技术领域
[0001] 本
发明涉及一种高效饲料添加剂，具体为一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，属于饲料添加剂应用领域。
背景技术
[0002] 畜禽饲养业中畜禽
粪便铜、
铁、锌等重金属元素排放日益受到关注。重金属污染物通过
肥料在
土壤中的积累、迁移，不仅危害区域生态安全，影响动
植物的生长发育，而且通过食物链进入人体，对人体安全构成严重的威胁。
土壤污染治理具有持续时间长、污染隐蔽、无法被
生物降解、在不同地域反映出不同污染等特点。因此，解决土壤中畜禽粪便重金属元素污染是一个十分紧迫的问题。
[0003] 畜禽粪便重金属元素主要来源于饲料，解决的途径须从控制饲料微量元素的添加入手。值得指出的是：1）饲料中铜锌添加剂常为无机盐类，如
硫酸铜和
氧化锌等。但无机微量元素的利用率极低，常为10%-20%，没有被利用的大量金属元素随粪便排出污染环境。2）针对饲料高铜锌的危害，国内外正积极研发有机微量元素如蛋白微量元素
螯合物，这类产品化学性质相对稳定，吸收利用率较高。但由于金属元素与有机配位体之间只有一个结合点，螯合强度低，在不同的pH环境易解离，生物
稳定性和利用率不可控，尚未能工厂化标准生产。
[0004] 选用蒙脱石为载体。一方面，天然蒙脱石本身无毒无害且不被消化系统吸收，进入胃肠道后，附着于胃肠道粘膜上形成一层保护膜，阻止有害病毒、病原菌通过肠道进入血液；另一方面，蒙脱石具有特殊的 2:1 型层状结构形成的层间域与表面电荷以及层间可交换阳离子，具有大的表面积，
吸附能
力强，在
水溶液中形成稳定的悬浮物，可以将病毒、病原菌或各种毒素吸附在蒙脱石表面或层间，并随粪便排出体外，维持了消化道的健康。且国内外长期的研究应用中未见上述
硅基材料有毒和有危害性的报告。
[0005] 微量元素添加剂是畜禽生长所必需的，目前主要有无机微量元素、有机微量元素以及
氨基酸螯合物等形式。由于纳米微量元素可以不通过离子交换，直接渗透，进而可以提高
机体吸收和利用的速率，从而减少外源性微量元素的添加，降低环境负荷。因而纳米微量元素可能会成为新一代微量元素添加剂形式。有研究表明，饲料中添加纳米氧化锌(ZnO)比添加一般的ZnO具有高吸收率、用量小的特点，并且可以提高机体的非特异性免疫，增加采食量，提高胰岛素、胰岛素样生长因子等
激素的水平。鉴于此，结合
纳米技术，将天然硅基材料进行处理合成新型纳米硅基材料增强硅基材料的吸附、离子交换及催化作用。
发明内容
[0006] 本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法。
[0007] 本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，包括以下步骤：（1）载体天然蒙脱石的预处理
取1kg天然蒙脱石于烘箱中，经60 ℃干燥 48 h 后，使用行星
球磨机粉碎过200目筛，置于干燥器中保存；
（2）纳米小肽铜的制备
分别取小肽铜与蒙脱石于锥形瓶中，其中小肽铜与蒙脱石
质量比在5以上，加入50mL蒸馏水，然后将锥形瓶置于摇床上，以200r／min转速混匀，100min后，将溶液转移至离心管中离心，以800r/min转速离心5min后去上清液，重复上述操作至上清液透明，去除上清液所得沉淀即为纳米小肽铜；
（3）体外细胞培养
取传代后细胞达到80%融合的猪小肠上皮细胞，调整细胞悬液
密度约5×104ml／L，96孔培养板每孔加入100 ul细胞悬液，置于37℃，5%CO2的
培养箱中培养至细胞贴壁，贴壁后第二天
给药分别吸出96孔板各孔中的培养液，再用PBS溶液冲洗3次，然后分别加入预先配制的无血清液体培养基100μl，培养12、24、36小时后分别检测细胞活性、吸收效率、氧化应激结果。
[0008] 优选地，所述天然蒙脱石采购自内蒙古宁城天宇化工有限公司，其主要成分为SiO2 60.20％，Al2O3 13.80％，Fe2O3 1.40％，CaO 2.50％，MgO 2.00％。
[0009] 优选地，所述小肽铜螯合物采购自奥格生物科技有限公司。
[0010] 优选地，所述细胞活性检测方法采用CCK-8法，细胞活性计算公式如下：细胞活性（%）=[Ai-A空白]/[A0-A空白]×100
其中Ai指具有细胞、CCK溶液和铜培养液的孔的吸光度；A空白指具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；A0则表示具有细胞、CCK溶液而没有铜的孔的吸光度。
[0011] 优选地，所述氧化应激采用如下公式计算：数值表示＝ (处理组
荧光强度－空白组荧光强度)/(对照组荧光强度-空白组荧光强度)
其中细胞荧光图片采用Nikon荧光
显微镜拍照获得。
