本发明涉及检测免疫系统组分如自身抗体和自身反应性T细胞的 方法，以及发展自身免疫性疾病首次诊断和监测的诊断性免疫方法技 术。

自身免疫性疾病包括一组具有共同特征的复杂疾病，在这些疾病 中，机体的自身成分被免疫系统识别，并导致异常免疫应答的启动。 为了发生自身免疫反应，正常维持的免疫耐受必须“停止”(Cooke 1988)(见下“参考文献”)，而这种免疫耐受在正常个体中是终身 持续的。发生的原因通常难以评价，因为自身免疫反应开始发生的时 间通常比疾病的临床诊断早几年，并且在不同疾病中，激发事件也可 能不同。假设在人体中存在大量潜在的自身抗原，值得注意的是，自 身免疫性疾病似乎只局限于几个组织和抗原。假设给靶抗原和自身免 疫反应的分布在机体内定位，自身免疫性疾病的分类可以是器官特异 性和非器官特异性(系统性)。在每种情况下，免疫反应都可能既涉 及免疫系统的体液部分(即抗体合成)，又涉及细胞部分。

本发明还涉及刻画免疫系统组分特征的技术，用来检测、量化这 些免疫系统组分和自身抗原，所述免疫系统组分如自身抗体和自身反 应性T细胞或B细胞，以及与之发生相互反应的分子如自身抗原。在 利用本发明应用技术的实施例中，描述了与系统性自身免疫性疾病类 风湿关节炎(RA)或多发硬化(MS)相关的自身免疫现象。但这仅仅 是本发明的一个示例，并非旨在将本发明的范围限制在RA或MS上。 本发明的基本假说

本发明基于如下假说，蛋白质中易感残基的异构化和光学反转在 自身免疫性疾病中可能对自身免疫应答的产生至关重要。在一些易感 蛋白质中，天门冬氨酸和天门冬酰胺(Asx)和谷氨酸和谷氨酰胺(Glx) 残基可能发生自发重排，其中，Asx或Glx残基与邻近残基间的正常肽 键可能从侧链正常的α-羧基转变为β-羧基(Glx残基则为γ-羧基) (Clarke 1987)。异构化反应还可通过琥珀酰亚胺介导进行，在自发 水解的基础上，该反应可导致4种形式：如下概括的天门冬氨酸的反 应图示，正常产生的αL型，异构型βL型，或两种光学反转型αD型和 βD型：

肽骨架氮原子对邻近天门冬氨酸残基侧链羰基的攻击，可以形成 琥珀酰亚胺环(A→B)。琥珀酰亚胺环倾向于水解，产生D和L构型 的光学反转肽和异构肽。光学反转过程通过负碳离子中间物介导(D，E 和F)，可以通过直接的质子摄取(ADG或CFI)进行，也可 以通过琥珀酰亚胺旁路(BEH)进行。在整幅图中，肽骨架以黑色 粗线代表。该图描绘了发生在天门冬氨酸和甘氨酸序列之间的异构/光 学反转反应，但该反应可以在含有任何易感Asx或Glx的抗原决定簇 上发生。

但是，为了使环状酰亚胺形成(以及异构化/光学反转)能够发生， 包绕Asx或Glx残基的三维结构必须具有光学构型和足够的弹性 (Clarke 1987)。

研究显示，肽和蛋白质中Asx残基的光学反转过程主要通过琥珀 酰亚胺旁路进行(BEH)(Geiger and Clarke 1987，Radkiewics et al 1996)。但是，其他旁路，如质子直接摄取或酰亚胺-δ-内酯形 成可能也对光学反转有作用(Radkiewics et al 1996)。但普遍认 为这些旁路较不重要(Geiger and Clarke 1987，Radkiewics et al 1996)。

蛋白质或肽中引入这些结构变化，对其功能、稳定性和理化特征 具有深远影响。本发明描述了这些结构变化对这些分子免疫原性的影 响。

在蛋白质中引入一个异构化和/或光学反转残基可以导致新的βL， αD和βD型的形成，这些构型的蛋白在诱导免疫应答能力方面具有重要 意义。特别是在自身免疫性疾病中，患者自身组织或器官的组分突然 作为抗原成为免疫系统的作用对象，异构化和/或光学反转在该过程中 起重要作用。

以极低速率自发发生的异构化和/或光学反转可以在分子中引入 新的抗原决定簇，通常不太可能成为免疫耐受的对象。这种新的抗原 决定簇可以被免疫系统的抗原提呈细胞识别，并因此诱导免疫应答。

业已提议，与Asx损伤相关的“蛋白疲劳”对蛋白质性质包括免 疫原性的影响，值得进一步研究(Galletti et al 1995)。

已有报导，天门冬氨酸残基的光学反转可能影响短肽的免疫学特 征(Benkirane et al 1993)。

还有进一步报导，血清白蛋白体外去酰胺化可以改变其抗原特 性，并成为机体免疫原，体内发生的相似过程可能在老化机体自身免 疫的发生过程中起一定作用(Lukash et al，1987)。

天门冬酰胺的去酰胺化可能是肽键异构化的结果，但去酰胺化还 存在很多其他过程(Mor et al，1992)。不象以上述反应图所示的方 式通过琥珀酰亚胺介导的异构化/光学反转，这种去酰胺化不会导致蛋 白质骨架的结构变化。例如，去酰胺化可能是酶特异性作用去除酰胺 中胺-NH2基的结果，但不改变肽键，或涉及任何光学活性的改变。

已有报导，针对含有D-氨基酸的肽的免疫应答与针对相应的只含 L-氨基酸的肽的免疫应答不同(Sela & Zisman 1997，Maillere et al 1995，Todome et al 1992，Sela & Fuchs 1965)。Todome et al(1992) 显示，含有D-丙氨酸残基的细菌蛋白质片段能够在人类中诱发免疫应 答。Maillere et al(1995)显示，取代源于蛇毒的T细胞抗原决定 簇中的天然L-氨基酸，抗原改变其与T细胞受体的结合和反应特性。 Sela和Fuchs(在1964年布拉格会议之前的发布会上)指出，在抗原 决定簇/抗原中包括D-氨基酸，可以增强(或减弱)其抗原性，与应用 含D-酪氨酸的合成寡肽进行的实验工作评价一致。Mor et al(1992) 以及Sela和Zisman(1997)在综述中进一步探讨了这些结果及一些相 似的观察。

这些报导中没有一篇探讨自身抗原或自身抗原的抗原决定簇包括 D-氨基酸的可能性，也没有一篇探讨产生D-氨基酸诱导自身免疫应答 的可能性。而且，上述研究中没有一项涉及本发明所述通过琥珀酰亚 胺旁路自发的光学反转，他们描述的工作都是应用D-氨基酸合成肽进 行的，但不包括*Glx和*Asx。 类风湿关节炎

类风湿关节炎(RA)是一种严重的慢性进行性疾病，无论发达国 家还是发展中国家，累及大约1％的人口。尽管环境因素、遗传因素和 疾病进展因素业已暗示在RA病因学中有一定作用，但目前建立的观点 是，RA是一种自身免疫性疾病(Williams 1996)。

RA的主要临床表现是软骨和滑膜组织的异常和退化，导致关节润 滑功能的严重减退，并最终导致RA患者的运动问题。受累关节显示包 括多形中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和其他免疫系统细胞的浸润(滑 膜炎)。这些细胞参与了免疫过程的活化，这些细胞的活动和它们的 分泌产物介导了关节破坏(Munthe & Natvig 1972；Harris 1993)。 接着，活动性滑膜炎导致新生毛细血管的生成(血管生成)，以及滑 膜内层细胞进入关节，进一步损伤关节的正常功能(Munthe & Natvig 1972)。

RA最具特征的血清学变化是针对自体IgG循环抗体的存在 (Bernstein 1990)。这些抗IgG自身抗体又被称为类风湿因子 (RFs)。RFs可以是IgM，IgG，IgA和IgE，但IgM和IgG RFs似乎 更具临床意义，并主要存在于RA患者中(Jonsson & Valdimarsson 1993)。在RF应答中涉及多种免疫球蛋白类型的发现强烈提示，RF 的形成是抗原驱动和T细胞依赖的，并不仅仅是单克隆增生或免疫系 统泛化刺激的结果(Harris 1993；Bernstein 1990)。

RFs并非RA的特异性抗体，它们也存在于相当一部分急性炎症性 疾病患者、自身免疫性疾病患者和一些正常个体的血清中(Chen et al 1987，Carson et al 1993，Bernstein 1990)。在滑膜组织局部形 成自体相关性RF复合物只见于RA和其他系统性自身免疫性疾病，如 Sjogrens综合征，系统性红斑狼疮和硬皮病(Natvig & Munthe 1975， Winchester 1975)，提示一些异常因子或免疫应答加速了IgG-RF复 合物在这些疾病中的累积。

与绝大多数自身免疫性疾病的情况类似，RA的始动、致病因子尚 未鉴定，这些研究难以开展，是因为自身免疫攻击可能在这些疾病临 床表现出现前几年就开始了。业已建立的观点是，RA易感性高与特定 MHC基因的等位基因相关，即DR-1位点的命名为Dw4和Dw14的基因 (Nepom 1990)。

RF在疾病的始动和发病机理中的作用尚不知晓，而且在RA中，RF 是疾病的中心事件还只是继发现象这一问题，也始终没有答案。在RA 中，RF开始形成可能是IgG Fc区构型改变的结果(Johnson et al 1975)。

Parekh et al(1985)观察到，在RA患者中分离的IgG显示了 Fc段寡糖半乳糖苷化缺陷，这一发现导致了巨大震撼，但在IgG-糖基 化状态临床意义的进一步研究中，却出现了相互矛盾的结果(Parekh et al.1988，Tomana et al.1988)。不仅如此，IgG半乳糖苷化 缺陷还可能是自身免疫性疾病发生的普遍危险因子(Harris 1993； Pilkington et al.1995)。

RA患者关节的免疫组化研究发现，在类风湿滑膜中，大量含IgG 的浆细胞显示RF活性(Munthe & Natvig 1972)，现在认为，RFs 与自体IgG反应形成大的自体集合复合物，这些复合物可能被吞噬， 导致随后溶酶体酶的释放。有几项观察支持在RA中免疫激发组织损伤 的机制(Williams 1996；Carson 1993)。

RFs涉及几种免疫球蛋白类型，IgG涉及多个抗原决定簇，这些不 均一性也干扰了对这些分子在疾病中作用的精确评价(Kalsi & Isenberg 1993)。与RA相关的RFs，与在其他情况下发现的RF不同， 它们很显然定向针对IgG Fc区CH2和CH3功能区的抗原决定簇 (Bonagura et al 1993)。

