杂交体的两种技术的组合。第一种技术为产生配子的基因组内容的非减数分裂或有丝分裂，而不是减数分裂(MiMe)的技术，如拟南芥中所显示(d′Erfurth，et al.，(2009).PLoS Biol 7：e1000124(d′Erfurth等人，2009年《，公共科学图书馆—生物学》，第7卷，第e1000124页)。第二种技术具有在高频率下引起亲本特异性基因组消除的能力(CENH3 GFP-tailswap)(Ravi and Chan，(2010)Nature 464：615-618(Ravi和Chan，2010年，《自然》，第464卷，第615-618页))。如本文所用，“自繁殖杂交体”是指能够在自体受精后使杂合基因组永久保存在子代中的杂交植物。这些组分产生自繁殖植物的能力的证明在Marimuthu，et al.，(2011)Science 331：876
(Marimuthu等人，2011年，《科学》，第331卷，第876页)中示出。然而，该系统的效率很低，需要大量的修改才能变得在经济和生物上有效。具体地讲，由Marimuthu等人在2011年证明的该系统不通过单一植物系提供自保持无性系。相反，它依赖于两个不同系的杂交，其中每一代都使克隆延续，这会显著限制稳定杂交生产系统的优点。如本文所公开，假设Marimuthu论证的系统不提供胚乳的持续和可靠的产生。另外，基因组消除技术可以破坏一些减数分裂事件，而这是系统中观察到的非整倍体的潜在原因(Ravi，，(2011).Meiosis-Specific Loading of the Centromere-Specific Histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.PLoS Genet.7，e1002121.Epub 1002011 Jun 1002129(Ravi等人，拟南芥中的着丝粒特异性组蛋白CENH3的减数分裂特异性加载，《PLoS遗传学》，第7卷，第e1002121页，Epub 1002011 Jun
1002129)。本文所述的方法提供了克服这些限制的方法。
(Marimuthu等人，2011年，《科学》，第331卷，第876页)中示出。然而，该系统的效率很低，需要大量的修改才能变得在经济和生物上有效。具体地讲，由Marimuthu等人在2011年证明的该系统不通过单一植物系提供自保持无性系。相反，它依赖于两个不同系的杂交，其中每一代都使克隆延续，这会显著限制稳定杂交生产系统的优点。如本文所公开，假设Marimuthu论证的系统不提供胚乳的持续和可靠的产生。另外，基因组消除技术可以破坏一些减数分裂事件，而这是系统中观察到的非整倍体的潜在原因(Ravi，，(2011).Meiosis-Specific Loading of the Centromere-Specific Histone CENH3 in Arabidopsis thaliana.PLoS Genet.7，e1002121.Epub 1002011 Jun 1002129(Ravi等人，拟南芥中的着丝粒特异性组蛋白CENH3的减数分裂特异性加载，《PLoS遗传学》，第7卷，第e1002121页，Epub 1002011 Jun
1002129)。本文所述的方法提供了克服这些限制的方法。
[0023] A.有丝分裂，而不是减数分裂
[0024] 减数分裂为有性繁殖生物体所必需的细胞分裂机制。在植物中，减数分裂从一个包含每个染色体的两个副本(2n)的二倍体细胞开始，并产生四个包含每个染色体的单个副本(1n)的单倍体配子细胞。传统的减数分裂产生单倍体配子，每个具有母本和父本DNA的唯一组合。减数分裂通常涉及染色体复制，然后是重组以及两轮分离和分裂。或者，有丝分裂在一轮染色体复制、分离和分裂后产生两个相同的子细胞。
[0025] 控制减数分裂的特定基因的失活能改变所得配子的染色体组成。例如，拟南芥的DYAD基因中的突变导致雌性减数分裂和产生大孢子DYAD的大孢子发生，而不是四分体(Siddiqi，et al.，(2000)Arabidopsis Development 127：197-207(Siddiqi等人，2000年，拟南芥发育，第127卷，第197-207页))。通过选择性地使与减数分裂相关的基因的组合失活，第二次减数分裂可被类似有丝分裂的分裂取代，从而产生与亲本细胞相同的未减数配子(d’Erfurth，et al.，(2009)PLoS Biol 7(6)：e1000124(d’Erfurth等人，2009年，《公共科学图书馆—生物学》，第7卷，第6期，第e1000124页))。失活的osd1导致产生未发生减数分裂II的拟南芥突变体，从而产生具有重组染色体的二倍体配子。另外，双spo11-1/rec8拟南芥突变体避免了减数分裂的第一次分裂，相反，经受类似有丝分裂的分裂，然后进行不平衡的第二次分裂，从而产生染色体不平衡和不育的配子。三osd1/spo11-1/rec8突变体(称为MiMe)由于Atspo11-1和Atrec8突变导致类似有丝分裂的第一次分裂，并且由于osd1突变而没有第二次减数分裂。因此，MiMe突变导致减数分裂被类似有丝分裂的分裂替换，从而产生具有与亲本基因在遗传上相同的染色体的配子。
[0026] 提供了包含编码抑制性多核苷酸的抑制盒的多种组合物，其降低靶多肽的活性。在特定的实施例中，提供了编码抑制性多核苷酸的沉默元件，其降低Spo11-1、Rec8或Osd1的活性。在具体的实施例中，提供了编码抑制性多核苷酸的沉默元件，其降低Spo11-1、Rec8和Osd1的活性，从而产生MiMe表型。此类核酸分子构建体在本文中称为“MiMe沉默元件”。
[0027] 植物蛋白的Spo11家族是古细菌DNA拓扑异构酶VIA亚基(拓扑VIA)的同源物，其参与DNA复制。Spo11-1特别有助于形成减数分裂的早期阶段中的重组所必需的双链断裂，并且失活的Spo11-1产生不育植物。Rec8负责减数分裂过程中轴向染色体元件的定位。减数分裂I之后，Rec8已被确认为在着丝粒处，Rec8的耗尽消除了着丝粒的内聚力。因此，着丝粒处存在Rec8被认为可在整个减数分裂I过程中保持姐妹染色单体内聚力(参见，Nat Cell Biol 1：E125-7(1999)(《自然细胞生物学》，1999年，第1卷，第E125-7页))。Osd1(省去第二次分裂)是因其与其他减数分裂基因的共调控而鉴定的UVI4样蛋白。在osd1不足的拟南芥植物中，雄性减数分裂的产物为DYAD，而不是四分体。另外，在自花传粉的osd1不足的突变体中只检测到四倍体(4n)和三倍体(3n)子代。因此，由于不存在第二次减数分裂，osd1的失活产生了功能性二倍体配子。
[0028] 在本发明的特定实施例中，本文其他地方提供的抑制盒包含可操作连接到驱动植物中的表达的启动子上的MiMe沉默元件。在一些实施例中，可操作连接到MiMe沉默元件上的启动子是诱导型启动子。例如，在具体的实施例中，MiMe沉默元件可操作连接到由反式激活因子激活的诱导型启动子上。如本文别处所述，可以在相同的植物或单独的植物中提供反式激活因子，随后与包含可操作连接到反式激活因子诱导型启动子上的MiMe沉默元件的植物杂交，从而产生功能性二倍体配子。
[0029] B.基因组消除
[0030] 用于产生只遗传来自一个亲本的染色体的植物的方法，可通过在单代中提供植物而无需若干代的同系繁殖而显著加快植物育种的速度。通过改变动粒复合体的蛋白质(着丝粒特异性多肽)如CENH3的结构，消除了受精卵中改变的亲本的染色体，从而产生单倍体植物。所得的单倍体植物具有非常高的雄性不育，但当由野生型雄性授粉时，在第一次受精卵有丝分裂时雌性基因组被消除。除了几乎全部雄性不育外，所得的植物还表现出非常低的雌性繁殖力，原因很可能是胚乳中的雌性基因组消除。卵细胞特异启动子可用于通过驱动卵细胞中的活性CENH3突变体表达来提高与受精卵的雌性基因组消除相关的雌性生殖力。卵细胞特异表达可以保持胚乳中的雌性基因组，从而确保适当的胚乳发育所必需的母本与父本染色体的合适比率。在一些实施例中，活性CENH3突变体表达可以通过胚珠进行更广泛的表达，但可以用中央细胞启动子表达野生型CENH3，从而“挽救”所得胚乳中的母本基因组。
[0031] 提供了采用野生型和改性的动粒(着丝粒特异性)蛋白的多种组合物。提供的方法和组合物包含(例如)CENH3、CENPC、MCM21、MIS12、NDC80或NUF2着丝粒特异性蛋白。下文讨论了CENH3蛋白。其他动粒蛋白的结构和/或功能特征在(例如)Du，et al.，(2010)PLoS Genet.6：e1000835(Du等人，2010年，《PLoS遗传学》，第6卷，第e1000835页)；Talbert，et al.，(2004)J.Biol.3：18(Talbert等人，2004年，《生物学杂志》，第3卷，第18页)；Sato，et al(2005)Chrom.Res.13：827-834(Sato等人，2005年，《染色体研究》，第13卷，第827-834页)；Pidoux，et al.，(2000)Opin.Cell Biol.12：308-319(Pidoux等人，2000年，《细胞生物学新见》，第12卷，第308-319页)；Du，et al.，(2007)Chrom.Res.15：767-775(Du等人，2007年，《染色体研究》，第15卷，第767-775页)；Zhang and Dawe，(2011)Chrom.Res.(March 19，2011 epub)1-10(Zhang和Dawe，2011年，《染色体研究》，(2011年3月19日电子出版)第1-10页)和Meraldi，et al.，(2006)Genome Biol.7：R23(Meraldi等人，2006年，《基因组生物学》，第7卷，第R23页)中有所描述，其全部以引用的方式并入本文。
[0032] 具体地讲，提供了采用CENH3和其改性变体的多种组合物。CENH3蛋白作为形成动粒复合体的蛋白之一，是与着丝粒功能和发展相关的一类充分表征的H3组蛋白变体。CENH3蛋白通过不形成刚性二级结构的可变的尾部结构域和由环部分连接的三个α-螺旋区构成的保守的组蛋白折叠结构域来表征。CENH3蛋白的其他结构和功能特征可见于，如，Cooper，et al.，(2004)Mol Biol Evol.21(9)：1712-8(Cooper等人，2004年《，分子生物学与进化》，第21卷，第9期，第1712-1718页)；Malik，et al.，(2003)Nat Struct Biol.10(11)：882-91(Malik等人，2003年，《天然结构生物学》，第10卷，第11期，第882-891页)；Black，et al.，(2008)Curr Opin Cell Biol.20(1)：91-100(Black等人，2008年《，细胞生物学新见》，第20卷，第1期，第91-100页)。
[0033] CENH3组蛋白折叠结构域在来自不同种类的CENH3蛋白之间为保守的，并可以通过由环部分连接的三个α-螺旋区来区分。虽然应当理解，组蛋白折叠结构域的确切位置在CENH3变体中有所不同，但会发现它在内源性(野生型)CENH3蛋白的羧基端。CENH3蛋白的尾部结构域与组蛋白折叠结构域之间的边界在保守的PGTVAL(SEQ ID NO：1)序列处、内或附近(即，与“P”的距离在5、10、15、20或25个氨基酸内)。PGTVAL序列距离拟南芥CENH3蛋白的N端大约81个氨基酸，但与不同内源性CENH3蛋白的N端的距离有所不同。因此，在一些实施例中，tailswap蛋白中使用的CENH3的组蛋白折叠区包括内源性CENH3蛋白(或基本上类似于内源性序列的蛋白)的所有C端氨基酸，直到并且包括PGTVAL。在其他实施例中，tailswap蛋白可以包含更多或更少的CENH3序列。例如，在一些实施例中，tailswap将包含CENH3蛋白的C端序列，但在C端方向与保守的PGTVAL序列的“P”最多相距5、10、15、20或25个氨基酸。在一些实施例中，tailswap将包含CENH3蛋白的C端序列，但在N端方向与保守的PGTVAL序列的“P”最多相距5、10、15、20或25个氨基酸。
[0034] 可以将任何数量的CENH3突变引入CENH3蛋白，以便在具有内源性CENH3蛋白的抑制表达的植物中表达时，产生能够生成单倍体植物的突变的(包括但不限于重组改变的)CENH3蛋白，并且其中为所得的转基因植物提供野生型CENH3蛋白。例如，可以通过将表达活性CENH3突变体的转基因植物与表达野生型CENH3蛋白的植物杂交提供野生型CENH3。活性CENH3突变蛋白可以(例如)通过随机诱变，通过针对单个或多个氨基酸的诱变，通过完整或部分蛋白结构域缺失的产生，通过与异源氨基酸序列的融合或通过它们的组合进行鉴定。活性着丝粒特异性突变型多肽是指以下多肽：当它在野生型着丝粒特异性多肽被敲除或灭活的植物中表达时，形成活的植物，当该活的植物与野生型植物杂交时，以高于正常频率的频率(如，至少0.1、0.5、1、5、10、20％或更高)产生单倍体子代。例如，“活性CENH3突变型蛋白”是指以下蛋白：当它在CENH3被敲除或灭活的植物中表达时，形成活的植物，当活的植物与野生型植物杂交时，以高于正常频率的频率(如，至少0.1、0.5、1、5、10、20％或更高)产生单倍体子代。通过以下方法可以容易地检测活性突变CENH3蛋白：在缺乏内源性CENH3蛋白的植物中进行突变CENH3蛋白的重组表达，将转基因植物(雄性或雌性，取决于生育力)与表达野生型CENH3蛋白的植物杂交，然后筛选用于产生单倍体子代。
[0035] 在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白与内源性CENH3蛋白除1、2、3、4、5、6、7、8或更多(如，1-2、1-4、1-8)个氨基酸外相同。例如，在一些实施例中，来自植物的内源性野生型蛋白与SEQ ID NO：5相同或基本上相同，活性CENH3突变型蛋白与内源性CENH3蛋白相差1、2、3、4、5、6、7、8或更多(如，1-2、1-4、1-8)个氨基酸。据信，活性CENH3突变体包括(例如)含有异源氨基酸序列的蛋白(包括但不限于绿荧光蛋白(GFP))，该序列连接到CENH3截短的或完整的尾部结构域或非CENH3尾部结构域上，其中任一者连接到CENH3组蛋白折叠结构域或CENH3截短的尾部结构域、异源CENH3尾部结构域或非CENH3尾部结构域上，其中任一者连接到CENH3组蛋白折叠结构域上。在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白包含氨基末端的异源氨基酸序列与CENH3蛋白的组蛋白折叠结构域的融合。一般来讲，组蛋白折叠结构域与其中活性CENH3突变型蛋白将被表达的生物体的内源性CENH3蛋白相同或至少基本上相同。
