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用于在 植物中赋予 除草剂耐受性的核酸构建体

阅读：1043发布：2020-07-10

专利汇可以提供用于在植物中赋予除草剂耐受性的核酸构建体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及核酸序列，当将该核酸序列引入到细胞中时，其赋予草丁膦乙酰转移酶和5-烯醇丙酮酰-3- 磷酸莽草酸合酶的表达。这些蛋白质可以赋予除草剂耐受性。，下面是用于在植物中赋予除草剂耐受性的核酸构建体专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种核酸分子，该核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性的核酸序列，或其互补体。
2.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性的核酸序列，或其互补体。
3.一种嵌合核酸分子，该嵌合核酸分子包含如权利要求1所述的核酸分子。
4.一种重组核酸载体，该重组核酸载体包含如权利要求1所述的核酸分子。
5.如权利要求1至4所述的核酸分子的用途，其中所述分子的表达赋予除草剂耐受性。
6.一种转基因宿主细胞，该转基因宿主细胞包含如权利要求1至4所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的转基因宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞或植物细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中该细菌细胞是大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；蜡样芽孢杆菌、土壤杆菌属或假单胞菌属细胞。
9.一种包含如权利要求7所述的转基因植物细胞的转基因植物、植物部分、植物组织、或植物细胞培养物。
10.根据权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
11.根据权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
12.根据权利要求9所述的转基因植物，其中所述植物选自下组，该组由以下各项组成：
玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、燕麦、草皮草、牧场草、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甘蔗、甜菜、烟草、大麦和油菜籽油菜。
13.一种如权利要求9所述的植物的任一代的子代，其中该子代包含与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性的核酸序列，或其互补体。
14.一种来自如权利要求9所述的转基因植物的任一代的繁殖体，其中该繁殖体包含与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性的核酸序列，或其互补体。
15.如权利要求14所述的繁殖体，该繁殖体进一步被定义为种子或插条。
16.一种产生具有除草剂耐受性的转基因植物的方法，该方法包括将如权利要求1所述的核酸分子引入植物中从而产生转基因植物，其中该核酸分子表达有效量的蛋白质以赋予除草剂耐受性。
17.一种产生具有除草剂耐受性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供如权利要求1至4所述的核酸分子；
b)将步骤(a)的核酸分子引入植物、组织培养物或植物细胞中以获得具有除草剂耐受性的转化的植物、转化的组织培养物、或转化的细胞；以及
c)使所述转化的植物生长、或者从该转化的组织培养物或转化的植物细胞再生转化的植物，由此产生具有除草剂耐受性的转基因植物。
18.一种产生转基因种子的方法，该方法包括以下步骤：
a)获得根据权利要求9所述的可育转基因植物；以及
b)使所述植物在适当的条件下生长以产生所述转基因种子。
19.一种产生具有除草剂耐受性的可育转基因植物的任一代的子代的方法，该方法包括以下步骤：
a)获得具有除草剂耐受性的可育转基因植物，该可育转基因植物包含如权利要求1所述的核酸分子；
b)从所述转基因植物收集转基因种子；
c)种植收集的转基因种子；以及
d)从所述种子使子代转基因植物生长，
其中所述子代相对于非转化的植物具有除草剂耐受性。
20.一种用于产生具有除草剂耐受性的转基因植物的方法，该方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交的步骤，其中所述第一或第二亲本植物是如权利要求9所述的植物，该步骤产生第一代子代植物，该第一代子代植物包含与SEQ ID NO:1具有至少
90％一致性的核酸序列，或其互补体。
21.一种用于产生具有除草剂耐受性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本物是如权利要求9所述的植物；
b)选择具有除草剂耐受性的第一代子代植物；
c)使第一代子代植物自交，从而产生多株第二代子代植物；以及
d)从第二代子代植物中选择具有除草剂耐受性的植物，
其中这些第二代子代植物包含与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性的核酸序列，或其互补体。

说明书全文

用于在植物中赋予 除草剂耐受性的核酸构建体

[0001] 关于序列表的电子提交的声明

[0002] 提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.§1.821提交的，名称为“80561_ST25.txt”，大小为31千字节，于2016年1月29日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表由此通过引用以其披露内容结合到本说明书中。
发明领域

[0003] 本发明通常涉及具有除草剂耐受性的转基因植物。特别地，本发明提供了当通过转化引入植物中时赋予对除草剂草甘膦和草铵膦的抗性的构建体。

[0004] 发明背景

[0005] 除草剂耐受性转基因植物是可广泛地商购的。在美国超过90％商业种植的玉米和大豆是除草剂耐受性转基因植物。广泛使用单一除草剂耐受性状可导致除草剂有效性的破坏。为了解决这个问题，可以产生携带针对多种类型除草剂的除草剂耐受性的转基因植物。

