毕赤酵母的高效生产及其在促进植物和动物健康中的用途
阅读：1044发布：2020-05-30
专利汇可以提供毕赤酵母的高效生产及其在促进植物和动物健康中的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包括培养的 微 生物 和/或其生长的副产物的微生物基组合物，以及产生和使用这些组合物的方法和系统。更具体地，本发明提供了包括选自毕赤 酵母 进化枝的生物学上纯的酵母和/或其如生物 表面活性剂 、酶和 溶剂 的生长的副产物的微生物基组合物。还提供了使用这些组合物以提高农业、 园艺 、畜牧饲养和 水 产养殖的产量的方法。，下面是毕赤酵母的高效生产及其在促进植物和动物健康中的用途专利的具体信息内容。
1.一种用于提高农业、园艺、畜牧业和/或水产养殖产量的组合物，所述组合物包括一种或多种生物学上纯的毕赤酵母属进化枝酵母和/或其生长的副产物，以及任选地包括载体。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述酵母是异常毕赤酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母或其组合。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述酵母是异常毕赤酵母。
4.权利要求1所述的组合物，其进一步包括佐剂，所述佐剂选自富里酸、腐殖酸和腐植酸盐。
5.权利要求1所述的组合物，其进一步包括用于微生物生长的添加营养物。
6.权利要求1所述的组合物，其中微生物生长的副产物是酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸和/或生物表面活性剂。
7.权利要求1所述的组合物，其中微生物生长的副产物包括植酸酶。
8.一种提高产业的产量的方法，所述产业选自农业、园艺、畜牧业和水产养殖，其中所述方法包括将有效量的权利要求1-7所述的组合物施加于与所选产业相关的目标位点。
9.权利要求8所述的方法，其中所述目标位点是植物、真菌、动物和/或其周围环境。
10.权利要求8所述的方法，其用于预防和/或治疗由有害的单细胞或多细胞生物体引起的感染、侵染和/或病害，所述生物体包括细菌、病毒、真菌、寄生虫和/或线虫。
11.权利要求10所述的方法，其用于控制线虫。
12.权利要求8所述的方法，其中将所述组合物施加于土壤。
13.权利要求12所述的方法，其中所述方法导致农作物产量增加。
14.权利要求12所述的方法，其用于治疗和/或预防植物的营养缺乏。
15.权利要求14所述的方法，其中所述营养缺乏是缺磷。
16.权利要求8所述的方法，其中所述组合物作为膳食补充剂与动物的饲料和/或动物的饮用水一起配制或将所述组合物作为膳食补充剂施加于动物的饲料和/或动物的饮用水。
17.权利要求16所述的方法，其用于治疗和/或预防动物的营养缺乏。
18.权利要求17所述的方法，其中所述营养缺乏是缺磷。
19.权利要求8所述的方法，其中将所述组合物作为养殖鱼的膳食补充剂施加于鱼的环境或鱼饲料。
20.权利要求19所述的方法，其用于治疗和/或预防养殖鱼的营养缺乏。
21.权利要求20所述的方法，其中所述营养缺乏是缺磷。
22.权利要求9所述的方法，其进一步包括在将微生物和/或其生长的副产物施加于目标位点之前对其进行培养。
23.权利要求22所述的方法，其中所述微生物在可分配反应器内的培养基中培养，所述培养基包括：
糖蜜，4％，
脲，0.2％，和
蛋白胨，2.5％。
毕赤酵母的高效生产及其在促进植物和动物健康中的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
背景技术
[0003] 在农业、园艺、畜牧业和水产养殖中，某些常见问题阻碍了农民最大化生产产量同时保持较低成本的能力。这些问题包括但不限于，细菌、真菌和其他害虫和病原体引起的感染和侵染；饲料和化学肥料的高成本，包括其对环境和健康的影响；以及将基本营养物(尤其是磷酸盐)增溶为可用形式的难度。
[0004] 在农业和园艺产业中，农民已严重依赖于使用合成化学品和化学肥料来提高作物产量和保护作物免受病原体、害虫和病害侵害；但是，当这些物质被过度施用或施用不当时，它们会流到地表水中，渗入地下水，并蒸发到空气中。作为空气和水污染的源头，对这些物质的负责任使用是生态和商业上的当务之急。即使使用适当，但某些化学肥料和农药的过度依赖和长期使用也会有害地改变土壤生态系统、降低胁迫耐受性、增加害虫抗性并阻碍植物和动物的生长和活力。
[0005] 对于畜牧业和水产养殖，饲养成本可能很高。例如，喂养鱼群，特别是在大规模养殖的情况下，占水产养殖经营支出的主要部分。鱼食必须包含高度可消化的蛋白质源以及适当营养所需的全方位其他组分，包括氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质、胆固醇和必需脂肪酸。传统上，饲料来源已包括从如野生或养殖的鱼中产生的鱼粉，例如，鱼粉、虾粉和鱿鱼粉；但是，由于养殖和生产用于制作传统鱼饲料和鱼油饲料的鱼的成本增加，许多水产养殖已开始使用谷类饲料喂养鱼。如玉米、大豆、全麦和高粱等成分现在被用于生产鱼饲料。目前尚无谷类饲料对鱼类自身健康的影响的结论，但仍有可能造成长期不理想后果。
[0006] 大规模畜牧养殖通常依靠饲料谷物(如玉米和大豆)提供必要的碳水化合物、纤维和蛋白质，以实现动物最佳生长。这些食品产品对于胃最适合消化草和其他含高纤维素的植物的动物而言并不是最佳选择，这可能导致一系列问题。例如，依靠谷类饲料的畜牧养殖通常必须依靠抗生素来预防病害的传播，因为不合适的饮食，加上高度集中饲养操作的拥挤生存条件，导致动物的免疫系统受损。
[0007] 除了饲养和保护农作物及养殖动物的成本外，营养缺乏通常是这些行业持续存在的问题，尤其是缺磷。磷(磷酸盐形式)是遗传物质和三磷酸腺苷(ATP)的生物合成，以及所有生物体生长和活力的许多其他功能所必需的。为了预防或治疗植物的磷缺乏，种植者通常在土壤上施加含磷肥料。然而，将这些化合物施加于土壤并不能保证植物能够吸收和使用磷。一些形式的磷，如植酸盐，是不溶的，或是不能被植物的根吸收。植酸盐用作磷、能量、阳离子和肌醇(细胞壁前体)的储存物，其保持这种形式，无法被植物和非反刍动物利用。
[0008] 对于养殖动物，例如那些在土壤中植物可生物利用的磷含量低的地区放牧的动物，缺磷可导致包括不育、(例如，牛的)产奶量减少和(例如鱼类、哺乳动物和家禽的)骨矿化不足等问题。(例如，使用无机饲料磷酸盐的)膳食补充剂是解决这些问题的最常见的方法，但大规模使用时可能成本昂贵。
[0009] 为了满足全球对食品和消费品的可持续生产方法的需求，如细菌、酵母和真菌等微生物及其副产物在包括农业和园艺、动物饲养、林业以及土壤、水域和其他自然资源的修复的许多方面变得越来越有用，。例如，农民正欣然接受使用生物制剂，如活微生物、由其衍生的生物产品及其组合，作为生物农药和生物肥料。这些生物制剂比其他常规农药和肥料具有重要优势，包括：1)与常规化学药品相比，它们危害较小；2)它们更高效且具有更高的特异性；3)它们通常可快速生物降解，从而对环境的污染较少。
[0011] 因此，持续需要以低成本生产农作物、牲畜和鱼类的改进的、无毒的且环保的方法。特别是，需要产品用于治疗和预防农业、畜牧业和水产养殖中病害的传播和侵染；补充土壤以促进农作物生长；以及降低饲养牲畜和养殖鱼类的成本，而均不会损害农作物、动物和人类消费者的健康和活力。发明内容
[0012] 本发明提供了微生物及其生长的副产物，如生物表面活性剂、代谢物和/或酶。本发明还提供了使用这些微生物及其副产物的方法，以及产生它们的方法和系统。有利地，本发明的微生物基产品和方法环保、操作友好和成本效益。
[0013] 在优选的实施方式中，本发明提供了包括培养的微生物和/或其生长的副产物的微生物基组合物，以及生产这些组合物的方法及它们在农业、园艺、畜牧饲养和水产养殖中的使用方法。通常，微生物基组合物可用于预防和/或治疗植物和动物的感染或侵染；改良土壤并促进农作物生长；和/或促进牲畜和鱼类的生长和健康。
[0014] 更具体地，该微生物基组合物可用于通过控制由有害单细胞或多细胞生物体(包括但不限于真菌、细菌、寄生虫和线虫)引起的感染、侵染和/或病害来保护植物、人或动物；
提高产品产量和质量；富集土壤；补充牲畜饲料；和/或补充鱼类和水生动物饲料。本文还提供了用于此类用途的方法。
提高产品产量和质量；富集土壤；补充牲畜饲料；和/或补充鱼类和水生动物饲料。本文还提供了用于此类用途的方法。
