技术领域
[0001] 本
发明属于青贮饲料制作的技术领域，具体涉及一种甘蔗尾叶的全混青贮饲料及其应用。
背景技术
[0002] 近年来，许多亚热带及热带国家及地区对于
反刍动物乳、肉需求量在迅速增长，反刍动 物产业也随之迅猛发展，由此导致对粗饲料资源的需求量巨大，优质
饲草短缺及供应
不平衡 的问题也日益突出。
[0003] 甘蔗是一种广泛种植于热带及亚热带地区的禾本科
植物。2017年全国甘蔗总产量达 10440.4万吨，其中广西总产量达7132.3万吨，约占全国总产量的68.31％。甘蔗梢是甘蔗收 获时砍下顶上2～3个嫩节和青绿色
叶片的统称，是甘蔗种植过程中产生的附属产物，约占甘 蔗
生物量的10％。广西地区年产甘蔗梢数量约为1400万吨，数量巨大，但仅有不到30％被 用作饲料直接饲喂草食动物，大部分甘蔗梢被焚烧和丢弃，造成了极大的资源浪费和严重的 环境污染问题。甘蔗的
收获季节通常为当年的11月份至次年的5月份，甘蔗梢的饲料化正好 可以弥补因秋冬季节牧草生长缓慢导致的饲料资源短缺问题。
[0004] 而目前国内对于甘蔗梢的利用主要是直接鲜喂或制成普通青贮后饲喂，公布的甘蔗尾青 贮方法也较多。这些方法大部分需要晾晒降低
水分，制作青贮后利于长期保存，但营养价值 和饲喂效果并没有显著提高。本发明
专利是将玉米、
豆粕、麦麸等精饲料加入甘蔗梢一起进 行青贮，制成全价混合饲料，不但有效提高青贮品质，且适宜的
微生物添加使豆粕的植物蛋 白经过
发酵降低对动物胃肠道应激，提高采食量和消化率。同时青贮经过比例调配，营养均 衡，饲喂时直接投喂即可，不用另添喂精料，省时省
力，解决了散养农户及不懂饲料调配技 术的养殖场(户)的饲料调配技术问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种甘蔗尾叶的全混青贮饲料及其应用。本发明通过在甘蔗尾叶铡 碎后加入玉米、豆粕、麦麸及尿素等制作成全混打包青贮，进行育成奶水
牛的饲养，从而达 到提高青年奶水牛生产性能的效果。
[0006] 本发明的发明内容：
[0007] 一种甘蔗尾叶的全混青贮饲料，由如下具体步骤制备得到：
[0008] (1)混合料：将甘蔗尾叶铡碎后与精饲料按8.5:1.5的比例混合搅拌，得到混合料，混 合料中干物质含
粗蛋白11％；
[0009] 所述精料配方如下：玉米50％，豆粕37％，麦麸11％，骨粉1％，盐1％，粗蛋白含量22％；
[0010] (2)青贮：将复合菌剂洒在混料上，然后用打包机打包青贮，1.5个月后再用于进行饲 喂试验即可；
[0011] 所述复合菌剂由矮小假丝
酵母菌(Candida humils)GS2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS3、干
酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) GS5以活菌落单位计数(CFU)，比例为0-100％:0-100％:0-10％:0-10％。
[0012] 在本发明中，进一步说明，所述矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2于2018年7月2 日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018441； 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS3于2018年08月03日保藏在中国，武汉，武汉大 学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018522；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) GS4于2018年08月03日保藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号 为CCTCC M 2018523；副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GS5于2018年08月03日保 藏在中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018524。
[0013] 在本发明中，进一步说明，所述矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)GS3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)GS5以活菌数百分比计，比例为20％-50％:30％-60％:10％:10％。