在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白将包括组蛋白尾部结构域，其可以为(例如)非CENH3尾部结构域或CENH3尾部结构域。
在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白将包括组蛋白尾部结构域，其可以为(例如)非CENH3尾部结构域或CENH3尾部结构域。
[0036] 据信，当大量不同的氨基酸序列连接到包含CENH3组蛋白折叠结构域和可用作或替换组蛋白尾部结构域的序列的蛋白上时，它们可用于构建活性CENH3突变体。在一些实施例中，异源序列直接连接到CENH3组蛋白折叠结构域上。
[0037] 在一些实施例中，异源序列为连接到CENH3组蛋白折叠结构域上的间插氨基酸序列。在一些实施例中，间插氨基酸序列为完整或截短的CENH3尾部结构域。异源氨基酸序列与组蛋白折叠结构域结合，将足以防止与缺乏内源性CENH3相关的杀伤力，但也将足以破坏着丝粒以允许产生单倍体子代，如本文所述。因此，在一些实施例中，异源氨基酸序列将包含为组蛋白尾部结构域或模仿组蛋白尾部结构域功能的部分，并还可以任选地包含破坏着丝粒功能的大位阻氨基酸序列。在某些实施例中，突变CENH3蛋白的异源氨基酸序列的至少一部分包含至少10、20、30、40、50，如10-30、10-50、20-50、30-50个氨基酸的任何氨基酸序列，任选地缺乏稳定的二级结构(如，缺乏卷曲、螺旋或β折叠)。在一些实施例中，该尾部结构域与其中突变CENH3蛋白将被表达的生物体的内源性CENH3蛋白的尾部结构域(如，N端135氨基酸)具有小于90、80或70％的同一性。在一些实施例中，突变CENH3蛋白的尾部结构域包含非CENH3组蛋白的尾部结构域，包括但不限于H3组蛋白。在一些实施例中，突变CENH3蛋白的尾部结构域包含其中突变CENH3蛋白将被表达的生物体的内源性非CENH3组蛋白的尾部结构域。在一些实施例中，突变CENH3蛋白的尾部结构域包含同源或直系同源(来自不同的植物种类)CENH3尾部的尾部结构域。例如，已经发现的是，融合到与拟南芥CENH3组蛋白折叠结构域连接的玉蜀黍CENH3尾部结构域上的GFP是有活性的。
[0038] 如上所述，在一些实施例中，H3组蛋白(不要与CENH3组蛋白混淆)的尾部结构域用作活性CENH3突变型蛋白的尾部结构域部分(这些实施例有时称为“tailswap”蛋白)。植物H3尾部结构域在多种生物体中非常保守。
[0039] 在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白将缺乏内源性CENH3 N端区域的至少一部分(如，至少5、10、15、20、25、30或更多个氨基酸)，因此，在一些实施例中，与野生型内源性CENH3蛋白相比，其将具有截短的CENH3尾部结构域。活性CENH3突变型蛋白可以或可以不连接到异源序列上。
[0040] 任选地是，异源氨基酸序列可以包含，或另外包含一个或多个在氨基和/或羧基末端处和/或连接尾部结构域和组蛋白折叠结构域的氨基酸序列。例如，在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白(如，tailswap或其他活性CENH3突变型蛋白)包含连接到尾部结构域的氨基末端上的异源氨基酸序列。在一些实施例中，异源序列连接到另外的野生型CENH3蛋白的氨基末端上，其中异源序列干扰着丝粒功能。例如，已经发现的是，当GFP连接到野生型CENH3上时，它足以破坏着丝粒，从而允许产生单倍体子代。据信，异源序列可以是能破坏CENH3蛋白保持着丝粒功能的能力的任何序列。因此，在一些实施例中，异源序列包含至少5、10、15、20、25、30、50或更多kD的氨基酸序列。
[0041] 在一些实施例中，活性CENH3突变型蛋白将包含用作可检测或选择性标记的蛋白结构域。例如，示例性的选择性标记蛋白为发荧光的或抗生素或除草剂的基因产物。可选择或可检测蛋白结构域可用于监测生物体中突变CENH3蛋白的存在或不存在。
[0042] 在其他实施例中，提供的表达盒包含可操作连接到驱动植物中的表达的启动子的活性CENH3突变型蛋白。在特定的实施例中，可操作连接到活性CENH3突变型蛋白上的启动子是诱导型启动子或组织特异性启动子。例如，在具体的实施例中，活性CENH3突变型蛋白可操作连接到在植物胚珠中被特异性诱导的启动子。
[0043] 在一些实施例中，提供了包含编码野生型CENH3的核苷酸序列的表达盒，其中野生型CENH3可操作连接到驱动植物中的表达的启动子。在特定的实施例中，可操作连接到编码野生型CENH3的核苷酸序列上的启动子为组织特异性启动子。例如，提供了编码野生型CENH3的核苷酸序列，其中野生型CENH3可操作连接到驱动野生型CENH3在植物的中央细胞中表达的中央细胞特异性启动子(如，AT-DD65启动子)。可以在与CENH3抑制盒相同的父本植物和/或与活性CENH3突变表达盒相同的父本植物中提供包含可操作连接到编码野生型CENH3的多核苷酸上的中央细胞特异性启动子的表达盒。
[0044] 还提供了降低野生型CENH3的活性的抑制性多核苷酸。在一些实施例中，提供了包含编码抑制性多核苷酸的沉默元件的抑制盒，其中抑制性多核苷酸可降低可操作连接到驱动植物中的表达的诱导型启动子上的野生型CENH3的活性。在具体的实施例中，提供了包含编码抑制性多核苷酸的沉默元件的抑制盒，其中抑制性多核苷酸可降低可操作连接到由反式激活因子特异性诱导的启动子上的野生型CENH3的活性。如本文别处所述，可以在相同的植物或单独的植物中提供反式激活因子，随后将该植物与包含可操作连接到反式激活因子诱导型启动子上的CENH3沉默元件的植物杂交，从而激活子代植物中的CENH3沉默元件。在一些实施例中，可以用重组酶消除启动子与编码抑制性多核苷酸的DNA区域之间的缓冲组分。
[0045] 在特定的实施例中，第一植物与第二植物杂交，生成四倍体受精卵，其随后在发生自体受精之后失去来自卵细胞的雌性基因组，最后产生自繁殖的杂交子代植物，其中第一植物包含含有中央细胞特异性启动子的CENH3表达盒、含有反式激活因子A诱导型启动子的CENH3抑制盒和含有胚珠特异性启动子的反式激活因子B表达盒，第二植物包含含有胚珠特异性启动子的活性CENH3突变表达盒、含有反式激活因子B诱导型启动子的MiMe抑制盒和含有胚珠特异性启动子的反式激活因子A表达盒。
[0046] C.产生自繁殖的杂交植物的方法
[0047] 单交杂交植物通过两种自交系品种的杂交产生，其中每一种具有补充另一种基因型的基因型。第一代杂交子代称为F1。在植物育种计划的商业杂交体的开发中，最需要的是F1杂交植物。F1杂交体比它们的自交亲本更茁壮。这种杂种优势可以体现在多个多基因性状中，包括增加的营养生长和提高的产率。
[0048] 将包含抑制子代胚珠中的内源性动粒复合体蛋白(如，CENH3、CENPC、MCM21、MIS12、NDC80或NUF2蛋白)的活性的抑制盒和表达子代中央细胞中的内源性动粒复合体蛋白的表达盒的花粉亲本植物与包含表达在子代中产生MiMe表型的抑制性多核苷酸的表达盒和如本文所述表达子代胚珠中的活性突变动粒复合体蛋白(如，tailswap或其他突变CENH3或非CENH3动粒复合体蛋白)的表达盒的胚珠亲本植物杂交，将会在自体受精之后产生至少一些为二倍体的子代(如，至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％或更多)并且只包含来自表达动粒复合体蛋白的雄性亲本的染色体。因此，本发明允许生成能够自繁殖的二倍体植物。
[0049] 虽然已知本发明并不依赖于特定的机制，但据信，本发明方法通过防止胚珠中央细胞中的雌性基因组消除而提高了自繁殖杂交种子的生存能力。还据信，用野生型CENH3补充中央细胞允许通过保持适当胚乳发育所必需的2M∶1P(2母本∶1父本)的比率而获得适当的胚乳发育。
[0050] 在一些实施例中，提供了产生自繁殖的杂交植物的方法，该方法包括将第一植物与第二植物杂交，其中第一植物包含含有MiMe沉默元件的第一抑制盒和表达活性CENH3突变型蛋白的第一表达盒，第二植物包含降低野生型CENH3水平的第二抑制盒和在胚珠中特异性表达CENH3的第二表达盒。所得的子代植物的自体受精导致受精卵中雌性二倍体基因组的消除和胚乳的正常发育，从而产生自繁殖的杂交植物。
[0051] II.组合物
[0052] 本文所公开的组合物提供了包含表达盒和抑制盒的核酸分子构建体，其中表达盒和抑制盒包含与减数分裂或基因组消除有关的多核苷酸。如本文所用，“与减数分裂相关的”或“与MiMe相关的”是指编码直接或间接参与减数分裂过程的多肽的那些多核苷酸。另外，如本文所用，“动粒”或“CENH3”是指在细胞分裂过程中介导纺锤丝的附着的染色体上专门的蛋白结构。
[0053] 降低编码此类多肽的多核苷酸的水平或降低编码的多肽的活性可导致不存在第一减数分裂、减数分裂II或不平衡的第二减数分裂。本文的其他地方公开了测量多核苷酸水平和编码的多肽的活性的方法。例如，通过使用qRT-PCR监测RNA转录物。可以使用SybrGreen或TaqMan探针。用细胞遗传学和子代分离分析间接地测定多肽活性。
[0054] 所谓“减少”或“降低”多核苷酸的表达水平或由其编码的多肽的活性，是指靶序列的多核苷酸或多肽水平统计上低于不表达沉默元件的合适对照植物中的相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在本发明的特定实施例中，根据本发明降低植物中靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平导致其与合适对照植物中相同靶序列的多核苷酸水平或者由其编码的多肽的水平相比，小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。测定RNA转录物的水平、编码的多肽的水平或多核苷酸或多肽的活性的方法是本领域已知的并且已在本文的其他地方讨论。
[0055] 表1
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] A.沉默元件
[0065] 还提供了包含编码抑制性核酸的核苷酸序列的核酸分子，以及可用于降低负责正常减数分裂的蛋白的水平和野生型动粒活性的所述序列的片段和变体。此类片段和变体可用于沉默元件和抑制盒。
[0066] 所谓“沉默元件”，是指能够通过影响靶RNA转录物的水平或者通过影响翻译并从而影响所编码多肽的水平来降低或消除靶序列的表达水平的多核苷酸。如本文所用，“靶序列”或“靶多核苷酸”包含用于降低表达水平所需的任何序列。在具体的实施例中，靶序列包含SEQ ID NO：2、3和4中示出的核苷酸序列，并且降低靶序列的表达水平导致改变正常的减数分裂活性。在其他实施例中，靶序列包含SEQ ID NO：5中示出的核苷酸序列。用于分析能够降低或消除所关注序列水平的功能性沉默元件的方法是本领域已知的。
[0067] 如下文所详述，沉默元件可以包括但不限于有义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、siRNA、amiRNA、miRNA或发夹抑制元件。可用于降低的减数分裂相关基因或CENH3基因的表达的沉默元件的非限制性例子包括SEQ ID NO：2、3、4和/或5中示出的序列的有义序列或反义序列的片段和变体。在其他实施例中，显性负突变体或蛋白片段可用于抑制靶功能。
[0068] i.有义抑制元件
[0069] 本发明的沉默元件可以包含有义抑制元件。如本文所用，“有义抑制元件”包含设计用于表达与“有义”取向的靶信使RNA的至少一部分相对应的RNA分子的多核苷酸。包含有义抑制元件的RNA分子的表达降低或消除靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平。包含有义抑制元件的多核苷酸可以对应靶多核苷酸序列的全部或一部分、靶多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的全部或一部分、靶多核苷酸的编码序列的全部或一部分或靶多核苷酸的编码序列和非翻译区二者的全部或一部分。
[0070] 通常，有义抑制元件具有与靶多核苷酸实质的序列同一性，通常大于约65％的序列同一性，大于约85％的序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。参见以引用的方式并入本文的美国专利No.5,283,184和5,034,
323。有义抑制元件可以是任何长度的，只要允许抑制靶序列就可以。有义抑制元件可以是(例如)SEQ ID NO：2、3、4和5的全长核苷酸序列或SEQ ID NO：2、3、4和5中示出的约10、15、
16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500个核苷酸或更长核苷酸的序列。在其他实施例中，有义抑制元件可以是(例如)SEQ ID NO：2、3、4和5的全长核苷酸序列或SEQ ID NO：2、3、4和5中示出的约10、15、16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、
150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个核苷酸或更长核苷酸的序列。
323。有义抑制元件可以是任何长度的，只要允许抑制靶序列就可以。有义抑制元件可以是(例如)SEQ ID NO：2、3、4和5的全长核苷酸序列或SEQ ID NO：2、3、4和5中示出的约10、15、
16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500个核苷酸或更长核苷酸的序列。在其他实施例中，有义抑制元件可以是(例如)SEQ ID NO：2、3、4和5的全长核苷酸序列或SEQ ID NO：2、3、4和5中示出的约10、15、16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、
150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个核苷酸或更长核苷酸的序列。
[0071] ii.反义抑制元件