[0015] 在具体实施方式中，所述微生物基组合物的微生物是选自毕赤酵母属进化枝的生物学上纯的酵母，例如，异常毕赤酵母(P.anomala)(异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus))、库德里阿兹威氏毕赤酵母(P.kudriavzevii)(库德里阿兹威氏威克汉姆酵母(Wickerhamomyces kudriavzevii))和/或季也蒙毕赤酵母(P.guilliermondii)(季也蒙梅耶洛酵母(Meyerozyma guilliermondii))，和/或其组合。还设想包括其他毕赤酵母属进化枝酵母，或与其密切相关的酵母(例如，属于相同属或科)，和/或其生长的副产物。
[0017] 该组合物中的酵母可以是活性形式或非活性形式。此外，该组合物还可以包含由酵母培养产生的发酵液，其尤其可以包含细胞组分和微生物生长的副产物，如生物表面活性剂、代谢物和/或酶。有利地，直接使用该组合物(即无需进一步稳定、保存和储存)，可以保持微生物的高活力、减少被外来物质和不理想微生物污染的可能性，并保持微生物生长的副产物的活性。
[0018] 在某些实施方式中，该微生物基组合物进一步包含载体。该载体可以是本领域已知的任何合适的载体，其允许酵母或酵母副产物以产品保持活力的方式被递送至目标植物、土壤、动物、鱼类等，或者，在无活性酵母的情况下，保持有效性必需的组分。
[0020] 该微生物基组合物可以配制成，例如，液体悬浮液、乳剂、冻干粉或喷雾干燥粉、丸剂、颗粒或凝胶。
[0021] 在某些实施方式中，例如，由于使用整体微生物培养物，因此本发明的组合物相对于如仅纯化的微生物代谢物具有优势。这些优势包括以下一项或多项：高浓度的甘露糖蛋白作为酵母细胞壁外表面的一部分；酵母细胞壁中存在β-葡聚糖；培养物中存在生物表面活性剂；培养物中存在溶剂(例如，乳酸、乙酸乙酯等)和其他代谢物(例如，维生素、矿物质、碳水化合物和蛋白质源)。当使用活性或非活性酵母时，存在这些优势。
[0022] 在某些实施方式中，微生物以及微生物的代谢物和其他副产物彼此协同作用。
[0023] 在一个实施方式中，本发明提供了通过在适于生长和产生生长的副产物的条件下培养本发明的微生物菌株来生产毕赤酵母属酵母的生长的副产物的方法；以及任选地，纯化副产物的方法。在一些实施方式中，生长的副产物未进行纯化，而是以粗制形态使用，例如，包括在其中产生它的发酵液。根据本发明的生长的副产物的实例包括酶、酸、溶剂、乙醇、蛋白质、氨基酸、生物表面活性剂和其他。在具体实施方式中，提供了用于生产植酸酶的方法。
[0024] 本发明进一步提供了提高产业的产量的方法，所述产业选自农业、园艺、畜牧业和水产养殖，其中将有效量的本发明的微生物基组合物施加于与所选产业相关的特定的施加位点或目标位点。施加位点将依赖于产业，并且可以包括，例如，植物和/或其环境或者动物和/或其环境。
[0025] 所述方法的施加可以包括将微生物基组合物直接施加于植物、动物和/或其周围环境。施加时微生物可以是活性(或有活力)或无活性的。
[0026] 在活微生物情况下，微生物可在施加位点原位生长并在原位产生任何活性化合物或生长的副产物。因此，可以在处理位点(例如，CAFO或养鱼场)容易且连续地获得高浓度的微生物和有益的生长的副产物。
[0027] 为此，该方法可包括添加材料以在施加期间促进微生物生长(例如，添加营养物以促进微生物生长)。在一个实施方式中，营养物来源可以包括，例如，氮、硝酸盐、磷、镁和/或碳。
[0028] 在一个实施方式中，该方法进一步包括在施加之前培养该微生物基组合物的步骤。优选地，该微生物基组合物在施加位点或附近培养，例如，距离施加位点少于100英里。
[0029] 在某些实施方式中，提供了治疗和/或预防农业、园艺、畜牧饲养和/或水产养殖中的感染、侵染和/或病害的方法，其中将本发明的微生物基组合物施加于植物、动物和/或其周围环境。在一些实施方式中，将该组合物直接施加于引起或已经引起感染、侵染和/或病害的生物体或害虫。
[0030] 在某些实施方式中，提供了富集土壤的方法，其中将本发明的微生物基组合物施加于土壤。有利地，这些方法可以增加产量并提高在土壤中生长的农作物和农产品的质量。此外，这些方法可通过回收土壤中存在的无法使用的磷酸盐并将其转化为可被植物吸收的形式以助于保存磷酸盐。
[0031] 在某些实施方式中，本发明使用该微生物基组合物来提供饲养牲畜和养殖鱼类的低成本材料和方法。例如，通过将该组合物与传统牲畜饲料一起引入饲槽中并允许牲畜摄取该组合物，可以将该组合物用作牲畜的高营养补充食物来源。例如，通过将该组合物引入鱼池或鱼缸并允许其中的鱼摄取该组合物，可以将该微生物基组合物用作鱼类的高营养补充食物来源。有利地，本发明可以用于降低饲养牲畜和养殖鱼类的成本，同时通过例如支持动物的生长和免疫系统以促进动物的生长和健康。
[0032] 在某些实施方式中，本发明提供了用于治疗和/或预防植物和/或动物的营养缺乏的材料和方法。在植物营养缺乏的情况下，该方法可以包括将该微生物基组合物施加于植物周围的土壤。在动物营养缺乏的情况下，该方法可以包括将该微生物基组合物施加于动物的饲料和/或饮用水。在一个实施方式中，营养缺乏是缺磷。
[0033] 有利地，可以在未将大量无机化合物释放到环境中的情况下使用本发明。另外，该组合物和方法利用可生物降解和毒理学上安全的组分。因此，本发明可以作为“绿色”处理用于提高农业、园艺、畜牧饲养和/或养鱼业的产量。附图说明
[0034] 图1显示了描绘用于确定异常毕赤酵母的植酸酶产生活性的磷酸盐浓度的图。
具体实施方式
[0035] 本发明提供包含培养的微生物和/或其生长的副产物的微生物基组合物，以及产生和使用这些组合物的方法。该微生物基组合物可以用于农业、园艺、牲畜饲养和水产养殖中，例如，用于预防和/或治疗植物和动物的感染或侵染；改良土壤并促进农作物生长；和/或促进牲畜和鱼类的生长与健康。
[0036] 在具体实施方式中，该微生物基组合物的微生物是选自毕赤酵母属进化枝的生物学上纯的酵母，例如，异常毕赤酵母(Pichia anomala)(异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus))、库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)(库德里阿兹威氏威克汉姆酵母(Wickerhamomyces kudriavzevii))、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)(季也蒙梅耶洛酵母(Meyerozyma guilliermondii))，和/或其组合。预期还包括其他毕赤酵母属进化枝酵母，或与其密切相关的酵母(例如，西方毕赤酵母)，和/或其生长的副产物。
[0037] 本发明还提供了提高产业的产量的方法，该产业选自农业、园艺、牲畜饲养和水产养殖，其中该方法包括将本发明的微生物基组合物施加于与该产业有关的特定位点。例如，施加位点可以是植物、动物和/或植物或动物周围的环境。
[0039] 如本文中使用的，提及“微生物基组合物”意指包含作为微生物或其他细胞培养物生长的结果所产生的组分。因此，该微生物基组合物可以包含微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可以处于营养状态、孢子形式、菌丝体形式、任何其他繁殖体形式或这些的混合物。微生物可以为浮游生物或生物膜形式，或者这二者的混合物。生长的副产物可以例如是代谢物(例如，生物表面活性剂)、细胞膜组分、表达的蛋白和/或其他细胞组分。微生物可以是完整的或裂解的。细胞可能完全不存在，或例如以每毫升组合物1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或1×1011个或更多细胞或繁殖体的浓度存在。如本文中使用的，繁殖体是可以形成新生和/或成熟生物体的微生物的部分，包括但不限于细胞、分生孢子、包囊、孢子(例如，生殖孢子、内生孢子和外生孢子)、菌丝体、芽孢和种子。
[0040] 本发明进一步提供“微生物基产物”，其是待要在实践中施加以获得预期结果的产物。该微生物基产物可以仅仅是从微生物培养工艺收获的微生物基组合物。可选地，该微生物基产物可以包含已经添加的其他成分。这些另外的成分可以包括例如稳定剂、缓冲剂、载体(例如，水或盐溶液)、用于支持进一步的微生物生长而添加的营养物、非营养物生长促进剂和/或有利于在已施加微生物和/或组合物的环境中追踪微生物和/或组合物的制剂。该微生物基产物还可以包含微生物基组合物的混合物。该微生物基产物还可以包含已经以某种方式(例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等)处理的微生物基组合物的一种或多种组分。
[0041] 如本文所用，“收获”是指从生长容器中移出一些或全部微生物基组合物。
[0042] 如本文所用，“分离的”或“纯化的”分子或化合物基本上不含与其在性质上相关的其他化合物，如细胞材料。纯化的或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含天然存在状态的侧翼基因或序列。纯化的或分离的多肽不含天然存在状态的侧翼氨基酸或序列。