[0014] 在本发明中，进一步说明，所述复合菌剂由以下具体步骤制备而得：
[0015] 1)活化：提取4种菌种分别按照菌种10％添加量分别接入液体培养基，矮小假丝酵母菌 (Candida humils)GS2培养
温度为28℃24h，150r/min摇床培养；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) GS5温度为37℃24h，静态培养；
[0016] 2)扩大培养：接着将活化后的4种菌株按照5％添加量分别接入液体培养基，矮小假丝 酵母菌(Candida humils)GS2培养温度为28℃24h，150r/min摇床培养；植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)GS3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GS5培养温度为37℃24h，静态培养，用涂板对接种菌液进行计数；
[0017] 3)
冷冻干燥：对离心管用95％
乙醇擦拭离心机内壁做杀菌处理，将浓缩培养的菌发酵液 按照4种菌株的浓度比例混合后，于3000r/min下离心10min，弃上清液得菌泥，用适量的 无菌水同菌泥充分混匀，制得浓度均匀的菌悬液，添加保护剂，菌泥：保护剂＝1:3，一起转 入无菌培养皿，厚度为皿高的一半，用保鲜膜包裹，置于超低温
冰箱中预冻5h，形成小的冰 晶，立即转入冷冻干燥装置中干燥，直到没有明水为止，取样测定此时活菌数，立即
真空密 封
包装后与4°冰箱保藏。
[0018] 在本发明中，进一步说明，所述保护剂按照百分数计，由以下组分组成80％无脂奶粉、 8％海藻糖、8％谷
氨酸钠、4％甘油。
[0019] 在本发明中，进一步说明，在步骤(1)-(2)中，MRS液体培养基用于植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)GS3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)GS5活化和菌液培养；MRS固体培养基用于植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)GS3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)GS5涂板计数；YPD液体培养基用于矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2活化和菌液培养；YPD琼脂用于矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2涂板计 数。
[0020] 如上所述的甘蔗尾叶的全混青贮饲料在喂养青年奶水牛的应用。
[0021] 与
现有技术相比较，本
申请的有益效果：
[0022] 本
申请人经过研究发现，采用本申请人自主选育得到的4种优势菌株组合复合菌剂形式， 对新鲜甘蔗尾叶进行青贮处理后，相比任何一种单一菌种作为菌剂的形式上对新鲜甘蔗尾叶 的青贮的品质上得到了进一步的提高，例如显著提高乳酸、乙酸含量，显著降低pH值，降 低NH3-N含量。另利用本申请记载的比例添加精料，能使青贮水分调节到60％-65％最佳青贮 比例，同时精料富含的
碳水化合物能有效提高乳酸菌等发酵活动，提高青贮品质；混合青贮 经过调配营养均衡，可不需补充任何精料直接用于饲喂育成奶水牛，饲喂效果优良。
具体实施方式
[0023] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合
实施例对本发明的具 体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但 是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发 明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0024] 实施例1
[0025] 矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS3、 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GS5菌株 获得及命名：
[0026] 用接种环挑取青贮甘蔗尾取样，在添加0.5％CaCO3和添加0.001％(g/100ml)纳它霉 素的MRS固体培养基平板上长出来的植物乳杆菌菌落，随机挑选表面光滑、形态呈圆形、乳 白或灰白色、有明显