[0006] 一种主要的除草剂耐受性性状由谷氨酰胺合成酶的转基因表达赋予。谷氨酰胺合酶(GS)在大多数植物中构成用于植物细胞发育和生命的基本酶之一。已知GS将谷氨酸转化为谷氨酰胺。GS在大多数植物中参与了通过硝酸盐还原、氨基酸降解或光呼吸释放的氨的解毒的有效途径。因此，GS的有效抑制剂对植物细胞具有很强的毒性，并且可用作广谱除草剂。一类除草剂(其包括草丁膦和草铵膦)包括作为活性成分的GS抑制剂。通过引入编码草丁膦乙酰转移酶(PAT)的基因，已经使转基因植物对这类除草剂具有耐受性。基因PAT衍生自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)并赋予对草铵膦的耐受性。(美国专利号5531236、5646024、5648477和5276268)

[0007] 第二种广谱除草剂是N-膦酰基甲基-甘氨酸，通常称为草甘膦。草甘膦抑制莽草酸途径，导致包括氨基酸和维生素在内的芳香化合物的生物合成。具体地，草甘膦通过抑制酶5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)来抑制磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸转化为5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸。可以通过引入对草甘膦耐受的EPSPS来生产草甘膦耐受性植物。一个实例是转基因表达修饰的玉米EPSPS基因(在此称为ZmEPSPS；美国专利号6566587)的玉米事件GA21(美国专利号6040497)。

[0008] 草甘膦是一种叶面施用的、出苗后除草剂。草甘膦沿韧皮部移动，并已知在分生组织和新鲜、积极生长的组织(包括根、叶和雄性生殖组织)中本地化(Hetherington等，1999，J of Experimental Botany[实验植物学杂志]，50:1567-1576)。在表达EPSPS基因以赋予草甘膦耐受性的转基因植物中，在以草甘膦施用的商业速率恢复完全雄性可育转基因事件中可能存在问题(Heck等人，2005，Crop Science[作物科学]44:329-339；Green，2009，Weed Science[杂草科学]，57:108-117)。包含赋予对草甘膦的耐受性而不损害雄性生育力的基因的商业构建体的产生是不可预知的，并且需要大量的测试和实验。

[0009] 携带多种除草剂耐受性性状的转基因植物将为种植者提供更多的选择来管理杂草和作物周期。向种植者提供此类植物的策略是“叠加”除草剂耐受性性状。目前，通过育种和随后的筛选，经常堆叠转基因性状以使多种转基因性状融入单个商业种质。这些育种和筛选步骤对于需要引入这两种性状的各种种质而言是必需的。此外，对于许多农学上重要的作物而言，这两个性状需要作为数十种种质品种的杂种来维持。最后，多个因素(如不希望的性状的遗传连锁或基因重组)可以使来自两个不同基因座的两种性状进入单个种质品种的引入变得复杂。因此，产生如下核酸分子是有利的：携带多种除草剂耐受性性状，并且可以在转基因植物的基因组中的单个基因座处引入的核酸分子。

[0010] 发明概述

[0011] 本发明提供了任选地分离的核酸分子，该核酸分子与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性。本发明还提供了包含SEQ ID NO:1、由其组成或基本上由其组成的核酸分子、嵌合核酸分子、和/或重组核酸构建体或载体。本发明还提供了包含核酸序列、由核酸序列组成或基本上由核酸序列组成的核酸分子、嵌合核酸分子、和/或重组核酸构建体或载体，该核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性。

[0012] 本发明还提供了如在此描述的本发明的核酸分子的用途，其中所述核酸分子在细胞中的表达赋予除草剂耐受性。

[0013] 本发明还提供了转基因宿主细胞，该转基因宿主细胞包含如在此描述的本发明的核酸分子。以上描述的转基因宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。该转基因细菌细胞可以是大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；蜡样芽孢杆菌、土壤杆菌属或假单胞菌属细胞。该转基因植物细胞可以在转基因植物、植物部分、植物组织、或植物细胞培养物内发现。该转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。该转基因植物可以选自下组，该组包含以下各项：玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、燕麦、草皮草、牧场草、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甘蔗、甜菜、烟草、大麦和油菜籽油菜。

[0014] 本发明还提供了转基因植物的任一代的子代，其中所述转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子。本发明还提供了来自所述转基因植物的转基因种子和转基因繁殖体。

[0015] 本发明还提供了产生除草剂耐受性转基因植物的方法，该方法包括将如在此描述的本发明的核酸分子引入植物中从而产生转基因植物，其中该核酸分子能够以控制杂草的量表达除草剂耐受性基因。