[0043] 如本文所用，“生物学上纯的培养物”是从与其在性质上相关的材料中分离出的培养物。在优选的实施方式中，已经从所有其他活细胞分离培养物。在进一步优选的实施方式中，与其本质上存在的相同微生物的培养物相比，生物学上纯的培养物具有有利特征。有利特征可以是例如提高一种或多种期望的生长的副产物的产量。
[0044] 在某些实施方式中，纯化的化合物按重量计为目标化合物的至少60％(干重)。优选地，制剂按重量计为目标化合物的至少75％、更优选至少90％、并且最优选至少99％。例如，纯化的化合物按重量计为所需化合物的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。通过任何合适的标准方法测量纯度，例如，通过柱色谱、薄层色谱或高效液相色谱(HPLC)分析。
[0045] “代谢物”是指由代谢产生的任何物质(即生长的副产物)或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是有机化合物，其是起始材料(例如葡萄糖)、中间体(例如乙酰辅酶A)或代谢的终产物(例如正丁醇)。代谢物的实例包括但不限于生物聚合物、酶、酸、溶剂、醇、蛋白质、维生素、矿物质、微量元素、氨基酸和生物表面活性剂。
[0046] 如本文所用，“调节”可与改变(例如，增加或减少)互换。通过如本文所述的那些本领域已知的标准方法检测这种改变。
[0047] 本文提供的范围被理解为该范围内的所有值的简称。例如，1至20的范围应理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20组成的组中的任何数字、数字组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间十进制值例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，示例性范围1至50的嵌套子范围可以在一个方向上包括1至10、1至20、1至30和1至40，或者在另一个方向上包括50至40、50至30、50至20和是50至10。
[0048] 如本文所用，“减少”是指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的负变化。
[0049] 如本文所用，“参考”是指标准或对照条件。
[0050] 如本文所用，“表面活性剂”是指降低两种液体之间或液体和固体之间的表面张力(或界面张力)的表面活化剂。表面活性剂用作洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。“生物表面活性剂”是由活生物体产生的表面活性剂。
[0051] 如本文所用，“农业”是指用于食品、纤维、生物燃料、药物、化妆品、补剂、装饰目的和其他用途的植物和/或真菌的培养和繁殖。根据本发明，农业还可以包括园艺、美化环境、园林、植物保护、果园和树木栽培。本文的农业进一步包括土壤科学(例如，发生土壤学和农业土壤学)以及农学，或土壤、农作物生产的护理、监测和管理。
[0052] 如本文所用，“牲畜”是指在农业或工业环境中饲养以生产如食品、纤维和劳工的商品的任何驯养动物。“畜牧业”包括这些动物的繁殖、喂养、饲养(rearing)、养殖(husbandry)、管理和/或屠宰。牲畜可以自由放养，如在空旷的田地、农场或动物饲养企业中。术语牲畜中包括的动物类型可以包括但不限于羊驼、肉牛和奶牛、野牛、猪、绵羊、山羊、马、骡子、驴、骆驼、鸡、火鸡、鸭、鹅、珍珠鸡和乳鸽。
[0053] 如本文所用，“动物饲养企业”或“AFO”是指在12个月周期中的共45天或以上，动物已经、正在或将被圈养或限制和喂养或维持地段或设施(不包括鱼类养殖设施)，并且在设施的任何部分，在正常的生长期，作物、植被、草料的生长或收获后的残留物均不被维持。AFO实质上是利用人造结构和设备(用于饲养、温度控制、粪便管理等)代替土地和劳动力。
“CAFO”或“集中式AFO”是将大量动物集中在相对较小且狭窄的空间内的AFO，其空间大小符合环境保护机构定义的某些阈值。
“CAFO”或“集中式AFO”是将大量动物集中在相对较小且狭窄的空间内的AFO，其空间大小符合环境保护机构定义的某些阈值。
[0054] 如本文所用，“水产养殖(aquaculture)”、“水产养殖(aquafarming)”、“水产养殖(aquatic farming)”、“水产饲养(aquatic husbandry)”或“养鱼”是指在养鱼场中繁殖、饲养和收获水生动物。水产养殖可以是精养(依靠高密度人工圈地中养鱼的技术)，也可以是散养(在海洋、天然或人造湖、海湾河峡或其他水域中进行)。水产养殖包括从孵化场鱼类和贝类生产海鲜，这些鱼类和贝类在围栏、池塘、水箱、鱼缸、网箱或水道中将其生长到市场规模。另外，水产养殖包括海水养殖，这需要在开放海水或封闭海水中进行海洋生物的养殖。此外，水产养殖包括种群恢复或“增强”，其中孵化场鱼类和贝类被释放到野外，以重建野生种群或沿海栖息地。更进一步，水产养殖包括为水族馆贸易生产观赏鱼，以及饲养在鱼缸内的观赏鱼的饲养。可以养殖的种属包括淡水或咸水鱼和贝类，并且可以包括观赏鱼、食用鱼、运动鱼、诱饵鱼、甲壳类动物、软体动物、藻类、海菜或鱼卵。
[0055] 如本文所用，“养鱼场”是发生或可以发生水产养殖的任何水环境。根据本公开的养鱼场可以包括人造的或天然存在的所有类型的水环境或水环境的部分，包括池塘、灌溉沟渠、河流、湖泊、海洋、峡湾、水箱、鱼缸、网箱或水道。
[0056] 如本文所用，“害虫”是除人类之外的任何对人类或人类关注领域(例如，农业、园艺、牲畜养殖、水产养殖)具有破坏性、有毒害和/或有害性的生物体。害虫可能引起感染、侵染和/或病害。害虫可以是单细胞或多细胞生物体，包括但不限于病毒、真菌、细菌、寄生虫和/或线虫。
[0057] 如本文所用，“治疗”是指在任何程度上根除、减轻、改善、逆转或预防病症或疾病的程度、体征或症状，并且包括但不要求完全治愈该病症或疾病。治疗可以是治愈、改善或部分缓解病害。治疗还可以包括预防病症或疾病，如本文所用，其是指延迟病症或疾病的特定体征或症状的发作或进展。
[0058] 微生物基组合物
[0059] 本发明提供了微生物基组合物，其包含有益的微生物及其生长的副产物，如生物表面活性剂、代谢物、酸、溶剂和/或酶。本发明还提供了使用这些组合物促进农业、园艺、牲畜饲养和水产养殖的产量的方法。此外，本发明提供了用于生产微生物基组合物的材料和方法。
[0060] 有利地，根据本发明生产的微生物基组合物是无毒的(例如，摄入毒性大于5g/kg体重)，并且可以以高浓度施加而不会引起例如对人或动物的皮肤或消化道的刺激。因此，本发明在存在活生物体(如由人生产并供人食用的牲畜和鱼类)的情况下施加微生物基组合物时特别有用。
[0061] 在某些实施方式中，本发明的微生物是生物学上纯的嗜杀酵母。特别地，本发明利用属于毕赤酵母属的嗜杀酵母。甚至更特别地，在一个实施方式中，该微生物包括异常毕赤酵母(Pichia anomala)(异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus))、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)(季也蒙梅耶洛酵母(Meyerozyma guilliermondii))、库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)(库德里阿兹威氏威克汉姆酵母(Wickerhamomyces kudriavzevii))和/或其组合。
[0062] 本发明的微生物和微生物基组合物具有多种有益的性质，可用于提高农业、园艺、牲畜饲养和水产养殖的产量。例如，在一个实施方式中，该组合物包含生物表面活性剂。生物表面活性剂可以由于存在于组合物中的微生物的生长而存在于组合物中，或者生物表面活性剂可以由其他微生物单独生产，并以粗制和/或纯化形式添加到组合物中。例如，粗制形态的微生物生长的副产物可以包含产生它们的发酵液。
[0063] 生物表面活性剂抑制微生物粘附至各种表面、防止生物膜的形成，并具有强大的乳化和破乳性能。另外，生物表面活性剂能够减少例如养鱼场和鱼缸中水的表面和界面张力。
[0064] 在某些实施方式中，该组合物的生物表面活性剂是糖脂生物表面活性剂，如甘露糖基赤藓糖醇脂质、槐糖脂、鼠李糖脂或海藻糖脂质。生物表面活性剂还可以是脂肽，如表面活性素、伊枯草素、丰原素和地衣素。
[0065] 在具体实施方式中，该组合物包含一种或多种糖脂，如由例如拟酵母大量产生的甘露糖基赤藓糖醇脂质(MEL)，和由例如球拟酵母和毕赤酵母属酵母产生的槐糖脂(SLP)。
[0066] MEL和SLP表现出优异的水表面和界面张力降低性能、高效的乳化和破乳性能，并通过例如其抗真菌、抗菌、抗寄生虫和/或抗病毒特性表现出广泛的生化和生理影响。