钙溶圈的菌落，然后，分别进行过
氧化氢酶检测(取一
块预先清洗干净 的
载玻片一块，滴加一滴3％的过氧化氢，用接种环蘸取菌落于过氧化氢液体中，观察是否 有气泡产生，有气泡产生为阳性，无气泡产生为阴性)和革兰氏
染色镜检；挑选过氧化氢酶 为阴性，革兰氏染色为阳性的细菌菌落；用接种环挑取植菌落在MRS固体培养基平板上再次 画线纯化，纯化两次后，在纯化后的细菌平板上挑取菌落接种于MRS液体培养基中，扩大培 养，培养24h后，挑选出细菌菌落即可。
[0027] 将细菌送至武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏，确定该菌株为：
[0028] 矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2于2018年07月02日保藏在中国，武汉，武汉 大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018441；
[0029] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS3于2018年08月03日保藏在中国，武汉，武 汉大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018522；
[0030] 干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4于2018年08月03日保藏在中国，武汉，武汉大 学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018523；
[0031] 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GS5于2018年08月03日保藏在中国，武汉，武汉 大学，中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018524。
[0032] 实施例2复合菌剂制备：
[0033] 1、材料与方法
[0034] 2.1试验材料
[0035] 1.1.1常规材料：新鲜甘蔗尾、海藻糖、
脱脂奶粉、甘油、谷氨酸钠、尿素等。
[0036] 1.1.2微生物菌株：矮小假丝酵母菌(Candida humils)GS2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS3、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)GS4、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) GS5。
[0037] 1.1.3培养基：MRS液体培养基用于乳杆菌活化和菌液培养；MRS固体培养基用于乳杆 菌涂板计数；YPD液体培养基用于酵母菌活化和菌液培养；YPD琼脂用于酵母菌涂板计数。
[0038] 1.1.4保护剂：
[0039] 10％脱脂奶粉、8％海藻糖、7.5％谷氨酸钠、4％甘油。
[0040] 1.2试验方法
[0041] 1.2.1复合菌剂的制定
[0042] 1.2.1.1
选定各菌株的添加量以确定不同的复合菌剂配方，配方表中用量以活菌数计量。
[0043] 表1复合菌剂配方
[0044] 单位：％
[0045]配方编号 植物乳杆菌 干酪乳杆菌 副干酪乳杆菌 矮小假丝酵母菌 空白对照 0 0 0 0
对照1 100 0 0 0
对照2 0 100 0 0
对照3 0 0 100 0
对照4 0 0 0 100
配方1 30 10 10 50
配方2 60 10 10 20
[0046] 1.2.1.2复合菌剂的制作
[0047] 复合菌剂制作工艺流程如下：
[0048] 浓缩增殖培养 离心 添加保护剂[0049] 混合菌剂---------→高浓度发酵液------→菌悬液----------→冷冻干燥----→菌粉
[0050] 1.2.1.2.1菌活化与培养
[0051] 活化：提取菌种10％添加量接入液体培养基，酵母菌培养温度为28℃24h，150r/min摇 床培养；乳杆菌培养温度为37℃24h，静态培养。
[0052] 扩大培养：5％添加量接入液体培养基，酵母菌培养温度为28℃24h，150r/min摇床培养； 乳杆菌培养温度为37℃24h，静态培养。
[0053] 用涂板对接种菌液进行计数。
[0054] 1.2.1.2.2冷冻干燥