[0072] 本发明的沉默元件可以包含反义抑制元件。如本文所用，“反义抑制元件”包含设计用于表达与靶信使RNA的全部或一部分互补的RNA分子的多核苷酸。反义RNA抑制元件的表达降低或消除靶多核苷酸的水平。用于反义抑制的多核苷酸可以对应于编码靶多核苷酸的序列的互补序列的全部或一部分、靶多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或一部分、靶多核苷酸的编码序列的互补序列的全部或一部分或者靶多核苷酸的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或一部分。此外，反义抑制元件可与靶多核苷酸完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。在具体的实施例中，反义抑制元件与靶多核苷酸具有至少85％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补。反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见(例如)美国专利No.5,942,657。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸的一部分互补。
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列互补。反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白质的表达。参见(例如)美国专利No.5,942,657。此外，反义抑制元件可以与靶多核苷酸的一部分互补。
[0073] 例如，可以使用SEQ ID NO：2、3、4和5中示出的具有至少约15、16、17、18、19、20、22、25、50、100、200、300、400、450、500个核苷酸或更长核苷酸的序列或它们的互补序列。又如，可以使用SEQ ID NO：2、3、4和5中示出的具有至少约15、16、17、18、19、20、22、25、50、
100、200、300、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个核苷酸或更长核苷酸的序列或它们的互补序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu，et al.，(2002)Plant Physiol 129：1732-1743(Liu等人，2002年《，植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和5,
942,657，将这些参考文献和专利的每一个以引用的方式并入本文。
100、200、300、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500个核苷酸或更长核苷酸的序列或它们的互补序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu，et al.，(2002)Plant Physiol 129：1732-1743(Liu等人，2002年《，植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和5,
942,657，将这些参考文献和专利的每一个以引用的方式并入本文。
[0074] iii.双链RNA抑制元件
[0075] 本发明的沉默元件可以包含双链RNA沉默元件。“双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包含至少一种能够形成dsRNA的转录物。因此，“dsRNA沉默元件”包括dsRNA、能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸或者不止一种能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”是指由单个自互补的RNA分子形成的多核糖核苷酸结构或由至少两个不同的RNA链的表达形成的多核糖核苷酸结构。本发明方法和组合物中使用的dsRNA分子(例如)通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来介导靶序列表达的降低。在本发明的上下文中，dsRNA能够降低或消除植物中靶多核苷酸或由其编码的多肽的水平和表达。
[0076] dsRNA可以通过影响靶RNA转录物的水平、通过影响翻译并从而影响编码的多肽的水平或通过影响转录前水平的表达(即，通过染色质结构调节、甲基化模式等改变基因表达)来降低或消除靶序列的表达水平。参见，例如，Verdel，et al.，(2004)Science 303：672-676(Verdel等人，2004年，《科学》，第303卷，第672-676页)；Pal-Bhadra，et al.，(2004)Science 303：669-672(Pal-Bhadra等人，2004年，《科学》，第303卷，第669-672页)；
Allshire，(2002)Science 297：1818-1819(Allshire，2002年，《科学》，第297卷，第1818-
1819页)；Volpe，et al.，(2002)Science 297：1833-1837(Volpe等人，2002年，《科学》，第
297卷，第1833-1837页)；Jenuwein，(2002)Science 297：2215-2218(Jenuwein，2002年，《科学》，第297卷，第2215-2218页)和Hall，et al.，(2002)Science 297：2232-2237(Hall等人，
2002年《，科学》，第297卷，第2232-2237页)。测定能够降低或消除所关注序列水平的功能性dsRNA的方法在本文其他地方有所公开。因此，如本文所用，术语“dsRNA”旨在涵盖用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括，例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、人工微RNA(amiRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其他。
Allshire，(2002)Science 297：1818-1819(Allshire，2002年，《科学》，第297卷，第1818-
1819页)；Volpe，et al.，(2002)Science 297：1833-1837(Volpe等人，2002年，《科学》，第
297卷，第1833-1837页)；Jenuwein，(2002)Science 297：2215-2218(Jenuwein，2002年，《科学》，第297卷，第2215-2218页)和Hall，et al.，(2002)Science 297：2232-2237(Hall等人，
2002年《，科学》，第297卷，第2232-2237页)。测定能够降低或消除所关注序列水平的功能性dsRNA的方法在本文其他地方有所公开。因此，如本文所用，术语“dsRNA”旨在涵盖用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括，例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、人工微RNA(amiRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其他。
[0077] 在具体的实施例中，dsRNA的双链体或双链区域的至少一个链与靶多核苷酸共享足够的序列同一性或序列互补性，以允许dsRNA降低靶序列的表达水平。如本文所用，与靶多核苷酸互补的链为“反义链”，与靶多核苷酸同源的链为“有义链”。
[0078] 在另一个实施例中，dsRNA包含发夹RNA。发夹RNA包含能够折回到自身上以形成双链结构的RNA分子。多种结构都可以用作发夹元件。在具体的实施例中，dsRNA抑制元件包含发夹元件，所述发夹元件依次包含第一片段、第二片段和第三片段，其中第一和第三片段共享足够的互补性，以允许转录的RNA形成双链茎环结构。
[0079] 发夹的“第二片段”包含“环”或“环区”。这些术语在本文中是同义词，并且广义地被解释为包含赋予足够柔韧性以允许多核苷酸的互补区域之间发生自配对(即，形成发夹茎的片段1和3)的任何核苷酸序列。例如，在一些实施例中，环区可以为基本上单链的并充当发夹茎环的自互补区域之间的间隔区。在一些实施例中，环区可以包含随机或无义核苷酸序列，因此与靶多核苷酸不共享序列同一性。在其他实施例中，环区包含与靶多核苷酸共享同一性的有义或反义RNA序列或其片段。参见，例如，以引用的方式并入本文的国际专利公开No.WO 2002/00904。在具体的实施例中，可以对环区进行优化，使其尽可能短，同时仍提供足够的分子内柔韧性，以允许形成碱基配对的茎区。因此，环序列通常小于约1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、19、18、
17、16、15、10个核苷酸或更小。
17、16、15、10个核苷酸或更小。
[0080] 发夹RNA分子的“第一”和“第三”片段包含发夹结构的碱基配对的茎。第一和第三片段为彼此反向重复序列并共享足够的互补性，以允许形成碱基配对的茎区。在具体的实施例中，第一和第三片段彼此完全互补。或者，第一和第三片段可以彼此部分互补，只要它们能够彼此杂交形成碱基配对的茎区就可以。第一和第三片段之间的互补量可以计算为整个片段的百分比。因此，发夹RNA的第一和第三片段通常共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，最高至并包括100％的互补性。
[0081] 在具体的实施例中，第一、第二和/或第三片段中使用的序列包含设计为与所关注的靶多核苷酸具有足够的序列同一性从而能够降低靶多核苷酸的表达水平的结构域。因此，抑制性RNA转录物的特异性通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在本发明的一些实施例中，沉默元件的第一、第二和/或第三片段包含具有至少10、至少15、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或1000以上的核苷酸的结构域，它与靶多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许在合适的细胞中表达时降低靶多核苷酸的表达水平。
[0082] 在另外的实施例中，第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸具有100％的序列同一性。在其他实施例中，与靶多肽具有同源性的第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。第一、第二和/或第三片段的结构域与靶多核苷酸的序列同一性只需足以降低所关注靶多核苷酸的表达。参见例如Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，
2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第
1723-1731页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfini，et al.，BMC Biotechnology 3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)以及美国专利申请公布No.2003/0175965，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。用于分析发夹RNA构建体使体内基因表达沉默的效率的瞬时测定法已由Panstruga，et al.，(2003)
Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-
140页)描述，该文献以引用方式并入本文。
2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第
1723-1731页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfini，et al.，BMC Biotechnology 3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)以及美国专利申请公布No.2003/0175965，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。用于分析发夹RNA构建体使体内基因表达沉默的效率的瞬时测定法已由Panstruga，et al.，(2003)
Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-
140页)描述，该文献以引用方式并入本文。
[0083] 第一、第二和/或第三片段与靶多核苷酸间共享的互补量或第一片段与第三片段(即，发夹结构的茎)间共享的互补量可以根据要控制其中的基因表达的生物体而有所不同。一些生物体或细胞类型可能需要精确配对或100％同一性，而其他生物体或细胞类型可以容忍一些错配。
[0084] 可以用靶多核苷酸的任何区域设计共享足够序列同一性的沉默元件的结构域，以允许发夹转录物的表达，从而降低靶多核苷酸的水平。例如，可将该结构域设计为与靶多核苷酸的5′未翻译区、靶多核苷酸的3′未翻译区、靶多核苷酸的外显子区、靶多核苷酸的内含子区以及它们的任何组合共享序列同一性。在某些情况下，为了优化发夹中使用的siRNA序列，可以用合成寡脱氧核糖核苷酸/RNAse H法确定靶mRNA上易经受RNA沉默的构象中的位点。参见，例如，Vickers，et al.，(2003)J.Biol.Chem 278：7108-7118(Vickers等人，2003年，《生物化学杂志》，第278卷，第7108-7118页)和Yang，et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：9442-9447(Yang等人，2002年《，美国国家科学院院刊》，第99卷，第9442-9447页)，所述专利和文献以引用方式并入本文。这些研究表明，RNase-H-敏感位点与促进有效的siRNA导向的mRNA降解的位点之间具有显著的相关性。
[0085] 在特定的实施例中，本发明的发夹RNA还可以包含内含子。这种包含内含子的发夹RNA的干扰分子与上文所述的发夹RNA的干扰分子具有相同的通式结构，但这种RNA分子另外还包含能够在表达发夹RNA的细胞中剪接的内含子。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环的大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见，例如，Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)。事实上，Smith等人示出了用包含内含子的发夹RNA介导的干扰对内源性基因表达的100％抑制。使用包含内含子的发夹RNA干扰以抑制内源性植物基因表达的方法在，例如，Smith，et al.，(2000)Nature