[0012] 优选地，述体外细胞培养中对照组为无血清液体培养基，实验组分别为含硫酸铜、小肽铜和纳米小肽铜的无血清液体培养基，每个实验组中铜浓度分别为0.5、1、2、4、8 mg/L，所述无血清液体培养基包括1640培养液40ml，胎
牛血清10ml，双抗1ml。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明公开了一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，提高了小肽微量金属螯合物的稳定性和生物利用率，提高猪小肠上皮细胞的细胞活性和吸收效率，并降低氧化应激。
附图说明
[0014] 图1为本发明天然蒙脱石处理前后对比图。
[0015] 图2为本发明天然蒙脱石粉末
X射线衍射图谱。
[0016] 图3为本发明天然蒙脱石对小肽铜的固载动力学曲线图。
[0017] 图4为本发明天然蒙脱石对小肽铜的固载平衡学曲线图。
[0018] 图5为本发明淋洗对天然蒙脱石对小肽铜的固载的影响图。
[0019] 图6为本发明纳米小肽铜随介质pH值变化曲线图。
[0020] 图7为本发明
温度对天然蒙脱石对小肽铜的固载的影响图。
[0021] 图8为本发明不同铜浓度对细胞活性的影响图。
具体实施方式
[0022] 下面将结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023] 本实施例中所使用的
试剂为分析纯，猪小肠上皮细胞（IPEC-1）购自上海雅吉生物有限公司；胰蛋白酶、1640培养基、无血清液体培养基、FBS血清购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
活性氧（ROS）测定
试剂盒购自南京建成生物有限公司；BCA试剂盒购自碧
云天生物技术有限公司。
[0024] 本实施例中所用到的实验仪器如表1所示。
[0025] 表1 实验仪器一种高效饲料添加剂纳米小肽铜的制备方法，包括以下步骤：
（1）载体天然蒙脱石的预处理；
（2）纳米小肽铜的制备；
（3）体外细胞培养。
[0026] 实施例1载体天然蒙脱石的预处理天然蒙脱石经60 ℃干燥 48 h 后，使用
行星球磨机粉碎过200目筛，置于干燥器中保存。对比天然蒙脱石预处理前后差异，并进行XRD粉末晶体衍射分析。
[0027] X射线衍射结果：天然蒙脱石为层状硅
铝酸盐，其粉末X射线衍射图谱如图2所示，其广
角衍射在l0°～50°基本没有衍射峰，但在5.9281°处有一明显衍射峰，通过布拉格公式可计算得到预处理后的天然蒙脱石层间距为1.49nm，衍射峰数据如表2所示。
[0028] 表2 预处理后的天然蒙脱石衍射峰数据实施例2纳米小肽铜的制备
取少量蒙脱石加入盛有足量小肽铜溶液的锥形瓶中，然后将锥形瓶置于摇床上，以
200r／min转速混匀，100min后，将溶液转移至离心管中离心。以800r/min转速离心5min后去上清液，重复操作至上清液透明，去除上清液所得沉淀即为纳米小肽铜。
[0029] 实施例3.1天然蒙脱石固载小肽铜动力学分析称取0.5g小肽铜于50ml具塞锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，摇匀后加入0.1g蒙脱石，将锥形瓶置于摇床上，200r／min转速。以10min为间隔，取清液0.1ml，以BCA蛋白定量法测定小肽铜含量，绘制固载动力学曲线。
[0030] 天然蒙脱石对小肽铜的固载动力学曲线见图3，结果表明天然蒙脱石对小肽铜的固载在100 min时达到平衡。
[0031] 实施例3.2天然蒙脱石固载小肽铜平衡学分析称取5份质量为0.1g的蒙脱石，分别加入20 mL梯度浓度为0.0025g/ml、0.005 g/ml、
0.0075 g/ml、0.01 g/ml、0.0125 g/ml的小肽铜溶液，置于摇床上，200 r／m in转速，固载平衡后，离心并测定其上清液小肽铜含量，绘制固载等温曲线。
[0032] 天然蒙脱石对小肽铜的固载平衡学曲线见图4，结果表明天然蒙脱石对小肽铜的最大固载量为1.81mg/mg。
[0033] 实施例3.3淋洗对固载程度的影响称取50 mg制备好的纳米小肽铜，用5mL pH为3.5
醋酸-
盐酸缓冲溶液反复洗涤纳米小肽铜三次，使用BCA法分别测试溶液中的
蛋白质含量。
[0034] 淋洗对固载的影响见图5，实验结果表明，蒙脱石固载小肽铜的游离率为60%，存在缓释特点，利于吸收，蒙脱石固载小肽铜的稳定性中等，相对容易被游离而重新进入溶液中当蒙脱石附着在胃壁、肠壁等消化系统内壁时，可以缓慢释放出游离的小肽铜，从而更容易被畜禽消化利用。
[0035] 实施例3.4 pH对固载的影响选用一系列离子强度相当的缓冲溶液作为介质进行纳米小肽铜的pH适应性实验，在pH=3.0～3.5范围内，选用甘氨酸-盐酸缓冲对；在pH=4.0-6.5范围内，选用乙酸-乙酸钠缓冲对；在pH=7.0-9.0范围内，选用Tris-盐酸缓冲对。