[0016] 本发明还提供了用于产生除草剂耐受性植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供如在此描述的本发明的核酸分子；(b)将步骤(a)的核酸分子引入植物、组织培养物、或植物细胞中以获得具有除草剂耐受性的转化的植物、转化的组织培养物、或转化的细胞；以及(c)使所述转化的植物生长、或者从转化的组织培养物或转化的植物细胞中再生转化的植物，由此产生除草剂耐受性植物。本发明还提供了用于从以上描述的转基因植物中产生转基因种子的方法，其中将该植物在适当的条件下培养或生长以产生转基因子代种子。

[0017] 本发明还提供了用于产生除草剂耐受性可育转基因植物的任一代的子代的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得除草剂耐受性可育转基因植物，该转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子；(b)从所述转基因植物收集转基因种子；(c)种植收集的转基因种子；以及(d)从所述种子生长子代转基因植物，其中所述子代相比于非转化的植物具有增强的除草剂耐受性。

[0018] 本发明还提供了用于产生具有除草剂耐受性的植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本植物是转基因植物，该转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子；(b)选择具有除草剂耐受性的第一代子代植物；(c)使第一代子代植物自交，从而产生多株第二代子代植物；以及(d)从第二代子代植物中选择具有除草剂耐受性的植物，其中该第二代子代植物包含如在此描述的本发明的核酸分子。

[0019] 附图简要说明

[0020] 图1是二元载体18857的图形表示，该二元载体的核酸序列是SEQ ID NO:2。

[0021] 序列表的序列的简要说明

[0022] SEQ ID NO:1是转基因的核酸序列并包含表达盒，该表达盒包含ZmEPSPS和PAT编码序列。

[0023] SEQ ID NO:2是二元载体18857的核酸序列。

[0024] 发明详细说明

[0025] 应当理解的是，本发明不限于如在此描述的具体方法、实验方案、细胞系、植物种类或属类、构建体以及试剂。还应当理解的是在此使用的术语仅仅是出于描述具体实施例的目的并且不旨在限制本发明的范围，其将仅由随附的权利要求限制。应该注意的是，如在此和所附权利要求书中使用时，单数形式“一个/种(a)”、“和(and)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等等。如在此使用的，词语“或(or)”意指具体清单的任何一个成员并且还包括这个清单的成员的任何组合(即，还包括“和”)。

[0026] 术语“约”在此用于意指大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在此用于将数值限定至以20％的变化，优选10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，精确值(即，无“约”)是优选的。

[0027] 术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”以及其词形变化意指“包括但不局限于”。术语“由其组成”意指“包括并且局限于”。术语“主要由其组成”意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但条件是这些另外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。

[0028] 单位、前缀以及符号可以其SI公认的形式来表示。除非另外说明，分别以5′至3′的方向从左至右来书写核酸；以氨基至羧基的方向从左至右来书写氨基酸序列。数字范围包括界定范围的数字。氨基酸可在此由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可由其普遍接受的单字母代码来提及。以下定义的术语总体上参照说明书而更完整地定义。

[0029] “cDNA”是指与mRNA互补并衍生自mRNA的单链或双链DNA。术语“信使RNA”或“mRNA”是指不包含内含子并可以通过细胞被翻译为蛋白质的RNA。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在此可互换使用。

[0030] 如在此使用的“对照植物”或“对照”可以是用于产生在此的转基因植物的亲本品系的非转基因植物。在一些情况下，对照植物可以是转基因植物品系，它包含空载体或标记基因，但是不含有在所评估的转基因植物中表达的本发明的重组多核苷酸。在其他情况下，对照植物是通过组成性启动子来表达基因的转基因植物。一般来说，对照植物是与所测试的转基因植物相同品系或品种的植物，对照植物缺乏表征转基因植物的赋予特定性状的重组DNA。没有这个赋予特定性状的重组DNA的这种祖代植物可以是天然的野生型植物、原种的(elite)非转基因植物、或没有表征转基因植物的赋予特定性状的重组DNA的转基因植物。没有特定的赋予性状的重组DNA的祖代植物可以是具有特定的赋予性状的重组DNA的转基因植物的姊妹种(sibling)。这种祖代姊妹种植物可包括其他重组DNA。

[0031] 如在此使用的，术语“玉米(corn)”意指玉蜀黍(Zea mays)或玉米(maize)，并包括可以与玉米育种的所有植物种类，这些种类包括野生型玉米物种。

[0032] 术语“多核苷酸”包括指具有天然核苷酸的必要性质的脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，它们具有该必要性质是因为它们在严格杂交条件下杂交至与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，且/或允许翻译成与天然存在的核苷酸所翻译成的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或子序列。除非另外指示，否则该术语包括指指定的序列以及其互补序列。因此，出于稳定性或其他原因而对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在此所意指的“多核苷酸”。此外，仅举两个例子，包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是如该术语在此使用的多核苷酸。应认识到，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。如在此使用术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这些化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞以及复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。

