一种同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR方法及其引物
和试剂盒
技术领域
[0001] 本
发明属于
植物保护技术领域，具体涉及一种同时检测斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒、
高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒四种甘蔗种传性病毒的多重PCR方法及其检测引物和试剂盒。
背景技术
[0002] 甘蔗是我国最重要的糖料作物，由于其栽培过程中采用种茎
无性繁殖，病毒病发生逐年加重，每年可造成数以亿计的经济损失，严重制约了我国
蔗糖产业的持续稳定发展。因病毒病病原具有潜育期和隐蔽性，传统方法难以诊断，所以如何对其进行精准有效地诊断检测，是明确监测致病病毒科学有效防控甘蔗病毒病随种苗传播蔓延为害的
基础和关键，对确保甘蔗生产安全具有重要意义。
[0003] 由斐济病病毒(Fiji disease virus,FDV)引起的甘蔗斐济病在澳大利亚、斐济、印尼、菲律宾、
马来群岛、泰国等国家和地区发生，造成甘蔗生产的较大损失。目前甘蔗斐济病在我国还未见发生报道，但是甘蔗斐济病是我国甘蔗上的检疫对象，该病一旦发生将会对生产带来潜在威胁。
[0004] 花叶病是甘蔗上发生最普遍、危害最严重的一类病毒病，病原复杂，可由多种病毒引起。目前，自然侵染条件下已明确鉴定出的病害病原有甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)3种病毒。其中SCMV和SrMV是非洲、美洲和澳大利亚等地的甘蔗花叶病主要病原。SCSMV在印度、斯里兰卡、泰国、越南和印度尼西亚等地区有过报道。在中国蔗区，SrMV是福建、广西、
云南、广东和海南等所有主产蔗区的主要甘蔗花叶病病毒；SCMV在广西、云南、广东、江西、海南和浙江等蔗区零星发生；SCSMV是云南蔗区甘蔗花叶病主要病原。在田间，甘蔗不只感染单一病毒，存在两种或两种以上病毒复合侵染的情况，这无疑加重了甘蔗花叶病的发生为害，给蔗糖业带来严峻灾害威胁。
[0005] 种苗检验检疫是控制种传性病毒病害的第一道防线，也是防止种传性病毒病害传入的最有效措施，因此建立一种精准有效和方便快捷的检测方法对甘蔗种苗的检验检疫和病毒病害的科学有效防控极为重要。目前对FDV、SCSMV、SrMV和SCMV的常用检测方法主要是血清学检测和分子
生物学检测，血清学检测费时、灵敏度较低，当病毒含量较低时容易出现假阴性结果；分子生物学检测包括PCR检测、实时
荧光PCR和分子杂交等，已建立的常规PCR技术一次只能检测一种病毒，比较费工费时。而多重PCR技术是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病毒特异性引物，能够同时检测多种病毒，从而缩短检测周期，提高检测效率。目前除本发明外，国内未发现同时检测上述四种病毒的报道。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有针对这四种病毒单重PCR检测技术的局限性，提供一种基于应用特异性引物能准确、快速，同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR方法及其检测引物和试剂盒。
[0007] 本发明所提供的一种同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR特异性引物组，四种甘蔗种传性病毒为引起甘蔗斐济病的斐济病病毒、引起甘蔗花叶病的甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒，所述多重PCR特异性引物组由用于检测斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒的特异性引物组成，所述检测斐济病病毒的特异性引物由FDV-F和FDV-R引物组成，目标
片段长度为346bp，FDV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，FDV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述检测甘蔗线条花叶病毒的特异性引物由SCSMV-F和SCSMV-R引物组成，目标片段长度为711bp，SCSMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，SCSMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述检测高粱花叶病毒的特异性引物由SrMV-F和SrMV-R引物组成，目标片段长度为545bp，SrMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，SrMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述检测甘蔗花叶病毒的特异性引物由SCMV-F和SCMV-R引物组成，目标片段长度为208bp，SCMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，SCMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