[0055] 将浓缩培养后的酵母菌和乳酸菌，根据菌浓度，以实验方案的配比混合后，再进行冷冻 干燥试验。
[0056] 菌悬液的制备：
[0057] 将浓缩培养的菌发酵液于3000r/min下离心，事先对离心管做杀菌处理，用95％乙醇擦 拭离心机内壁，弃上清液，用适量的无菌水同菌泥充分混匀，制得浓度均匀的菌悬液。
[0058] 保护剂的处理：
[0059] 保护剂的前处理：紫外杀菌2h，确保保护剂中无菌，以避免对试验产生影响。
[0060] 冷冻干燥前处理：
[0061] 在制备菌悬液过程中添加保护剂，菌泥：保护剂＝1:3，一起转入无菌培养皿，厚度为皿 高的一半，用保鲜膜包裹，每种组合两个平行，置于超低温冰箱中预冻5h，形成小的冰晶， 立即转入冷冻干燥装置中干燥，直到没有明水为止，取出将其
粉碎，过筛200目，取样测定 此时活菌数，立即真空密封包装后与4°冰箱保藏。
[0062] 1.2.2全混青贮饲料品质检测试验
[0063] 全混青贮饲料的制备方法如下：
[0064] (1)
[0065] 混合料：将甘蔗尾叶铡碎后与精饲料按8.5:1.5的比例混合搅拌，得到混合料，混合料中 干物质含粗蛋白11％；
[0066] 所述精料配方如下：玉米50％，豆粕37％，麦麸11％，骨粉1％，盐1％，粗蛋白含量22％；
[0067] (2)青贮：将复合菌剂洒在混料上，然后用打包机打包青贮，1.5个月后再用于进行饲 喂试验即可。
[0069] 将上述各个料包的全混青贮饲料，分别于第0、45天进行开袋检查及评测，观察并记录 青贮样品的气味、色泽、质地(按附表执行)。
[0070] 2.1测定项目及方法
[0071] (1)感观评定
[0072] 感官评定参考我国农业部1996年发布的《青贮饲料质量评定标准(试行)》进行，具体 见表2。
[0073] 表2感官评价标准
[0074] Table 2 Sensory evaluation criteria
[0075]
[0076]
[0077] 甘蔗尾青贮完成后开袋并分别从色泽、气味和质地、pH和水分五个方面进行感官评价打 分，各处理组在感官方面评价均在优等品质。
[0078] (2)PH值及品质项目分析
[0079] 1)样品预处理
[0080] 每袋取35g样品，放至250mL广口瓶中，再添加150mL的去离子水，放于4℃冰箱提 取24小时，然后用2层纱布进行过滤，滤液用于pH、乳酸、氨态氮(NH3-N)和挥发性脂 肪酸(VFA)的测定。除菌种筛选培养所用甘蔗尾外，剩余的甘蔗尾样品在65℃下烘干、粉 碎(过40目筛)制成
风干样，用于常规营养成分的测定。
[0081] 2)PH的测定
[0082] 采用PH计进行测定，PH计型号：HANNA HI 8424。
[0083] 3)NH3-N的测定
[0084] NH3-N釆用比色法测定，取⑴获得的滤液5mL，加5ML的0.2mol/L HCL，3500rpm离 心10min取上清。用
氯化铵做标准品，采用紫外可见分光光度计(PE Lambda 35型，产地美 国)，在700nm下比色，根据光
密度值和标准曲线得出NH3-N的含量。
[0085] 4)VFA的测定
[0086] 取⑴获得的滤液0.5mL，加入0.5mL 8.2％偏
磷酸，13000rpm/min离心10min，再取上 清液加入巴豆酸后，用Agilent 7890A型气相色谱仪进行测定，毛细管柱： HP-INNOWAX(19091N-133)，毛细管的柱规格：30m×0.25mm×0.25μm，测定样品的乙、丙、 丁酸含量。
[0087] 2.2数据分析
[0088] 数据采用EXCEL
软件进行初步处理，应用SPSS 16.0软件进行单因子方差分析，同时进 行Duncan多重比较。
[0089] 2.3结果与分析
[0090] 表3复合微生态制剂对甘蔗尾全混青贮发酵品质的影响
[0091]
[0092] 由上表可知，采用本申请的复配剂进行全混青贮制备得到的饲料，能有效提高乳酸、乙 酸指标，显著降低青贮中氨态氮含量(P<0.05)。
[0093] 表4复合微生态制剂对甘蔗尾全混青贮
营养品质影响
[0094]
[0095]
[0096] 由上表可知，配方2混合菌与空白组对照、对照1～4相比，DMR差异不显著(P>0.05)， NDF有所降低，CP显著高于对照对照1和对照3(P<0.05)。
[0097] 实施例3：喂养实验
[0098] 1、材料及方法：
[0099] 1.1试验设计及动物选择
[0100] 选取体重相近的12月龄健康青年奶水牛24头(230±20Kg)，随机分为8组，公母各半 的情况下每组6头。试验牛饲喂4种不同类型日粮，试验期100天，其中预试期10天，正试 期90天。
[0101] 组别 日粮 青贮添加剂Ⅰ 新鲜甘蔗尾