[0033] 术语“重组”包括指已经通过引入异源核酸来修饰的细胞或载体，或该细胞源自以这种方式修饰的细胞。因此，例如，作为有意人为干预的结果，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中发现的不同形式的基因，或表达在其他情况下异常表达、低表达或根本不表达的天然基因，或可具有天然基因的减少或消除表达。如在此使用的术语“重组”不包括通过天然发生的事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转座)，例如不需要有意人为干预就发生的事件而造成的细胞或载体的改变。

[0034] 如在此使用的术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”(和类似术语)是指如下构建体或分子，该构建体或分子包含被组装进单个核酸分子中的不同来源的两个或更多个多核苷酸。术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸或“嵌合核酸”是指任何构建体或分子，该构建体或分子含有(1)多核苷酸(例如，DNA)，包括在自然界中没有被发现在一起的调节多核苷酸和编码多核苷酸(即，至少一个多核苷酸相对于它的其他多核苷酸中的至少一个是异源的)，或(2)编码不是天然毗邻的蛋白质部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗邻的启动子部分。另外，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸可以包括衍生自不同来源的调节多核苷酸和编码多核苷酸，或包括衍生自相同来源、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行安排的调节多核苷酸和编码多核苷酸。在本发明的优选的方面中，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包含表达盒，该表达盒包含在调节多核苷酸的控制下的、特别地在植物中具有功能性的调节多核苷酸的控制下的本发明的多核苷酸。

[0035] 在此使用的术语“染色体”是如本领域公认的，意指含有细胞DNA并具有线性阵列基因的细胞核中的自我复制遗传结构。

[0036] “编码多核苷酸”是转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的多核苷酸。优选地，RNA进而在生物体中被翻译以产生蛋白质。它可由如在cDNA中的“不间断的编码多核苷酸”构成，即缺乏内含子，或它可包括以适合的剪接点为界的一个或多个内含子。“内含子”是聚(核糖)核苷酸，其含有在原转录本中但通过该细胞内的RNA的裂解和再连接去除以建立可被翻译为蛋白质的成熟mRNA。

[0037] 当参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即通过RNA聚合酶的酶促作用)将基因中的编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白质)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。例如，在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，各自地表达可仅指该反义RNA或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白质的产生。

[0038] 如在此使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中直接表达特定的一种或多种多核苷酸的核酸分子，该核酸分子包含可操作地连接至感兴趣的一种或多种多核苷酸(其可操作地连接至终止信号上)的启动子。表达盒还典型地包含需要感兴趣的一种或多种多核苷酸的适当的翻译的多核苷酸。该表达盒还可以包含在感兴趣的多核苷酸的直接表达中不是必需的但是由于用于从表达载体去除该表达盒的方便限制位点而存在的多核苷酸。包含一个或多个感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，通常表达盒相对于宿主来说是异源的，即表达盒的特定多核苷酸在宿主细胞中不是天然存在的，并且必须已经通过本领域已知的转化方法引入至宿主细胞或宿主细胞的祖先中。该表达盒中的一个或多个多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物体(如植物)的情况下，启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。

[0039] “基因”在此定义为由多核苷酸组成的遗传单位，该遗传单位占据染色体上特定位置并且含有用于生物体中的具体特征或性状的遗传指令[或根据上下文来自一组异源生物的遗传单位]。

[0040] 在此将“遗传工程”、“转化”和“基因修饰”用作将分离的和克隆的基因转移到另一生物体的DNA(通常是染色体DNA或基因组)的同义词。

[0041] “转基因”是指通过遗传操作将基因、多核苷酸或核酸引入生物体基因组中，以改变其基因型。转基因可以包括例如与待转化的特定植物异源或同源的基因、多核苷酸或核酸。此外，转基因可以包括被插入非天然生物体中的天然基因、或嵌合基因、多核苷酸或核酸。

[0042] 术语“基因型”是指细胞或生物体的基因组成。个体的“一组基因标记的基因型”包括个体中存在的一个或多个基因标记位点的具体等位基因。如本领域中已知，基因型可以涉及单一位点或多个位点，无论这些位点是相关还是非相关的，和/或是关联还是非关联的。在一些实施例中，个体的基因型涉及一个或多个相关的基因，因为这些基因中的一个或多个参与感兴趣的表型(例如，如在此定义的定量性状)的表达。因此，在一些实施例中，基因型包括个体内在数量性状的一个或多个基因位点处存在的一个或多个等位基因的总和。在一些实施例中，基因型从单倍型(定义于下文中)方面来表达。

