蛋白质表达构建体及其方法
阅读：798发布：2020-05-13
专利汇可以提供蛋白质表达构建体及其方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通过使用包含前肽的表达构建体来在重组乳酸细菌中表达融合蛋白。所述前肽的优选实施方案包括DTNSDIAKQD、DTTTDIAKQE和DTSADIANQE，其在pH 7下具有-2至-3的净负电荷。进一步地，本专题 说明书 公开了编码脯 氨 酰内肽酶与所述前肽的融合蛋白的表达构建体，以及包含这样的表达构建体的重组乳酸细菌。所述重组乳酸细菌和融合蛋白可以在肠道 疾病 例如 乳糜泻 的 治疗 中使用。，下面是蛋白质表达构建体及其方法专利的具体信息内容。
1.编码融合蛋白的表达构建体，其中所述构建体包含
a)编码通式(I)的肽的第一核酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:1)
其中X1、X5和X10中的每一个为带负电荷的氨基酸或其功能变体，
其中X2、X3、X4、X6、X7和X9中的每一个为极性或非极性氨基酸或其功能变体，其中X8为带正电荷的或极性的氨基酸或其功能变体；
和
b)编码用于表达的蛋白质的第二核酸序列；
其中所述第一核酸序列与所述第二核酸序列邻接，从而使得由所述第一核酸序列编码的肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质形成融合蛋白；
其中相比于当由所述第一核酸序列编码的肽不存在时而言，由所述第一核酸序列编码的肽改善由所述第二核酸序列编码的蛋白质的表达。
2.根据权利要求1所述的表达构建体，其中：
i)X1和X5中的每一个为天冬氨酸或其功能变体，
ii)X2为苏氨酸或其功能变体，
iii)X3选自由天冬酰胺、苏氨酸和丝氨酸组成的组，或者为其功能变体，iv)X4选自由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸组成的组，或者为其功能变体，
v)X6为异亮氨酸或其功能变体，
vi)X7为丙氨酸或其功能变体，
vii)X8选自由赖氨酸和天冬酰胺组成的组，或者为其功能变体，
viii)X9为谷氨酰胺或其功能变体，并且
ix)X10选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组，或者为其功能变体。
3.根据权利要求1所述的表达构建体，其中，由所述第一核酸序列编码的肽具有通式(Ia)：
D-T-X3-X4-D-I-A-X8-Q-X10(SEQ ID NO:25)
其中：
i)X3选自由天冬酰胺、苏氨酸和丝氨酸组成的组，或者为其功能变体，
ii)X4选自由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸组成的组，或者为其功能变体，
iii)X8选自由赖氨酸和天冬酰胺组成的组，或者为其功能变体，并且
iv)X10选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组，或者为其功能变体。
4.根据权利要求1所述的表达构建体，其中由所述第一核酸序列编码的肽与从由下列各项组成的组中选择的序列至少60％同一：
a)DTNSDIAKQD(SEQ ID NO:26)；
b)DTTTDIAKQE(SEQ ID NO:27)；和
c)DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。
5.根据权利要求1所述的表达构建体，其中由所述第一核酸序列编码的肽在pH 7下具有-2至-3的净负电荷。
6.根据权利要求1所述的表达构建体，其中由所述第二核酸序列编码的蛋白质为脯氨酰内肽酶(PEP)或硫氧还蛋白。
7.根据权利要求6所述的表达构建体，其中所述脯氨酰内肽酶(PEP)选自由下列各项组成的组：黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)脯氨酰内肽酶、脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)脯氨酰内肽酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脯氨酰内肽酶和荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulate)脯氨酰内肽酶。
8.根据权利要求1所述的表达构建体，其中由所述第一核酸序列编码的肽位于信号肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质之间。
9.包含根据权利要求1-8中任一项所述的表达构建体的重组乳酸细菌。
10.根据权利要求9所述的重组乳酸细菌，其中所述乳酸细菌的属选自由下列各项组成的组：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、气球菌属(Aerococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、魏斯氏菌属(Weisella)、差异球菌属(Alloiococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、狡诈球菌属(Dolosigranulum)、球链菌属(Globicatella)、四联球菌属(Tetragenococcus)和漫游球菌属(Vagococcus)。
11.根据权利要求10所述的重组乳酸细菌，其中所述乳酸细菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)。
12.在乳酸细菌中表达蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤：培养根据权利要求9-11中任一项所述的重组乳酸细菌，和分离由所述细菌表达的蛋白质。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的重组乳酸细菌或者通过根据权利要求12所述的方法而表达出的蛋白质，其用于用作药物。
14.治疗肠道疾病的方法，所述方法包括下述步骤：将根据权利要求9-11中任一项所述的重组乳酸细菌或者通过根据权利要求12所述的方法而表达出的蛋白质施用给有此需要的患者。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述肠道疾病为乳糜泻。
16.根据权利要求9-11中任一项所述的重组乳酸细菌或者通过根据权利要求12所述的方法而表达出的蛋白质，其用于在治疗肠道疾病中使用。
17.根据权利要求16所述的重组乳酸细菌或者蛋白质，其中所述肠道疾病为乳糜泻。
18.根据权利要求9-11中任一项所述的重组乳酸细菌或者通过根据权利要求12所述的方法而表达出的蛋白质在制备用于治疗肠道疾病的药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述肠道疾病为乳糜泻。
蛋白质表达构建体及其方法
发明领域
[0001] 本发明总体上涉及微生物学和分子生物学领域。本文提供了用于产生重组蛋白质的表达构建体。本专题说明书公开了用于在乳酸细菌中产生脯氨酰内肽酶蛋白的表达构建体，和包括使用这样的脯氨酰内肽酶的治疗方法。
[0002] 发明背景
[0003] 在说明书的末尾处按字母顺序收集了在本说明书中作者所提及的出版物的参考文献目录细节。
[0004] 在本说明书中对于任何在先出版物(或源自其的信息)或者任何已知事项的提及不是也不应被视为承认或认可或以任何形式暗示：所述在先出版物(或源自其的信息)或者已知事项构成本说明书所涉及的努力领域中的公知常识的一部分。
[0005] 乳糜泻是由于对食物中的麸质(gluten)(在小麦、黑麦、大麦和燕麦中发现的蛋白质)不耐受而引起的小肠的炎症性自身免疫病症。典型地，衬在肠内的微小的指状突起发炎并变平，这导致绒毛萎缩。所述疾病的症状包括胃肠道问题例如慢性腹泻、吸收不良或食欲不振。