407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，et al.，(2001)Plant J.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；Wang and Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《植物生物学新见》，第5卷，第146-150页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)
Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第
29-38页)；Helliwell and Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295(Helliwell和
Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)和美国专利申请公布No.2003/0180945中有所描述，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，et al.，(2001)Plant J.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；Wang and Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《植物生物学新见》，第5卷，第146-150页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)
Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第
29-38页)；Helliwell and Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295(Helliwell和
Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)和美国专利申请公布No.2003/0180945中有所描述，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
[0086] 另外，可以通过使用发夹抑制元件实现转录基因沉默(TGS)，其中发夹的反向重复序列与要沉默的靶多核苷酸的启动子区域共享序列同一性。参见，例如，Aufsatz，et al.，(2002)PNAS 99(4)：16499-16506(Aufsatz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4期，第16499-16506页)和Mette，et al.，(2000)EMBO J 19(19)：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第19期，第5194-5201页)。
[0087] 在其他实施例中，dsRNA可以包含小RNA(sRNA)。sRNA可以包含微RNA(miRNA)和短干扰RNA(siRNA)(Meister and Tuschl，(2004)Nature 431：343-349(Meister和Tuschl，2004年《，自然》，第431卷，第343-349页)和Bonetta，et al.，(2004)Nature Methods 1：79-
86(Bonetta等人，2004年，《自然方法》，第1卷，第79-86页))。miRNA为包含约19个核糖核苷酸的调控剂，其在抑制靶多核苷酸的表达方面很高效。参见例如Javier，et al.，(2003)Nature 425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，该文献以引用的方式并入本文。对于miRNA干扰，可以将沉默元件设计为表达形成发夹结构的dsRNA分子，所述发夹结构包含与所关注靶多核苷酸互补的19-核苷酸序列。可以用合成方法产生miRNA或将其转录为更长的RNA，其随后裂解，以产生活性miRNA。具体地讲，miRNA可以包含与靶多核苷酸具有同源性的有义取向的19个核苷酸的序列，以及与有义序列互补的19个核苷酸的对应反义序列。
86(Bonetta等人，2004年，《自然方法》，第1卷，第79-86页))。miRNA为包含约19个核糖核苷酸的调控剂，其在抑制靶多核苷酸的表达方面很高效。参见例如Javier，et al.，(2003)Nature 425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，该文献以引用的方式并入本文。对于miRNA干扰，可以将沉默元件设计为表达形成发夹结构的dsRNA分子，所述发夹结构包含与所关注靶多核苷酸互补的19-核苷酸序列。可以用合成方法产生miRNA或将其转录为更长的RNA，其随后裂解，以产生活性miRNA。具体地讲，miRNA可以包含与靶多核苷酸具有同源性的有义取向的19个核苷酸的序列，以及与有义序列互补的19个核苷酸的对应反义序列。
[0088] 表达miRNA时，已经认识到miRNA的多种形式都可以进行转录，包括，例如，经多个核溶步骤加工为较短前体miRNA(称为“pre-miRNA”)的初级转录物(称为“pri-miRNA”)；pre-miRNA；或者最终(成熟的)miRNA以双链体形式存在，两个链称为miRNA(最终将与靶进行碱基配对的链)和miRNA*。Pre-miRNA为dicer形式的底物，它从前体上移除miRNA/miRNA*双链体，然后，与siRNA类似，双链体可被纳入RISC复合体。已经证明，miRNA可被转基因表达，并通过前体形式而不是整个初级形式的表达有效(Parizotto，et al.，(2004)Genes&Development 18：2237-2242(Parizotto等人，2004年，《基因与发育》，第18卷，第2237-2242页)和Guo，et al.，(2005)Plant Cell 17：1376-1386(Guo等人，2005年，《植物细胞》，第17卷，第1376-1386页))。
[0089] 人工微RNA(amiRNA)最近在Arabidopsis targeting viral mRNA sequences(Niu，et al.，(2006)Nature Biotechnology 24：1420-1428(拟南芥靶向病毒mRNA序列(Niu等人，2006年，《自然生物技术》，第24卷，第1420-1428页))或endogenous genes(Schwab，et al.，(2006)Plant Cell 18：1121-1133(内源性基因(Schwab等人，2006年，《植物细胞》，第18卷，第1121-1133页))中有所描述。可以在不同的启动子作用下表达amiRNA构建体，以便改变沉默的空间模式(Schwab，et al.，(2006)Plant Cell 18：1121-1133(Schwab等人，2006年，《植物细胞》，第18卷，第1121-1133页))。人工miRNA替换前体miRNA中的微RNA和它的互补星级序列以及置换靶向要沉默的mRNA的序列。用内源性miRNA进行沉默可见于多种空间、时间和发育表达模式(Parizotto，et al.，(2007)Genes Dev 18：2237-
2242(Parizotto等人，2007年，《基因和发育》，第18卷，第2237-2242页)；Alvarez，et al.，(2006)Plant Cell 18：1134-51(Alvarez等人，2006年，《植物细胞》，第18卷，第1134-1151页))。人工miRNA可被构建为能捕集和扩展沉默模式中的多样性和特异性。
2242(Parizotto等人，2007年，《基因和发育》，第18卷，第2237-2242页)；Alvarez，et al.，(2006)Plant Cell 18：1134-51(Alvarez等人，2006年，《植物细胞》，第18卷，第1134-1151页))。人工miRNA可被构建为能捕集和扩展沉默模式中的多样性和特异性。
[0090] 本发明的方法和组合物可以使用转录时形成dsRNA分子的沉默元件。因此，正在表达的异源多核苷酸不需要自己形成dsRNA，但可以与植物细胞中的其他序列相互作用，以允许形成dsRNA。例如，可以通过将包含miRNA或siRNA靶序列的嵌合构建体表达到与要沉默的一个或多个基因的全部或一部分相对应的序列中，生成有选择地使靶多核苷酸沉默的嵌合多核苷酸。在该实施例中，当miRNA或siRNA的靶与细胞中存在的miRNA相互作用时，“形成”dsRNA。然后所得的dsRNA可以降低要被沉默的一个或多个基因的表达水平。参见，例如，名称为“Methods and Compositions for Gene Silencing”(用于基因沉默的方法和组合物)的美国专利公开2007/0130653，该专利以引用的方式并入本文。可以将该构建体设计为具有内源性miRNA的靶，或者，可以在构建体中使用异源和/或合成miRNA的靶。如果使用异源和/或合成miRNA，可以将其引入与嵌合多核苷酸相同的核苷酸构建体上或单独的构建体上的细胞中。如本文别处所述，可以用任何方法引入包含异源miRNA的构建体。
[0091] 在具体的实施例中，本发明的组合物包括含有Spo11-1(SEQ ID NO：2)、Osd1(SEQ ID NO：3)、Rec8(SEQ ID NO：4)和CENH3(SEQ ID NO：5)核苷酸序列的核酸分子。或者，此类核酸分子包含与SEQ ID NO：2、3、4和/或5选择性杂交的核苷酸序列。此外，此类分离的多核苷酸可以包含以下核苷酸序列：包含与SEQ ID NO：2、3、4和/或5的互补序列或与SEQ ID NO：2、3、4和/或5选择性杂交的核苷酸序列的互补序列。
[0092] B.反式激活因子元件
[0093] 本文提供的反式激活因子元件用于通过选择性地激活诱导型启动子来调控所关注基因的表达。例如，可将编码本发明反式激活因子蛋白的多核苷酸置于组成型、组织特异性或其他反式激活因子诱导型启动子的控制下，以控制可操作连接到反式激活因子诱导型启动子上的所关注核苷酸的表达。在一些实施例中，可以从包含对应的反式激活因子诱导型启动子的表达或抑制盒在单独植物中的表达盒上提供编码反式激活因子蛋白的多核苷酸。本文提供的包含编码反式激活因子蛋白的多核苷酸的表达盒还可以包含驱动植物中反式激活因子表达的有效连接的启动子。如本文所用，“反式激活因子A”和“反式激活因子B”是指用于通过选择性地激活诱导型启动子来调控所关注基因的表达的任何反式激活因子元件。反式激活因子的例子包括本领域通常已知的GAL4DBD-VP16/UAS PRO体系、T7聚合酶/T7 PRO体系和LexA反式激活因子体系或它们的任何组合(Yagi，et al.，(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.107(37)：16166-16171(Yagi等人，2010年，《美国国家科学院院刊》，第107卷，第37期，第16166-16171页))。
[0094] 如本文所用，“反式激活因子启动子”是指可操作连接到编码反式激活因子的多核苷酸上的启动子。在具体的实施例中，提供了编码多核苷酸的表达盒，其中多核苷酸编码可操作连接到组成型或组织特异性启动子上的反式激活因子。例如，可操作连接到编码反式激活因子的多核苷酸上的组织特异性启动子可以是胚珠特异性启动子，其中反式激活因子在植物的胚珠中特异性表达。在植物的胚珠中特异性表达的此类反式激活因子可以激活对应的反式激活因子诱导型启动子，从而只在胚珠中表达所关注的基因。在本发明的一个实施例中，第一植物与第二植物杂交，其中第一植物包含表达盒，表达盒包含编码可操作连接到胚珠特异性启动子上的反式激活因子A的多核苷酸，第二植物包含抑制盒，抑制盒包含可操作连接到反式激活因子A诱导型启动子上的CENH3沉默元件。在所得的子代植物中，CENH3沉默元件在胚珠中特异性表达。
[0095] 在本发明的另一个实施例中，第一植物与第二植物杂交，其中第一植物包含表达盒，表达盒包含编码在组成型启动子控制下的反式激活因子B的多核苷酸，第二植物包含抑制盒，抑制盒包含在反式激活因子诱导型启动子控制下的MiMe沉默元件。在来自所得杂交的子代中，反式激活因子激活MiMe沉默元件的组成型表达。在某些实施例中，在与包含反式激活因子B诱导型启动子的抑制盒相同的植物中提供了包含编码反式激活因子A的多核苷酸的表达盒，其中反式激活因子A不激活反式激活因子B诱导型启动子的表达。
[0096] C.表达盒和抑制盒
[0097] 本发明组合物还涵盖表达盒和抑制盒。已经认识到，本发明的多核苷酸和沉默元件可以分别在表达盒和抑制盒中提供，用于在所关注的植物中表达。本文提供的表达盒可以包含，例如，编码反式激活因子的多核苷酸、活性CENH3突变体和/或野生型CENH3或它们的片段或变体。本文提供的抑制盒可以，例如，包含上文所述的沉默元件。
[0098] 本发明的表达盒和抑制盒可以包括可操作连接到本发明的多核苷酸或沉默元件上的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，多核苷酸和调控序列(即启动子)之间的有效连接是可使本发明的多核苷酸得以表达的功能性连接。在特定的例子中，本发明的多核苷酸或沉默元件可以可操作连接到驱动植物中的表达的启动子。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。表达盒可另外含有至少一个要共转化到生物体中的额外多核苷酸。或者，可在多个表达盒上提供额外的多肽。表达盒和抑制盒可以设有多个限制性位点和/或重组位点，以使多核苷酸的插入处于调控区域的转录调控之下。表达盒和抑制盒可以另外包含选择性标记基因。
[0099] 表达盒和抑制盒可以包括5′-3′方向的转录、转录和翻译起始区(即，启动子)、编码多肽的多核苷酸或本发明方法和组合物中使用的沉默元件，以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。在那些实施例中，如果抑制盒编码双链RNA，那么抑制盒可以包含驱动有效连接的沉默元件的转录的两个趋同启动子。“趋同启动子”是指在有效连接的沉默元件的任一端上取向，使得每个启动子以相反方向驱动沉默元件的转录，从而获得两个转录物的启动子。在此类实施例中，趋同启动子允许有义和反义链的转录，从而允许形成dsRNA。