[0008] 本发明还提供了一种同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括上述同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR特异性引物组，所述的四种甘蔗种传性病毒为斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0009] 进一步，所述试剂盒还包括多重PCR反应液，18μL多重PCR反应液中有灭菌ddH2O 4.0μL，2×Easy Taq SuperMix 10.0μL，10μmol/L FDV-F 0.5μL，10μmol/L FDV-R 0.5μL，
10μmol/L SCSMV-F 0.5μL，10μmol/L SCSMV-R 0.5μL，10μmol/L SrMV-F 0.5μL，10μmol/L SrMV-R 0.5μL，10μmol/L SCMV-F 0.5μL，10μmol/L SCMV-R 0.5μL。
[0010] 本发明还提供了一种同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR方法，该方法的多重PCR反应体系中以样品cDNA为模板，所用的引物为上述同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR特异性引物组，检测结果判定方式如下：
[0011] 当检测样品扩增到346bp大小的单一条带时，该样品为斐济病病毒阳性；若无346bp条带，则为甘蔗斐济病病毒阴性；
[0012] 当检测样品扩增到711bp大小的单一条带时，该样品为甘蔗线条花叶病毒阳性；若无711bp条带，则为甘蔗线条花叶病毒阴性；
[0013] 当检测样品扩增到545bp大小的单一条带时，该样品为高粱花叶病毒阳性；若无545bp条带，则为高粱花叶病毒阴性；
[0014] 当检测样品扩增到208bp大小的单一条带时，该样品为甘蔗花叶病毒阳性；若无208bp条带，则为甘蔗花叶病毒阴性；
[0015] 当检测样品同时扩增到上述四条条带、或同时扩增到上述任意三条条带、或同时扩增到上述任意两条条带，则该样品感染了对应的病毒。如：
[0016] 当检测样品同时扩增到346bp、711bp、545bp、208bp大小的四条条带时，则该样品感染了斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0017] 当检测样品同时扩增到346bp、711bp、545bp大小的三条条带时，则该样品感染了斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒阳性和高粱花叶病毒。
[0018] 当检测样品同时扩增到346bp、545bp、208bp大小的三条条带时，则该样品感染了斐济病病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0019] 当检测样品同时扩增到346bp、711bp、208bp大小的三条条带时，则该样品感染了斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0020] 当检测样品同时扩增到711bp、545bp、208bp大小的三条条带时，则该样品感染了甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0021] 当检测样品同时扩增到346bp、711bp大小的两条条带时，则该样品感染了斐济病病毒、和甘蔗线条花叶病毒。
[0022] 当检测样品同时扩增到346bp、545bp大小的两条条带时，则该样品感染了斐济病病毒、和高粱花叶病毒。
[0023] 当检测样品同时扩增到346bp、208bp大小的两条条带时，则该样品感染了斐济病病毒和甘蔗花叶病毒。
[0024] 当检测样品同时扩增到711bp、545bp大小的两条条带时，则该样品感染了甘蔗线条花叶病毒和高粱花叶病毒。
[0025] 当检测样品同时扩增到545bp、208bp大小的两条条带时，则该样品感染了高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0026] 当检测样品同时扩增到711bp、208bp大小的两条条带时，则该样品感染了甘蔗线条花叶病毒和甘蔗花叶病毒。
[0027] 进一步，上述同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR方法，所述多重PCR反应体系为：20μL反应体系中有灭菌ddH2O 4.0μL，2×Easy Taq SuperMix 10.0μL，10μmol/L FDV-F 0.5μL，10μmol/L FDV-R 0.5μL，10μmol/L SCSMV-F 0.5μL，10μmol/L SCSMV-R 0.5μL，10μmol/L SrMV-F 0.5μL，10μmol/L SrMV-R 0.5μL，10μmol/L SCMV-F 0.5μL，10μmol/L SCMV-R 0.5μL，样品cDNA模板2μL。
[0028] 进一步，上述同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR方法中多重PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃
退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
[0029] 本发明还提供了上述同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重PCR检测试剂盒在同时检测四种甘蔗种传性病毒中的应用，该应用所检测的四种甘蔗种传性病毒为斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒，在所述多重PCR反应液中加入待检测样品cDNA模板2μL。
[0030] 所述试剂盒在同时检测四种甘蔗种传性病毒中的应用中，多重PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
[0032] 本发明根据斐济病病毒的结构蛋白基因，甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒的多聚蛋白基因序列设计特异性引物，通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组能特异性同时检测出斐济病病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒的引物；然后通过优化PCR反应体系和反应条件，建立了能同步检测这四种病毒的多重PCR方法。本发明所选的四种病毒引物均是对应四种病毒的专用检测引物，特异性强；同时，本发明建立的多重PCR方法能够在一次PCR反应中检测出待测样品中是否含有这四种病毒中的一种、两种、三种或四种，无需再进行克隆、测序和序列比对，快速准确，方便、
稳定性好，只需2小时即可得到检测结果。本发明能特异性检测出甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒，有助于精准诊断甘蔗花叶病、精准评价筛选抗甘蔗花叶病品种及其合理布局、有效防控甘蔗花叶病。本发明克服了以往单一PCR检测操作繁琐、费工费时、易污染、适用性低等诸多限制，实现了甘蔗多种种传病毒的高效快速检测，为甘蔗斐济病和甘蔗花叶病的精准有效诊断和引种检疫提供了关键技术
支撑，对确保甘蔗安全生产具有重要意义。
[0033]
序列表中SEQ ID NO：1所示的是FDV-F引物的核苷酸序列。
[0034] 序列表中SEQ ID NO：2所示的是FDV-R引物的核苷酸序列。
[0035] 序列表中SEQ ID NO：3所示的是SCSMV-F引物的核苷酸序列。
[0036] 序列表中SEQ ID NO：4所示的是SCSMV-R引物的核苷酸序列。
[0037] 序列表中SEQ ID NO：5所示的是SrMV-F引物的核苷酸序列。
[0038] 序列表中SEQ ID NO：6所示的是SrMV-R引物的核苷酸序列。
[0039] 序列表中SEQ ID NO：7所示的是SCMV-F引物的核苷酸序列。
[0040] 序列表中SEQ ID NO：8所示的是SCMV-R引物的核苷酸序列。
附图说明
[0041] 图1：四种甘蔗种传性病毒的多重PCR检测
电泳图，M：DNA Marker E；1：FDV+SCSMV+SrMV+SCMV；2：FDV+SCSMV+SrMV；3：FDV+SCSMV+SCMV；4：FDV+SrMV+SCMV；5：SCSMV+SrMV+SCMV；6：FDV+SCSMV；7：FDV+SrMV；8：FDV+SCMV；9：SCSMV+SrMV；10：SCSMV+SCMV；11：SrMV+SCMV；12：FDV；13：SCSMV；14：SrMV；15：SCMV；NC：健康甘蔗
叶片；CK：ddH2O。
具体实施方式
[0042] 为了更好的理解本发明，下面结合具体
实施例对本发明做进一步的说明，实施例中无特殊说明的为常规方法。
[0043] 实施例1
[0044] 1.引物设计
[0045] 根据斐济病病毒的结构蛋白基因序列设计用于检测斐济病病毒的特异性引物，预期扩增片段大小为346bp，所述检测斐济病病毒的特异性引物由FDV-F引物和FDV-R引物组成，目标片段长度为346bp，所述FDV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，FDV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0046] 根据甘蔗线条花叶病毒的多聚蛋白基因序列设计用于检测甘蔗线条花叶病毒的特异性引物，预期扩增片段大小为711bp，所述检测蔗线条花叶病毒的特异性引物由SCSMV-F引物和SCSMV-R引物组成，目标片段长度为711bp，所述SCSMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SCSMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0047] 根据高粱花叶病毒的多聚蛋白基因序列设计用于检测高粱花叶病毒的特异性引物，预期扩增片段大小为545bp，所述检测高粱花叶病毒的特异性引物由SrMV-F引物和SrMV-R引物组成，目标片段长度为545bp，所述SrMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SrMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