[0006] 乳糜泻的传统治疗主要在于饮食限制，但是即使痕量的麸质污染物也可以是免疫原性的，并且随着时间推移导致有害的后果。来自开发使用食品级脯氨酰内肽酶(PEP)来分解麸质污染物的用于乳糜泻的口服疗法的结果是有希望的。还有正在进行的用于开发使用粘膜酶载体将消化酶递送给患者的非膳食替代物的研究。
[0007] 乳酸细菌(LAB)由于其通常被认为安全(Generally Regarded as Safe，GRAS)的状态而是有希望的用于异源蛋白质产生的食品级生物家族。传统上，LAB在食品中用作用于发酵的起子培养物和用作益生菌。LAB与宿主相互作用的研究也直接将LAB与肠道的细胞活性(例如，病原体控制、免疫刺激和维持健康的微生物区系)联系起来。与它们在食品发酵中的传统作用、有益的肠道特性以及对于严苛的肠道条件的抵抗力相结合地，另外的相比于传统的重负荷机器(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))而言的优势(例如，LAB分泌重组蛋白质而同时具有较少的蛋白酶的能力)已经使得它们成为用作重组细胞工厂和用于将治疗性分子递送至肠道的活载体的有吸引力的靶标。
[0008] 发明概述
[0009] 本说明书公开了用于在乳酸细菌中产生蛋白质的表达构建体。在一个方面，本发明提供了用于在乳酸细菌中有效表达重组蛋白质的工具。在另一个方面，本发明提供了更好的用于将消化酶递送给患者以治疗乳糜泻的手段。本文提供了编码融合蛋白的表达构建体，其中所述构建体包含，a)编码通式(I)的肽的第一核酸序列：
[0010] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:1)
[0011] 其中X1、X5和X10中的每一个为带负电荷的氨基酸或其功能变体，其中X2、X3、X4、X6、X7和X9中的每一个为极性或非极性氨基酸或其功能变体，其中X8为带正电荷的或极性的氨基酸或其功能变体；和b)编码用于表达的蛋白质的第二核酸序列；其中所述第一核酸序列与所述第二核酸序列邻接，从而使得由所述第一核酸序列编码的肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质形成融合蛋白；其中相比于当由所述第一核酸序列编码的肽不存在时而言，由所述第一核酸序列编码的肽改善由所述第二核酸序列编码的蛋白质的表达。
[0012] 本文提供了在乳酸细菌中表达蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤：培养在本文中所定义的重组乳酸细菌，和分离由所述细菌表达的蛋白质。
[0013] 本文提供了包含在本文中所定义的表达构建体的重组乳酸细菌。
[0014] 本文提供了治疗肠道疾病的方法，所述方法包括下述步骤：将在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质施用给有此需要的患者。
[0015] 本文提供了在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质，其用于在治疗肠道疾病中使用。
[0016] 本文提供了在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质在制备用于治疗肠道疾病的药物中的用途。
[0017] 在一个实施方案中，所述肠道疾病为乳糜泻。
[0019] 图1：从经测序的乳球菌属(Lactococcus)基因组装配物中挖掘前肽。图1(a)显示了天然乳球菌属细菌蛋白质与USP45-LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)序列的比对的示意图。图1(b)显示了三种前肽(PP1-PP3)和阳性对照LEISSTCDA(PC)前肽的等电点和净电荷的示意图。
[0020] 图2：在NZ9000中TRX的分泌。图2(a)显示了用于分泌型TRX的表达构建体的示意图，USP：USP45；PP：前肽；Linker：具有TEV切割位点的柔性连接体；His6：His标签；Term：终止子。图2(b)显示了关于仅pNZ8148载体、USP45-TRX、USP45-PP1-TRX、USP45-PP2-TRX、USP45-PP3-TRX、USP45-PC-TRX的生长曲线的图示。图2(c)显示了细胞裂解物级分(C)与分泌型级分(S)的比较的照片图示(在该图下方给出％产量和效率)。这些是基于条带的光密度测定法测量来计算的。
[0021] 图3：在NZ9000中TRX的分泌。图3(a)显示了用于分泌型TRX的表达构建体的示意图，USP：USP45；PP：前肽；Linker：具有TEV切割位点的柔性连接体；His6：His标签；Term：终止子。图3(b)显示了关于仅pNZ8148载体、USP45-TRX、USP45-PP1-TRX、USP45-PP2-TRX、USP45-PP3-TRX、USP45-PC-TRX的生长曲线的图示。通过箭头指明了诱导。图3(c)显示了细胞裂解物级分(C)和分泌型级分(S)的代表性Western印迹的照片图示。将细胞裂解物级分和分泌型级分分别浓缩3倍和25倍，并且将各自2μL加载到凝胶上。在细胞裂解物级分中观察到的最低保留条带为非特异性结合的人为产物(图6)。在下面给出了各种TRX构建体的％蛋白质产量(相关于USP45-TRX)和分泌效率。这些是基于光密度测定法和技术三次重复来计算的。
[0022] 图4：在NZ9000中Fm PEP的分泌。图4(a)显示了用于分泌型FmPEP的表达构建体的示意图，USP：USP45；PP：前肽；His6：His标签；Term：终止子。图4(b)显示了关于仅pNZ8148载体、USP45-FmPEP、USP45-PP1-FmPEP、USP45-PP2-FmPEP、USP45-PP3-FmPEP、USP45-PC-FmPEP的生长曲线的图示。图4(c)显示了培养基级分的比较的照片图示。载体是指空的pNZ8148载体的表达。图4(d)显示了细胞裂解物中可溶(S)和不可溶(IS)级分的比较的照片图示。载体是指空的pNZ8148载体的表达。图4(e)显示了各种构建体的相关于USP45-FmPEP的％分泌产量和分泌效率的图示。分泌蛋白产量是基于光密度测定法来计算的。酶活性是基于Z-gly-pro-4-硝基苯胺测定法来计算的。对于这些实验进行生物学三次重复。
[0023] 图5：在NZ9000中Fm PEP的分泌。图5(a)显示了用于分泌型Fm PEP的表达构建体的示意图，USP：USP45；PP：前肽；His6：His标签；Term：终止子。图5(b)显示了关于仅pNZ8148载体、USP45-FmPEP、USP45-PP1-FmPEP、USP45-PP2-FmPEP、USP45-PP3-FmPEP、USP45-PC-FmPEP的生长曲线的图示。通过红色箭头指明了诱导。图5(c)显示了在代表性Western印迹上培养基级分的比较的照片图示。载体是指空的pNZ8148载体的表达。图5(d)显示了细胞裂解物中可溶(S)和不可溶(IS)级分的代表性Western印迹的照片图示。载体是指空的pNZ8148载体的表达。将细胞裂解物级分和分泌型级分分别浓缩3倍和25倍，并且将各自2μL加载到凝胶上。图5(e)显示了各种构建物的相关于USP45-Fm PEP的％分泌产量和分泌效率的图示。分泌蛋白产量是基于光密度测定法来计算的。酶活性是基于Z-gly-pro-4-硝基苯胺测定法来计算的。对于这些实验进行生物学和技术三次重复，在*p<0.05、**p<0.01时是显著的。结果概括在表1中。
[0024] 图6：TRX分泌。图6显示了关于包含载体*(仅空的pNZ8148)、有TRX而无USP45SP的构建体和USP45SP-TRX构建体的NZ9000菌株的细胞裂解物级分(C)和分泌型级分(S)的照片图示。
[0025] 图7为关于仅pNZ8148载体、USP45-FmPEP、USP45-PP1-FmPEP、USP45-PP2-FmPEP、USP45-PP3-FmPEP、USP45-PC-FmPEP的代表性的一组细胞内级分的酶活性的图示。随时间(秒)在410nm下测量通过Z-gly-pro-4-硝基苯胺的裂解而引起的对硝基苯胺的释放。
[0026] 发明详述