[0100] 本发明中所用的调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或多核苷酸或沉默元件对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。或者，本发明中所用的调控区和/或多核苷酸或沉默元件对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，可操作连接到异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者实质上从它们的原始形式和/或基因座修饰而得，或者该启动子不是该被有效连接的多核苷酸的天然启动子。本文所用的嵌合基因包含与转录起始区有效连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。
[0101] 终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于编码多肽或沉默元件的有效连接的多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、多核苷酸、沉默元件、植物宿主或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。另参见Guerineau，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot，(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon，et al.，(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；
Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年《，基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)以及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe，et al.，(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年《，基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)以及Joshi，et al.，(1987)Nucleic Acids Res.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
[0102] 已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类得到充分表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
[0103] 在制备本发明的表达盒或抑制盒时，可对多个DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制位点、去除多余的DNA、去除限制位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如转换和颠换)。
[0104] 在特定的实施例中，可以将抑制盒的沉默元件可操作连接到驱动植物中沉默元件的表达的启动子上。在其他实施例中，可以将编码活性CENH3突变体、野生型CENH3或表达盒的反式激活因子的多核苷酸可操作连接到驱动植物中多核苷酸表达的启动子上。已经认识到，可以在本发明的操作中使用多个启动子。编码沉默元件的多核苷酸可以与组成型、组织偏好的、反式激活因子诱导型或其他启动子结合，用于植物中的表达。
[0105] 此类组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和WO 1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy，et al.，(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页))和
Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)
Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-
588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年《，欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等等。
其他组成型启动子包括(例如)美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、
5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)
Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-
588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年《，欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)等等。
其他组成型启动子包括(例如)美国专利No.5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、
5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
[0106] 提供了诱导型启动子，例如，反式激活因子诱导型启动子。例如，用于本文所公开的表达盒或抑制盒的反式激活因子诱导型启动子包括：Gal4DBD::VP16/UAS；Gal4DBD::假设激活结构域/UAS；T7聚合酶/T7启动子；其他专有体系；理论上：独特的DNA结合结构域::激活结构域/DNA识别元件::最小启动子元件，如植物瞬时实验系统中的许多新型融合体中所显示。
[0107] 可将化学调控启动子用于通过施加外源化学调控剂来调节基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学阻抑型启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作前突生(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他所关注的化学调控启动子包括类固醇响应启动子(参见，例如，糖皮质素诱导型启动子，Schena，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-
10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)和McNellis，et al.，(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第
14卷，第2期，第247-257页))和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见，例如，Gatz，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.，227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)以及美国专利No.5,814,618和5,789,156)，上述文献以引用的方式并入本文。
10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)和McNellis，et al.，(1998)Plant J.14(2)：247-257(McNellis等人，1998年，《植物杂志》，第
14卷，第2期，第247-257页))和四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见，例如，Gatz，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.，227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第227卷，第229-237页)以及美国专利No.5,814,618和5,789,156)，上述文献以引用的方式并入本文。
[0108] 组织偏好启动子可用来靶向特定的植物组织内的增强的表达。组织偏好启动子包括Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：
157-168(Russell等人，1997年《，转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第
112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Camp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年《，植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第
112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-
778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年《，植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka，et al.，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)和Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：
495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
157-168(Russell等人，1997年《，转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第
112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Camp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年《，植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第
112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-
778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam，(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年《，植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka，et al.，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)和Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：
495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
[0109] 卵细胞特异性启动子、中央细胞特异性启动子和花粉特异性启动子可用于限制沉默元件、活性CENH3突变体或野生型CENH3向卵细胞、中央细胞或植物花粉的表达。例如，AT-DD45 PRO、AT-RKD1 PRO或AT-RKD2 PRO可以用作卵细胞特异性启动子。卵细胞和中央细胞特异性MEA(FIS1)和FIS2启动子也是可用的生殖组织特异性启动子(Luo，et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10637-10642(Luo等人，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第10637-10642页)；Vielle-Calzada，et al.，(1999)Genes Dev.13：2971-2982(Vielle-Calzada等人，1999年，《基因和发育》，第13卷，第2971-2982页))。卵细胞和中央细胞特异性启动子的其他例子可见于，例如，Steffen，et al.，(2007)Plant J 51：281-292(Steffen等人，2007年，《植物杂志》，第51卷，第281-292页)和Ohnishi，et al.，(2011)Plant Physiology 155：881-891(Ohnishi等人，2011年，《植物生理学》，第155卷，第881-
891页)，上述文献全文以引用的方式并入本文。例如，可以使用来自Steffen等人的中央细胞特异性启动子，包括，例如，AT-DD7 PRO、AT-DD9 PRO、AT-DD22 PRO、AT-DD25 PRO、AT-DD36 PRO、AT-DD41 PRO、AT-DD66 PRO和AT-DD65 PRO。
891页)，上述文献全文以引用的方式并入本文。例如，可以使用来自Steffen等人的中央细胞特异性启动子，包括，例如，AT-DD7 PRO、AT-DD9 PRO、AT-DD22 PRO、AT-DD25 PRO、AT-DD36 PRO、AT-DD41 PRO、AT-DD66 PRO和AT-DD65 PRO。
[0110] 胚珠特异性启动子是已知的，并可以选择用于本文其他地方所公开的多核苷酸的胚珠特异性表达。例如，胚珠特异性启动子可以驱动整个胚珠(包括但不限于卵细胞和中央细胞)中反式激活因子或活性CENH3突变体的表达。也可以使用用于BEL1基因的胚珠特异性启动子(Reiser，et al.，(1995)Cell 83：735-742 GenBank Number U39944(Reiser等人，1995年，《细胞》，第83卷，第735-742页，GenBank号U39944)；Ray，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5761-5765(Ray等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第5761-5765页))以及提交于2010年10月26日的美国专利申请No.12/912,231，该专利以引用的方式全文并入本文。