IgG包括很多天门冬酰胺和天门冬氨酸(Asx)残基，理论上可以 形成环状酰亚胺(异构化/光学反转)。IgG的三维结构众所周知，并 包括在一项研究人类蛋白Asx异构化潜在位点的理论研究中(Clarke 1987)。在假设标准键长和几何学的情况下，Clarke基于phi，psi， chi和chi2两面角，计算了包括人类IgG在内的多种蛋白质中骨架氮 原子与Asx或Glx残基侧链γ羰基碳原子的距离。这些理论考虑提示， 人类IgG FcH3区的Asn-384仅需要很小的构型变化，就可形成酰亚胺。 因此推测，该位点倾向于异构化(Clarke 1987)。此外，Svasti和 Milstein(1972)的研究显示，鼠IgG在Fc段的Asn-Gly序列存在 (Svasti and Milstein 1972)异构化。Asn-384邻近区是暴露表面， 可能会对环境影响特别敏感，促进酰亚胺的形成。 自身免疫反应与多发硬化

多发硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)白质的炎症性疾病，可以 导致区域性脱髓鞘，以及神经功能障碍。MS的发病机理仍然需要阐释， 但相信是由于自身免疫机制导致的髓鞘损伤。

与绝大多数自身免疫性疾病的情况类似，RA的始动、致病因子尚 未鉴定，这些研究难以开展，是因为自身免疫攻击可能在这些疾病临 床表现出现前几年就开始了。有几个事件一定在MS疾病过程到达病理 水平之前就发生了。这些事件包括对正常髓鞘蛋白免疫耐受的崩溃， 以及正常存在的血脑屏障的缺陷，正常状态下血脑屏障可以防止CNS 组分与免疫系统的接触(de Vries et al 1997)。

自身抗原在该病的始动和发病机理方面的作用尚不知晓，而且在 MS中，自身抗原形成是疾病的中心事件还只是继发现象这一问题，也 始终没有答案。在MS中，自身抗原开始形成可能是髓鞘蛋白构型变化 的结果。

几种髓鞘蛋白业已显示成为自身抗体和自身反应性T细胞的作用 对象，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)和髓鞘少树突细胞糖蛋白(MOG)以 及αβ-晶状体球蛋白(Martin 1997，Bettadapura et al.1998，Van Noort et al 1998)。

MBP是MS中自身抗体和自身反应性T细胞的作用对象。MBP的三 维结构众所周知(Beniac 1997)，该分子包括很多天门冬酰胺和天门 冬氨酸残基，理论上可以形成环状酰亚胺(异构化/光学反转)。异构 化/光学反转似乎可以影响该蛋白的抗原性。

MOG是位于髓鞘外表面的跨膜糖蛋白(Linington et al.1984)。 由于MOG严格定位于髓鞘外表面，它在MS中为自身免疫攻击提供了理 想的原发靶抗原，特别是因为抗MOG抗体存在于CNS，导致体内、体外 的广泛脱髓鞘(Adelman et al 1995)。MOG是迄今为止描述的唯一 一种髓鞘自身抗原，能够在EAE模型中激发脱髓鞘抗体，并包括致脑 炎T细胞抗原决定簇(Linington et al.1993)。此外，业已显示， 在MS患者的血液和CSF中存在抗MOG抗体(Sun et al.1991)。而 且，Kerlero de Rosbo及其同事显示，在MS患者群中存在显著的针 对MOG的T细胞应答(Kerlero de Rosbo et al.1993)。MOG仅包 括一个光学反转/异构化潜在位点。该位点包括MOG的54-55残基， 位于该分子暴露部分表面。此外，该位点属于MOG35-55序列部分，业已 显示，该部分具有很强的致脑炎性，并是B细胞、T细胞应答的强(最 强)诱导剂(Ichikawa et al.1996)。

因此我们认为，MBP，αβ-晶状体球蛋白或MOG易感位点的潜在异 构化在MS发病机理中发挥一定作用：异构化/光学反转通过提供新型 免疫原性抗原决定簇而直接涉及MS的始动相，并成为免疫系统体液免 疫和细胞免疫的作用对象。 其他自身免疫性疾病

本发明的基础理论(即自身蛋白的异构化/光学反转形成了新的不 被耐受的抗原决定簇，导致自身免疫应答)还可用于其他抗原驱动的 自身免疫性疾病，包括： 胰岛素依赖性糖尿病(IDDM )

胰腺朗格罕岛中β细胞由于自身免疫反应而遭到破坏，导致胰岛素 依赖性糖尿病(IDDM)。在临床症状发生前，这种破坏作用已持续相 当长一段时间(Gorsuch et al.1981)。在IDDM中，业已鉴定了多 种作为自身抗原的自体蛋白质。

在IDDM中，神经内分泌酶谷氨酸脱羧酶(GAD)是一种主要的自 身抗原(Bakkeskov et al.1990)。存在两种异型GAD，GAD65和 GAD67，它们最大的差异存在于N末端前100个氨基酸中。IDDM血清 主要与GAD65发生反应，但自身抗原决定簇主要位于GAD65与GAD67 高度同源的区域。

业已显示，属于越膜酪氨酸磷酸酶家族的两个密切相关的蛋白IA2 和IA2β(Bonifacio et al.1995，Lu et al.1996)，也很可能是 IDDM的自身抗原。IDDM患者经常显示针对这些蛋白的自身抗体(Li et al.1997)。

Glima38是一种38kDa的胰岛细胞膜糖蛋白，也已显示是IDDM的 一种自身抗原(Bakkeskov et al.1982，Aanstoot et al.1996)。

此外，在至少半数新近确诊的IDDM患者中，可以检测到胰岛素自 身抗体(IAA)(Palmer et al 1983)，但是IAA的预测能力非常有 限(Dean 1986)。 重症肌无力(MG)

重症肌无力(MG)是一种以骨骼肌乙酰胆碱受体(AChR)为靶向 的器官特异性自身免疫性疾病(Berrih-Aknin 1995)。因此，绝大 多数MG患者存在针对AChR的自身抗体，从而干扰神经肌肉传导。尽 管AChR存在于胸腺，但MG患者缺乏对该蛋白的耐受。对该观察现象 的一种解释是，MG患者对“改变”(异构化或光学反转)了的AChR 产生了免疫应答，这种改变了的AChR包括新的抗原决定簇，从而使机 体不能耐受。业已描述了几种AChR上的T细胞抗原决定簇(Zisman et al.1996，Yoshikawa et al.1997，Atassi & Oshima 1997)，其 中，AChR129-145包括几个Asx和Glx残基，具有异构化/光学反转的潜在 倾向性。最近，又鉴定了该病的另一种可能自身抗原：Gravin，一种 250kDa激酶脚手架蛋白(Nauert et al.1997)。该蛋白中的相应 Asx和Glx残基倾向于发生异构化/光学反转，诱导自身免疫应答。 乳糜泻(ClD)

乳糜泻(ClD)的特征是针对肌内膜的IgA自身抗体和T细胞介导 的对食物中谷蛋白的超敏反应。业已显示，麸朊是谷蛋白的免疫原部 分，能够与来自ClD患者的T细胞克隆发生反应。ClD患者的肠道炎症 可以通过暴露于饮食中的小麦麸朊而迅速发生，并且与酶组织转谷氨 酰胺酶(TGase)粘膜活性的增强有关。业已鉴定，该酶(TGase)是 在乳糜泻中是自身抗原(Dieterich et al.1997)。因此，98％的 患者有针对(TGase)的IgA滴度增高，而95％的健康对照组呈阴性 (Dieterich et al.1998)。 Chagas病(CD)

感染原生动物寄生虫克氏锥虫通常导致慢性心脏、肠道相关性自 身免疫性疾病，称为Chagas病(CD)。这种慢性病的特征是在心肌和 神经组织有丰富的炎症浸润。在这些心脏肌球蛋白(Abel et al. 1997)，毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)(Goin et al.1997)，以 及小核核蛋白(UsnRNP)(Bach-Elias et al.1998)中，业已鉴定 出作为CD自身抗原的多种自体蛋白。 银屑病(Ps)

银屑病(Ps)是一种表皮慢性增生性疾病，似乎具有自身免疫特 征。该病的典型临床表现是肿胀的炎症性皮肤损伤，上覆鳞状银屑。 但是疾病表现差异很大，严重程度各不相同。Ps患者中有5-10％发 展为银屑病关节炎，导致关节炎症核损伤。疾病的发病机理仍有争议， 但通过众所周知的免疫抑制剂治疗和IL-2毒素(选择性阻滞激活T细 胞生长的药物)治疗的成功，该病的自身免疫特征已基本证实 (Gottlieb et al.1995)。有几项研究似乎暗示，T细胞在该病的 发病机理中起一定作用(Schon et al.1997)。最近鉴定了一种公 认的200kDa片状明星Ps自身抗原(Chen et al.1996)。 克隆病(CrD)

克隆病(CrD)是一种肠道的慢性炎症性疾病。最常位于小肠和大 肠，可以导致溃疡，但CrD可以影响消化系统的任何部位。目前CrD 的致病原因不清，但疾病似乎具有自身免疫特征，不过，目前尚未鉴 定任何自身抗原或T细胞抗原决定簇。 发明简述

本发明提供了一种检测方法，包括对样本进行定量或定性测定， 确定样本中是否存在(a)特异性识别抗原决定簇的自身反应性免疫系 统组分，所述抗原决定簇包括异构化肽连接和/或光学反转氨基酸，和 /或(b)含有所述抗原决定簇的自身抗原或其片段，和/或(c)含有 所述抗原决定簇并能够诱导自身免疫应答的非自身抗原或其片段。

异构化可以发生于天门冬氨酸或天门冬酰胺氨基酸残基或谷氨酸 或谷氨酰胺氨基酸残基。

所述免疫系统组分可以是细胞免疫系统组分，如T淋巴细胞。

此外，所述免疫系统组分还可以是体液免疫系统组分，如抗体。 抗体可以是任何已知的抗体类型，特别是IgG。

所述抗原决定簇可以包括基本上任何蛋白质的氨基酸序列，但涉 及一些自身免疫性疾病，抗原决定簇可以是异构化或光学反转IgG， MOG，MBP或αβ-晶状体球蛋白。涉及其他一些自身免疫性疾病时，抗 原决定簇可以在疾病进展过程中形成攻击蛋白的部分。