[0027] 在整个说明书中，除非上下文另作要求，否则词语“包含”或者变化形式例如“包括”或“含有”将被理解为暗示包括所陈述的要素或整数或方法步骤或者要素或整数或方法步骤的组，但不排除任何其他要素或整数或方法步骤或者要素或整数或方法步骤的组。
[0028] 如在本专题说明书中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数方面，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“方法”包括单种方法，以及两种或更多种方法；提及“试剂”包括一种试剂，以及两种或更多种试剂；提及“公开内容”包括由所述公开内容所教导的单个和多个方面；等等。在本文中所教导和使得能够实现的方面由术语“本发明”所包括。在本文中所考虑的任何变体和衍生物由本发明的“形式”所包括。
[0029] 在整个申请中使用下列缩写：GRAS＝通常被认为安全；SP＝信号肽；PC＝阳性对照；TRX＝硫氧还蛋白；Fm PEP＝脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)脯氨酰内肽酶；和Mx PEP＝黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)脯氨酰内肽酶。
[0030] 本说明书公开了用于在乳酸细菌中产生蛋白质的表达构建体。本文提供了编码融合蛋白的表达构建体，其中所述构建体包含a)编码通式(I)的肽的第一核酸序列：
[0031] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:1)。
[0032] 术语“表达构建体”可以是指这样的核酸分子，其包含所希望的编码序列和对于在特定宿主细胞中表达经可操作地连接的编码序列(例如，编码产物的插入片段序列)来说必需的合适的核酸序列。对于在原核生物中进行表达来说必需的核酸序列通常包括启动子和核糖体结合位点，其常常与其他序列一起。在一个实例中，所述表达构建体适合于在乳酸细菌中进行表达。
[0033] 术语“编码”包括指在转录和/或翻译意义上与其他核苷酸或氨基酸相应的核苷酸和/或氨基酸。
[0034] 术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且是指任何通过肽键或经修饰的肽键相连接的氨基酸的聚合物(二肽或更大)。少于大约10-20个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。本发明的多肽可以包含非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽取代基可以由其中产生所述多肽的细胞添加至多肽，并且将会随着细胞类型而变化。在本文中按照其氨基酸主链结构来定义多肽；取代基例如碳水化合物基团通常没有具体规定，但是仍然可以存在。
[0035] 术语“核酸”包括以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且包括已知的以与天然出现的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似物，除非另有限制。术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，除非上下文另有指明。
[0036] 术语“非极性氨基酸”、“极性氨基酸”、“疏水性氨基酸”、“带正电荷的氨基酸”、“带负电荷的氨基酸”均与现有技术术语相一致地进行使用。这些术语中的每一个是在本领域中众所周知的，并且已经在许多出版物(包括标准生物化学教科书)中被广泛地描述，其描述了导致它们被定义为极性、非极性或酸性的氨基酸的特性。
[0037] 一般而言，非极性氨基酸可以是指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸。非极性氨基酸还可以包括芳族非极性氨基酸，例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。中性极性氨基酸可以是指丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和甲硫氨酸。带负电荷的氨基酸可以是指天冬氨酸和谷氨酸。带正电荷的氨基酸可以是指赖氨酸、组氨酸或精氨酸。
[0038] 在一个实例中，X1、X5和X10中的每一个为带负电荷的氨基酸或其功能变体。
[0039] 在一个实例中，X2、X3、X4、X6、X7和X9中的每一个为极性或非极性氨基酸或其功能变体。
[0040] 在一个实例中，X8为带正电荷的或极性的氨基酸或其功能变体。
[0041] 术语“功能变体”可以是指本领域技术人员已知的氨基酸的天然或化学合成的衍生物或类似物。氨基酸的“功能变体”可以具有一个或多个对于其侧链部分的修饰或变化。例如，D-或L-氨基酸的侧链部分可以已被修饰成包括直链或支化的、环状或非环状的、经取代或未取代的、饱和或不饱和的烷基、芳基或芳烷基部分。D-或L-氨基酸的侧链可以已被修饰成包括反应性官能团(例如，叠氮基或炔基)。术语“功能变体”还可以包括但不限于，通过添加一个或多个糖/碳水化合物部分、寡糖或脂质基团进行修饰的氨基酸。可以通过本领域中已知的技术来将“功能变体”在体内掺入到重组蛋白质中。例如，可以在细菌中通过选择性压力掺入来将氨基酸的“功能变体”掺入到重组蛋白质中。正交氨酰基-tRNA合成酶和tRNA也可以用于响应于在表达构建体上的密码子而在细菌中将氨基酸的“功能变体”直接掺入到重组蛋白质中。
[0042] 所述构建体可以包含b)编码用于表达的蛋白质的第二核酸序列。
[0043] 所述第一核酸序列可以与所述第二核酸序列邻接，从而使得由所述第一核酸序列编码的肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质形成融合蛋白。
[0044] 术语“融合蛋白”是指至少两个共价键合的多肽分子的嵌合体。
[0045] 术语“邻接”是指两个彼此相邻的核酸。所述两个核酸分子可以在允许“融合蛋白”形成的同一个阅读框中。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽位于由所述第二核酸序列编码的蛋白质的N-末端。
[0046] 在一个实例中，相比于当由所述第一核酸序列编码的肽不存在时而言，由所述第一核酸序列编码的肽改善由所述第二核酸序列编码的蛋白质的表达。在一个实例中，表达的改善是在由所述细菌产生的蛋白质的总产量方面。在一个实例中，表达的改善是在所述细菌的体积蛋白质产量方面。在一个实例中，表达的改善是在所述细菌的比蛋白质产量方面。在一个实例中，表达的改善是在所产生的具有酶促活性的蛋白质的量方面。在另一个实例中，表达的改善是在所述细菌的分泌效率方面。
[0047] 由所述第一核酸编码的肽可以被修饰以具有插入、缺失或置换(保守的或非保守的)，条件是这样的改变允许经修饰的肽保留原始肽的活性(即改善由所述第二核酸编码的蛋白质的表达)。这些类型的改变中的每一种可以在给定的序列中单独地或与其他类型相组合地出现一次或多次。例如，可以通过使用蛋白质工程和位点定向诱变的方法来造成这样的改变。“保守”改变是其中所置换的氨基酸具有相似的结构或化学特性。“非保守”改变是其中所置换的氨基酸在结构上或在化学上是不同的。
[0048] 在一个实例中，提供了编码融合蛋白的表达构建体，其中所述构建体包含，a)编码通式(I)的肽的第一核酸序列：
[0049] X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:1)
[0050] 其中X1、X5和X10中的每一个为带负电荷的氨基酸或其功能变体，其中X1、X5和X10中的每一个为带负电荷的氨基酸或其功能变体，其中X2、X3、X4、X6、X7和X9中的每一个为极性或非极性氨基酸或其功能变体，其中X8为带正电荷的或极性的氨基酸或其功能变体；和b)编码用于表达的蛋白质的第二核酸序列；其中所述第一核酸序列与所述第二核酸序列邻接，从而使得由所述第一核酸序列编码的肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质形成融合蛋白；其中相比于当由所述第一核酸序列编码的肽不存在时而言，由所述第一核酸序列编码的肽改善由所述第二核酸序列编码的蛋白质的表达。