[0043] “转化的”、“转基因的”和“重组的”可以互换地使用，并且每个是指引入了异源核酸分子的宿主生物体，例如细菌或植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含有该异源的核酸分子的野生型生物，例如细菌或植物。

[0044] “野生型”是指在自然界中发现的没有进行任何突变或修饰的正常基因、病毒或生物。

[0045] 术语“种质”是指属于或来自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物品系、品种或家族)、或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从该生物或细胞中分离。通常，种质提供了具有特定分子构成的遗传物质，该分子构成提供了对于生物或细胞培养物的一些或所有遗传品质而言的物理基础。如在此使用的，种质包括可从其生长新植物的细胞、种子或组织，或可培养成整株植物的植物部分，如叶、茎、花粉或细胞。

[0046] 如在此使用的，“植物材料”、“植物部分”或“植物组织”是指植物细胞、植物原生质体、植物可由其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织(plant calli)、植物丛(plant clump)、以及在植物或植物部分中完整的植物细胞，这些植物部分例如是胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、粒、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药、块茎、根茎等。

[0047] 如在此使用的，“繁殖体”是指用于繁殖植物、优选是转基因植物、更优选是包含SEQ ID NO:1的转基因植物的任何材料。繁殖体可以是种子、插条或来自转基因植物的大量细胞，可以使用这些繁殖体以产生转基因植物的作物。

[0048] 如在此使用的，“植物样品”或“生物样品”是指完整或不完整(例如研磨的种子或植物组织、切碎的植物组织、冻干的组织)的植物组织。它还可以是包含完整或不完整种子或植物组织的提取物。生物样品或提取物可以选自下组，该组由以下各项组成：玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类食物。

[0049] 当提及基因或核酸使用时，术语“异源”是指编码因子的基因不是在其天然环境中(即，已经通过人工改变)。例如，异源基因可以包括自一个物种引入到另一个物种的基因。异源基因还可以包括对生物来说是天然的基因，该基因已经以一些方式(例如，突变；以多个拷贝添加；连接至非天然启动子或增强子多核苷酸等)被改变。异源基因可以进一步包含植物基因多核苷酸，其包含植物基因的cDNA形式；这些cDNA可以以正义方向(以产生mRNA)或反义方向(以产生反义RNA转录本，其与mRNA转录本是互补的)被表达。在本发明的一个方面中，异源基因区别于内源性植物基因在于该异源基因多核苷酸被典型地连接至包含调节元件如启动子的多核苷酸上，未发现这些多核苷酸与由该异源基因编码的蛋白质的基因或与该染色体中的植物基因多核苷酸天然相关联，或者与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在基因座中表达的基因，其中该基因未正常表达)相关联。另外，在实施例中，“异源”多核苷酸是不与将多核苷酸引入其中的宿主细胞天然地相关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多拷贝。

[0050] “一致性”或“百分比一致性”是指在两种核酸或氨基酸序列之间的相似性的程度。对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(若有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列一致性百分比。在两个核酸或两个氨基酸序列的上下文中，短语“基本上一致的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少约50％核苷酸或氨基酸残基一致性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。在某些实施例中，基本上一致的序列具有至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或甚至至少约90％或95％核苷酸或氨基酸残基一致性。在某些实施例中，基本上的一致性存在于这些序列的整个长度为至少约50个残基的区域中，或在整个至少约100个残基的区域中，或这些序列在至少约150个残基中是基本上一致的。在另外的实施例中，当这些序列在编码区的整个长度上时，这些序列是是基本上一致的。

[0051] 在本发明的上下文中，术语“同源性”是指在两个核酸或氨基酸序列之间就核苷酸和氨基酸一致性或相似性而言的相似性水平(序列相似性或一致性)。同源性、同源物、以及同源的也是指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。同源物包括直系同源物和旁系同源物的基因。可以通过使用在此公开的编码序列或在适当的数据库中找到的同源物(例如在NCBI或其他数据库中)，以一种或多种以下方式确定同源物。对于氨基酸序列，应使用算法比较序列(例如参见“一致性”和“基本上的一致性”部分)。对于核苷酸序列，可以用几乎相同的方式将一个DNA分子的序列与已知或推定的同源物的序列进行比较。跨越分子的任何实质区域(DNA、RNA、或蛋白质分子)上，同源物是至少20％一致性、或至少30％一致性、或至少40％一致性、或至少50％一致性、或至少60％一致性、或至少70％一致性、或至少80％一致性、或至少88％一致性、或至少90％一致性、或至少92％一致性、或至少95％一致性。

[0052] 适合于确定序列一致性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，它描述于以下文献中：Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403 410(1990)[Altschul等人，分子生物学杂志，215:403-410(1990)]。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开地获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul et al.,1990[Altschul等人，1990])。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于零或零以下；或者到达任一序列的末端时，停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为
100、M＝5、N＝4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字码长度(W)3、期望值(E)10、以及BLOSUM62得分矩阵作为默认值(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)[Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院刊]，
89:10915(1989))。