[0067] 在某些实施方式中，一种或多种生物表面活性剂在组合物中的浓度为0.001至90重量％(wt％)、优选0.01至50wt％、并且更优选0.1至20wt％。生物表面活性剂可以进一步以约0.01g/L至约500g/L、约0.5g/L至约50.0g/L、约1.0至约10.0g/L或约2.0至约5.0g/L存在。
[0068] 在某些实施方式中，该组合物还包含微生物酶。这些酶可以由于微生物在其中的生长而存在于组合物中，或者可以单独生产并以粗制和/或纯化的形式添加到组合物中。例如，粗制形态的酶可以包含产生它们的发酵液。
[0069] 在具体实施方式中，该组合物包含植酸酶。有利地，本文所述的培养方法，除了所述的酵母种类的特定组合之外，还以非预期的高浓度和非预期效率的协同产生植酸酶。
[0070] 在某些实施方式中，植酸酶(或其他酶)在组合物中的浓度为0.001至90重量％(wt％)、优选0.01至50wt％、并且更优选0.1至20wt％。植酸酶(或其他酶)可以进一步以约
0.01g/L至约500g/L、约0.5g/L至约50.0g/L、约1.0至约10.0g/L或约2.0至约5.0g/L存在。
0.01g/L至约500g/L、约0.5g/L至约50.0g/L、约1.0至约10.0g/L或约2.0至约5.0g/L存在。
[0071] 在一些实施方式中，该组合物还包含另外的粗制形态或纯化的微生物生长的产物，如酶、生物表面活性剂、溶剂、酸、蛋白质、矿物质和/或维生素。
[0072] 粗制形态代谢物可以采取例如液体混合物的形式，该液体混合物微生物培养产生的发酵液中的代谢物沉淀物。该粗制形态溶液可包含约25％至约75％、约30％至约70％、约35％至约65％、约40％至约60％、约45％至约55％或约50％的纯代谢物。
[0073] 在某些实施方式中，本发明的微生物基组合物可以包含发酵液，该发酵液包含活性和/或无活性的培养物和/或由微生物产生的微生物代谢物和/或任何残留的营养物。发酵产物可不经提取或纯化直接使用。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。
[0074] 有利地，根据本发明，微生物基组合物可以包含其中生长有微生物的发酵液。该组合物可以是例如至少按重量计1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的发酵液。该组合物中生物质的量按重量计可以例如为0％至100％之间的任何值，包括其间所有百分比。
[0075] 发酵液的生物质含量可以为例如5g/l至180g/l或更高。在一个实施方式中，发酵液的固含量为10g/l至150g/l。
[0076] 微生物发酵
[0077] 本发明利用用于培养微生物并产生微生物代谢物和/或生长的副产物的方法。更具体地，本发明提供了用于生产生物质(例如，活细胞材料)、细胞外代谢物(例如，小分子和排泄的蛋白质)、残留营养物和/或细胞内组分(例如，酶和其他蛋白质)的材料和方法。
[0078] 本发明利用适于任何所需规模从小(例如实验室环境)到大(例如工业环境)的微生物培养和微生物代谢物生产的培养工艺。这些培养工艺包括但不限于深层培养/发酵、固态发酵(SSF)及其组合。
[0079] 如本文所用，“发酵”是指细胞在受控条件下的生长。该生长可以是有氧的或厌氧的。
[0080] 根据本发明使用的微生物生长容器可以是任何工业用发酵罐或培养反应器。在一个实施方式中，容器可具有功能控制/传感器或可连接至功能控制/传感器以测量培养工艺中的重要因素，如pH、氧气、压力、温度、搅拌器轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。
[0081] 该容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，细胞数量和生长期的测量)。可选地，可以从容器中取出每日样品，并通过本领域已知的技术(如稀释涂布技术)进行计数。
[0082] 在优选的实施方式中，包括多个微生物生长容器的微生物生长设施以期望的规模产生新鲜的、高密度的微生物和/或目标微生物生长的副产物。微生物生长设施可以位于施加位点或附近。该设施以分批、准连续或连续培养的方式生产高密度的微生物基组合物。
[0083] 分布式微生物生长设施可以位于将使用微生物基产品的位置(例如，田间或养鱼场)。例如，微生物生长设施距离使用地点可能不到300、250、200、150、100、75、50、25、15、
10、5、3或1英里，或可以直接位于使用地点。
10、5、3或1英里，或可以直接位于使用地点。
[0084] 在某些实施方式中，可以或不可以使用本地和/或分布式发酵方法来实现生产，这表示也可以根据本发明利用常规方法。然而，本文所述的本地和/或分布式微生物生长设施有利地提供了解决当前问题的解决方案，该问题是指对庞大的工业规模生产商的依赖，其由于上游加工延迟、供应链的瓶颈、不适当的存储和阻碍有用产品的及时交付和应用的其他突发事件而导致产品质量下降。
[0085] 微生物生长设施产生新鲜的微生物基组合物，其包括微生物本身、微生物代谢物和/或在其中生长微生物的发酵液的其他成分。如有需要，该组合物可以具有高密度的营养细胞、无活性细胞、繁殖体或营养细胞、无活性细胞和/或繁殖体的混合物。
[0087] 微生物生长设施通过定制微生物基产品来改善与目的地地理位置的协同作用，从而提供生产通用性。例如，本发明的系统能够利用天然存在的本地微生物及其代谢副产物的能力。可以基于例如耐盐性、在高温下生长的能力和/或产生某些代谢物的能力来鉴别本地微生物。
[0088] 由于微生物基产品是在施加位点或附近产生的，不需要常规生产的稳定、保存、长期存储和广泛的运输过程，可以产生更高密度的活的(或无活性的)微生物和/或其繁殖体，从而需要用于现场施加的体积较小的微生物基产品，或在必要时允许更高密度的微生物施加。这减少了被外来物和不想要的微生物污染的可能性，维持了微生物生长的副产物的活性，并允许高效地按比例缩小的生物反应器(例如，较小的发酵罐和较小体积的起始原料、营养物、pH控制剂、消泡剂等)，没有理由去使细胞稳定。本地生产的高密度、稳健的微生物培养物在该领域比经过营养性细胞稳定或已经进入供应链已有一段时间的微生物更为有效。
[0089] 微生物基产物的本地生产也促进了发酵液在产物中的掺入。发酵液可以包含发酵过程中产生的特别适合本地使用的试剂。这进一步促进了产品的便携性。
[0090] 减少的运输时间允许根据当地需求所需的时间和体积生产和运送新鲜批次的微生物和/或其代谢物。在例如发酵的24小时内的本地生产和运送，产生纯的、高细胞密度的组合物，并且大大降低了运输成本。鉴于在开发更有效且更强大的微生物接种剂方面有快速发展的前景，消费者将从这种快速运送微生物基产品的能力中受益匪浅。
[0091] 在一个实施方式中，无论是使用常规方法还是使用本地或分布式系统进行的培养方法，均利用包含糖蜜(molasses)、脲和蛋白胨的培养基。
[0092] 在一个实施方式中，糖蜜的浓度为2至6％、优选为4％。在一个实施方式中，脲的浓度为0.01至1.0％、优选为0.2％。在一个实施方式中，蛋白胨的浓度为1.0-5％、优选为2.5％。
[0094] 培养方法可以为生长的培养物提供氧合作用。一个实施方式利用空气的慢速运动除去含低氧的空气并引入含氧空气。含氧空气可以是通过包括用于机械地搅动液体的叶轮和用于向液体供应气体气泡以将氧气溶解到液体中的空气喷布器的机构每天补充的环境空气。
[0095] 该方法可以进一步包括给培养物补充碳源。碳源通常是碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和/或麦芽糖；有机酸，如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇，如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；油脂，如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和/或亚麻子油。这些碳源可以单独使用或两种以上组合使用。
[0096] 在一个实施方式中，培养基中包含微生物的生长因子和微量营养素。当生长的微生物无法产生它们所需的所有维生素时，这是特别优选的。培养基中还可以包含无机营养物，包括微量元素，如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，维生素、必需氨基酸和微量元素的来源可以包括，如以细粉(flour)或粗粉(meal)的形式，如玉米粉，或以提取物的形式，如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等，或以纯化形式。还可以包括如对蛋白质的生物合成有用的那些氨基酸，例如，L-丙氨酸。
[0097] 在一个实施方式中，还可以包括无机盐。可用的无机盐可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或两种以上组合使用。