[0051] 在一个实例中，X1和X5中的每一个为天冬氨酸或其功能变体。在一个实例中，X2为苏氨酸或其功能变体。在一个实例中，X3选自由天冬酰胺、苏氨酸和丝氨酸组成的组，或者为其功能变体。在一个实例中，X4选自由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸组成的组，或者为其功能变体。在一个实例中，X6为异亮氨酸或其功能变体。在一个实例中，X7为丙氨酸或其功能变体。在一个实例中，X8选自由赖氨酸和天冬酰胺组成的组，或者为其功能变体。在一个实例中，X9为谷氨酰胺或其功能变体。在一个实例中，X10选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组，或者为其功能变体。
[0052] 在一个实例中，X1任选地存在或不存在。在另一个实例中，X10任选地存在或不存在。
[0053] 由所述第一核酸序列编码的肽可以具有下述通式：D-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:3)、X1-T-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:4)、X1-X2-X3-X4-D-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:5)、X1-X2-X3-X4-X5-I-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:6)、X1-X2-X3-X4-X5-X6-A-X8-X9-X10(SEQ ID NO:7)或X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X10(SEQ ID NO:8)。
[0054] 由所述第一核酸序列编码的肽可以具有下述通式：D-T-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:9)、D-X2-X3-X4-D-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:10)、D-X2-X3-X4-X5-I-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:11)、D-X2-X3-X4-X5-X6-A-X8-X9-X10(SEQ ID NO:12)、D-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X10(SEQ ID NO:13)、X1-T-X3-X4-D-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:14)、X1-T-X3-X4-X5-I-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:15)、X1-T-X3-X4-X5-X6-A-X8-X9-X10(SEQ ID NO:16)、X1-T-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Q-X10(SEQ ID NO:17)、X1-X2-X3-X4-D-I-X7-X8-X9-X10(SEQ ID No:18)、X1-X2-X3-X4-D-X6-A-X8-X9-X10(SEQ ID NO:19)、X1-X2-X3-X4-D-X6-X7-X8-Q-X10(SEQ ID NO:20)、X1-X2-X3-X4-X5-I-A-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)、X1-X2-X3-X4-X5-I-X7-X8-Q-X10(SEQ ID NO:22)和X1-X2-X3-X4-X5-X6-A-X8-Q-X10(SEQ ID NO:23)。
[0055] 在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为D-T-X3-X4-D-I-A-X8-Q-X10(SEQ ID NO:24)。X3和X4各自可以为极性或非极性氨基酸或其功能变体。X8可以为带正电荷的或极性的氨基酸或其功能变体。X10可以为带负电荷的氨基酸或其功能变体。
[0056] 在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽具有通式(Ia)：D-T-X3-X4-D-I-A-X8-Q-X10(SEQ ID NO:25)。
[0057] 在一个实例中，X3选自由天冬酰胺、苏氨酸和丝氨酸组成的组，或者为其功能变体。在一个实例中，X4选自由丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸组成的组，或者为其功能变体。在一个实例中，X8选自由赖氨酸和天冬酰胺组成的组，或者为其功能变体。在一个实例中，X10选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组，或者为其功能变体。
[0058] 由所述第一核酸序列编码的肽可以与从由下列各项组成的组中选择的序列至少60％、70％、80％或90％同一：a)DTNSDIAKQD(SEQ ID NO:26)；b)DTTTDIAKQE(SEQ ID NO:
27)；和c)DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽与从由下列各项组成的组中选择的序列至少90％同一：a)DTNSDIAKQD(SEQ ID NO:26)；b)DTTTDIAKQE(SEQ ID NO:27)；和c)DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为DTNSDIAKQD(SEQ ID NO:26)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为DTTTDIAKQE(SEQ ID NO:27)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。
27)；和c)DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽与从由下列各项组成的组中选择的序列至少90％同一：a)DTNSDIAKQD(SEQ ID NO:26)；b)DTTTDIAKQE(SEQ ID NO:27)；和c)DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为DTNSDIAKQD(SEQ ID NO:26)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为DTTTDIAKQE(SEQ ID NO:27)。在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽为DTSADIANQE(SEQ ID NO:28)。
[0059] 在本文中所使用的术语“序列同一性”是指在比较窗口中在逐个氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过下述方式来进行计算：在比较窗口中比较两个经最佳比对的序列，确定在其之处在这两个序列中出现相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以在比较窗口中的位置的总数目(即窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。比对氨基酸序列的方法是本领域中众所周知的。例如，生物信息学或计算机程序和比对算法例如ClusterW可以用于确定两个氨基酸序列之间的“％同一性”。
[0060] 在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽在pH 7下具有-2至-3的净负电荷。