[0053] 除计算序列一致性百分比之外，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性统计分析(参见例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:58735787(1993)[Karlin和Altschul，美国国家科学院院刊，90:58735787(1993)])。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相类似的。

[0054] 用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson,et al.Nuc.Acids Res.,22:4673-4680,1994[Thompson等人，核酸研究，22:4673-4680，1994])。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，获得百分比一致性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是
25％相同的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在一个200个氨基酸的蛋白质与一个400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列这两个蛋白质是50％相同的。如果该较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100，获得百分比一致性。

[0055] 当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时这两个核苷酸序列也可以被认为是基本上一致的。在代表性实施例中，被认为基本上一致的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。

[0056] 术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指核酸与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于非靶序列)的条件，并且任选地可以基本上排除与非靶序列的结合。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会改变。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可以鉴定可以与参考核苷酸序列高达100％互补的靶序列。可替代地，可以使用中度或甚至低严格性的条件来允许序列中的一些不匹配，从而检测到较低程度的序列相似性。例如，本领域技术人员将理解，为了起到引物或探针的作用，核酸序列仅需要与靶序列充分互补以基本上与其结合，从而在采用的条件下形成稳定的双链结构。因此，可以在高、中等或甚至低严格条件下使用引物或探针。类似地，低或中度严格性的条件可以有利于检测同源物、直向同源物和/或旁系同源序列，该同源物、直向同源物和/或旁系同源序列具有与在高度严格条件下鉴定的较低的序列一致性程度。

[0057] 对于DNA-DNA杂交体，可从Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.[分析生物化学]，138:267-84(1984)的方程粗略估计Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷以及胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm是
50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度及pH下)。对于每
1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以便杂交至所希望的程度的一致性的序列。例如，如果寻找具有>90％一致性的序列，则可将Tm降低10℃。一般来说，将严格条件选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度以及pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而，高严格条件可利用在热熔点(Tm)或者低于热熔点(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用低于热熔点(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用低于热熔点(Tm)11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。如果所需的不匹配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则可以增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen的Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes[生物化学和分子生物学实验室技术-使用核酸探针的杂交]第I部分第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂交原理和核酸探针测定策略综述]”，Elsevier，纽约(1993)；Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术]，第2章，Ausubel等人编，Greene Publishing与Wiley-Interscience，纽约(1995)；以及Green和Sambrook,In:Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆，实验手册]，第4版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(2012)。

[0058] 典型地，严紧条件是这些：其中盐浓度小于约1.5M Na离子、典型地在约pH 7.0至pH 8.3下大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少大约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少大约60℃。通过加入不稳定剂如甲酰胺或Denhardt's(在500ml水中的5g聚蔗糖(Ficoll)、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)也可以达到严格条件。示例性的低严格条件包括用30％至35％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中在37℃下杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸橼酸钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性的中严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交，并且在0.1X SSC在60℃至65℃下洗涤。高严格条件的另外的非限制性实例包括在4X SSC、5X Denhardt's、0.1mg/ml煮沸鲑鱼精子DNA下杂交，并在25mM磷酸Na在65℃下洗涤，并在0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤。另一个高严格杂交条件的阐述包括在7％SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃下杂交，在2X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，可替代地在1X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，可替代地在0.5X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，或可替代地在0.1X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，或甚至在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。本领域技术人员将会理解特异性通常是杂交后的洗涤的作用，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。

[0059] 如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上一致的，则它们仍然是基本上一致的(例如，由于遗传密码的简并性)。两个核酸序列或蛋白质基本上一致的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白质与由第二核酸编码的蛋白质进行免疫性交联反应。因此，蛋白质典型地是与第二蛋白质基本上一致的，例如其中这两种蛋白质仅区别于保守性置换。

[0060] 如本文使用的，术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”(和相似的术语)是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。例如，序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。两单链分子之间的互补性可以是部分的(partial)，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于分子之间杂交的效率和强度具有显著影响。

[0061] 如在此使用的，术语“基本上互补的”(和相似的术语)意指两个核酸序列是至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多互补的。可替代地，术语“基本上互补的”(和相似的术语)可以意指两个核酸序列在高严格条件(如以上描述的)下可以杂交在一起。

[0062] 当在本发明的核酸分子和多核苷酸的上下文中使用时，术语“分离的”是指在相应源生物体内的染色体多核苷酸上下文中识别并分离/分开的多核苷酸。如果分离的核酸或多核苷酸确实具有天然存在的对应物，则其分离的核酸或多核苷酸不是其在其天然环境中存在的核酸。相比之下，非分离的核酸是核酸(如DNA和RNA)，它们是在自然界存在的状态下发现的。例如，在相邻基因附近的宿主细胞染色体上发现给定的多核苷酸(例如，基因)。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。可替代地，其可以含有正义链和反义链(即，核酸分子可以是双链的)。在优选的实施例中，本发明的核酸分子理解为分离的。