[0036] 畜禽消化器官为酸性环境，其体液介质pH值一般为3.5-7.0。纳米小肽铜随介质pH值变化曲线，见图6。由图6可看出，天然蒙脱石对小肽铜的固载量随pH的升高而降低，在酸性环境下，其固载量相对较高。在pH为7时，其固载量仍大于1。
[0037] 由此可见，纳米小肽铜可以比较稳定的存在于畜禽的消化系统中，不会因酸性环境而被破坏。
[0038] 实施例3.5温度对固载的影响取0.1g纳米小肽铜于40ml浓度为0.1g/ml的小肽铜溶液中，摇匀后离心，使用BCA法测定上清液中蛋白质浓度，将试管暴露于85℃高温下，分别测定高温0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后上清液中蛋白质浓度。
[0039] 温度对固载的影响如图7，结果表明，随高温时间的延长，蒙脱石对小肽铜的固载量逐渐增大。
[0040] 由此可见，在饲料制粒过程中产生的瞬间高温（85℃）不会影响纳米小肽铜的固载量。
[0041] 实施例4 体外细胞实验探究纳米小肽铜对猪小肠上皮细胞产生的影响取传代后细胞达到80%融合的猪小肠上皮细胞，调整细胞悬液密度约5×104ml／L，96孔培养板每孔加入100 ul细胞悬液，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养至细胞贴壁，贴壁后第二天给药，分别吸出96孔板各孔中的培养液，再用PBS溶液冲洗3次，然后分别加入预先配制的工作液100μl，培养12、24、36小时后分别检测细胞活性、吸收效率、氧化应激结果。
[0042] 体外细胞培养中对照组为无血清液体培养基，实验组分别为含硫酸铜、小肽铜和纳米小肽铜的无血清液体培养基，每个实验组中铜浓度分别为0.5、1、2、4、8 mg/L。
[0043] ①细胞活性测定CCK-8法检测细胞活性：向培养板每孔中加入10μL CCK-8溶液，混匀，随时观察
颜色变化情况，待颜色变为黄色就可以检测，一般为1～4小时。将96孔板放入酶标仪，
波长设为
450nm，检测各孔的吸光度。
[0044] 细胞活性计算公式如下：细胞活性（%）=[Ai-A空白]/[A0-A空白]×100，
其中Ai指具有细胞、CCK溶液和铜培养液的孔的吸光度；A空白指具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；A0则表示具有细胞、CCK溶液而没有铜的孔的吸光度。
[0045] 结果显示，纳米小肽铜组的细胞活性在浓度为4、8mg/L时与小肽铜组差异显著（P<0.05），其余组差别不大；两者在浓度为2、4、8 mg/L时均与硫酸铜组差异显著（P<0.05）。铜对细胞活性的促进作用最为明显，且纳米小肽铜组在浓度为4、8mg/L时与小肽铜差异显著（P<0.05），并都显著高于硫酸铜组，其余组差别不大。高浓度小肽铜抑制细胞生长，且纳米小肽铜组与小肽铜组间的差异随着浓度的升高逐渐扩大, 在4、8mg/L时差异显著（P<
0.05），其余组差别不大；两者在浓度为2、4、8 mg/L时均显著高于硫酸铜组。
[0046] ②吸收效率取104细胞，用5ml胰酶消化3分钟，然后用DPBS清洗细胞3次，800r/min离心10min，弃上清；第3次洗涤时记录细胞悬浮液体积，混匀后取出1mL用于细胞计数，用火焰-
石墨炉
原子吸收
光谱仪测定细胞样品中铜元素含量。
[0047] ③氧化应激细胞处理完成后PBS洗涤2遍，添加工作浓度为10μM的DCFH-DA探针孵育30 min，PBS洗2遍，添加新鲜培养基，采用荧光酶标仪测定荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为525 nm。
[0048] 采用如下公式计算：数值表示＝ (处理组荧光强度－空白组荧光强度)/(对照组荧光强度-空白组荧光强度)，
其中细胞荧光图片采用Nikon荧光显微镜拍照获得。
[0049] 综上所述，低浓度小肽铜（0-2mg/L）处理细胞，24h内会促进细胞生长，并随着铜的增多而增强；若培养液中铜浓度超过2mg/L时，促进作用减弱，并可能抑制细胞生长。当处理时间超过24h时，低浓度铜对细胞的促进作用减弱，高浓度铜的毒性作用更加明显。
[0050] 本实验结果说明了纳米小肽铜对细胞的促进作用更强，而毒性作用更弱。
[0051] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附
权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
[0052] 此外，应当理解，虽然本
说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