Ⅱ 青贮甘蔗尾 实例2复合菌制剂配方2
Ⅲ 全混青贮甘蔗尾(8.5:1.5) 实例2复合菌制剂配方2
Ⅳ 青贮甘蔗尾+精料(8.5:1.5) 实例2复合菌制剂配方2
[0102] 1.2饲养管理
[0103] 试验牛进行专人管理，试验前所有牛只统一驱虫，试验牛只单栏圈养，自由饮水和采食， 每天上午7：00和下午15:00各饲喂一次。
[0104] 1.3指标测定与方法
[0105] 1.3.1生产性能
[0106] 于试验开始和结束时清晨空腹对试验牛称重，计算平均日增重【平均日增重＝(试验结束 体重-开始体重)/试验天数】，试验期间每天记录饲喂量(精料及粗料)，计算实际日采食量。
[0107] 1.3.2血清生化指标
[0108] 正试期最后一天，于晨饲前颈静脉
采血5ml于真空采血管，2500g离心15min制备血清 于-20℃保存待用。用于分析总蛋白(TP)、
白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、
葡萄糖(GLU)、 尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)。
[0109] 1.3.3肉用性能指标
[0110] 采用Echo Blaster128型背膘仪检测水牛背膘厚、眼肌面积、肌间脂肪、大理石花纹等肉 用性能指标。
[0112] 试验数据经Excel初步
整理后，用SPSS 19.0进行单因素方差分析，显著差异用Duncan 法进行多重比较。
[0113] 2结果与分析
[0114] 2.1采食量与日增重
[0115] 由表5可知，全混合青贮甘蔗尾叶(Ⅲ)干物质采食量、粗蛋白摄入量和平均日增重为 各组最高，显著高于单独饲喂新鲜甘蔗尾叶(Ⅰ)和青贮甘蔗尾叶组(Ⅱ)(P<0.05)。表 明全混青贮在饲料保存和饲喂效果上具有很大可行性。
[0116] 表5不同处理方式甘蔗尾叶对水牛犊牛干物质采食量和日增重的影响[0117]
[0118] 注：同行肩标相同或者无肩标，表明差异不显著(P>0.05)；肩标不同表明差异显著 (P>0.05)；下表同。
[0119] 2.3血液生化指标
[0120] 由表6可知，各组总蛋白、白蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等生化指标差异 不显著(P>0.05)。但全混青贮组(Ⅲ)血清尿素氮水平显著低于甘蔗尾青贮+精料(Ⅳ)组 (P<0.05)。
[0121] 表6不同处理对水牛犊牛血液生化指标的影响
[0122]
[0123]
[0124] 2.4肉用性能指标
[0125] 由表7可知，全混甘蔗尾青贮组(Ⅲ)背膘厚度、大理石花纹评分显著高于新鲜甘蔗尾 组(Ⅰ)和青贮甘蔗尾组(Ⅱ)(P<0.05)。眼肌面积、肌间脂肪含量各组组间差异均不显 著(P>0.05)。
[0126] 表7不同处理甘蔗尾叶饲喂对水牛犊牛肉用指标影响
[0127]
[0128] 3.讨论
[0129] 影响动物DMI的饲粮因素主要包括适口性、营养浓度和
纤维水平等，DMI直接反映了动 物的生产性能和健康水平。本试验表明全混青贮对青年奶水牛适口性影响不大，而日增重有 所提高，说明优质青贮饲料能有效利用于生产。
[0130] 血液中的白蛋白、总蛋白的含量可以作为反映动物
机体蛋白质总体代谢水平的指标，来 衡量饲粮养分对机体营养代谢的影响状况。ALT和AST是动物体内最重要的两种转氨酶，天
门冬氨酸转氨酶(AST)和ALT通常在血液中低水平存在，当肝脏受损时，血液中AST和 ALT水平会升高。试验组这些血液生化指标各组差异不显著，说明动物机体健康未受影响。
[0131] 背膘厚反映的主要是胴体背侧皮下脂肪(Subcutaneous fat)的
覆盖情况，而大理石花纹 与牛肉嫩度和风味密切相关。本试验在相同的饲养模式下，单独饲喂青贮甘蔗尾和新鲜甘蔗 尾，背膘厚、大理石花纹显著低于全混青贮和甘蔗尾青贮+精料组(P<0.05)，说明饲料营养 价值显著影响肉用性能(P<0.05)，全混青贮对青年奶水牛肉用性能未产生负面影响。
[0132] 4.结论
[0133] 从本次试验结果看：
[0134] (1)甘蔗尾叶全混青贮不但利于长期保存，提高青贮品质，且与单独青贮甘蔗尾+精料 相比，提高青年奶水牛采食量、日增重，差异不显著(P>0.05)。
[0135] (2)而与单独饲喂新鲜甘蔗尾和青贮甘蔗尾相比显著提高日增重、采食量和肉品质 (P<0.05)。
[0136] 虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的
修改和完善，因此本发明的保护范围当以权 利要求书所界定的为准。