[0111] 可用的启动子还包括用于野黑樱苷水解酶的黑樱桃启动子(PH DL1.4PRO)(美国专利No.6,797,859)、来自黄瓜和水稻的硫氧还蛋白H启动子(Fukuda，et al.，(2005).Plant Cell Physiol.46(11)：1779-86(Fukuda等人，2005年，《植物细胞生理学》，第46卷，第11期，第1779-1786页))，水稻(RSs1)(Shi，et al.，(1994).J.Exp.Bot.45(274)：623-631(Shi等人，1994年，《实验植物学杂志》，第45卷，第274期，第623-631页))和玉蜀黍蔗糖合成-1启动子(Yang，et al.，(1990)PNAS 87：4144-4148(Yang等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第4144-4148页))、来自南瓜的PP2启动子(Guo，et al.，(2004)Transgenic Research 13：559-566(Guo等人，2004年，《转基因研究》，第13卷，第559-566页))、At SUC2启动子(Truermit，et al.，(1995)Planta 196(3)：564-70(Truernit等人，
1995年，《植物》，第196卷，第3期，第564-570页)，At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge，et al.，(1996)Planr.Cell.Physiol.37(8)：1108-1115(Mijnsbrugge等人，
1996年，《植物细胞生理学》，第37卷，第8期，第1108-1115页))以及水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasi，et al.，(1993)Plant J.4(1)：71-79
(Bhattacharyya-Pakrasi等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第1期，第71-79页))。
1995年，《植物》，第196卷，第3期，第564-570页)，At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge，et al.，(1996)Planr.Cell.Physiol.37(8)：1108-1115(Mijnsbrugge等人，
1996年，《植物细胞生理学》，第37卷，第8期，第1108-1115页))以及水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasi，et al.，(1993)Plant J.4(1)：71-79
(Bhattacharyya-Pakrasi等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第1期，第71-79页))。
[0112] 表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因被利用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su，et al.，(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)和Fetter，et al.，(2004)Plant Cell 16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato，et al.，(2002)Plant Physiol 129：913-42(Kato等人，2002年《，植物生理学》，第129TM
卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP ，参见Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标记，一般参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao，et al.，(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff等人，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley，et al.，(1980)The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，《操纵子》，第177-220页)；Hu，et al.，(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年《，细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown，et al.，(1987)Cell 49：603-612(Brown等人，1987年《，细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge，et al.，(1988)Cell 52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；
Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst，et al.，(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年《，美国国家科学院院刊》，第
86卷，第2549-2553页)；Deuschle，et al.，(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，
1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，博士论文，海德堡大学)；Reines，et al.，(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年《，美国国家科学院院刊》，第
90卷，第1917-1921页)；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，
1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-
5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；
Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第
1094-1104页)；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，博士论文，海德堡大学)；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年《，实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill，et al.，(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因均可用于本发明。
卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP ，参见Bolte，et al.，(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标记，一般参见Yarranton，(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao，et al.，(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff，(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff等人，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley，et al.，(1980)The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，《操纵子》，第177-220页)；Hu，et al.，(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年《，细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown，et al.，(1987)Cell 49：603-612(Brown等人，1987年《，细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge，et al.，(1988)Cell 52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；
Deuschle，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst，et al.，(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553(Fuerst等人，1989年《，美国国家科学院院刊》，第
86卷，第2549-2553页)；Deuschle，et al.，(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，
1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，博士论文，海德堡大学)；Reines，et al.，(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年《，美国国家科学院院刊》，第
90卷，第1917-1921页)；Labow，et al.，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，
1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-
5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski，et al.，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman，(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；
Degenkolb，et al.，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt，et al.，(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第
1094-1104页)；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，博士论文，海德堡大学)；Gossen，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva，et al.，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka，et al.，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年《，实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill，et al.，(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标记基因均可用于本发明。
[0113] D.片段和变体
[0114] 可以根据天然存在的CENH3、Spo11-1、Rec8或Osd1多核苷酸或它们的片段或变体设计本发明的表达盒和抑制盒。所谓“片段”，是指核苷酸序列的一部分。本发明所公开的核苷酸序列的片段可以在至少约10、16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个连续的核苷酸范围内，或最多至本文所公开的全长CENH3、Spo11-1、Rec8或Osd1多核苷酸中存在的核苷酸数量(例如，SEQ ID NO：2的1089个核苷酸)，只要片段达到所需的目的就可以，即，所关注的生物活性多肽(例如，活性CENH3突变体或CENH3多肽)的表达或抑制CENH3、Spo11-1、Rec8或Osd1多肽的表达或功能的功能性沉默元件的表达。
[0115] 所谓“变体”，是指基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸当中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如本文所用，“天然”多核苷酸包含天然存在的核苷酸序列，例如，天然存在的CENH3、Spo11-1、Rec8或Osd1多核苷酸。对于多核苷酸，可以使用公知的分子生物学技术来鉴定天然存在的变体，例如用本文别处所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成法获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变产生的多核苷酸。通常，通过本领域通常已知的序列比对程序和参数测定，本发明的特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高的序列同一性。
98％、99％或更高的序列同一性。
[0116] 在特定的实施例中，本发明的沉默元件可以包含SEQ ID NO：2、3、4和/或5的全长核苷酸序列或SEQ ID NO：2、3、4和/或5的核苷酸序列的片段。另外，本发明的沉默元件可以包含SEQ ID NO：2、3、4和/或5的全长核苷酸序列的变体或SEQ ID NO：2、3、4和/或5的核苷酸序列片段的变体。此类变体将保持与衍生变体的天然全长序列或片段的核苷酸序列至少80％的序列同一性。已经认识到，可以用多种方法改变CENH3和活性CENH3突变体，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。可以通过DNA中的突变制备CENH3、Spo11-1、Rec8或Osd1基因的核苷酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，82：488-492(Kunkel，