检测所述自身抗体优选是自身免疫性疾病的指标，例如类风湿关 节炎，多发硬化，胰岛素依赖性糖尿病，重症肌无力，乳糜泻，Chagas 病，银屑病或克隆病。

所述免疫系统组分可以是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原 决定簇包括在任一序列中含有的氨基酸*Asx： Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr Trp-Glu-Ser-*Asx-Gly His-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-Pro Pro-Ser-*Asx-Glu-Gly-Lys-Gly-Arg Ala-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-*Asx-Ser-Val-Ile Trp-Ser-Phe-Gly-Ser-Glu-*Asx-Gly-Ser-Gly-*Asx-Ser-Glu-Asn Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val- His-Leu-Tyr-Arg-*Asx-Asn-Gly-Lys Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-Pro Ala-Gly-Trp-Leu-*Asx-Gly-Ser-Val-Arg或 Gly-Arg-Val-Arg-Val-*Asx-Ser-Ala-Tyr 其中*Asx是在原始序列中通过异构化/光学反转天门冬氨酸或天门冬 酰胺残基，形成的αD型天门冬酰胺或天门冬氨酸，或βD或βL型天门 冬氨酸。

所述免疫系统组分可以是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原 决定簇包括在任一序列中含有的氨基酸*Glx： Pro-Ser-*Glx-Gly-Lys-Gly-Arg Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-*Glx-Gly-Arg或 Asp-Ala-*Glx-Gly-Thr-Leu-Ser-Lys 其中*Glx是在原始序列中通过异构化/光学反转谷氨酸或谷氨酰胺残 基，形成的αD型谷氨酸或谷氨酰胺，或γL或γD型谷氨酸。

正在讨论的抗原决定簇可以是T细胞抗原决定簇，也可以是B细 胞抗原决定簇。

本发明包括检测自身抗原或片段的方法，包括检测所述自身抗原 或片段与免疫结合配体的反应性，所述免疫结合配体可以特异性检测 所述抗原中异构化肽连接或光学反转氨基酸的存在。

优选地，所述自身抗原与自身免疫性疾病相关。

本发明包括检测可以诱导免疫应答的非自身抗原的方法，所述免 疫应答可以与包括异构化或光学反转氨基酸的自身抗原决定簇发生交 叉反应。因此，暴露于类似自体蛋白序列的非自身原始序列，可能诱 导免疫应答，该免疫应答随后可能以致病方式针对自体蛋白。此外， 非自身抗原还可能诱导免疫系统产生诸如炎症反应的应答，导致自体 耐受的崩溃，进而产生对其他抗原决定簇的自身免疫反应，所述抗原 决定簇并不存在于激惹非自身抗原上(抗原决定簇泛化)。根据本发 明的这一方面，提供了一种检测非自体抗原或其片段的方法，该方法 制造一个自身免疫条件，包括检测所述抗原或其片段与免疫结合配体 之间的反应性，所述免疫结合配体可以特异性检测所述抗原中异构化 肽连接或光学反转氨基酸的存在。

这些方法可以提供所述探测的自身反应性免疫系统组分或自身抗 原或其片段的数量，也可以是纯粹定性的。

这些推测的针对异构化发生的免疫应答对于疾病是非常重要的， 即它们可能是疾病的始动或致病因子。或者，它们在疾病发展过程中 处于次要地位，是疾病发生后其他免疫或细胞过程的结果。在两种情 况下，都会涉及免疫系统的体液和细胞免疫。因此，本发明的目标是 开发能够检测或定量免疫系统特异性组分(如抗体)存在的诊断试剂， 所述特异性组分针对特异性抗原的异构化(和/或光学反转)靶抗原决 定簇，并因此使疾病的诊断和监测变得更加容易。在疾病背景中，尚 有争议的免疫应答无论是次要的还是致病的，改变的免疫应答都是诊 断相关的。

作为本发明特定实施方案的进一步解释，我们在下面描述了特定 IgG序列异构化在RA发病机理中的作用。但是，这并不意味着可以将 本发明的范畴限制在不能用于其他自身免疫性疾病，在那些自身免疫 性疾病中，关键抗原的异构化或光学反转也会发生，并导致与下述反 应相似的反应。

如上所述，IgG的Asn-384是异构化的潜在位点(Clarke 1987)。 但是，该残基不是IgG Fc区唯一可以发生异构化的表面暴露天门冬酰 胺残基。在下述实施例1中，给出了直接证据，证明Asn-315也可以 异构化，该残基也暴露于表面，位于FcH2区(Bonagura et al 1993)。

Tomiyama et al(1994)发现，依赖Asx残基的位置，这些残基 的光学反转影响β淀粉样物质的聚集特性，根据这一发现，不难想象， IgG异构化/光学反转会改变它的溶解性和亲水性，并诱导IgG发生自 动聚集。而且，根据我们的发现，异构化/光学反转几乎可以肯定，会 影响蛋白质的抗原性。IgG血液清除减少和/或IgG浓度升高的个体， 更倾向于发生。使该状况恶化的其他因素，如其他血清蛋白或IgG基 因等位基因变异体可以降低其溶解性，或增加其聚集力。环境因素也 可通过调节免疫系统功能而影响该状况。

因此，IgG易感位点的潜在异构化/光学反转可能通过两种方式在 自身免疫性疾病的发病机理中起作用：

A)首先，异构化/光学反转可能通过提供新的免疫抗原决定簇而 直接涉及RA的始动相，并成为体液免疫系统的作用对象。因此，能够 识别异构化或光学反转自身IgG的特异性抗体出现，并通过产生大量 不溶性免疫复合物在疾病过程中起始动作用，这些免疫复合物在关节 的滑膜组织聚集，并激发炎症反应(Inman & Day 1981)。而且，免 疫系统的细胞组分也会针对这一新的抗原决定簇发挥作用，介导RA中 特征性滑膜组织损伤。

B)此外，RA中IgG的聚集还会降低IgG的清除，进而使聚集的 IgG在迟滞时段内发生功能性异构化/光学反转。尤其是清除率非常低 的滑膜液，非常容易成为该过程发生的地点。因此，在这种情况下， 异构化/光学反转就成为与RA病程相关的IgG聚集的征象，但是，会 如上所述，逐渐导致异型IgG特异性自身抗体的形成。同样，免疫系 统的细胞组分会在此阶段介入。

上面概括的两种假说并非完全互相排斥，而且在两种情况下，识 别异构化或光学反转Asx或Glx残基的自身抗体是疾病的特异性标 志。有观点认为，易感天门冬酰胺或天门冬氨酸残基的异构化涉及以 产生类风湿因子为特征的自身免疫反应，支持上述观点的观察包括： RFs识别抗原决定簇位于所有潜在异构化位点存在的和CH3(Johnson and Page Faulk 1976；Nardella et al.1981)。有几条证据提示， 异常(非正常)IgG存在于RA中(Rawson et al.1969；Watkins et al.1972；Johnson et al.1974)。最后，IgG1，2和4中CH2区 Asn315以及CH3区Asn384周围的空间构型和氨基酸序列非常适于酰亚胺 键的形成(Clarke 1987)，而且潜在的抗原决定簇暴露于表面。

Glant et al业已报导，软骨聚集蛋白聚糖包括的抗原决定簇可 以在鼠中产生自身免疫应答。聚集蛋白聚糖是软骨的糖蛋白组分，我 们已经鉴定了其中的潜在异构化/光学反转位点，包括在聚集蛋白聚糖 G-1功能区的氨基酸序列Gly-Arg-Val-Arg-Val-Asn-Ser-Ala-Tyr 中。针对该序列定义的异构化和/或光学反转抗原决定簇的自身免疫应 答也是本发明的目标。

软骨连接蛋白(CLP)在软骨中与聚集蛋白聚糖和hyaluronan相 关，也已显示与针对该蛋白的自身免疫相关，并在动物模型中可以诱 导RA(Zhang et al 1998)。我们鉴定了作为潜在异构化和/或光学 反转位点的序列，Ala-Gly-Trp-Leu-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Arg，可 能涉及自身免疫。

通过类比，针对其他关键自身抗原如MS中的MBP或MOG、或自身 免疫性疾病中更普遍的异构化或光学反转抗原的自身免疫应答，可能 在正在讨论的疾病的发病机理方面起相似的作用。

在本发明另一方面，其他自身免疫性疾病的特征在于关键抗原发 生异构化或光学反转形式的易感性，并因此产生对于疾病来说首要或 次要的免疫应答。因此，本发明并不限于只针对RA或MS的诊断试剂， 还可以广泛用于其他自身免疫性疾病。

为了实施本发明，如果已知靶抗原，可以通过下述一个或多个步 骤，鉴定自身免疫性疾病中靶自身抗原关键抗原决定簇的异构化/光学 反转。

如果靶抗原的三维结构已知，就可以鉴定其潜在异构化/光学反转 位点(如，Asx-Gly序列)。它们理论上形成异构化/光学反转的倾向 性可以基于两面角phi，psi，chi和chi2的计算、以及含有β羧基的 氨基酸侧链弹性来评价(Clarke 1987)。而且，还可以评价潜在变化 的残基是否暴露于表面，并能为自身抗体接近。一个非常重要的参数 是该蛋白质的半衰期，因为只有具有相对较长半衰期(超过10天)的 蛋白质才会发生程度显著的异构化和/或光学反转。

应该指出，本发明还可用于检测对含有*Asx或*Glx的抗原决定簇 具有特异性的免疫系统组分，即使这种正在讨论的变化蛋白不是正在 讨论的疾病的致病因素，并且自身反应性免疫系统组分只是一种症 状，而非致病原因。在这些情况下，识别自身反应性组分的存在对于 首次诊断和治疗监测具有价值不匪的诊断意义。

本发明还包括在自身抗原上定位一个或多个抗原决定簇的方法， 包括应用L异构型天冬氨酰(D-天冬氨酰)甲基转移酶(IAMT)-EC 2.2.2.77以及标记甲基，将所述标记甲基引入到所述自身抗原的一个 或多个异构化或D型天门冬氨酸中，并测定该自身抗原中引入标记甲 基的至少一个位点，然后建立包括该位点区域的自身抗原氨基酸序 列，并检测所述氨基酸序列肽在所述部位整合了异构化或光学反转氨 基酸后，与自身反应性免疫系统组分如自身抗体的免疫反应性。

因此，感兴趣靶抗原(如I型糖尿病中的谷氨酸脱羧酶，多发硬 化中的髓鞘碱性蛋白或MOG，或类风湿关节炎中的IgG)可以通过酶 IAMT来分析。该酶识别αD型或βL型Asx(但不识别βD型天门冬氨酸， 也不识别改变的Glx)，即该酶识别特定异构化或光学反转的天门冬氨 酸和天门冬酰胺残基，并使α羧基甲基化。通过应用放射活性元素标记 的甲基供体，与该酶共同孵育的异构化蛋白质或肽也将被放射活性元 素标记，蛋白的标记可以通过测定整体放射活性来检验。

异构化位点的位置可以通过下述方法鉴定，该方法包括应用化学 或蛋白水解法将感兴趣抗原分解为片段，然后应用已知的层析法纯化 产生的抗原片段，再通过IAMT法分析这些片段。将通过IAMT法鉴定 含有异构化序列的片段进行氨基酸排序和氨基酸分析，以明确它们在 靶抗原中的确切位置。