[0063] 术语“场所”是指在给定的物种中在染色体上的位置(例如，基因、基因标记等的)。

[0064] 术语“连锁”和它的语法变体是指同一染色体上不同的位点处的等位基因在它们的传递是单独的情况下倾向于比偶然所预期的更经常地一起分离，在一些实施例中是它们物理的邻近的结果。短语“连锁不平衡”(也称为“等位基因关联”)是指这样一种现象，其中在两个或更多个基因座处的特定等位基因倾向于以与给定群体中的单个频率预期的频率相比更大的频率从亲代到子代分离时在连锁群中保持在一起。例如，当遗传标记等位基因和QTL等位基因一起发生时，可以显示连锁不平衡，其频率大于从各个等位基因频率预测的频率。连锁不平衡可以由若干个原因发生，包括但不限于等位基因在染色体上非常接近。术语“连锁群”是指位于相同染色体上的所有基因或遗传性状。在连锁群体中，足够接近的那些基因座将在遗传杂交中显示出连锁关系。由于交叉的概率随着染色体上的基因之间的物理距离而增加，所以在连锁基团中位置彼此远离的基因在直接基因测试中可以不表现出任何可检测的连锁。术语“连锁群”主要用于指遗传基因座，其在遗传系统中尚未形成染色体分配的遗传基因。因此，在本文中，术语“连锁群”与染色体(物理实体)同义。

[0065] 短语“核酸”或“多核苷酸”是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA聚合物或聚脱氧核糖核苷酸或RNA聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，例如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另外指示，否则本发明的具体核酸或多核苷酸任选地包含或编码除明确指示的任何多核苷酸之外的互补多核苷酸。

[0066] “PCR(聚合酶链反应)”在本发明的范围内应理解为是指产生DNA的相对较大量的具体区域，从而进行可能的基于那些区域的不同的分析的方法。

[0067] “可操作地连接”是指在单一核酸片段上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸或功能RNA的表达时(即，该编码多核苷酸或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码多核苷酸或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码多核苷酸能够与调节多核苷酸可操作地连接。

[0068] 术语“启动子”是指如下多核苷酸，通常在它的编码多核苷酸的上游(5')，它通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码多核苷酸的表达。“组成型启动子”是指一种启动子，该启动子能够在所有或几乎所有的植物组织中在植物的所有或几乎所有的发育阶段过程中表达它所控制的开放阅读框(ORF)(称为“组成型表达”)。“受调节的启动子”是指非组成性地、但是却以一种时间地和/或空间地调节方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性的、组织优先的启动子以及诱导型启动子。它包括自然多核苷酸以及合成多核苷酸、连同可能是合成多核苷酸与自然多核苷酸的组合的多个多核苷酸。不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应于不同的环境条件来指导基因的表达。

[0069] “组织特异性启动子”或“组织优选的启动子”是指以下受调节的启动子，它们不表达于所有植物细胞中或仅优选地在特异器官(如，叶或种子)的一个或多个细胞类型、特异性组织(如，胚或子叶)、或特异的细胞类型(如，叶实质或种子存储细胞)中表达。这些术语还包括受时间调节的启动子，例如在胚形成的初期或晚期、在种子或果实发育的果实成熟期间、在叶子被彻底分化中、或在衰老的起始时。本领域技术人员将理解组织特异性启动子不需要展示出绝对的组织特异性，但是却在大多数植物部分中以一种水平来介导转录激活，该水平是在该植物中的转录最有活性的部分中所达到的水平的约1％或小于其。

[0070] “增强子”或“转录增强子”是一个核苷酸序列，它可以刺激启动子的活性，并且可以是该启动子或插入的异源元件的一个固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。一级序列可以存在于双链DNA分子中的任一个链上，并且甚至当放置在启动子的上游或下游时能够发挥功能。

[0071] “调节序列”和“适合的调节序列”各自是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并影响所关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。这些调节顺序包括增强子、启动子、翻译增强序列、内含子、以及多腺苷酸化信号序列。它们包括自然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的序列。调节序列可以决定表达水平、表达的空间模式和时间模式，并且对于启动子的子集，决定在诱导性条件下的表达(由外部因子，例如光、温度、化学品和激素来调节)。调节序列可以是DNA序列6-100个碱基对的短区域，这些短区域限定了反式作用因子例如转录因子的结合位点。调节序列还可以是增强子，即DNA序列的更长区域，这些更长区域可以在到核心启动子区域一个距离(有时到核心区域有几千多个碱基)处发挥作用。调节序列可以受反式作用因子影响，这些反式作用因子包括一般的转录机构、转录因子和染色质装配因子。