[0048] 根据甘蔗花叶病毒的多聚蛋白基因序列设计用于检测甘蔗花叶病毒的特异性引物，预期扩增片段大小为208bp，所述检测甘蔗花叶病毒的特异性引物由SCMV-F引物和SCMV-R引物组成，目标片段长度为208bp，所述SCMV-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，SCMV-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0049] 上述四对引物的设计克服了在多重PCR反应体系中的相互干扰。
[0050] 2.RNA提取
[0051] 按文献“Wang X Y,Li W F,Huang Y K,et al.Molecular detection and phylogenetic analysis of viruses causing mosaic symptoms in new sugarcane varieties in China.European Journal of Plant Pathology,2017,148(4):931-940.”方法检测得到甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒的甘蔗叶片。分别取感染甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒的甘蔗叶片各0.2g，使用植物基因组RNA提取试剂盒(以北京全式金生物技术有限公司的TransZol Plant试剂盒为例)分别提取叶片总RNA，具体步骤按照该
说明书操作。因甘蔗斐济病是我国甘蔗上的检疫对象，国内未发生，所以斐济病病毒RNA由澳大利亚甘蔗研究负责甘蔗检疫的Nicole Thompson博士提供。
[0052] 3.cDNA合成
[0053] 以提取的甘蔗叶片总RNA为模板，使用cDNA合成试剂盒(以北京全式金生物技术有限公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis SuperMix试剂盒为例)合成cDNA第一链，具体步骤按照该说明书操作。
[0054] 4.多重PCR检测
[0055] 20μL多重PCR反应体系，其中，灭菌ddH2O 4.0μL，2×Easy Taq SuperMix 10.0μL，10μmol/L FDV-F 0.5μL，10μmol/L FDV-R 0.5μL，10μmol/L SCSMV-F 0.5μL，10μmol/L SCSMV-R 0.5μL，10μmol/L SrMV-F 0.5μL，10μmol/L SrMV-R 0.5μL，10μmol/L SCMV-F 0.5μL，10μmol/L SCMV-R 0.5μL，样品cDNA模板2μL；具体地，取多份FDV、SCSMV、SrMV和SCMV四种病毒的cDNA模板，按照四种病毒复合模板(1种)、三种病毒随机组合的复合模板(4种)、两种病毒随机组合的复合模板(6种)以及单一病毒模板(4种)的方式配置成15种不同的检测样品，健康甘蔗cDNA作为阴性对照，灭菌ddH2O cDNA作为空白对照。多重PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
[0056] 5.结果判定
[0057] 取5μL多重PCR扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，模板加入混合了FDV、SCSMV、SrMV和SCMV cDNA的出现四条特异性扩增条带，依次约为346bp、711bp、545bp和208bp；模板加入混合了FDV、SCSMV和SrMV cDNA的出现三条特异性扩增条带，依次约为346bp、711bp和545bp；模板加入混合了FDV、SCSMV和SCMV cDNA的出现三条特异性扩增条带，依次约为346bp、711bp和208bp；模板加入混合了FDV、SrMV和SCMV cDNA的出现三条特异性扩增条带，依次约为346bp、545bp和208bp；模板加入混合了SCSMV、SrMV和SCMV cDNA的出现三条特异性扩增条带，依次约为711bp、545bp和208bp；模板加入混合了FDV和SCSMV cDNA的出现两条特异性扩增条带，依次约为346bp和711bp；模板加入混合了FDV和SrMV cDNA的出现两条特异性扩增条带，依次约为346bp和545bp；模板加入混合了FDV和SCMV cDNA的出现两条特异性扩增条带，依次约为346bp和208bp；模板加入混合了SCSMV和SrMV cDNA的出现两条特异性扩增条带，依次约为711bp和545bp；模板加入混合了SCSMV和SCMV cDNA的出现两条特异性扩增条带，依次约为711bp和208bp；模板加入混合了SrMV和SCMV cDNA的出现两条特异性扩增条带，依次约为545bp和208bp；模板只加入了FDV cDNA的出现一条约为346bp的单一条带；模板只加入了SCSMV cDNA的出现一条约为711bp的单一条带；
模板只加入了SrMV cDNA的出现一条约为545bp的单一条带；模板只加入了SCMV cDNA的出现一条约为208bp的单一条带；健康甘蔗和ddH2O对照未扩增出任何条带。