应用IAMT或其他本文描述的方法鉴定的相关异构化序列包括： 来自IgG：

(RA) Asn-315：Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr，His-Gln-Asp-Trp- Leu-*Asx-Gly，His-Gln-Asp-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr。 Asn-384：Trp-Glu-Ser-*Asx-Gly-Gln-Pro-Glu，Val-Glu-Trp-Glu- Ser-*Asx-Gly，Val-Glu-Trp-Glu-Ser-*Asx-Gly-Gln-Pro-Glu。 来自MBP：

(MS) Asn-92：His-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-Pro Gln-103：Pro-Ser-*Glx-Gly-Lys-Gly-Arg Gln-119：Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-*Glx-Gly-Arg Gln-143：Asp-Ala-*Glx-Gly-Thr-Leu-Ser-Lys 来自MOG：

(MS) Asn-53：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg- Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-*Asx-Gly-Lys 来自GAD65：

(I型糖尿病) Asp-297：Ala-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-*Asx-Ser-Val-Ile Asp-15 & 19：Trp-Ser-Phe-Gly-Ser-Glu-*Asx-Gly-Ser-Gly- *Asx-Ser-Glu-Asn 其中，*Asx是通过光学反转/异构化天门冬氨酸或天门冬酰胺形成的 αD型天门冬氨酸或天门冬酰胺，或βD型或βL型天门冬氨酸。*Glx是 通过光学反转/异构化谷氨酸或谷氨酰胺形成的αD型谷氨酸或谷氨酰 胺，或γD型或γL型谷氨酸。

在本发明范畴内还包括含有任一这些氨基酸序列的抗原决定簇的 肽。本发明还包括其他肽，所述肽含有应用L异型天冬氨酰(D-天冬 氨酰)甲基转移酶(IAMT)定位的包括异构化或光学反转氨基酸的抗 原决定簇。

如果感兴趣自身免疫性疾病的自身抗原尚未鉴定，就需要分析自 身免疫损伤的靶组织或器官。如上所述，溶解并蛋白水解该组织，然 后通过层析法或其他技术纯化产生的肽，随后应用IAMT法鉴定异构化 /光学反转片段。这些片段再应用氨基酸排序、氨基酸分析、质谱和其 他相关方法进行鉴定。 检测针对异构化或光学反转抗原决定簇的自身抗体

可以通过下述方法检测来自患者或动物研究对象的自身抗体，所 述抗体能够识别关键自身抗原中主要抗原决定簇的异构化/光学反转 的肽序列。

通常，可以采用很多已知形式和过程的免疫方法，包括ELISA， RIA，异源和同源法。以举例的方式，可以将合成的异构化或光学反转 肽、或含有感兴趣抗原决定簇的真实抗原的蛋白水解片段包被到微量 滴定板(MTP)的固态相上，或者与载体蛋白(如甲状腺球蛋白或血清 白蛋白)结合或通过与生物素结合进而与链霉亲和素包被的MTP表面 结合。然后通过在MTP孔中添加适宜稀释于实验缓冲液中的血清样本 鉴定反应性自身抗体，在孔中它们可以与固定的含有抗原决定簇的物 质结合。结合抗体的数量可以通过应用二级酶联抗人抗体、然后应用 生色酶底物来量化。在该实验系统中必须小心，使由于吸附到MTP表 面的IgG或其他血清组分而引起的非特异性反应最小化。

此外，正在讨论的抗原决定簇还可导致其他抗体的产生，这些抗 体也可以固定在MTP表面。然后可以将含有正在讨论的异构化抗原决 定簇的合成肽、或者含有靶抗原决定簇的真实抗原的蛋白水解片段连 接到诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶上，或应用诸如生物素或地高 辛配体的配体标记。然后将该试剂加入适宜的稀释剂中，与血清样本 一起加入滴定板孔中。血清样本中能够与靶抗原决定簇反应的自身抗 体可以阻断抗原决定簇与包被在MTP表面的抗体的结合，进而导致信 号的减弱，该信号是在随后加入生色酶底物或链霉亲和素结合检测试 剂后产生的。该信号可以量化，并用来评价研究样本中自身抗原的数 量。

可以应用MTP平板进行另一种竞争性实验形式，所述平板包被了 含有正在讨论的抗原决定簇的合成或真实肽或肽片段，如上所述，该 实验应用正在讨论的抗原决定簇导致的非人抗体。该肽可以直接包被 到MTP表面上，或者与载体蛋白(如甲状腺球蛋白或血清白蛋白)结 合或通过与生物素结合进而与链霉亲和素包被的表面结合。在MTP中 孵育适宜稀释于实验缓冲液中的人血清样本，随后或同时加入正在讨 论的抗原决定簇产生的抗体。血清样本中含有的能够与正在讨论的抗 原决定簇发生反应的自身抗体可以与MTP表面上的抗原决定簇反应， 从而取代其他抗体的结合。通过应用与非人抗体特异性反应的酶标二 抗，在与生色酶底物孵育后，可以量化结合人抗体的数量，所述非人 抗体是正在讨论的抗原决定簇产生的。染色的量与结合人自身抗体的 量成反比。

同源实验形式还可以通过如下步骤进行，包括将适宜稀释的人血 清样本与含有正在讨论的抗原决定簇的生物素结合肽、以及与适宜酶 或放射活性分子如125I共价标记的链霉亲和素孵育。人血清样本中存在 的自身抗体可以与链霉亲和素分子上的靶抗原决定簇结合，然后应用 蛋白A琼脂糖或其他沉淀试剂或人IgG特异性固相使之沉淀。在酶标 链霉亲和素的情况下，结合抗体的量可以应用生色酶底物来定量，在 放射同位素标记链霉亲和素的情况下，结合抗体的量可以应用闪烁计 数来定量。 检测对异构化/光学反转自身抗原的细胞免疫反应性

为了帮助疾病确诊，协助治疗选择，监测并计算患者预后，对新 确诊的自身免疫性疾病患者进行体外自身免疫应答研究是非常必要 的。确定涉及自身免疫应答的免疫系统分子组分间的相互作用对于勾 勒疾病特征、评价抗原和细胞免疫在疾病发展过程中的重要性也是非 常必要的。上面的段落阐述了对βL型、αD型或βD型Asx残基(以及 γL型或γD型Glx残基)靶抗原决定簇产生体液反应的分析。但是，为 了监测疾病，针对变化的自身蛋白产生的细胞免疫应答可能同等/更重 要。绝大多数自身免疫性疾病涉及免疫系统的细胞成分，包括在RA和 MS中，T细胞作为组织损失的主要介质被提及。为了确定免疫应答是 主要的还是次要的，必须测定免疫系统细胞成分的作用对象。

T细胞介导的自身免疫可以通过几种方法进行检测，如：T细胞增 殖法，ELISPOT法，有限稀释法，或51Cr释放法(对这些方法的总体 认识，请见C.A.Janeway & P.Travers(1997))。下面给出了一 些方法的简短概述，可以用来研究针对异构化和/或光学反转抗原的细 胞免疫应答： T细胞增殖法

T细胞对抗原的特异反应性可以通过淋巴细胞增殖法测定，所述T 细胞分离自自身免疫性疾病患者的外周血或受累靶器官(即RA患者的 滑膜液/组织，或MS患者的CNS)，或者分离自自身免疫性疾病动物模 型。将淋巴细胞置于适宜的细胞培养基中培养，所述培养基中含有βL 型、αD型或βD型的特异性抗原/抗原片段，或者含有不相关对照抗原 或根本不含抗原。将3H-胸腺嘧啶脱氧核苷加入培养基中，在抗原刺激 下活跃分裂的淋巴细胞能够把标记的胸腺嘧啶脱氧核苷整合到DNA 中。通过定量整合到DNA中的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的量，可以评价淋 巴细胞对不同形式的自身抗原或自身抗原衍生性抗原决定簇的增殖反 应(Weir 1996)。抗原特异性增殖是CD4+T细胞特异性反应的特点。 有限稀释法

为了获得针对给定βL型、αD型或βD型(或γL型或γD型)自身抗 原或其抗原决定簇的细胞免疫反应“滴度”的信息，可以进行有限稀 释法。该方法包括将不同数量的淋巴样细胞(即取自外周血的细胞) 以及刺激性抗原、抗原提呈细胞或特异性生长因子加入单独的培养孔 中。几天后，检测每孔针对抗原的特异性反应，如靶细胞的细胞毒杀 伤作用或特异性增殖。含有特异性T细胞的孔会对其作用对象产生反 应，从Poisson分布曲线可以得到，对于给定稀释度的T细胞，如果 37％的孔呈阴性，那么在培养开始时，每孔平均包括一个特异性T细 胞。通过比较对照个体以及对异构化和/或外消旋性抗原显示自身免疫 反应性的个体(即RA或MS患者)，可以在两个群体间评估T细胞滴 度的差异，并将此差异作为衡量自身反应性细胞的抗原特异性扩张的 标准，业已显示，这种自身反应性细胞针对抗原的特异性扩张可能在 罹患自身免疫性疾病的个体中发生。 ELISPOT法

ELISPOT法可以作为一种敏感方法，用来从(即)外周血样本中 定量单独的淋巴细胞，所述淋巴细胞可以产生特异性抗体(B细胞)或 细胞因子，其特征是刺激抗原特异性T细胞。ELISPOT法通过培养淋 巴细胞进行，所述淋巴细胞分离自自身免疫性疾病患者的外周血或受 累靶器官(即RA患者的滑膜液/组织，或MS患者的CNS)，或者分离 自自身免疫性疾病动物模型。ELISPOT法通过在硝酸纤维素薄膜或其 他固体表面上的适宜培养基中培养淋巴细胞进行，所述其他固体表面 能够保留淋巴细胞分泌的蛋白质和肽(Ronnelid & Klareskog， 1997)。如果在培养基中添加给定抗原，将会刺激特异性针对该抗原 或其抗原决定簇的淋巴细胞分泌特征性淋巴因子(即γ-干扰素，白细 胞介素2或白细胞介素4)(Weir 1996，Okamoto et al 1998)。 培养一段时间后，将细胞从薄膜上洗脱，然后应用特异性试剂(即抗 体)检测细胞产生的淋巴因子。通过量化产生某一给定淋巴因子的细 胞数量，以及产生的淋巴因子的类型，可以评价针对刺激抗原发生的 反应，并了解反应特征。

本发明还应用下面的实施例来描述、举例，在实施例中，还要参 考附图，附图内容见下：

图1：(A)显示了实施例1获得的结果，结果来自于胃蛋白酶降 解人IgG的首次(片段)大小排除层析，以图的形式显示了洗脱物质 的OD280nm吸收值，以及收集部分的IAMT反应性。(B)显示了通过 (片段)大小排除层析分离的胃蛋白酶降解IgG不同部分的特异性异 构化程度；