[0061] 由所述第二核酸序列编码的蛋白质可以为脯氨酰内肽酶(PEP)或硫氧还蛋白。
[0062] 在一个实例中，其中所述脯氨酰内肽酶(PEP)选自由下列各项组成的组：黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)脯氨酰内肽酶、脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)脯氨酰内肽酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脯氨酰内肽酶和荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulate)脯氨酰内肽酶。
[0063] 在一个实例中，由所述第一核酸序列编码的肽位于信号肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质之间。所述信号肽典型地位于所述融合蛋白的N-末端处。在一个实例中，所述信号肽位于由所述第一核酸编码的肽的N-末端处，而由所述第一核酸序列编码的肽位于由所述第二核酸编码的蛋白质的N-末端处。在一个实例中，所述信号肽为USP45信号肽。在一个实例中，所述信号肽在分泌时被从所述融合蛋白上切割掉，而由所述第一核酸序列编码的肽和由所述第二核酸序列编码的蛋白质在分泌后仍保持为融合蛋白。
[0064] 术语“信号序列”或“信号肽”是指短的(长度为大约5至大约60个氨基酸)肽，其指导蛋白质从胞质溶胶到某些细胞器(例如，细胞核、线粒体基质和内质网)的共翻译或翻译后转运。对于具有ER靶向性信号肽的蛋白质，信号肽典型地在蛋白质转运至ER后通过信号肽酶而被从前体形式上切割下来，并且所得的蛋白质沿着分泌途径移动至其细胞内(例如，高尔基体、细胞膜或细胞壁)或细胞外位置。在本文中所使用的“ER靶向性信号肽”包括氨基末端的疏水性序列，其通常在该蛋白质的部分或全部通过ER膜插入到ER腔中后以酶促方式被去除。因此，本领域中已知，序列的信号前体形式可以作为蛋白质的前体形式的一部分存在，但是通常在蛋白质的成熟形式中将会是不存在的。
[0065] 在一个实例中，提供了包含在本文中所定义的表达构建体的重组乳酸细菌。
[0066] 术语“重组(的)”包括是指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞，或者衍生自已以这种方式进行修饰的细胞的细胞，但不包括通过天然发生的事件(例如，自发突变、自然转化、自然转导、自然转座)例如在没有蓄意的人为干预下发生的那些而出现的细胞的变动。
[0067] 在一个实例中，所述乳酸细菌的属选自由下列各项组成的组：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、气球菌属(Aerococcus)、明串珠菌属
(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属
(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、魏斯氏菌属(Weisella)、差异球菌属(Alloiococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、狡诈球菌属(Dolosigranulum)、球链菌属(Globicatella)、四联球菌属(Tetragenococcus)和漫游球菌属(Vagococcus)。
(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属
(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、魏斯氏菌属(Weisella)、差异球菌属(Alloiococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、狡诈球菌属(Dolosigranulum)、球链菌属(Globicatella)、四联球菌属(Tetragenococcus)和漫游球菌属(Vagococcus)。
[0068] 在一个实例中，所述乳酸细菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)。
[0069] 在一个实例中，所述乳酸细菌为经冷冻干燥或冻干的制剂。也可以将所述细菌重构以用于用作药物。
[0070] 在一个实例中，提供了在乳酸细菌中表达蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤：培养在本文中所定义的重组乳酸细菌，和分离由所述细菌表达的蛋白质。
[0071] 在一个实例中，提供了在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质，其用于用作药物。
[0072] 在一个实例中，提供了治疗肠道疾病的方法，所述方法包括下述步骤：将在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质施用给有此需要的患者。
[0073] 在一个实例中，提供了将蛋白质递送至受试者的肠道的方法，所述方法包括下述步骤：将在本文中所定义的重组乳酸细菌施用给所述受试者。
[0074] 在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质可以以固体或液体药用组合物的形式。药用组合物可以用在药学上可接受的承载体进行配制以施用给受试者。术语“承载体”是指与治疗剂一起进行施用的稀释剂、助剂、赋形剂或载料。这样的药用承载体可以为无菌液体(例如，水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。水、盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体承载体。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果希望，所述组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。口服制剂可以包含标准承载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用承载体的例子描述在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这样的组合物将会包含治疗有效量的重组乳酸细菌或重组蛋白质以及合适量的承载体，以提供用于正确地施用给患者的形式。所述制剂应当适宜于施用方式。
[0075] 术语“施用”和该术语的变化形式(包括“进行施用”)包括通过任何合适的方式接触、施加、递送或提供药学有效量的所述重组乳酸细菌或蛋白质至生物体或表面。可以在考虑诸如受者动物的年龄、性别、体重、种类和状况以及施用途径的因素的情况下，以医学或兽医学领域技术人员熟知的剂量和通过医学或兽医学领域技术人员熟知的技术来施用所述重组细菌或蛋白质。施用途径可以是经皮、通过粘膜施用(例如，口服、鼻、肛门、阴道)或通过胃肠外途径(真皮内、肌内、皮下、静脉内或腹膜内)。重组细菌或蛋白质可以单独地进行施用，或者可以与其他治疗或疗法共施用或相继地进行施用。施用形式可以包括悬浮液、糖浆剂或酏剂，以及用于胃肠外、皮下、真皮内、肌内或静脉内施用(例如，注射施用)的制备物，例如无菌悬浮液或乳剂。在一个实例中，在本文中所定义的重组细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质通过口服途径进行施用。
[0076] 对于口服施用，所述重组细菌或蛋白质的制剂可以作为胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或悬浮液呈现。所述制备物可以具有常规的添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉。所述制备物也可以与粘合剂(例如，结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶)一起呈现。另外，所述制备物可以与崩解剂(例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠)一起呈现。所述制备物可以进一步与无水磷酸氢钙或羟乙酸淀粉钠一起呈现。所述制备物可以与润滑剂(例如，滑石或硬脂酸镁)一起呈现。