[0098] 在一些实施方式中，用于培养的方法可以进一步包括在培养工艺之前和/或培养工艺期间在液体培养基中添加另外的酸和/或抗菌剂。抗菌剂或抗生素可用于保护培养物免受污染。例如，可以将链霉菌属红霉素、啤酒花或啤酒花酸和/或少量例如50-100ppm的槐糖脂或其他生物表面活性剂作为抗菌剂加入营养培养基中。另外，还可以添加消泡剂，以防止在培养过程中产生气体时泡沫的形成和/或累积。
[0099] 混合物的pH值应适合目标微生物。可以使用缓冲剂和pH调节剂(如碳酸盐和磷酸盐)将pH稳定在优选值附近。pH控制也可以用于防止培养物的污染。例如，可以在适合酵母生长的低pH(例如，3.0-3.5)下开始培养，然后在酵母累积后增加pH(例如，增加至4.5-
5.0)，并在剩余的发酵中稳定pH。当金属离子以高浓度存在时，可能需要在液体培养基中使用螯合剂。
5.0)，并在剩余的发酵中稳定pH。当金属离子以高浓度存在时，可能需要在液体培养基中使用螯合剂。
[0100] 微生物可以以浮游生物形式或生物膜形式生长。在生物膜的情况下，容器中可以具有基质，微生物可以以生物膜的状态生长在基质上。该系统还可以具有例如施加鼓励和/或改善生物膜生长特性的刺激(如剪切应力)的能力。
[0101] 在一个实施方式中，用于培养微生物的方法在约5℃至约100℃、优选在15℃至60℃、更优选在25℃至50℃下进行。在另一实施方式中，可以在恒定温度下连续进行培养。在另一实施方式中，培养可以经历变化的温度。
[0102] 在一个实施方式中，该方法和培养工艺中使用的设备是无菌的。如反应器/容器的培养设备可以与消毒单元(例如，高压釜)分开但连接。培养设备还可以具有在开始接种之前原位灭菌的灭菌单元。以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，环境空气在被引入容器之前可以经过至少一个过滤器。在其他实施方式中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或者可选地，完全不加热，其中可以利用低水分活度和低pH来控制细菌的生长。
[0103] 在其他实施方式中，培养系统可以是自灭菌的，这表示被培养的生物体能够防止由于产生抗菌生长的副产物或代谢物而被其他生物体污染。
[0104] 在一个实施方式中，通过在适于其生长和产生的条件下培养本发明的微生物菌株来产生表面活性剂、酶、代谢物和/或其他蛋白质；以及可选地，纯化表面活性剂、酶、代谢物或其他蛋白质。根据本发明，可以生产和纯化已知由毕赤酵母属酵母产生的任何有益的生长的副产物。这些包括但不限于生物表面活性剂、酶(如外切-β-1,3-葡聚糖酶)、几丁质酶和植酸酶、溶剂、蛋白质、脂质、碳源以及矿物质和维生素(如维生素B1、B2、B3(PP)、B5、B7(H)、B6和E)。
[0105] 由目标微生物产生的微生物生长的副产物可以保留在微生物中或分泌到生长培养基中。在另一个实施方式中，用于产生微生物生长的副产物的方法可以进一步包括浓缩和纯化目标微生物生长的副产物的步骤。可选地，生长培养基可以包含稳定微生物生长的副产物活性的化合物。
[0106] 发酵液的生物质含量可以为例如5g/l至180g/l或更高。在一个实施方式中，发酵液的固含量为10g/l至150g/l。
[0107] 当需要从一个或多个生长容器中收获微生物基产品时，可以将微生物生长所产生的微生物和/或发酵液从生长容器中除去，并通过例如管道进行转移以立即使用。微生物可以是活性或非活性形式，或可以包含活性和非活性微生物的组合。
[0108] 还可以将组合物(微生物、发酵液或微生物和发酵液)放入适当大小的容器中，并考虑例如预期用途、预期施加方法、发酵罐的大小以及从微生物生长设施到使用地点的任何形式运输。因此，放置微生物基组合物的容器可以是例如1加仑至1,000加仑或更高。在某些实施方式中，容器是2加仑、5加仑、25加仑或更大。
[0109] 当将收获的产品放入容器和/或用管道输送(或以其他方式运输使用)时，可以添加其他组分。添加剂可以是例如缓冲剂、载体、在相同或不同设施下生产的其他微生物基组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物、示踪剂、农药和预期用途专用的其他成分。
[0110] 在一个实施方式中，在培养完成时(例如，在达到期望的细胞密度或发酵液中特定代谢物的密度时)除去(remove)所有微生物培养组合物。在此批次过程中，在收获第一批次后会启动一个全新的批次。
[0111] 在另一个实施方式中，在任何一次仅除去一部分发酵产物。在该实施方式中，具有活细胞的生物质作为新培养批次的接种剂保留在容器中。除去的组合物可以是无细胞发酵液或可以包含细胞。以这种方式，构建准连续系统。
[0112] 微生物基产品的制备
[0113] 本发明的一种微生物基产品仅仅是含有微生物和/或由微生物产生的微生物代谢物和/或任何残留营养物的发酵液。发酵产物可以不经提取或纯化直接使用。如有需要，可以使用文献中描述的标准提取和/或纯化方法或技术容易地实现提取和纯化。
[0114] 微生物基产品中的微生物可以以活性或非活性形式。微生物基产品可能包含活性和非活性微生物的组合。
[0115] 该微生物基产品无需进一步稳定，保存和存储即可使用。有利地，这些微生物基产品的直接使用保持了微生物的高活力，减少了被外来物质和不理想微生物污染的可能性，并保持了微生物生长的副产物的活性。
[0116] 可以将微生物生长产生的微生物和/或发酵液从生长容器中移出，并通过例如管道进行转移以立即使用。在其他实施方式中，如前所述，可以将组合物(微生物、发酵液或微生物和发酵液)放在适当大小的容器中。
[0117] 当从生长容器中收获微生物基组合物时，当将收获的产品放入容器和/或通过管道输送(或以其他方式运输使用)时，可以添加其他组分。添加剂可以是例如缓冲剂、载体、佐剂、以相同或不同的设备生产的其他微生物基组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养物、示踪剂、杀生物剂、其他微生物、非生物表面活性剂、乳化剂、润滑剂、缓冲剂、溶解度控制剂、pH调节剂、稳定剂、抗紫外线剂和预期用途专用的其他成分。
[0118] 在一个实施方式中，该组合物可进一步包含缓冲剂，其包括有机酸和氨基酸或其盐，以将pH稳定在优选值附近。微生物基组合物的pH应适合于目标微生物(microorganism of interest)。
[0119] 合适的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、乙酸盐、乳酸盐、草酸盐、天冬氨酸、丙二酸盐、葡庚糖酸盐、丙酮酸盐、半乳糖二酸盐、葡萄糖二酸盐、丙醇二酸盐、谷氨酸盐、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、胱氨酸、精氨酸及其混合物。还可以使用磷酸和亚磷酸或其盐。合成缓冲剂适于使用，但是优选使用天然缓冲剂，如有机酸和氨基酸或其盐。
[0121] 在一个实施方式中，微生物基组合物中可以包括其他组分，如盐的水溶液制剂，如碳酸氢钠或碳酸钠、硫酸钠、磷酸钠或磷酸二氢钠。
[0122] 有利地，微生物基产品可以包括其中生长有微生物的发酵液。该产品可以是例如至少按重量计1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的发酵液。该产品中生物质的量按重量计可以例如为0％至100％，包括其间所有百分比。
[0123] 在某些实施方式中，本发明的微生物基组合物进一步包含载体。该载体可以是本领域中已知的任何合适的载体，其允许酵母或酵母生长的副产物以使产品保持活力的方式递送至目标植物、土壤、动物、鱼类等，或在无活性酵母的情况下，其保留有效所需的成分。
[0124] 在某些实施方式中，特别是在农业的背景下，微生物基组合物可以进一步包含佐剂以增加组合物的功效。在一个实施方式中，佐剂选自富里酸、腐殖酸和腐植酸盐中的一种或多种。
[0125] 可选地，该组合物可以在使用前储存。储存时间优选较短。因此，储存时间可以小于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方式中，如果产品中存在活细胞，则将产品储存在冷温度下，例如，低于20℃、15℃、10℃或5℃。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以在环境温度下储存。
[0126] 在某些实施方式中，由于例如使用整体微生物培养物，因此本发明的微生物基产品相对于例如仅纯化的微生物代谢物具有优势。这些优势包括以下一项或多项：高浓度的甘露糖蛋白作为酵母细胞壁外表面的一部分；酵母细胞壁中存在β-葡聚糖；培养物中存在生物表面活性剂；培养物中存在溶剂和其他代谢物(例如，乳酸、乙醇、乙酸乙酯等)。当使用活性或非活性酵母时，存在这些优势。