图2：显示了实施例1获得的结果，将通过(片段)大小排除层析 分离获得的低分子量IgG片段在阴离子交换柱上进一步分离。收集的 部分池在进一步纯化后，以a，b，c和d表示；

图3：显示了图2所示的阴离子交换纯化IgG肽“b池”肽进行 RP-HPLC分离的结果。描绘了以下方面：UV 214nm，荧光(380/297nm)， 乙腈梯度和IAMT反应性；

图4：显示了图3纯化后b池进行第二轮RP-HPLC纯化的结果。 图示了洗脱物质的UV 214nm探测信号和IAMT反应性；

图5显示了实施例2获得的结果，以图的形式显示了3名患者组 血清样本应用ELISA法检测获得的信号；

图6显示了实施例3获得的结果，以条形图的形式显示了在竞争 性肽存在的情况下，检测的6个血清样本的ELISA信号；

图7：显示了实施例4获得的结果，以图的形式显示了RA患者和 健康对照样本在同源RIA法中获得的信号(以CPM为单位)；

图8：显示了实施例4获得的结果，以条形图的形式显示了在竞争 性肽存在的情况下，获得的以抑制百分比表示的RIA信号；以及

图9：以散点图的形式显示了实施例6获得的结果，包括A，B和 C。

实施例1：鉴定异构化易感的IgG Fc区Asn-315

根据以下方法，应用胃蛋白酶消化人IgG(Sigma cat no.I- 4506)：根据生产厂商(Pierce)描述的步骤，应用固定的胃蛋白酶 (Pierce Cat.No.20343)进行消化。简而言之，将0.125ml的固 定胃蛋白酶凝胶加入实验试管，在0.5ml消化缓冲液(20mM醋酸钠 缓冲液，pH4.5)中平衡。将10mg纯品冻干IgG加入1.0ml消化 缓冲液中，混合物在37℃孵育4小时。通过向孵育混合物中加入pH7.5 的1.5ml 10mM Tris HCl终止消化。然后通过离心(1000g，5分钟)， 从固定胃蛋白酶凝胶中分离IgG片段，移去含有片段的上清。

通过在Superdex 75 HR10/30柱(Pharmacia，Sweden)上进行 凝胶过滤，将IgG片段与未消化的IgG分离。应用pH8.0的0.2M NH4HCO3，以28ml/h的速度平衡柱(2.6×72cm(总体积360mL))。 装载2.75ml样本，收集0.25ml部分。柱应用下述Mw标记混合物进 行校准，从而可以测定洗脱部分的大小：白蛋白(67kDa)，卵白蛋白 (43kDa)，糜蛋白酶原A(25kDa)，核糖核酸酶A(13.7kDa) 和Aprotinin(6.5kDa)。从IgG Fc部分衍生的低分子量(分子量 小于10kDa)IgG片段出现在洗脱体积22-28ml(44-56部分，图1)。

将这些部分的等分试样再次溶解于磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中， 然后通过酶法应用L异构型天冬氨酰(D-天冬氨酰)甲基转移酶 (IAMT)分析异构化或光学反转Asx残基的存在。简而言之，该方法 就是通过IAMT酶，应用放射活性元素(氚)标记的蛋氨酸探测异构化 残基。该方法以下述方式进行：

在600ul Eppendorf管中加入下述试剂：含有IAMT活性的15ul 牛红细胞裂解液(根据Murray and Clarke 1984制备)，10ul实验 缓冲液(0.25M NaH2PO4/NaOH pH7.02)，15ul样本(或已知浓度的 合成异构化肽溶液校准品)，以及10ul SAM示踪剂(如下制备：将 3ml冷SAM加入26.1ml新鲜制备的10mM HCl中。再将100ul“热SAM” (Amersham TRA236，1000umol/L)加入20ml上述溶液中，然后以 1ml等分储存于-18℃)。将混合物旋转混和后，在37℃(水浴)孵育 小管60±1分钟。加入50ul Quenching溶液(0.2M NaOH，1％十二 烷基硫酸钠)终止反应，然后再混和。将75ul该溶液加到滤纸上(0.75 ×5.5cm，预先折成“手风琴摺样”)。将滤纸置于含有2.5ml Ecoscint H闪烁液的6ml闪烁管中(在管中大约半浸1.5cm)。闪烁管在室温下 放置大约18小时(过夜)，这样，放射性甲醇可以扩散到闪烁液中。 移去滤纸条，在下述终止条件下应用β计数器给小管计数：900sec.， 或最大6400CPM。可以应用标准曲线计算未知样本浓度，所述标准曲 线通过测定已知浓度的合成异构肽校准品制备。

这些测定显示，胃蛋白酶降解IgG的低分子量部分具有高度IAMT 活性，显然含有完整IgG分子的大部分异构化位点(44-56部分，图 1)。这些部分通过反相高效液相层析(RP-HPLC)进一步纯化。

收集经(片段)大小排除层析柱处理的含有IAMT反应肽(44-56 部分)的部分，将体积调整至9.5ml，然后加入20ul TFA。Sep-Pak C18柱(3cc，500mg，Waters)应用10ml 80％甲醇条件化，再应用 10ml 0.2％ TFA平衡。将样本装柱，应用20ml 1％ TFA洗柱。最后， 应用10ml 40％乙腈，0.1％ TFA洗脱结合肽。收集洗脱液，冷冻并冻 干。将洗脱液再次溶解于pH7.88的2ml 20mM Tris缓冲液中。将 100ul该溶液储存，用于测定IAMT活性，其余的(1900ul)用于离 子交换层析。

应用1ml mono-Q HR 5/5柱(Pharmacia 52-1622-00)进行阴 离子交换层析。该柱用pH7.88的20mM Tris以1ml/min的流速平衡。 样本通过手工注射器环装载，然后应用线性梯度的NaCl(0.0-0.3M NaCl，共进行30分钟)洗柱。然后应用0.3-1M的线性梯度NaCl洗 脱1分钟。应用1M的NaCl持续洗脱1分钟，最后应用1-0M的线性 梯度NaCl洗脱1分钟。应用该缓冲液持续洗脱2分钟。应用280nm 处的UV吸收值检测洗脱肽，收集0.5ml部分(30秒)。应用IAMT 法分析这些部分的等分试样，结果在图2给出。集中收集4-6部分是 a，集中收集25-27部分是b，集中收集29-31部分是c，储存以备 进一步分析。

如上所述，应用Sep-Pak C18柱缓冲交换集中收集的部分，然后 再溶解于200ul 0.1％ w/w三氟醋酸(TFA)中，并通过RP-HPLC进 一步纯化。第一轮RP-HPLC在C-18柱(Nova-Pak C-184um 3.9× 150mm HPLC柱，Waters)上进行，应用0-40％的线形梯度乙腈以1 ml/min的流速洗脱4 0分钟，所述乙腈溶解于0.1％(w/w)三氟醋酸 (TFA)中。通过在214nm处的UV吸收值、以及荧光(在380nm(发 射)，应用297nm光激发)检测洗脱肽，收集0.5ml部分(30秒)， 并冻干，以备IAMT法分析。

对于从阴离子交换柱获得的“a”池，绝大多数IAMT反应性物质 是在22-23.5分钟洗脱的(图3)。集中收集这些部分，如上所述， 应用Sep-Pak C-18柱浓缩这些部分中的肽。样本再次溶解于200ul 0.05％七氟丁酸(HFBA)中。该样本在相同的柱上进行第二轮RP-HPLC， 进一步纯化，但这一次应用溶解于0.05％七氟丁酸(HFBA)中的5- 30％的线形梯度乙腈，洗脱80分钟，然后收集0.5ml部分。该部分 通过在214nm处的UV吸收值、以及荧光(在380nm(发射)，应用 297nm光激发)监测，并将冻干的该部分再次溶解，进行IAMT法分 析。

从图4可以很明显地看出，从阴离子交换柱获得的“b”池(图2) 经第二轮HPLC纯化，获得的一个主峰包括绝大部分异构化Asx残基(图 4)。根据生产厂商的说明书，应用Applied Biosystems model 477A 序列分析仪对含有该峰的部分进行氨基酸序列分析。推导出下列序 列： “b池”：His-Gln-Asp-Trp-Leu “c池”：Thr-Val(Leu/Val)His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-Gly-Lys- Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys(Ala/Gly)Leu-Pro CH2；Thr-Val(Leu/Val)His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu- Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys(Ala/Gly)Leu-Pro(Ala/Ser) (Pro/Ser)Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys(Ala/Thr)Lys

因此，分离的异构化肽来自CH2区，但通过胃蛋白酶降解，产生不 同的长度。CH2区的公开序列如上，很显然，所有三个肽都与该序列匹 配。以黑体给出的天门冬酰胺残基就是Asn-315。残基308在IgG2中 是缬氨酸，在其他IgG亚类中是亮氨酸。以斜体给出的“c池”肽序列 是从氨基酸分析推出的(见后)。根据该残基与随后甘氨酸之间的肽 键，重排后从α羧基变为β羧基，给出的残基315是天门冬氨酸，而非 天门冬酰胺。

所有的分离肽应用异构天冬氨酸特异性IAMT酶识别，它们的序列 都不超过Asn-315残基N末端的亮氨酸残基。这一点强烈提示，Asn- 315残基发生了异构化反应，因此，侧链肽键重排，从正常的α羧基变 为β羧基，并伴随氨基的水解消失。肽序列分析不能超过315残基与以 前的结果一致，说明异构化反应导致通过正常Edman降解法进行的肽 序列分析，不能超过易感位点(Fledelius et al 1997)。 实施例2：检测与Asn-315具有反应性的自身抗体

发明人员研究了自身抗体是否能够识别Asn-315衍生的区隔肽， 以及这种自身抗体是否具有类风湿关节炎的特性。为了进行此项研 究，人工合成了IgG Fc Asn-315衍生的(βL)区隔肽，Trp-Leu- Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr。所用的肽是线性(αL型)肽制剂Trp- Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr，通过下述步骤经加热促进异构化产生。 将该肽溶解于缓冲液中，90℃加热4小时，促进异构化和/或光学反转 产生。获得的异构化(βL)、光学反转(αD和βD)和线性(αL)肽混 合物经RP-HPLC分析，在RP-HPLC中，应用溶解于0.1％ TFA的15 -35％的梯度乙腈以1ml/min流速洗脱10分钟，然后如上所述，应 用氨基酸分析研究获得峰的异构化状态。该肽以5mg/ml溶解于pH9.2 的0.2M磷酸钠中。通过下述方法，应用戊二醛(GA)(Fluka 49626 lot 43381/1)使该肽与胸腺球蛋白(Sigma lot 66H7085)结合。