[0077] 对于静脉内、皮肤或皮下注射或者在患处注射，活性成分将会以胃肠外可接受的水溶液的形式，其没有热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员有着良好的能力能够通过使用例如等渗载料(例如，氯化钠注射液、林格注射液或乳酸盐林格注射液)来制备适合的溶液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0078] 对于鼻内施用(例如，鼻喷雾剂)和/或肺部施用(通过吸入进行施用)，所述细菌或蛋白质制备物的制剂(包括气溶胶制剂)可以按照本领域技术人员众所周知的程序来制备。气溶胶制剂可以包含固体颗粒或溶液(水性或非水性的)。雾化器(例如，喷射雾化器、超声雾化器等)和喷雾器可以用于从溶液产生气溶胶(例如，通过使用溶剂例如乙醇)；定量吸入器和干粉吸入器可以用于产生小颗粒气溶胶。可以通过采用本领域中已知的许多方法(包括但不限于，喷射研磨、喷雾干燥和临界点冷凝)中的任何一种来获得所希望的气溶胶颗粒大小。
[0079] 术语“治疗”包括以任何方式纠正疾病状态或症状，防止疾病的建立，或者此外防止、阻碍、延迟或逆转疾病或其他不希望的症状的进展。在一个实例中，所述疾病为肠道疾病。所述肠道疾病可以为乳糜泻。
[0080] 术语“患者”是指人或其他哺乳动物的患者，并且包括希望通过使用本发明的方法进行检查或治疗的任何个体。但是，将会理解的是，“患者”并不暗示存在症状。落在本发明的范围内的合适的哺乳动物包括但不限于，灵长类动物、家畜动物(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如，兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(例如，猫、狗)和被捉住的野生动物(例如，狐狸、鹿)。
[0081] 在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质可以以“药学有效量”施用给有此需要的患者。术语“药学有效量”在其含义内包括无毒但是足够的量的试剂或化合物以提供所希望的治疗效果。所需的确切的量将会因受试者而变化，取决于诸如所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、所治疗的病况的严重度、所施用的特定试剂和施用方式等的因素。因此，不可能指定确切的“药学有效量”。但是，对于任何给定的情况，可以由本领域普通技术人员仅通过使用常规实验来确定合适的“药学有效量”。
[0082] 在一个实例中，提供了在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质，其用于在治疗肠道疾病中使用。
[0083] 在一个实例中，提供了在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质，当在治疗肠道疾病中使用时。
[0084] 在一个实例中，提供了在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质在制备用于治疗肠道疾病的药物中的用途。
[0085] 在一个实例中，提供了试剂盒，其包含一个或多个隔室，其中所述试剂盒包含适合于容纳在本文中所定义的重组乳酸细菌或者通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质的第一隔室。所述试剂盒可以用于检测罹患肠道疾病(例如，乳糜泻)的患者。所述试剂盒还可以用于检测在从罹患乳糜泻的患者获得的样品中过量麸质的存在。在一个实例中，通过在本文中所定义的方法而表达出的蛋白质切割麸质或生物标志物分子。所述生物标志物分子可以为关于乳糜泻的生物标志物分子。所述试剂盒可以检测该切割反应的一种或多种产物。所述重组细菌可以任选地以经冷冻干燥的或其他可重构的形式。所述试剂盒可以包含适合于容纳一种或多种试剂的一个或多个其他隔室。实施例
[0086] 通过下列非限制性实施例来进一步描述在本文中所公开的方面。
[0087] 方法
[0088] 细菌、LAB菌株、载体和培养基
[0089] NZ9000菌株和 表达系统的pNZ8148质粒[采用nisA启动子的乳酸乳球菌表达载体]获得自Boca Scientific。基因由Integrated DNA Technologies合成。生长培养基，M17和GM17，获得自BD Biosciences(USA)。
[0090] 在pNZ8148上的蛋白质盒构建
[0091] 对于乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis cremoris)，通过使用Integrated DNA Technologies的密码子优化工具来对基因进行密码子优化。通过使用KOD-Xtreme试剂盒(Merck)从合成的 基因片段(Integrated DNA
Technologies)[用于基因构建的双链的序列经验证的基因组区块]中扩增出经密码子优化的基因。将PCR产物进行DpnI处理至少2小时，和然后通过使用DNA清洗和浓缩试剂盒(Zymo research)来清洗干净和浓缩。将pNZ8148用限制酶在37℃下消化至少5小时。然后，将它们与热敏型碱性磷酸酶TSAP(Promega)一起温育2小时，之后将它们进行清洗和浓缩。然后，通过使用Gibson装配混合物(New England Biolabs)来将基因装配到载体中，在50℃下进行1小时。将2μL的Gibson装配混合物添加到50μL的电转感受态NZ9000细胞中，并且使用0.1cm电击杯在1800V下进行电穿孔。在电穿孔后立即添加1mL的具有20mM MgCl2和2mM CaCl2的GM17培养基。将电击杯在冰上放置5分钟，之后将细胞在30℃下温育1至2小时。将细胞离心并重悬浮在100μL的培养基中，之后将它们在具有10μg/ml氯霉素的含0.5％葡萄糖的M17(GM17)琼脂上进行铺板并在30℃下温育2天。在进行质粒的分离和测序之前，就正确的构建体来筛选菌落。
Technologies)[用于基因构建的双链的序列经验证的基因组区块]中扩增出经密码子优化的基因。将PCR产物进行DpnI处理至少2小时，和然后通过使用DNA清洗和浓缩试剂盒(Zymo research)来清洗干净和浓缩。将pNZ8148用限制酶在37℃下消化至少5小时。然后，将它们与热敏型碱性磷酸酶TSAP(Promega)一起温育2小时，之后将它们进行清洗和浓缩。然后，通过使用Gibson装配混合物(New England Biolabs)来将基因装配到载体中，在50℃下进行1小时。将2μL的Gibson装配混合物添加到50μL的电转感受态NZ9000细胞中，并且使用0.1cm电击杯在1800V下进行电穿孔。在电穿孔后立即添加1mL的具有20mM MgCl2和2mM CaCl2的GM17培养基。将电击杯在冰上放置5分钟，之后将细胞在30℃下温育1至2小时。将细胞离心并重悬浮在100μL的培养基中，之后将它们在具有10μg/ml氯霉素的含0.5％葡萄糖的M17(GM17)琼脂上进行铺板并在30℃下温育2天。在进行质粒的分离和测序之前，就正确的构建体来筛选菌落。
[0092] 蛋白质表达和细胞裂解物级分提取
[0093] 将2％的过夜培养物接种到50mL的新鲜的GM17培养基中。让所述培养物在30℃下静置地生长至OD600 0.5，之后用10ng/mL的乳酸链球菌肽进行诱导。在乳酸链球菌肽诱导后3小时，通过以4600rpm离心10分钟来收获所述培养物，上清液和细胞粒状沉淀。洗涤细胞粒状沉淀，并且重悬浮在300μL的裂解平衡洗涤缓冲液(LEW缓冲液：50mM NaH2PO4,300mM NaCl,pH 8.0)中。将1mg/mL溶菌酶和50U/mL变溶菌素添加至细胞悬浮液，并且将细胞悬浮液在30℃下温育30分钟。将细胞悬浮液保持在冰上，并且使用Microson XL2000超声波仪在