[0127] 可以将微生物基组合物配制成例如液体悬浮液、乳液、冻干粉或喷雾干燥粉、颗粒、丸剂或凝胶形式的微生物基产品。可以预期其他制剂适合于特定施加。
[0128] 在一个实施方式中，特别是用于牲畜施加中，可以将微生物基产品配制成饲料丸剂，每个丸剂包含均匀浓度的预期微生物或微生物生长产物，例如，纯化的植酸酶。用于生产饲料丸剂的本领域已知方法可用于其生产，包括加压研磨。优选地，制粒工艺是“冷”制粒，或不使用高热量或蒸汽的工艺。
[0129] 在一个实施方式中，特别是用于水生施加中，培养微生物菌株以产生非活性的微生物基组合物。通过培养预期微生物，通过微流化(或通过本领域已知的不引起蛋白质变性的任何其他方法)破坏微生物，巴氏灭菌并以浓缩形式添加到食品中以制备组合物。在一个实施方式中，失活发生在巴氏灭菌温度下(高达65℃至70℃持续足以使100％的酵母细胞失活的时间)，并且pH值升高至约10.0。这引起细胞的部分水解，并允许其中释放一些营养组分。然后，将组合物中和至pH值约为7.0–7.5，并混合各种水解组分。然后，所得的微生物基产品可以用于例如鱼饲料和养鱼场水的处理。
[0130] 由于例如高效地递送以下物质的能力，本发明的微生物基产品可以用于多种特有环境中：1)具有活性代谢物的新鲜发酵液；2)细胞和/或繁殖体和发酵液的混合物；3)具有高密度细胞的组合物，包括营养细胞和/或繁殖体；4)微生物基短期产品；5)远距离的微生物基产品。
[0131] 与其中细胞已与发酵生长培养基中存在的代谢物和营养物分离的传统产品相比，本发明的微生物基产品特别有利。
[0132] 根据本发明生长的微生物菌株
[0133] 根据本发明的系统和方法生长的微生物可以是例如细菌、酵母和/或真菌。这些微生物可以是天然的或遗传修饰的微生物。例如，可以用特定基因转化微生物以表现出特定特征。微生物也可以是预期菌株的突变体。如本文所用，“突变体”是指参考微生物的菌株、遗传变异体或亚型，其中与参考微生物相比，突变体具有一个或多个遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、重复、移码突变或重复扩增)。制备突变体的程序是微生物学领域众所周知的。例如，为此目的广泛使用紫外线诱变和亚硝基胍。
[0134] 在某些优选的实施方式中，微生物是被称为“嗜杀酵母”的任何酵母。如本文所用，“嗜杀酵母”是指特征在于其分泌毒性蛋白或糖蛋白的酵母菌株，该菌株本身具有免疫性。嗜杀酵母分泌的外毒素能够杀死酵母、真菌或细菌的其他菌株。例如，可以被嗜杀酵母控制的微生物包括镰刀菌和其他丝状真菌。这样的酵母可以包括但不限于威克汉姆酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、酵母属、孢汉逊酵母属、黑粉菌属德巴利氏酵母属、念珠菌属、隐球酵母属、克鲁维氏酵母属、球拟酵母属、拟威尔酵母属、接合酵母属和其他。
[0135] 在具体实施方式中，本发明利用属于毕赤酵母属的嗜杀酵母。甚至更具体地，本发明的微生物包括异常毕赤酵母(Pichia anomala)(异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus))、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)(季也蒙梅耶洛酵母(Meyerozyma guilliermondii))、库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)(库德里阿兹威氏威克汉姆酵母(Wickerhamomyces kudriavzevii))和/或其组合。如本发明所述，这三种毕赤酵母属微生物及其代谢物和其他生长的副产物(有时在本文中称为“3P”或“三重P”)在用于增强植物和动物健康时相互协同，以产生理想的结果。
[0136] 这些酵母具有可用于本发明的许多有益特性，包括它们产生有益代谢物的能力。例如，异常毕赤酵母能够具有外切-β-1，3-葡聚糖酶活性，使其能够杀死或抑制多种病原性真菌的生长。另外，如果培养5至7天，则异常毕赤酵母会产生生物表面活性剂，该表面活性剂能够降低水的表面/界面张力，并具有抗菌和抗真菌特性。
[0137] 库德里阿兹威氏毕赤酵母产生对几种人和动物病原体具有抗菌活性的代谢物，如大肠杆菌、粪肠球菌、克雷伯菌属、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和产碱假单胞菌。此外，库德里阿兹威氏毕赤酵母产生的毒素能够控制许多其他引起植物细菌疾病的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
[0138] 季也蒙毕赤酵母菌株产生水解酶，包括β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶。已知这些酶具有杀线虫(例如，抗南方根结线虫)和抗真菌(例如，抗灰霉菌)的性质。
[0139] 除了各种副产物之外，这些酵母还能够产生植酸酶，即一种可催化植酸(植酸盐或肌醇六磷酸盐)水解的磷酸酶。植酸是磷的一种不可消化的有机形式，在水解时会释放出可用形式的无机磷。
[0140] 此外，毕赤酵母属酵母是多种蛋白质(含有高达50％的干细胞生物量)、脂质和碳源以及各种矿物质和维生素(B1；B2；B3(PP)；B5；B7(H)；B6；E)的生产者。
[0141] 其他微生物菌株，例如包括能够累积大量酶、酸、蛋白质、生物表面活性剂、矿物质或维生素的其他微生物菌株，这些微生物菌株可用于提高农业、园艺、牲畜饲养和水产养殖的产量，还可以根据本发明使用。
[0142] 提高农业、园艺、畜牧业和水产养殖产量的方法
[0143] 在某些实施方式中，本发明提供了用于提高农业、园艺、畜牧业和/或水产养殖的产量的环境友好、有成本效益的材料和方法。更具体地，本发明提供了使用本发明的微生物基产品以改善培养植物、真菌和/或动物的健康和质量的方法。在一个实施方式中，提供了用于饲养牲畜和/或养殖鱼类的方法。
[0144] 具体地，本发明提供了提高选自农业、园艺、畜牧业和水产养殖的产业的产量的方法，其中将有效量的本发明的微生物基组合物施加于与所选产业相关的特定施加位点或目标位点。施加位点将依赖于产业，并且可以包括例如植物和/或其环境或者动物和/或其环境。
[0145] 如本文所用，将组合物或产品“施加”至目标或位点，或“处理”目标或位点是指使组合物或产品与目标或位点接触，使得组合物或产品可以对该目标或位点产生作用。该作用可以归因于例如微生物生长和/或代谢物、酶、生物表面活性剂或其他生长副产物的作用。施加或处理可以包括将微生物基组合物直接施加至植物、真菌、动物和/或其周围环境。
[0146] 施加可以进一步包括使组合物或产品直接与植物、植物部分和/或植物的周围环境(例如土壤)接触，或直接与动物、动物身体部分和/或动物的周围环境(例如动物的食物来源)接触。本发明的微生物基产品例如可以以液体或干粉、粉尘、颗粒、微粒、丸剂、可湿性粉剂、悬浮粉剂、乳剂、微胶囊、油、凝胶、糊剂或气雾剂的形式喷洒。
[0147] 在一个实施方式中，本发明允许将微生物基产品在农业和园艺环境中现场施加。本发明的微生物基产品可以例如通过灌溉系统、作为喷雾剂、作为种子处理剂施加于土壤表面，作物、植物或真菌表面和/或害虫表面。通过常规工具的机械施加或通过基于空中或地面的“无人机”的机器人施加也得到了促进。可以选择本发明的植物的任何部分进行处理，包括但不限于果实、花朵、鳞茎、叶子、谷物、根、种子和/或茎。
[0148] 在一个实施方式中，本发明允许将微生物基产品在畜牧业环境中现场施加。微生物基产品可以直接施加于动物，例如，口服、静脉内、皮下或局部用药或补充剂，或用于动物的食物和/或供水。微生物基产品还可以施加于动物的生活环境，例如，作为喷雾剂或涂层，施加于地面或围护表面，或直接施加于害虫表面。
[0149] 在一个实施方式中，本发明允许将微生物基产品在水生环境中现场施加。微生物基产品可以例如通过泵送、喷洒、倾倒或将组合物注入养鱼场的水中或通过例如将组合物涂覆或散布到养鱼场的各种表面墙壁或围护上而施加于鱼场。此外，该组合物可以例如以食物来源的形式施加于动物本身。
[0150] 施加时微生物可以是活的(或有活力)或无活性的。在活微生物的情况下，微生物可以在施加位点原位生长并在原位产生任何活性化合物或生长的副产物。因此，可以在处理位点(例如，CAFO或养鱼场)容易且连续地获得高浓度的微生物和有益的生长的副产物。
[0151] 为此，该方法可以进一步包括添加材料以在施加期间促进微生物生长(例如，添加营养物以促进微生物生长)。在一个实施方式中，营养源可包括例如氮、硝酸盐、磷、镁和/或碳。
[0152] 在一个实施方式中，该方法进一步包括在施加之前培养微生物基组合物。优选地，在施加位点处或附近培养微生物基组合物，例如，距离施加位点少于100英里。