溶解于pH8.0的0.1M磷酸钠缓冲液中的胸腺球蛋白(30mg/ml) 0.5ml，在持续混匀的情况下，逐滴(持续2分钟)加入0.5ml下述 溶液中：10％ GA，40％ H2O，50％ pH8.0的0.2M磷酸钠。容器 在室温持续混匀的情况下孵育过夜。通过凝胶过滤(NAP-10柱， Pharmacia)去除多余的GA，缓冲液换成PBS。终体积调整至1.5ml(每 种制剂载体蛋白10mg/ml)。500ul载体蛋白与500ul 5mg/ml的 肽溶液孵育。容器在室温持续混匀的情况下孵育24小时。多余的肽通 过凝胶过滤(NAP-10柱，Pharmacia)转移到PBS缓冲液中。终体积 调整至1500ul，应用BioRad蛋白法，根据生产厂商的使用说明，测 定蛋白浓度。

将Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体溶解于 PBS，终浓度为10ug/ml，并将100ul该溶液移加到微量滴定板(MTP， 平底，有机聚合物担体，Nunc)的孔中。如述(Bonde et al 1994) 封闭平板，加入在下述溶液中稀释100倍的血清样本：10mM磷酸钠、 140mM NaCl、0.1％ tween-20、1％ BSA pH7.4(实验缓冲液)。 在20℃旋转混和器上放置MTP 1小时±5分钟。通过手工平板清洗器， 应用清洗缓冲液(25mM tris，140mM NaCl，0.1％ tween-20，pH 7.4)洗板5次。每孔加入100ul实验缓冲液，所述缓冲液中含有1000 倍稀释的过氧化物酶结合的兔抗人λ链(Dako 063)和κ链(Dako 013)。 在20℃旋转混和器上再次孵育MTP 1小时±5分钟。清洗5次后，加入 100ul过氧化物酶底物(3，3’，5，5’四甲对二氨基联苯二盐酸(TMB)， Kirkegaard & Perry Laboratories，USA)，室温下(18-22℃) 避光孵育15±2分钟。加入0.18M硫酸后，在450nm处测定吸收值。

在比较类风湿因子阳性的RA血清、类风湿因子阴性的RA血清和 对照血清时发现，RA RF+患者较其他两组反应性显著升高(图5)。 在应用其他不相关Thy-GA结合体(Thy-GA-Glu-Lys-Ala-His-*Asx- Gly-Gly-Arg)进行的平行实验中，虽然遵循相同的实验步骤，但结 果发现，两组间没有差异。该实验说明，在RF阳性的RA患者中，针 对IgG Fc Asn-315衍生序列Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr的自 身抗体反应性，存在升高现象。 实施例3：识别异构化Asn-315的特异性自身抗体与合成肽的竞争性 结合

如上所述，RA自身抗体与Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu- Tyr包被平板之间的结合，可以通过如下方法而被竞争性抑制，即应用 溶液中含有Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr肽的血清预孵育平板。 该实验如下进行。血清样本在10mM磷酸钠、140mM NaCl、0.1％ tween-20、1％ BSA pH7.4(实验缓冲液)中稀释100倍。将200ul 加入1.5ml聚丙稀试管中，然后再加入50ul溶解于实验缓冲液中的 浓度为50ug/ml的下述试剂： 1.Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr(βL型抗原决定簇) 2.Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr(αL型抗原决定簇) 3.Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体(如实施例2所 述制备)。 4.单独的实验缓冲液。

试管置于4℃ 17小时，然后将100ul混合物加入包被有Thy- GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体的MTP。在如上实施例2 所述条件下，进行实验。

结果如图6所示。很显然，异构化肽(1)以及Thy-GA-Trp-Leu- *Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体(3)能够与6份RA分析血清竞争性结 合。该研究强烈提示，RA患者中能够识别残基315周围7个氨基酸抗 原决定簇的自身抗体，是主要的异构型(βL)抗原决定簇的特异性抗 体。 实施例4：同源放免法评价与异构化IgG Fc Asn-315衍生肽具有反应 性的自身抗体的检测

为了测定与IgG CH2区衍生的异构型抗原决定簇Trp-Leu-Asn- Gly-Lys-Glu-Tyr具有反应性的自身抗体，发展了同源RIA法。该方 法包括以下步骤：将血清样本与125I Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly- Lys-Glu-Tyr孵育过夜，然后应用蛋白A琼脂糖凝胶沉淀免疫复合物。

血清样本在IMP缓冲液中以1∶200稀释(IMP缓冲液：10mM磷 酸钠，pH7.4，140mM NaCl，5mM EDTA，0.5％ Triton X-100， 0.1％ BSA，10ug/ml大豆胰蛋白酶抑制剂)。如实施例2所述制备 Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体，根据氯胺T方法应 用125I碘化所述结合体：在0.25M磷酸钠溶液中稀释100ug结合体， 至总体积140ul。加入1.5mCi的Na125I，随后再加入10ul氯胺T (1mg/ml，新鲜制备)。旋转混和该溶液30秒，加入150ul蛋氨酸 (1mg/ml)，立即旋转混和120秒。在(片段)大小排除柱(类型： BIOSEP SEC S-2000，大小：300×7.80mm)上纯化示踪剂，所述柱 应用含有1％ BSA的PBS以流速1.0ml/min平衡。收集500ul部分， 在闪烁计数器(γ计数器)上分析。收集含有示踪剂的部分，用于同源 RIA法分析。

在IMP缓冲液中稀释125I Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu- Tyr示踪剂，在密封的聚丙烯试管中，将75ul 200倍稀释的血清样 本与25ul肽/链霉亲和素溶液混和。试管在4℃孵育过夜(16-18小 时)。称量蛋白A琼脂糖(PAS)(20ul/样本试管)，并用10ml IMP 清洗缓冲液清洗3次，然后应用转发移液枪将其转移到1.5ml Eppendorf管中。1000 RPM离心2分钟，沉淀PAS，用吸液长颈瓶或 移液枪吸取上清。抗体/抗原溶液孵育3小时后，转移到PAS沉淀上， 在摇动台上室温再孵育30分钟。1000 RPM离心2分钟，沉淀PAS。应 用750ul IMP清洗缓冲液清洗PAS沉淀5次。每次清洗后，都应用 1000 RPM离心2分钟，沉淀PAS，用吸液长颈瓶或移液枪吸取上清。 最后，在milli-Q水中再悬PAS沉淀至100ul悬液，转移到4ml聚 丙烯试管中，应用γ计数器计数。如上异源ELISA法所述，应用无意肽 进行对照实验。

根据该方法进行实验，血清可以获得高特异性信号。在分组基础 上，RF+RA患者较对照个体的血清样本反应性更高(图7)。

通过加入25ul含有100，1000或10,000ng/ml下述肽的溶液， 可以进行竞争性实验。所述肽包括：Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu- Tyr，Trp-Leu-Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr，Glu-Lys-Ala-His-Asp-β- Gly-Gly-Arg和Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg肽，以及“无意” 对照肽His-Thr-Ala-Arg-Gln-Met-Ala-Trp-Ala-Lys，以及Thy- GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr和Thy-GA-Glu-Lys-Ala-His- *Asx-Gly-Gly-Arg结合体。在编辑所有实验观察到的反应性、并在分 组基础上计算反应性时发现，在最高浓度下，针对Trp-Leu-Asp-β- Gly-Lys-Glu-Tyr肽(以及Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr 结合体)具有显著的反应性(采用Student’s T检验，P＝0.01)，但 是与其他肽却没有反应性(图8)。这一结果与前面实施例所述ELISA 法的观察一致。 实施例5：对含有人IgG Asn-315的免疫反应性抗原决定簇进行绘图 分析，所述抗原决定簇还能与RA患者经免疫亲和纯化的自身抗体发生 反应

IgM自身抗体分析为在自身抗体分析前从血清中去除内源性IgG 揭示了可能性。实际上，业已建立的结论性观点认为，正常个体和RA 患者都存在显著数量的循环异构化/光学反转IgG，可以想象，任何公 认的抗异构型IgG自身抗体都可能由于这些分子的存在而被几乎完全 封闭，因此，阻碍了与实验固相的结合。下面的实施例描述了一种纯 化人自身抗体的方法，所述自身抗体能够与来自人IgG的异构化靶抗 原决定簇发生反应，并通过与合成肽孵育，检测针对该抗原决定簇的 反应性，所述合成肽是在无活性纤维素支持物上合成的。 通过免疫亲和层析在IgG柱上纯化来自人血清样本的RF

应用的实验方法如下： 1.应用生产厂商提供的使用说明(Pharmacia，Upsala，Sweden)， 使IgG与CNBr激活的琼脂糖结合。 2.将IgG琼脂糖装到适宜的柱中(即可以任意使用的DG10柱，BioRad laboratories，Richmond，CA)。该柱应用至少10倍柱体积的PBS 和10倍柱体积pH3.5的0.1M醋酸钠、0.15M氯化钠洗柱，最后在 PBS中平衡。 3.RA患者血清在PBS中稀释10倍，然后上柱。应用PBS洗柱，直至 洗脱液的吸收值(OD 280nm)达到基线水平。 4.应用pH3.5的0.1M醋酸钠、0.15M氯化钠洗脱结合的RF。 5.在Sephadex G-200柱上，应用pH3.5的0.1M醋酸钠、0.15M 氯化钠，通过凝胶过滤将IgM与IgG、IgA分离， 6.洗脱的IgM在PBS-BT中稀释到1ug/ml，如下所述进行分析。 合成纤维素结合肽

应用前述过程(Frank，1992，Kramer et al 1994)，通过Whatman 540 paper(Maidstone，UK)，采用斑点合成技术，合成了跨越Asn-315 的七氨基酸肽。该肽通过斑点合成法自动制备(Abimed，Langenfeld， FRG)。下述肽被合成，并通过羧基末端共价粘附：

I.  Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp...

II.Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu...

III.Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-β...

IV.His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-β-Gly...

V.Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys...

VI.Asp-Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu...

VII.Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr...

VIII.Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys...

IX.Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys...

X.Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys...