22.5kHz下以10秒间隔进行超声处理4次(10秒)。将细胞裂解物在4℃下以10000g旋转沉降
30分钟，并且将上清液移除作为可溶性级分。洗涤剩余的粒状沉淀，并且重悬浮在变性缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,8M尿素,pH 8.0)中并旋转沉降(10000g，20分钟)以获得不溶性级分。进行生物学三次重复。
22.5kHz下以10秒间隔进行超声处理4次(10秒)。将细胞裂解物在4℃下以10000g旋转沉降
30分钟，并且将上清液移除作为可溶性级分。洗涤剩余的粒状沉淀，并且重悬浮在变性缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,8M尿素,pH 8.0)中并旋转沉降(10000g，20分钟)以获得不溶性级分。进行生物学三次重复。
[0094] 分泌级分
[0095] 在3小时的诱导后，移除30mL的培养基级分。在4℃下通过使用amicon超离心过滤器将这进行缓冲液交换并浓缩至200μL，其中使用冷的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)。为了确保NZ9000菌株的细胞裂解在产生期间是微不足道的，在收获之时将在培养基中的完整细胞的基因组DNA含量与经完全裂解的细胞进行比较，其中采用使用关于tuf持家基因的乳酸乳球菌特异性引物的定量PCR(如在Ruggirello M等人,PloS one.9(12)(2014):e114280中所描述的)。基于该比较，预测细胞裂解保持在0.1％以下。
[0096] 免疫印迹法
[0097] 在NuPAGE 4-12％w/v或12％w/v Bis-Tris凝胶(Life Technologies)上分析蛋白质样品。然后，通过使用半干法(Trans-Blot；Biorad)在20V下将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上20分钟。将膜用PBST(含0.1％v/v Tween的PBS)进行洗涤，然后在室温下在PBST(Biorad)中用5％w/v脱脂奶粉封闭1小时，然后用PBST进行洗涤。将在Signal Enhancer HIKARI溶液B(Nacalai Tesque)中的1:10000抗-His抗体(Millipore)添加至膜并在4℃下温育过夜，之后采用制造商的实验方案用Clarity Western ECL印迹法底物(Biorad)进行检测。使用ImageJ来进行光密度测定法。相对于不含前肽的USP45构建体来计算蛋白质产量，其中使用“分泌型蛋白质/培养物体积”。将分泌效率计算为分泌型蛋白质占所产生的总蛋白质的比例。
[0098] Z-gly-pro-4-硝基苯胺测定法
[0099] 将2μL的经浓缩的分泌型级分添加至包含5μL的2mM Z-gly-pro-4-硝基苯胺(在1,4-二噁烷中)和100μL的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)的混合物中。通过技术三次重复，在
410nm处测量对硝基苯胺的释放。还基于通过使用经纯化的FmPEP(Sigma-Aldrich)进行校准的标准曲线来估计分泌型蛋白质的酶促活性。
410nm处测量对硝基苯胺的释放。还基于通过使用经纯化的FmPEP(Sigma-Aldrich)进行校准的标准曲线来估计分泌型蛋白质的酶促活性。
[0100] 实施例1
[0101] TRX和FM PEP蛋白的分泌
[0102] 前肽的挖掘
[0103] 首先选择参照信号肽，即天然出现的来自功能未知的乳酸乳球菌分泌型蛋白质的信号肽(USP45SP)。除了作为目前最经常使用的用于乳酸乳球菌的分泌信号肽外，USP45SP还显示出比其他天然信号肽(SP310，Ravn,Peter等人,Gene 242.1(2000):347-356)或突变文库(USP45MT11Ng，Daphne TW等人,Applied and environmental microbiology 79.1(2013):347-356；SP310mut2,Ravn,Peter等人,Microbiology 149.8(2003):2193-2201)更为有效。为了挖掘分泌前肽，将USP45SP的氨基酸序列(登录号：ABY84357)用于针对109个保存的乳球菌属物种装配物进行blast。从BlastP搜索中，鉴定出三个最能代表结果的前肽序列(图1a)。这些前肽的等电点在从0.6至3.5的范围内变动，相比于我们的阳性对照前肽LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)的0.6的等电点而言。所有三个前肽在pH 7下具有-2至-3的净电荷(图1b)。所述前肽的负电荷是由序列中的多个天冬氨酸和谷氨酸残基贡献的。该观察结果还与以前的发现一致：LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)的负电荷在提高分泌效率中起着重要的作用。此后为简单起见，将会把这三个经数据挖掘的前肽标注为PP1-PP3(图1b)。
[0104] TRX分泌和优化
[0105] 作为对这些前肽的初步评价，将可溶性15kDa大肠杆菌TRX用作报道蛋白。经甘氨酸-丝氨酸连接的蛋白质表达盒(图2a)由下列组分组成：USP45SP，随后为目的前肽、经密码子优化的TRX基因盒的N-末端。该基因盒的C-末端由下列组分组成：甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸(GSGSGAAA(SEQ ID NO:29))连接体，之后为TEV切割位点(ENLYFQG(SEQ ID NO:30))和His6-标签(HHHHHH(SEQ ID NO:31))。在对照表达盒中，在USP45SP和TRX之间没有前肽，而只有一个GS连接体。通过DNA装配将该蛋白质表达盒引入到用乳酸链球菌肽可诱导的pNZ8148中。
[0106] 将最终的构建体转化到NZ9000中并在30℃下进行生长。用10ng/mL乳酸链球菌肽在OD600＝0.5时进行培养物的诱导(图2b)。在3小时的表达后，观察到具有预期大小(15-19kDa)的带有His-标签的蛋白质(图2c)。对于USP45-TRX分别在细胞内级分和分泌型级分中观察到相应于全长(17kDa)USP45-TRX和其截短的(15kDa)TRX的在Western印迹上的条带。
[0107] 类似地，对于USP45-前肽-TRX，也分别在细胞内级分和细胞外级分中观察到相应于全长(19kDa)USP45-前肽-TRX和截短的(16kDa)前肽-TRX的条带。从所观察到的TRX构建体的大小，预测分泌型蛋白质的截短发生在信号肽和前肽之间。这正如用SignalP所预测的那样(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP,Petersen,Thomas Nordahl等人,Nature methods 8.10(2011):785-786)。
[0108] 在仅USP45SP的情况下，观察到31％的关于TRX的分泌效率。然而，在插入前肽后，观察到分泌效率的最大1.7倍的改善(PP3，53％)。随着增加的分泌效率，对于包含前肽的构建体还存在相应的分泌产量的1.5-2.4倍增加，相比于没有前肽的构建体而言(图2c)。总的来说，观察到PP1-3提高了分泌效率和产量两者，像LEISSTCDA一样。
[0109] 使用可溶性15kDa大肠杆菌TRX作为报道蛋白来重复该实验(图3a)。将最终的构建体转化到NZ9000中并在30℃下进行生长。用10ng/mL乳酸链球菌肽在OD600＝0.5时进行培养物的诱导(图3b)。在3小时的表达后，观察到具有预期大小(15-19kDa)的带有His-标签的蛋白质(图3c)。对于USP45-TRX分别在细胞内级分和分泌型级分中观察到相应于全长(17kDa)USP45-TRX和其截短的(15kDa)TRX的在Western印迹上的条带。类似地，对于USP45-前肽-TRX构建体，也分别在细胞内级分和细胞外级分中观察到相应于全长(19kDa)USP45-前肽-TRX和截短的(16kDa)前肽-TRX的条带。