[0153] 在一些实施方式中，提供了用于预防和/或治疗有害的单细胞或多细胞生物感染或侵染的方法；改良土壤并促进农作物生长的方法；和/或促进牲畜和鱼类的生长与健康的方法。
[0154] 在一个实施方式中，提供了一种用于治疗和/或预防感染、侵染、病害和/或其传播的方法。在具体实施方式中，有害的感染、侵染和/或病害由有害的单细胞或多细胞生物引起，包括但不限于对植物、真菌和/或农作物；牲畜和其他陆生动物；和/或鱼类和其他水生生物有害的真菌、细菌、寄生虫和/或线虫。
[0155] 在一个实施方式中，该方法包括将包含毕赤酵母属酵母和/或它们的生长副产物的微生物基组合物施加到位点，其中该组合物杀死和/或竞争性抑制有害真菌的生长；杀死和/或竞争性抑制有害的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长；杀死有害的蠕虫寄生虫；
和/或杀死有害的线虫。这些酵母各自具有独特的杀伤能力，它们的组合可以在例如有机农业、有机畜牧业和有机水产养殖业中产生有效的协同生物防治剂。
和/或杀死有害的线虫。这些酵母各自具有独特的杀伤能力，它们的组合可以在例如有机农业、有机畜牧业和有机水产养殖业中产生有效的协同生物防治剂。
[0156] 有利地，这些方法在不使用刺激性化学物质或抗生素的情况下提高了植物、牲畜和养殖鱼类的免疫和/或病原体防御能力。
[0157] 在具体实施方式中，该方法用于通过预防和/或治疗农业环境中的作物、植物和/或真菌的感染、侵染和/或疾病以提高农业产量。
[0158] 本发明有用的影响植物的细菌感染的实例包括但不限于，丁香假单胞菌致病变型；青枯雷尔氏菌；根癌农杆菌；水稻白叶枯病菌；野油菜黄单胞菌致病变型；地毯草黄单胞菌致病变型；解淀粉欧文氏菌；木质部难养菌；甘薯茎腐病菌和马铃薯黑胫病菌；果胶杆菌(和黑胫病)；番茄细菌性溃疡病菌和马铃薯环腐病菌、萨氏假单胞菌(和柑橘黄龙病菌。
[0159] 对于本发明有用的影响植物的病毒感染的实例包括但不限于，香石竹潜隐病毒组、青麻病毒属、大麦病毒属、马铃薯Y病毒组、玉米线条病毒属、杆状DNA病毒属、呼肠孤病毒科斐济病毒属、水稻病毒属、植物呼肠孤病毒属、真菌呼肠孤病毒属、黑麦草镶嵌病毒属、花叶病毒属、番薯属病毒属、大麦黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒属、黄化病毒组、菜豆金色花叶病毒属、弹状病毒科、番茄斑萎病毒属、豇豆花叶病毒属、南方菜豆花叶病毒属、蠕传病毒属、烟草脆裂病毒属、甜菜坏死黄脉病毒属、真菌传杆状病毒组、花生丛簇病毒属和马铃薯帚顶病毒属。
[0160] 线虫也可以使用本发明进行治疗。线虫的实例是孢囊线虫属(例如，大豆孢囊线虫、燕麦孢囊线虫和甜菜孢囊线虫)和球异皮线虫属(例如，马铃薯金线虫和马铃薯白线虫)的孢囊形成线虫；毛刺线虫属的短粗根线虫；茎线虫属的鳞球茎茎线虫；金色线虫，马铃薯孢囊线虫；根结线虫属(例如，爪哇根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和南方根结线虫)的根结线虫；短体线虫属(例如，古氏短体线虫、穿刺短体线虫、最短尾短体线虫、玉米短体线虫、咖啡短体线虫、最短尾短体线虫和索氏短体线虫)的根腐线虫；半穿刺线虫属的柑橘线虫，和刺线虫属(Belonalaimus)的刺线虫。
[0161] 该方法和组合物有用的其他植物或农作物病害包括引起枯萎病、溃疡病、腐烂、枯萎、锈病、炭疽病、细菌斑、根肿病、玉米黑穗病、瘿瘤、猝倒病、霜霉病和白粉病、疮痂病、叶斑、霉菌、花叶病毒、叶疱病和卷叶病的害虫和/或病原体。
[0162] 在另一个实施方式中，该方法用于通过预防和/或治疗牲畜和其他陆生动物的感染、侵染和/或病害以促进畜牧业。
[0163] 本发明的方法和组合物有用的病害的实例包括但不限于，念珠菌病、癣、牛呼吸道疾病综合征、黑腿病(梭菌属)、牛呼吸道合胞病毒、牛病毒性腹泻、睡眠嗜血杆菌、牛传染性鼻气管炎、溶血性巴氏杆菌和多杀性巴氏杆菌、狂犬病、禽痘、流行性感冒、新城疫、传染性鼻炎、禽霍乱、大肠杆菌病、波氏杆菌病、曲霉病、支原体、东部马脑炎、肉毒中毒、出血性肠炎、沙门菌属、溃疡性或坏死性肠炎、白痢、禽伤寒、球虫亚纲、蠕虫(例如，蛔虫、鞭虫、肾蠕虫)、黑头粉刺、葡萄球菌属、链球菌属、细小病毒、钩端螺旋体病和其他。
[0164] 在另一实施方式中，该方法用于通过预防和/或治疗养鱼场中的鱼类和其他水生和/或海洋生物的感染、侵染和/或病害来提高水产养殖的产量。优选地，将根据该实施方式的微生物基组合物的酵母以灭活状态施加于养鱼场。
[0165] 本发明方法和组合物有用的病原体的实例包括但不限于，病毒(例如，水生双RNA病毒属、β野田村病毒属、正粘病毒、甲病毒属、弹状病毒和蛙病毒属)，细菌(例如，荧光假单胞菌、气单胞菌、爱德华氏菌属、黄杆菌属、弗朗西丝菌属、发光杆菌属、鱼立克次氏体属、假单胞菌属、黄杆菌属、弧菌属、耶尔森氏菌属、乳球菌属、肾杆菌属和链球菌属)，真菌(例如，水霉属、曲霉属、青霉属、外瓶霉属、鱼孢霉、鳃霉属、肤胞虫、原壁菌属、颤藻菌属、草茎点霉和拟青霉属)，水霉菌(例如，水霉属)和寄生虫(例如，线虫、绦虫、蛔虫、水蛭、虱子，后生动物的寄生虫(如桡足类)，单细胞寄生虫(如多子小瓜虫)和蠕虫(如胃瘤线虫属)。
[0166] 使用本发明可以减轻或预防的水生病毒病害包括但不限于，传染性胰腺坏死、病毒性神经坏死、鲑鱼贫血病毒、胰腺病、传染性造血坏死病毒和病毒性出血性败血病病毒，以及流行性造血坏死病毒。
[0167] 使用本发明可以减轻或预防的水生细菌病害包括但不限于，腐鳍病、鱼浮肿、运动性气单胞菌败血症、疖病、金黄杆菌病、鲶鱼肠道败血症、爱德华病或腐烂病、柱形病、假柱形病、黄杆菌病或虹鳟鱼苗综合征、细菌性鳃病、弗朗西丝菌病、冬季溃疡病、巴氏杆菌病、鱼立克次氏体病或立克次体败血病、假单胞菌败血症或红斑病、屈挠杆菌病、弧菌病、耶尔森氏菌病或肠红嘴病、乳球菌病、诺卡氏菌病、细菌性肾病、葡萄球菌病、链球菌病和出血性败血病。使用本发明可以减轻或预防的其他水生疾病或侵染包括烂鳃病、鱼孢霉病、水霉病、天鹅绒病、头洞症和眩晕症。
[0168] 在本发明的另外实施方式中，提供了通过富集土壤以提高农业产量的方法，其中本发明的微生物基组合物被施加于土壤。通过将包含一种或多种栽培毕赤酵母属酵母的组合物以及可选地一种或多种佐剂施加于土壤，本发明的方法可以提高作物产量并提高由于例如有益微生物代谢物(植酸酶、氨基酸、蛋白质、维生素和微量元素)的存在而生长的产品和植物产品的质量。在具体实施方式中，佐剂是富里酸、腐植酸和/或腐植酸盐。
[0169] 有利地，植酸酶的存在允许治疗和/或预防植物中的营养缺乏。特别地，当将本发明施加于植物周围的土壤时，可用于治疗和/或预防植物中的缺磷。
[0170] 在另一实施方式中，本发明可以用于磷酸盐保存。当磷酸盐以不溶形式存在于土壤中时，它们会留在土壤中，无法用于植物的根系。通过将三重P产品添加到土壤中，磷酸盐可以转化为可被植物回收的可溶解的形式，。
[0171] 本发明进一步提供了使用本发明的微生物基组合物饲养牲畜的低成本材料和方法。在一个实施方式中，微生物基组合物作为膳食补充剂与动物的饲料或饮用水一起配制或微生物基组合物作为膳食补充剂施加于动物的饲料或饮用水。
[0172] 例如，通过将组合物与传统牲畜饲料一起引入食槽，并允许牲畜摄取该组合物，微生物基组合物可以用作牲畜的高营养补充食物来源。在一个实施方式中，可将组合物与饲料组分混合并配制成均匀的均质颗粒。作为食品补充剂，除其他好处外，微生物基产品可提供植酸酶以及氨基酸、蛋白质、维生素和微量元素的其他来源。
[0173] 在一些实施方式中，微生物基组合物可以进一步用于治疗和/或预防牲畜的营养缺乏。特别地，本发明可以通过使用植酸酶补充其饲料来源而用作膳食补充剂，以治疗和/或预防家畜缺磷。
[0174] 有利地，本发明可以例如通过支持其免疫系统并提供磷、氨基酸、蛋白质、维生素和其他微量元素的其他来源而用于降低饲养牲畜的成本，同时促进牲畜的生长和健康。
[0175] 在另一实施方式中，本发明提供了使用本发明的微生物基组合物饲养鱼类的低成本材料和方法。例如，通过将组合物引入鱼类的环境中并允许鱼类摄取组合物和/或饲料，微生物基组合物可以用作鱼类的高营养膳食补充剂。该组合物还可以施加于标准鱼饲料或与标准鱼饲料组合并饲养养殖鱼。有利地，本发明可以用于降低饲养养殖鱼的成本。
[0176] 在一些实施方式中，本发明提供了通过改善养殖鱼类的营养吸收来提高水产养殖产量的方法。具体地，当由本发明的微生物产生的生物表面活性剂被鱼摄取时，其通过改善鱼的消化道内对营养的吸收(包括脂溶性维生素)而有助于提高养殖鱼的整体健康和品质。
[0177] 该组合物可以例如以液体溶液的形式，或以干粉、粗粉、薄片或颗粒的形式施加于鱼类环境，如养鱼场的水。有利地，与用常规鱼粉饲养的鱼相比，摄入本发明组合物的鱼体重增加，其中大部分体重增加是由于身体蛋白质百分比增加和较低的身体脂肪百分比引起的。