1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年《，分子生物学技术》，麦克米兰出版公司，纽约)，以及其中引用的参考文献。
1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel，et al.，(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年《，分子生物学技术》，麦克米兰出版公司，纽约)，以及其中引用的参考文献。
[0117] 因此，表达盒和抑制盒可以基于天然存在的核苷酸序列以及它们的变型形式和修改形式。此类变体将继续具有所需的活性。显然，如果要表达功能性多肽，在编码变体多肽的DNA中进行的突变不应将序列置于读取框之外，并且最好不形成会产生二级mRNA结构的互补区域。参见欧洲专利申请公开No.75,444。
[0118] 预期本文所涵盖的所编码多肽的缺失、插入和置换不会造成该蛋白质特性的根本变化。但是，当在进行缺失、插入和置换之前难以预测缺失、插入和置换的准确效应时，本领域技术人员应认识到该效应将通过常规的筛选测定进行评估。进行所关注多肽内的缺失、插入和置换，使得变体多核苷酸保持所需的活性，即，编码功能性CENH3变体或编码有效抑制CENH3、Spo11-1、Rec8或Osd1多肽的表达或功能的功能性沉默元件。在自交的情况中，蛋白功能性的分析最好通过细胞遗传学评估，即，减数分裂阶段的显微镜法和所得的产物进行。这些蛋白的Mis功能对生育力和子代健康会具有影响(在合理数量的植物中)，这是在大多数情况下很容易注意到的。在不同遗传背景的杂交中，可以用分子标记评估重组和分离。
[0119] III.植物
[0120] 提供了包含本文别处所述的表达盒和抑制盒中的一者或多者的植物、植物细胞、植物部分和种子以及谷粒。在具体的实施例中，植物和/或植物部分包含稳定结合在基因组中的至少一个反式激活因子表达盒、至少一个活性CENH3突变体表达盒、至少一个野生型CENH3表达盒、至少一个MiMe抑制盒和/或至少一个野生型CENH3抑制盒。因此，本发明提供了具有稳定结合在它们的基因组中的反式激活因子A表达盒、活性CENH3突变体表达盒和MiMe抑制盒的植物、植物细胞、植物部分和种子。还提供了具有稳定整合到它们的基因组中的反式激活因子B表达盒、野生型CENH3表达盒和野生型CENH3抑制盒的植物、植物种子、植物部分和种子。在具体的实施例中，提供了通过具有稳定整合到基因组中的反式激活因子A表达盒、活性CENH3突变体表达盒和MiMe抑制盒的植物与具有稳定整合到基因组中的反式激活因子B表达盒、野生型CENH3表达盒和野生型CENH3抑制盒的植物杂交获得的子代植物，其中该子代植物为自繁殖的杂交植物。此类自繁殖杂交子代植物包含至少一个反式激活因子表达盒、至少一个活性CENH3突变体表达盒、至少一个野生型CENH3表达盒、至少一个MiMe抑制盒和/或至少一个野生型CENH3抑制盒。
[0121] 在具体的实施例中，提供的植物和种子包含含有可操作连接到反式激活因子B诱导型启动子上的MiMe沉默元件的抑制盒、含有编码可操作连接到胚珠特异性启动子上的活性CENH3突变体的多核苷酸的表达盒和含有编码可操作连接到胚珠特异性启动子上的反式激活因子A的多核苷酸的表达盒。在其他实施例中，提供的植物和种子包含含有可操作连接到反式激活因子A诱导型启动子上的野生型CENH3沉默元件的抑制盒、含有编码可操作连接到中央细胞特异性启动子上的野生型CENH3多肽的多核苷酸的表达盒和含有编码可操作连接到启动子上的反式激活因子B的多核苷酸的表达盒。
[0122] 本文所用的术语植物包括植物细胞、植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完好的植物块和植物细胞如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些部分包含所引入的多核苷酸。
[0123] 本文所公开的表达盒和抑制盒可用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注的植物种类的例子包括(但不限于)：玉米、芸苔(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯
(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium
barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果
(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium
barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果
(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
[0124] 蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
[0125] 可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树，如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)，和雪松，如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松
(Chamaecyparis nootkatensis)，以及杨树和桉树。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。
在其他实施例中，玉米和大豆植物是优选的，在另外其他实施例中，大豆植物是优选的。
(Chamaecyparis nootkatensis)，以及杨树和桉树。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。
在其他实施例中，玉米和大豆植物是优选的，在另外其他实施例中，大豆植物是优选的。
[0126] 其他的目的植物包括提供目的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
[0127] 在一些实施例中，将包含本文别处所述的表达盒或抑制盒的多核苷酸工程化到分子堆。因此，本文所公开的多种植物、植物细胞和种子还可以包含一种或多种所关注的性状，在更具体的实施例中，植物、植物部分或植物细胞与所关注的多核苷酸序列、所关注的表达盒或所关注的抑制盒的任何组合堆叠，以形成具有所需性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”包括同一植物中存在多种性状。
[0128] 这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或遗传转化来对植物进行育种。如果序列通过遗传转化植物来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，上述专利以引用的方式并入本文。
[0129] 因此，在具体的实施例中，当本文所公开的表达盒和抑制盒结合在子代植物中时，可用于产生自繁殖杂交子代植物。然后可以将此类表达盒和抑制盒与包括赋予除草剂耐受性的多核苷酸在内的所关注的任何其他序列堆叠。此类序列的非限制性例子在本文别处有所公开。
[0130] “受试植物或植物细胞”是其中已针对所关注多核苷酸进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同但不暴露于会引起所关注基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
[0131] 本发明的方法包括将本文所公开的表达盒和抑制盒引入植物或植物细胞的基因组中。本文提供的方法不依赖于将包含表达盒或抑制盒的多核苷酸引入宿主细胞的特定方法，只需使多核苷酸进入至少一个宿主细胞内部。将多核苷酸引入宿主细胞(即，植物)的方法是本领域已知的，并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
[0132] “稳定转化”意指引入宿主(即植物)中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并能够由其后代遗传。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入宿主(即，植物)中并进行瞬时表达。
[0133] 转化规程以及将多核苷酸序列引入植物中的规程，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多核苷酸引入到植物细胞中的合适方法包括微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第
83卷，第5602-5606页))，农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(Townsend等人，美国专利No.5,563,055；Zhao等人，美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见，例如，Sanford等人，美国专利No.4,945,050；
Tomes等人，美国专利No.5,879,918；Tomes等人，美国专利No.5,886,244；Bidney等人，美国专利No.5,932,782；Tomes，et al.，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ
Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips，(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社，柏林)；McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-
926页))以及Lec1转化(WO 2000/28058)。另参见Weissinger，et al.，(1988)
Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴)》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年《，粒子科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen，(1991)In Vitro Cell
Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第
175-182页)(大豆)；Singh，et al.，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，
1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；
Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)
Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；Tomes，美国专利No.5,240,855；Buising等人，美国专利No.5,322,783和5,324,646；
Tomes，et al.，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via
Microprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：
Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(maize)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：
基本方法》，Gamborg编辑，施普林格出版社，柏林)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；
Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年《，生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：
763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年《，自然(伦敦)》，第311卷，第763-764页)；
Bowen等人，美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier，et al.，(1987)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年《，美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental
Manipulation of Ovule Tissues ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418
(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年《，理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第
250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)，全部上述专利文献以引用的方式并入本文。
83卷，第5602-5606页))，农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(Townsend等人，美国专利No.5,563,055；Zhao等人，美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见，例如，Sanford等人，美国专利No.4,945,050；