Asp-β：表示异构化的Asp残基，其中肽连接是通过β-羧基，而非 正常的α-羧基(βL型)。

...：表示粘附于纤维素支持物。

含有这些肽的纤维素膜与上述通过免疫亲和纯化的RA自身抗体共 同孵育。如(Kramer et al 1994)所述，应用传统免疫印迹技术进 行结合抗体的孵育和目测。

该实验显示，对肽IV和VII的反应性很强。这一点强烈提示，从 RA患者血清纯化的自身抗体可以识别异构化(βL型)的包绕Asn-315 残基的七氨基酸抗原决定簇。 实施例6：检测与Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly具有反应性 的自身抗体

研究罹患多发硬化的患者自身抗体是否能够识别髓鞘基底蛋白 (MBP)衍生性八肽Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly。

为达成这一目的，通过标准FMOC化学法人工合成了MBP衍生性八 肽Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly(γL型)。根据生产厂商的 使用说明，通过Bis-[sulfosuccinimidyl]suberate(BS3)，将该肽连 接于牛血清白蛋白(BSA)上，然后如实施例4所述，通过氯胺T方法 应用125I碘化该肽。

9名MS患者和8名健康人血清与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ- Gly-Lys-Gly-Arg-Gly反应过夜，然后通过蛋白A琼脂糖凝胶沉淀免 疫复合物。将血清样本在IMP缓冲液中以1∶200稀释。125I BSA- BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly示踪剂也在IMP缓冲液中 稀释(至活性为100000 CPM/25ul)。75ul稀释血清样本与25ul示 踪剂、及25ul IMP缓冲液或游离(未结合/未标记)Pro-Ser-Glu- γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly肽(溶解于IMP缓冲液中，浓度为10ug/ml) 混和。该混合物在4℃孵育过夜。称量20ul/样本试管的蛋白A琼脂 糖凝胶(PAS)，应用10ml IMP清洗缓冲液清洗3次，然后应用转发 移液枪将其转移到1.5ml Eppendorf管中。通过2000 RPM离心2分 钟沉淀PAS，应用吸移装置(或移液枪)吸取上清。抗体/抗原溶液孵 育过夜后，转移到PAS沉淀上，在摇动台上室温孵育3小时。2000 RPM 离心2分钟，沉淀PAS。应用750ul IMP清洗缓冲液清洗PAS沉淀5 次。每次清洗后，都吸取上清。最后，在milli-Q水中再悬PAS沉淀 至100ul悬液，转移到4ml聚丙烯试管中，应用γ计数器计数。根据 该方法进行实验，可以应用血清获得特异性信号。在分组基础上，MS 血清显示了较对照研究组血清样本更高的反应性(P＝0.0078，两尾非 参数t检验)，图9A。而且，通过添加“游离”的Pro-Ser-Glu-γ- Gly-Lys-Gly-Arg-Gly肽，可以特异性抑制125I-BSA-BS3-Pro-Ser- Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly结合体与人免疫球蛋白的结合。因此， 与对照血清相比，MS血清的免疫球蛋白结合抑制％显著为高 (P＝0.008，两尾非参数t检验)，图9C。因此，MS患者具有的抗体 可以针对含有异构化(γL)谷氨酸的MBP衍生性抗原决定簇。

结果如图9所示，其中3个小图如下：

图A，多发硬化患者(MS)和健康对照组(CO)血清中，人免疫球 蛋白与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly的结合 (没有添加游离肽作为拮抗剂)。

图B，多发硬化患者(MS)和健康对照组(CO)血清中，人免疫球 蛋白与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly的结合(添 加游离的Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly肽作为拮抗剂)。

图C，多发硬化患者(MS)和健康对照组(CO)血清中，人免疫球 蛋白与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly结合的 抑制百分比。

参考文献

1.Aanstoot HJ，Kang SM，Kim J，Lindsay LA，Roll U，Knip M，Atkinson M，Mose-Larsen P，Fey S，Ludvigsson J，Madsen O， & Baekkeskov S.J.Clin.Invest.(1996)June 15；97(12)； 2772-83鉴定并刻画糖基化胰岛细胞膜抗原glima 38的特征，该抗原 与GAD 65、IA2共同标志I型糖尿病中早期自身免疫应答

2.Abel LC，Kalil J，Cunha Neto E(1997)Braz.J.Med.Biol. Res.(1997)心肌肌球蛋白与克氏锥虫抗原B13之间的分子相似性： 鉴定B13驱动的能够识别心肌肌球蛋白的人T细胞克隆

3.Adelmann M，Wood J，Benzel I，Fiori P，Lassman H， Matthieu J-M，Gardinier MV，Dornmair K，Linnigton C(1995)髓 鞘少突细胞糖蛋白(MOG)的N末端功能区在Lewis大鼠中诱导实验性 急性脱髓鞘性自身免疫性脑脊髓炎。J.Neuroimmunol.63：17-27

4.Atassi MZ，Oshima M(1997)针对乙酰胆碱受体的自身免疫 应答：T、B细胞的协同作用以及通过合成肽的操作。Crit.Rev. Immunol.17(5-6)：481-495

5.Bach-Elias M，Bahia D，Teixeira DC，Cicarelli RM(1998) 在Chagas患者血清中存在针对小核核蛋白抗原决定簇的自身抗体。 Parasitol Res.84(10)：796-799

6.Beniac DR，Luckevich MD，Czarnota GJ，Tompkins TA， Ridsdale RA，Ottensmeyer FP，Moscarello MA，Harauz G (1997) 髓鞘基底蛋白的三维结构。I.通过随机定向单颗粒的有角重组进行重 建。J.Biol.Chem.272(7)：4261-4268

7.Benkirane N，Friede M，Guichard G，Briand J-P，Van Regenmorte MHV，Muller S.(1993)含有D氨基酸残基的改良合成 肽的抗原性和免疫原性。针对D对映体结构的抗体确实能够识别亲本L 型六肽，相反亦成立。J.Biol Chem 268：26279-26285

8.Bernstein RM(1990)综述：系统性红斑狼疮中的体液自身 免疫。J Royal Col.Phys.London.24：18-25

9.Bettadapura J，Menon KK，Moritz S，Liu J，Bernard CCA (1998)重组人髓鞘少突细胞糖蛋白的表达、纯化和致脑炎性。J Neurochem 70：1593-1599

10.Bakkeskov S，Nielson JH，Marner B，Bilde T，Ludvigsson J，Lernmark A(1982)新确诊糖尿病儿童的自身抗体可以与人胰岛 细胞蛋白发生免疫沉淀反应。Nature 298：167-169

11.Bakkeskov S，Aanstoot H-J，Christgau S，Reetz A， Solimena M，Cascalho M，Folli，F，Richter-Olesen H，and De-Camilli P(1990)在胰岛素依赖性糖尿病中鉴定作为GABA-合成 酶谷氨酸脱羧酶的64K自身抗原。Nature 347(6287)：151-156

12.Berrih-Aknin S.(1995)重症肌无力，一种器官特异性自 身免疫性疾病模型。J.Autoimmun 8(2)：139-143

13.Bonagura VR，Artandi SE，Davidson A，Randen I，Agostino N，Thompson K，Natvig J，Morrison SL(1993)绘图研究发现了 位于IgG上的能够被类风湿关节炎衍生性单克隆类风湿因子识别的独 特型抗原决定簇。J Immunol.151：3840-3852

14.Bonde M，Qvist P，Fledelius C，Riis BJ，C.Christiansen C.1994在备检尿液中定量I型胶原降解产物的免疫方法。Clin.Chem. 40，2022-2025

15.Bonifacio E，Lampasona V，Genovese S，Ferrari M，Bosi E，(1995)鉴定作为胰岛素依赖性糖尿病相关的37/40K自身抗原和胰 岛细胞自身抗体作用对象的蛋白质酪氨酸磷酸酶样IA2(胰岛细胞抗原 512)。J.Immunol.155(11)：5419-5426

16.Carson DA(1993).In：Kelley WN，Harris ED，Ruddy S， Sledge CB(Eds.).风湿学教科书；1：155-163，WB Saunders， London.

17.Chen KR，Shimizu S，Miyakawa S，Ishiko A，Shimizu H， Hashimoto T(1996)银屑病与IgG介导的不寻常表皮下大疱性皮肤 病共同存在：鉴定新型200-kDa低片状明星靶抗原。Br J Dermatol 134 (2)：340-346

18.Chen P，Fong S，Carson DA.(1987)类风湿因子。Rheum. Dis.Clin.North Am.13：575

19.Clarke S(1987)在细胞蛋白中天冬氨酰和天冬酰残基自发 形成琥珀酰亚胺的倾向性。Int.J.Peptide Protein Res.30： 808-821

20.Cooke A(1988)自身免疫的发病机理。Diabetic Med.5： 782-788

21.Dean BM，Becker F，McNally JM，Tarn AC，Schwartz G， Gale EA，Bottazzo GF(1986)在前糖尿病期的胰岛素自身抗体：与 胰岛细胞抗体和糖尿病发生的相互关系。Diabetologica 29：339-342

22.De Vries HE，Kuiper J，De Boer AG，Van Berkel TJC and Breimer DD，Pharmacological Reviews(1997)Vol.49，No.2，143

23.Dieterich W，Ehnis T，Bauer M，Donner P，Volta U， Riecken EO，Schuppan D(1997)鉴定作为乳糜泻自身抗原的组织转 谷氨酰胺酶。Nature Med.3(7)：797-801

24.Dieterich W，Laag E，Schopper H，Volta U，Ferguson A， Gillet H，Riecken EO，S chuppan D(1998)针对组织转谷氨酰胺 酶的自身抗体可以作为乳糜泻的预测因子。Gastroenterology 115 (6)：1317-1321

25.Fledelius C，Johnsen A，Cloos P，Bonde M，Qvist P.1997 尿C末端端肽降解产物的特征。鉴定I型胶原C末端α1链中天冬氨酰 残基的β异构化。J.Biol.Chem.272：9755-9763

26.Frank，R(1992)斑点合成：在膜支持物上能够定位的与化 学合成平行简易方法。Tetrahedron 48：9217-9232

27.Galletti P，Ingrosso D，Manna C，Clemente G，Zappia V.(1995)真核细胞中蛋白质损伤和甲基化介导的修复。Biochem J. 305：313-325

28.Geiger T，Clarke S(1987)肽中天冬酰和天冬氨酰残基的 脱酰胺、异构化和外消旋作用。J.Biol.Chem.262：785-794

29.Glant TT，et al.在糖蛋白诱导的关节炎中绘制软骨聚集 蛋白聚糖的致关节炎/自身免疫抗原决定簇。Scand J Rheumetol 1995： 24(Suppl.101)43-49

30.Goin JC，Leiros CP，Borda E，Serin-Borda L(1997)人 南美锥虫IgG与人心脏毒蕈碱乙酰胆碱受体第二个细胞外环之间的相 互作用：功能和病理学启示。FASEB J.11(1)：77-83

31.Gorsuch AN，Spencer KM，Lister J，McNally JM，Dean BM， Bottazo GF，Cudworth AH(1981)I型(胰岛素依赖性)糖尿病长 期前糖尿病期的证据。Lancet 2(8260-61)：1363-1365

32.Gottlieb SL，Gilleaudeau P，Johnson R，Estes L， Woodworth TG，Gottlieb AB，Krueger JG(1995)银屑病对淋巴细 胞选择性毒素(DAB289IL-2)的反应提示具有原发免疫但非角化细胞 的病理基础。Nat.Med.1(5)：442-447

33.Harris ED(1993)类风湿关节炎的病因学和发病机理。In： Kelley WN，Harris ED，Ruddy S，Sledge CB(Eds.).风湿学教科 书；1：833-873，WB Saunders，London.