[0110] 在仅USP45SP的情况下，观察到27％的关于TRX的分泌效率。然而，在插入前肽后，观察到分泌效率的最大1.7倍的改善(LEISSTCDA，47％，图3c)。随着增加的分泌效率，对于包含前肽的构建体还存在相应的体积分泌产量和比分泌产量两者的1.5-2.3倍增加，相比于没有前肽的构建体而言(图3c)。总的来说，观察到PP1-3提高了分泌效率和产量两者，像LEISSTCDA一样。
[0111] 功能性Fm PEP的表达和分泌
[0112] 接下来，检查PP1-3对于Fm PEP分泌的影响。经甘氨酸-丝氨酸连接的蛋白质表达盒由下列组分组成：USP45SP，随后为目的前肽、经密码子优化的Fm PEP基因盒和在C-末端的His6-标签(图4a)。在对照表达盒中，在USP45SP和Fm PEP之间没有前肽，而只有一个GS连接体。再次，通过DNA装配将该蛋白质表达盒引入到用乳酸链球菌肽可诱导的pNZ8148中。
[0113] 在30℃下对经转化的NZ9000菌株进行乳酸链球菌肽诱导3小时(图4b)后，通过Western印迹分析来分析细胞裂解物和培养基两者(图4c、d)。在细胞裂解物级分和培养基级分两者中均观察到相应于Fm PEP的大小的在75kDa处的条带(图4c、d)。在75kDa附近观察到的两条紧密地迁移的条带被预测为全长构建体(84和83kDa，分别关于有和没有前肽)和截短的Fm PEP(81和80kDa，分别关于有和没有前肽)。在可溶性细胞内级分中也观察到截短的Fm PEP的条带，这暗示前体正在细胞内经历切割。在细胞内级分中，蛋白质的溶解度为总细胞内蛋白质的47-63％，并且从我们的酶促测定法中发现可溶性细胞内蛋白质是有活性的。通过将前肽引入到Fm PEP表达盒中，观察到分泌产量的普遍增加(1.4至2.2倍)(图4e)。
[0114] 在培养基级分中的PEP活性的比较也展示出与分泌产量相似的提高趋势(图4e)。这也暗示，存在最小的由于不同的高度带负电荷的前肽而造成的对于Fm PEP活性的影响。
前肽之间的比较也表明，通过Fm PEP证明了前肽的不同偏好，相比于TRX而言。对于Fm PEP，PP1产生了最好的分泌产量和活性(2.2倍)，而阳性对照LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)仅达成产量和活性的1.4倍增加。
前肽之间的比较也表明，通过Fm PEP证明了前肽的不同偏好，相比于TRX而言。对于Fm PEP，PP1产生了最好的分泌产量和活性(2.2倍)，而阳性对照LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)仅达成产量和活性的1.4倍增加。
[0115] 尽管证明了在乳酸乳球菌中活性Fm PEP的分泌，但是Fm PEP的分泌效率(0.9-1.6％)低于TRX的分泌效率(24-53％)。这可以归因于TRX的相比于Fm PEP而言的更高的溶解度和更低的分子量。引人注目地，尽管预期在细胞内在信号肽存在下不会发生折叠，但是细胞裂解物由46-69％的可溶的、经切割的Fm PEP蛋白组成，其在我们的PEP测定法中是有功能的(图4d)。这些观察结果暗示，可以使用进一步的设计优化来减少细胞内切割，并进而增加分泌效率。
[0116] 使用相同的表达盒来重复关于PP1-3对于Fm PEP分泌的影响的实验(图5a)。在30℃下对经转化的NZ9000菌株进行乳酸链球菌肽诱导3小时(图5b)后，通过Western印迹分析来分析细胞裂解物和培养基两者(图5c、d)。在细胞裂解物级分和培养基级分两者中均观察到相应于Fm PEP的大小的在75kDa处的条带(图5c、d)。在75kDa附近观察到的两条紧密地迁移的条带被预测为全长构建体(84和83kDa，分别关于有和没有前肽)和截短的Fm PEP(81和80kDa，分别关于有和没有前肽)(图5c、d)。在可溶性细胞内级分中观察到截短的Fm PEP的条带，这暗示前体正在细胞内经历切割。在细胞内级分中，蛋白质的溶解度为总细胞内蛋白质的46-68％，并且从我们的酶促测定法中发现可溶性细胞内蛋白质是有活性的(图7)。通过将前肽引入到Fm PEP表达盒中，观察到体积分泌产量的普遍增加(1.4至2.2倍)(图5e)。
当标准化至光密度时，关于PP1、PP2、PP3和LEISSTCDA，比分泌产量的增加分别为2.3、1.7、
2.8和1.3倍(参见表1)。PP3的较高的比产量是在乳酸链球菌肽诱导后宿主细胞的生长显著减少的结果(图5b)。
当标准化至光密度时，关于PP1、PP2、PP3和LEISSTCDA，比分泌产量的增加分别为2.3、1.7、
2.8和1.3倍(参见表1)。PP3的较高的比产量是在乳酸链球菌肽诱导后宿主细胞的生长显著减少的结果(图5b)。
[0117] 表1.Fm PEP构建体的比较
[0118]
[0119] *PP3的平均OD为1.8，相比于关于无PP的2.7而言
[0120] 在培养基级分中的PEP活性的比较也展示出与分泌产量相似的提高趋势(图5e)。这也暗示，存在最小的由于在N-末端处插入不同的高度带负电荷的前肽而造成的对于Fm PEP活性的影响。前肽之间的比较也表明，通过Fm PEP证明了前肽的不同偏好，相比于TRX而言。对于Fm PEP，PP1产生了最好的体积分泌产量和活性(2.2倍)，而阳性对照LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)仅达成产量和活性的1.4倍增加。
[0121] 如上所提及的，相比于TRX而言Fm PEP的降低的分泌效率可能可以归因于TRX的相比于Fm PEP而言的更高的溶解度和更低的分子量。引人注目地，尽管预期在细胞内在信号肽存在下不会发生折叠，但是细胞裂解物被发现包含可溶的、经切割的且有功能的Fm PEP蛋白(图5d，图7)。这些观察结果暗示，可以使用进一步的设计优化来减少细胞内切割，并进而增加分泌效率。
[0122] 实施例2
[0123] 所述3种前肽的效力
[0124] 在该研究中，除了广泛使用的合成的前肽LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)外，还检查了3种天然出现的前肽。使用两种不同的重组蛋白质来评价该一组4种前肽，其中对于所有4种前肽证明了增加分泌产量和效率的能力。但是，从具有2种蛋白质的亚组中显示，对于每种具有USP45SP的蛋白质的最佳前肽并不相同。在TRX的情况下，通过PP3获得了最高的分泌效率。在Fm PEP的情况下，通过PP1获得了最高的体积产量和分泌效率。
[0125] 从保存的基因组学数据中，已经就分泌增强鉴定出三种新的肽。通过这三种前肽的表征(与阳性对照LEISSTCDA一起)，证明这些前肽在分泌增强方面与LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)相当，而且在Fm PEP的优化中，它们的表现优于LEISSTCDA(SEQ ID NO:2)。取决于目的蛋白质和前肽的组合，观察到体积分泌产量的1.4-2.3倍增加。在该工作中，首次证明了在乳酸乳球菌中功能性Fm PEP的表达和分泌。
[0126] 在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制为任何一个实施方案或特定的特征集合。因此，本领域技术人员将会理解，鉴于本公开内容，可以在所例示的具体实施方案中进行各种修改和改变，而不背离本发明的范围。所有这样的修改和改变都旨在被包括在所附权利要求书的范围内。
[0127] 参考文献
[0128] Ng,Daphne TW等人,Applied and environmental microbiology 79.1(2013):347-356
[0129] Petersen,Thomas Nordahl等人,Nature methods 8.10(2011):785-786
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