[0178] 在另一实施方式中，本发明提供补充鱼饲养的方法以及降低鱼饲养成本的方法。本发明的微生物基组合物可以作为包含无活性酵母细胞的单细胞蛋白质源施加于鱼类环
境，其以浓缩量提供大量的蛋白质、碳水化合物、脂质、脂肪酸、氨基酸、矿物质和维生素。在一些实施方式中，微生物基组合物可以用于治疗和/或预防鱼中的营养缺乏。特别地，本发明可以通过向其饲料源补充植酸酶而用作治疗和/或预防养殖鱼类中缺磷的膳食补充剂。
境，其以浓缩量提供大量的蛋白质、碳水化合物、脂质、脂肪酸、氨基酸、矿物质和维生素。在一些实施方式中，微生物基组合物可以用于治疗和/或预防鱼中的营养缺乏。特别地，本发明可以通过向其饲料源补充植酸酶而用作治疗和/或预防养殖鱼类中缺磷的膳食补充剂。
[0179] 由于传统的鱼和鱼油来源的饲料成本上涨，许多水产养殖业已开始使用谷类饲料饲养鱼。玉米、大豆和高粱等成分现在被用于生产鱼饲料。目前尚无定论谷物饲料对鱼自身健康的影响，但随着时间仍有可能成为不理想的。
[0180] 另外，例如，海产食品工业的成功部分依赖于人食用海产品的有吸引力的健康益处，如高水平的欧米伽-3脂肪酸。通过将养殖鱼从肉食性或杂食性饮食过渡到严格的植物性饮食，最终鱼产品的营养成分可以改变，例如，鱼产品中的脂肪酸含量可以降低。这种变化对海鲜产业以及人类营养的影响可能是广泛的。
[0181] 因此，通过充当现有鱼饲料的补充剂，本发明可以用于减轻使用传统的鱼基鱼饲料增加的成本。本发明可以降低饲养鱼的成本，同时允许恢复到传统的鱼基饲料，而所有这些都不会损害养殖鱼的健康和质量。
[0182] 实施例
[0183] 从以下通过说明的方式给出的实施例可以更好地理解本发明及其许多优点。以下实施例说明了本发明的一些方法、应用、实施方式和变体。它们不应被视为限制本发明。可以对本发明进行许多改变和修饰。
[0184] 实施例1–毕赤酵母属酵母产品“三重P”的培养
[0185] 为了降低培养用于本发明的毕赤酵母属酵母的成本，并建立低成本和高效的酵母工业规模化生产，提供了一种发酵系统和方法。
[0186] 通过使用非常规技术在有效促进生长和代谢物产生的有氧条件下培养酵母，即可完成三重P的生产。优选地，每个毕赤酵母菌株均单独培养，然后使用机械混合器将所得培养物组合以形成三重P产物。
[0187] 有利地，本发明的系统和方法对于任何规模的操作均是低廉的，并且可以生产几乎无限量的酵母基产物。此外，该系统可由例如以前很少或根本没有发酵系统经验的农民或种植者操作。
[0188] 发酵在可扩展的反应器中分批进行，优选不搅拌。利用便携式可分配反应器，其包括立式平行六面体罐。该系统配备有一个混合系统，该混合系统包括两个管道系统，每个管道系统都配备有一个泵送机构，用于将培养物从罐的底部抽出并沉积到罐的顶部。空气压缩机用于将过滤后的空气添加到系统中，以便为移动的培养物通气。
[0189] 过滤后的空气向罐中的添加由通过鼓泡器运行的喷射机构控制。用于喷射的过滤空气是通过大容量水生抽水系统产生的。每个罐总共有两个72英寸的鼓泡器。
[0190] 该反应器的工作容积为550-1,000升，用于生长酵母以生产细胞和代谢物。但是，反应器的尺寸、材料(例如金属)和配置可能会有所不同(取决于要求)。
[0191] 由于不使用传统方法对反应器进行灭菌，因此降低了培养物的生产成本。相反，对于毕赤酵母的生产，嗜杀酵母具有自我杀菌的能力，即它们的生长副产物控制任何可能污染培养物的外来微生物。此外，可以使用空容器卫生设备的方法，该方法包括用1％过氧化氢处理内表面，并用漂白剂和高压热水冲洗。
[0192] 反应器接种可以通过20至30升活跃生长的培养物进行，以确保接种材料中存在所需的毒素和/或其他生长副产物，并防止可能的污染物繁殖，或者使用浓缩的毕赤酵母上清液接种反应器。另外，接种可以在发酵周期开始的12小时后从pH值2.5-3.5开始并增加到4.5-5.0。
[0193] 发酵的温度和pH不是关键的，但是通常温度应在约25℃至小于37℃之间，优选在约25℃至30℃之间。pH水平应在约3.0至约5.0之间，优选在约3.5至约4.5之间。发酵过程中不需要稳定pH，但是如果pH低于3.0，建议将pH升高至3.5-4.0。
[0194] 如有需要，可以使用本领域常规的手动或自动技术，例如使用用于添加碱的自动pH控制器，以完成发酵过程中pH的控制或维持。用于pH控制的优选的碱包括但不限于NaOH和KOH。
[0195] 两种复合培养基，例如NYDB(每升水营养液体培养基，10g，酵母提取物，8g，葡萄糖20g)、PDB(马铃薯葡萄糖液体培养基)、ME(麦芽提取物)和化学成分明确的培养基，其中添加了多种碳源(如葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、糖蜜等)可用于通过发酵生产毕赤酵母。
[0196] 然而，如有需要，可以通过仅包含以下三个主要组分进一步降低培养基的成本。
[0197] 试剂 浓度(g/L) 重量(g)酵母提取物 5 5,000
葡萄糖 30 30,000
脲 1 1000
葡萄糖 30 30,000
脲 1 1000
[0198] 典型的生长时间为48小时至72小时，CFU浓度为6至10亿个细胞/ml。
[0199] 现成培养物是许多应用的最终产品。但是，如有需要，可以通过离心、过滤或沉淀来收获酵母细胞。可以通过添加盐、甘油、乳糖、海藻糖、蔗糖、氨基酸保存所得的酵母糊(湿生物质)，以延长存储期间的货架寿命。
[0200] 大多数市售酵母产品是通过高速离心从液体培养基中分离出酵母细胞而生产的。所收集的酵母细胞可以通过冷冻干燥、流化床干燥或喷雾干燥进行干燥。准备使用时，干燥的产品将在水中重新水化。这些步骤将损坏细胞壁并导致细胞死亡。
[0201] 如果必须在使用前将酵母细胞长时间保存，则应将其放在合适的容器中并在4℃下储存。使用此方法时，酵母细胞在两天内沉淀在容器底部。可以通过虹吸液体除去培养基上清液，仅留下少量上清液覆盖酵母细胞。在这些条件下，并且在储存六个月后，毕赤酵母细胞的活力未明显降低。
[0202] 实施例2–使用异常毕赤酵母计算植酸酶产量
[0203] 使用以下生长培养基(糖蜜(4％)、脲(0.2％)、蛋白胨(2.5％))，将异常毕赤酵母在pH调节至5.0的发酵反应器中生长72小时。
[0204] 通过将种子破碎/压碎，从芝麻中提取植酸。然后将种子部分(5g)添加到10mL水中并混合。检测培养基和细胞中植酸酶的存在。使用0.2M甘氨酸缓冲液将pH值调节至4，同时将植酸的pH值也调节至4。
[0205] 3天后，通过制备6种不同的标准品以检测植酸酶的活性：
[0206] 0)550微升水
[0207] 1)10微升的50mM磷酸钾和540微升的水
[0208] 2)20微升的50mM磷酸钾和530微升的水
[0209] 3)30微升的50mM磷酸钾和520微升的水
[0210] 4)40微升的50mM磷酸钾和510微升的水
[0211] 5)50微升的50mM磷酸钾和500微升的水
[0212] 使用500μL植酸、25μl0.2M甘氨酸缓冲液和25μl水制备15个植酸空白品。
[0213] 使用25μl植酸酶、25μl 0.2M甘氨酸缓冲液和500μl水制备15个植酸酶样品空白品。
[0214] 使用500μL植酸、25μl 0.2M甘氨酸缓冲液和25μl植酸酶制备15个植酸酶样品。
[0215] 将4ml丙酮-钼酸铵-H2SO4(50ml-25ml-25ml)的溶液添加到6个标准品的每一个中。
[0216] 将每个样品和空白品转移到37℃的水浴中30分钟。30分钟后，将4ml的丙酮-钼酸铵-H2SO4溶液快速添加到每个样品和空白品中以沉淀磷酸盐。然后将它们离心，将300μl上清液溶于600μl水中。
[0217] 接下来，将500μl所有样品、空白品和标准品上样至Varioscan设备孔板，并测量400nm处吸光度。
[0218] 测量标准品值3次，取它们平均值。从标准品1-5的每个值中减去标准品0值，以获得与特定浓度的磷酸盐的吸光度相关的数字。每个标准品的平均吸光度见表1。样品和空白品的平均吸光度见表1。
[0219] 表1.标准品0-5测得的平均吸光度(OD)和磷酸盐(mM)水平。
[0220]
[0221] 表2.样品和空白品的平均吸光度(OD)。
[0222]
[0223] 为了确定释放的磷酸盐的毫摩尔，将植酸酶样品空白品的平均吸光度与植酸空白品的平均吸光度相加，并从植酸酶样品的平均吸光度中减去。得到的数字为0.012OD。基于图1，释放的磷酸盐值为0.198mM。
[0224]
[0225] 最后，根据以上方程式1，计算反应器中的植酸酶浓度为792单位/ml。
[0226] 实施例3–三重P施加至番茄植株
[0227] 使用三重P产品处理番茄植株。番茄植株的高度增加20-25％。此外，产生的果实数量和果实大小均增加50％。
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