34.Ichikawa M，Johns TG，Jiu J，Bernard CC(1996)Lewis 大鼠注射致脑炎性髓鞘少突细胞糖蛋白肽35-55，分析在多发硬化样疾 病的慢性/复发期纯粹B细胞特异性。J.Immunol.157：919-926

35.Inman RD，Day NK(1981)免疫复合物疾病的免疫和临床特 征。Am.J.Med.70：1097

36.Janeway CA Jr.Travers P，Hunt S，“Immuno Biology” (1997)3rd ed.Current Biology Ltd.(London)pp 226-235

37.Johnson PM，Page Faulk W(1976)类风湿因子：在类风湿 关节炎中的性质、特异性和产生。Clin.Immun.Immunopath.6： 414-430

38.Johnson PM，Watkins J，Scopes PM，Tracey BM(1974)健 康人和类风湿患者中血清IgG的结构差异。Ann.Rheum Dis.33：366

39.Johnson PM，Watkins J，Holbrow EJ(1975)在类风湿关 节炎中针对变化了的IgG产生的抗球蛋白。The Lancet，1(7907)： 611-613

40.Johnson T，Valdimarsson H(1993)检测同型类风湿因子 有临床用途吗？Ann.Rheum.Diseases 52：161-164

41.Kalsi J，Isenberg D(1993)类风湿因子：在RA发病机理 中是原发事件还是继发事件？Int.Arch.Allergy Immunol.102： 209-215

42.Kerlero de Rosbo N，Milo R，Lees MB，Burger D，Bernard CCA，Ben-Nun A(1993)在多发硬化中对髓鞘抗原的反应性。外周血 淋巴细胞主要针对髓鞘少突细胞糖蛋白发生反应。J.Clin.Invest. 92：2602-2608

43.Kerlero de Rosbo N，Ben-Nun A(1998)在多发硬化中对 髓鞘抗原的T细胞应答：与主要针对髓鞘少突细胞糖蛋白的自身免疫 反应的相关性。J Autoimmun.11：287-299

44.Kramer A，Schus ter A，Reineke U，Malin R，Volkmer- Engert R，Landgraf C and Schneider-Mergener J(1994)纤维素 结合肽组合文库：鉴定能够与预先定义的特异性配体结合的肽的筛选 工具。Comp.Meth.Enzymol.6：388-395

45.LiQ，Borovitskaya AE，DeSilva MG，Wasserfall C， MacLaren NK，Notkins AL，Lan MS(1997)胰岛素依赖性糖尿病的 自身抗原：人IA-2β的分子克隆和性质。Proc.Assoc.Am Physicians 109 (4)L 420-439

46.Linington C，Webb M，Woodhams P(1984)在Lewis大鼠 体内介导实验性过敏性神经炎的永久性鼠T细胞系。J.Neuroimmunol. 6：387-396

47.Linington C，Berger T，Perry L，Weerth S，Hinze-Selch D，Zhang Y，Lu H-C，Lassmann H，Werkele H.(1993)针对髓鞘 少突细胞糖蛋白的特异性T细胞可以在中枢神经系统介导不寻常的自 身免疫性炎症反应。Eur.J.Immunol.23：1364-1372

48.Lu J，Li Q，Xie H，Chen ZJ，Borovitskaya AE，Maclaren NK，Notkins AL，Lan MS(1996)鉴定作为胰岛素依赖性糖尿病自身 抗原的第二个跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶IA-2β：37-kDa胰蛋白酶片段前 体。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(6)：2307-2311

49.Lukash AI，Pushkina NV，Tibulsky IE.“血清白蛋白脱 氨基后的自身抗原特性”Immunologiya 68：1987

50.Martin R(1997)实验性过敏性脑脊髓炎和多发硬化的免疫 学特征及其在新治疗策略方面的应用。J.Neural Transm.49：53- 67

51.Mor A，Amiche M，Nicolas P(1992)进入翻译后修饰的新 领域：基因编码肽中的D氨基酸。Elsevier Science Publishers(UK) Dec.1992 481-485

52.Munthe E and Natvig JB(1972)在类风湿血浆细胞中类风 湿因子IgG的补体固定细胞内复合物。Scand.J.Immunol.1：217

53.Murrey DE Jr. & Clarke S，Jnl of Biological Chemistry (1984)Vol.259，No.17，Sept.10 pp 10722-10732“在异构化 L-天冬氨酰残基上检测新的甲基化位点”

54.Nardella FA，Teller DC，Mannik M(1981)在自体相关 性IgG类风湿因子中研究抗原决定物质。J.Exp.Med.154：112-125

55.Natvig JB，Munthe E(1975)自体相关性IgG类风湿因子 代表血浆细胞在类风湿炎症组织中的主要反应。Ann.NY Acad.Sci. 156：88-95

56.Nauert JB，Klauck TM，Langenberg LK，Scott JD(1997) 重症肌无力患者血清识别的自身抗原gravin是一种激酶脚手架蛋 白。Curr.Biol.7(1)：52-62

57.Nepom GT(1990)HLA相关性疾病中的MHC基因。Curr. Opinion in Immunology 2：588-592

58.Noritake DT，Colburn KK，Chan G，Weisbart RH(1990) 急性类风湿关节炎特异性类风湿因子。Annals of the Rheumatic Diseases 49：910-915

59.Okamoto Y，Abe T，Niwa T，Mizuhashi S，Nishida M(1998) 研发同时检测鼠1型辅助T细胞和2型辅助T细胞的双色酶联免疫斑 点法。Immunopharmacology 39：107-116

60.Palmer JP，Asplin CM，Clemens P，Lyen K，Tatpati O， Raghu PK，Paquette TL(1983)在胰岛素治疗前胰岛素依赖性糖尿 病的胰岛素抗体。Science 222：1337-1339

61.Parekh RB，Dwek RA，Sut ton BJ，Fernandes DL，Leung A， Stanworth D，Rademacher TW，Mizuochi T，Taniguchi T，Matsuta K(1985)类风湿关节炎和原发骨关节炎与总血清IgG糖基化模式改变 的相关性。Nature 316：452-457

62.Parekh RB，I senberg DA，Ansell BM，Roitt IM，Dwek RA， Rademacher TW(1988)IgG相关性寡糖的半乳糖苷化在成年和青少年 类风湿关节炎中降低，并与疾病活动性相关。Lancet 1：966-999

63.Pilkington C，Yeung E，Isenberg D，Lefvert AK，Rook GAW(1995)在类风湿关节炎、结核、系统性红斑狼疮和重症肌无力中 的特异性半乳糖IgG和抗体。Autoimmunity.22：107-111

64.Rawson AJ，Hollander JL，Quismorio FP，Abelson NM(1969) Ann.N.Y.Aca d.Sci.168：188

65.Ronnelid J，Klareskog L.(1997)ELISPOT法检测细胞因 子生成细胞的比较：应用ELISA平板较硝酸纤维素膜更敏感，特异性 更高。J Immunol.Meth.200：17-26

66.Schon MP，Detmar M，Parker CM(1997)初生CD4+T细 胞诱导的鼠银屑病样紊乱。Nat.Med.3(2)：183-188

67.Sela MS，Fuchs(1964)电荷和光学构型在抗原性方面的作 用。Sec.Chem.Immunol.Pp 43-56

68.Sela M，Zisman E(1997)在免疫现象中D氨基酸的不同作 用。Dept.of Immunol.Rehovot pp 449-456

69.Sun J，Link H，Olsson T，Xiao BG，Andersson G，Ekre HP，Linington C，Diener P(1991)J.Immunol.146：1490-1495

70.Svasti J and Milstein C(1972)鼠κ轻链的完全氨基酸序 列。Biochem.J.128：427-444

71.Todome Y，Ohkuni H，Mizuse M，Furuya M，Fujikawa S， Tanaka S，Watanabe N，Fujii K，Zabriskie J(1992)在风湿性 疾病中检测针对链球菌肽聚糖和肽亚单位(合成四-D-丙酰基-牛血清 白蛋白复合物)的抗体。Int.Arch Allergy Immunol 1992：301-307

72.Tomana M，Schrohenloher RE，Koopman WJ，Alarcon GS and Paul WA(1988)慢性炎症性疾病患者血清IgG的异常糖基化。 Arthritis and Rheumatism.31：333-338

73.Tomiyama T，Asano S，Furiya Y，Shirasawa T，Endo N， and Morritt，Jnl of Biological Chemistry(1994)Vol.289，No. 14，April 9，pp 10205-10208“Asp23残基的外消旋对阿尔茨海默 病中β淀粉样蛋白类似物沉积特性的影响”

74.Van Noort JM，van Sechel AC，van Stipdonk MJB， Bajaramovic JJ(1998)“小型热休克蛋白αβ-晶状体球蛋白作为多 发硬化的关键自身抗原”In“Progress in brain research”Vol 117 (eds：Van Leuwen FW，Salehi，Giger RJ，Holtmaat AJGD， Verhaagen J)Elsevier Science，Amsterdam

75.Watkins J，Turner MW，Roberts A(1972) In：Peeters H (ed.)Protides of the Biological Fluids，19th Colloquium， Oxford：468

76.Weir，D(ed.)(1996).实验免疫性手册，vol 1.，5th edn. Blackwell Scientific Publication，Oxford

77.Williams RC(1996)类风湿关节炎发病机理中涉及的自身 免疫机制。Adv.Dent.Res.10：47-51

78.Winchester RJ(1975)类风湿关节炎患者IgG复合物的特 征。Ann.NY Acad.Sci.256：73-81

79.Yoshikawa H，Lambert EH，Walser-Kuntz DR，Yasukawa Y， McCormick DJ，Lennon VA(1997)乙酰胆碱受体的17-Mer自体肽可 以与B细胞MHC II类抗原结合，激活辅助T细胞，刺激自身抗体的产 生和重症肌无力电生理征象的出现。J.Immunol.159(3)：1570-1577

80.Zhang Y，Guerassimov A，Leroux JY，Cartman A，Webber C，Lalic R，de Miguel E，Rosenberg G，Poole AR，1998.软骨 连接蛋白在Balb C小鼠中诱导关节炎：涉及T、B淋巴细胞识别的特 异区。Am.J.Pathol.153：1283-1291

81.Zisman E，Kztz-Levy Y，Dayan M，Kirshner SL，Paas- Rozner M，Karni A，Abramsky O，Brautbar C，Fridkin M，Sela M， Mozes E.(1996)人乙酰胆碱受体α亚单位致病抗原决定簇的肽类似 物可以作为重症肌无力的潜在介导剂。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(9)：4492-4497