Tomes等人，美国专利No.5,879,918；Tomes等人，美国专利No.5,886,244；Bidney等人，美国专利No.5,932,782；Tomes，et al.，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ
Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips，(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社，柏林)；McCabe，et al.，(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-
926页))以及Lec1转化(WO 2000/28058)。另参见Weissinger，et al.，(1988)
Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴)》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年《，粒子科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe，et al.，(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen，(1991)In Vitro Cell
Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第
175-182页)(大豆)；Singh，et al.，(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，
1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；
Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)
Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；Tomes，美国专利No.5,240,855；Buising等人，美国专利No.5,322,783和5,324,646；
Tomes，et al.，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via
Microprojectile Bombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：
Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin)(maize)(Tomes等人，1995年，“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，载于《植物细胞、组织和器官培养：
基本方法》，Gamborg编辑，施普林格出版社，柏林)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；
Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年《，生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，et al.，(1984)Nature(London)311：
763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年《，自然(伦敦)》，第311卷，第763-764页)；
Bowen等人，美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier，et al.，(1987)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年《，美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet，et al.，(1985)in The Experimental
Manipulation of Ovule Tissues ed.Chapman，et al.，(Longman，New York)，pp.197-209(De Wet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操纵》，Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418
(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年《，理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；D′Halluin，et al.，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第
250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotechnology 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)，全部上述专利文献以引用的方式并入本文。
[0134] 在具体的实施例中，可以用多种瞬时转化方法为植物提供本发明所公开的表达盒和抑制盒。此类瞬时转化方法包括但不限于将表达盒和抑制盒直接引入植物中。这类方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway，et al.，(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学与普通遗传学》，第202卷，第179-185页)；Nomura，et al.，(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)和Hush，et al.，(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有文献均以引用的方式并入本文。或者，可以用本领域已知的技术将表达盒和抑制盒瞬时转化到植物中。这类技术包括病毒载体系统以及将多核苷酸以避免该DNA随后释放的方式进行的沉淀。因此，可能从粒子结合的DNA发生转录，但将它释放出来以整合到基因组中的频率大大降低。此类方法包括使用聚乙基亚胺(PEI；Sigma #P3143)涂覆的粒子。
[0135] 在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文所公开的表达盒和抑制盒引入植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内部。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见(例如)美国专利No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta，et al.，(1996)Molecular Biotechnology 5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；将这些文献以引用方式并入本文。
[0136] 用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，上述专利以引用的方式并入本文。简单而言，可以在转移盒中包含本发明的多核苷酸，所述转移盒旁侧分布有两个不相同的重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点侧接有与该转移盒的所述位点对应的两个不相同重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。
[0137] 转化的细胞可以根据常规方式培育成植物。参见，例如，McCormick，et al.，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84(McCormick等人，1986年《，植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特性的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。这样，本发明提供了具有稳定整合到它们的基因组中的本文所公开的表达盒和抑制盒的转化的种子(也称为“转基因种子”)。
[0138] 实例
[0139] 实例1。
[0140] 植物材料和生长条件
[0141] 在20℃和荧光照明下将植物种植到人工土壤混合物中。拟南芥的野生型和突变型植株得自俄亥俄州的拟南芥生物学资源中心(ABRC，Ohio)或英国的诺丁汉拟南芥库存中心(NASC，UK)。将DYAD杂交到No-0植株上，生成杂合的种群，用作整个基因组上的标记。MiMe植物为来自Atspo11-1-3/Atrec8-3的Col-0与来自osd1-1(S1)的No-0的混合物。该研究中使用的GEM植物为通过将cenh3-1/cenh3-1 GFP-tailswap/GFP-tailswap(雌性)杂交到cenh3-1/cenh3-1 GFPCENH3/GFP-CENH3(雄性)上获得的F1子代。
[0142] 用TILLING程序分离cenh3-1(Comai and Henikoff，(2006)Plant J 45：684-94(Comai和Henikoff，2006年，《植物杂志》，第45卷，第684-694页))。通过使用标准规程用乙基甲磺酸对Col-0登录中的拟南芥进行诱变以形成TILLING种群。使用CEL1异源双链体裂解测定，通过TILLING与专用于CENH3/HTR12基因的PCR引物分离Cenh3-1。GFP-CENH3和GFP-tailswap转基因的克隆以及互补的cenh3-1 GFP-CENH3和cenh3-1 GFP-tailswap系的构建在本文别处有所描述(Ravi等人，制备手稿)。
[0143] 为了将雌性野生型杂交到雄性GFP-tailswap上，使用解剖显微镜直接观察柱头上的花粉沉积(GFP-tailswap大多为雄性不育)。GFP-tailswap的各朵花上的活花粉量有所不同。选择清楚显示具有较高量花粉的花，并用60个以上的花粉囊/野生型柱头(10GFP-tailswap花)授粉，获得表1中所报告的结实率。使用双目放大镜(放大镜)和大约12个花粉囊(2GFP-tailswap花)/野生型柱头，获得每个角果低得多的结实率。将来自GFP-tailswap X野生型杂交的种子播种在包含1％蔗糖的1X MS板上，以最大化发芽效率，尤其是具有异常外观的种子。晚发芽的种子通常为单倍体。
[0144] 形成嵌合体，其中来自CENH3的拟南芥CENH3尾部被来自玉蜀黍(Zea mays)的CENH3尾部结构域替代，从而生成玉蜀黍CENH3尾部结构域和拟南芥CENH3组蛋白折叠结构域的融合，并将该融合转化成cenh3-1杂合子。可以预知，该GFP-玉蜀黍tailswap蛋白靶向于动粒并拯救cenh3-1的胚胎-致死表型。
[0145] 实例2。
[0146] 基因分型和微卫星标记分析
[0147] 描述了osd1-1、Atspo11-1-3和Atrec8-3(MiMe)基因分型的引物(S1)。分析了微卫星标记。引物序列得自TAIR(www.Arabidopsis.org)或得自MSAT数据库(INRA)。cenh3-1：用dCAPS引物检测到的CENH3基因(也称为，HTR12)中的点突变G161A(由EcoRV产生的dCAP限制性多态性，即野生型等位基因切割产物)：
[0148] 引物1：GGTGCGATTTCTCCAGCAGTAAAAATC(SEQ ID NO：6)
[0149] 引物2：CTGAGAAGATGAAGCACCGGCGATAT(SEQ ID NO：7)
[0150] 染色体1上的GFP-tailswap插入的检测：
[0151] 野生型和T-DNA的引物1：CACATACTCGCTACTGGTCAGAGAATC(SEQ ID NO：8)
[0152] 仅野生型的引物2：CTGAAGCTGAACCTTCGTCTCG(SEQ ID NO：9)
[0153] T-DNA的引物3：AATCCAGATCCCCCGAATTA(SEQ ID NO：10)
[0154] 用于检测GFP-CENH3的引物：
[0155] CAGCAGAACACCCCCATC(SEQ ID NO：11)(GFP中)
[0156] CTGAGAAGATGAAGCACCGGCGATAT(SEQ ID NO：12)(CENH3中)
[0157] 倍体分析
[0158] 用流式细胞仪进行MiMe和osd1后代倍体分析并通过染色体分散进行系统确认。对于DYAD后代，用流式细胞仪进行倍体分析，通过FISH分析使用着丝粒重复探针对染色体进行计数，从而进一步确认随机选择的二倍体消除(n＝5)，并且发现都为二倍体。用流式细胞仪进行核的分离。内部二倍体和四倍体对照物进行流式细胞仪分析，以明确识别二倍体植物。
[0159] 在与野生型四倍体系(C24背景)的消除杂交中，三倍体被确认为晚开花(由于Col-0 FRIGIDA和C24 FLOWERING LOCUS C等位基因的结合)。非整倍体植物显示出明显不同的形态表型，例如改变的营养生长、莲座叶形态的变化(大小和形状)、叶色范围(浅黄至深绿)，因此可以很容易地将其与普通的二倍体野生型植物区分开。另外，非整倍体植物显示出不同的开花时间，并且大部分具有降低的生育力和结实率。对推定的二倍体进行基因分型，每条染色体上至少一个标记(Chr 1：F5I1，CIW12；Chr 2：MSAT2.11；Chr 3：MSAT3.19，CIW11；Chr 4：nga8；Chr 5：CTR1.2，nga106)。除了在GEM系中存在的着丝粒处缺乏GFP荧光之外，消除被确认为只有C24等位基因。通过减数分裂染色体分散中的染色体核型分析进一步确认随机二倍体植物(n＝8)，并且发现全都为二倍体。
[0160] 本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。举例说，“一个要素”是指一个或多个要素。
[0161] 本说明书中提及的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
[0162] 虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修改。
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