[0072] “顺式元件”是指赋予基因表达全面控制的一个方面的一种起顺式作用的转录调节元件。顺式元件可以用以结合调节转录的起反式作用的蛋白质因子的转录因子。一些顺式元件结合一种以上转录因子，并且转录因子可以通过不同亲和力与一种以上顺式元件相互作用。顺式元件可以通过包括以下各项的大量技术来识别：缺失分析(即，使从5′末端或在一个启动子内部的一个或多个核苷酸缺失)；使用DNase I足迹法、甲基化干扰、电泳活动性位移分析、利用连接介导的PCR的体内基因组足迹法以及其他常规分析的DNA结合蛋白质分析；或通过用常规DNA序列相似性分析与已知的顺式元件基元进行DNA序列比较。顺式元件精细结构可以通过一种或多种核苷酸的诱变(或取代)或通过其他常规方法进一步研究。顺式元件可以通过化学合成或通过从包括这些元件的启动子分离来获得，并且它们可以利用含有适用限制酶位点以促进子序列操纵的其他侧接核苷酸合成。

[0073] “转录终止子”负责超出编码区域的转录终止并修正mRNA多聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与感兴趣的可操作地连接的DNA序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子以及豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物二者中使用。此外，可以使用一种基因的天然转录终止子。

[0074] 术语“翻译增强子序列”是指一个基因的处于启动子与编码序列之间的DNA序列部分，它被转录至RNA中并且存在于翻译起始密码子上游(5')的完全加工mRNA中。翻译增强子序列可影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。

[0075] 如在此使用的，基因或性状“堆叠”将所希望的基因或性状组合成转基因植物系。作为一种方法，植物育种家通过亲本(每个亲本均具有一个希望的特征)之间进行杂交并且然后鉴定具有这两种希望的特征的后代来堆积转基因的特征(所谓的“育种叠加”)。堆积基因的另一个方式是在转化的同时将两个或多个基因转移至一个植物的细胞核中。堆积基因的另一个方式是通过用另一个相关基因重新转化一个转基因的植物。例如，基因堆积可用于结合两个不同的昆虫抵抗特征，一个昆虫抵抗特征和一个疾病抵抗特征，或一个除草剂抵抗特征(如例如Bt11)。在一个相关基因之外使用一个可选择的标记物也被认为是基因堆积。

[0076] 术语“植物”包括指整株植物、植物器官、组织(例如叶、茎、根等)、种子以及植物细胞和其子代。如在此使用的植物细胞包括但不局限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉以及小孢子中的细胞。可用于本发明方法中的植物类别通常与适合于转化技术的高等植物类别一样广泛，包括单子叶和双子叶植物，包括来自以下属类的种：南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹤草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸笞属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马约拉纳属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、致命鱼虱属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)以及小麦属(Triticum)。尤其优选的植物是玉蜀黍(Zea mays)。

[0077] 术语“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源核酸序列的植物。一般来说，异源核酸序列稳定整合于基因组内以使得核酸序列得以传递至连续世代。异源核酸序列可单独或作为重组表达盒的一部分来整合至基因组中。在此使用“转基因”来包括：任何其基因型已因异源核酸序列的存在而改变的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初被这样改变的那些转基因以及那些通过从最初转基因进行有性杂交或无性繁殖所产生的转基因。如在此使用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变所造成的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。

[0078] 术语“产量”可包括指在收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数(针对籽粒水分进行了调整，例如玉蜀黍的水分通常为15％)，以及所产生的生物质的体积(对于饲料作物如苜蓿以及多种作物的植物根大小)。籽粒中的籽粒水分在收获时进行测量。调整后的籽粒容重确定为以磅/蒲式耳为单位的重量(对收获时籽粒水分的水平进行了调整)。生物质测量为所产生的可收获的植物材料的重量。产量可受到许多特性影响，包括不局限于植物高度、荚果数目、荚果在植物上的位置、节间数目、荚果破碎的发生率、籽粒大小、结瘤以及固氮的效率、养分同化的效率、碳同化、植物结构、种子发芽百分比、幼苗势以及幼年性状。产量还可受以下因素影响：发芽效率(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、穗数目、每个穗的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子充填的特征。植物产量可用许多方法测量，包括容重、每株植物的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(即每英亩的种子，或种子重量)、蒲式耳/英亩、吨/英亩或公斤/公顷。例如，玉米产量可测量为每单位生产面积的去壳玉米粒的产量，例如以蒲式耳/英亩或公吨/公顷为单位，经常基于水分调整来报告，例如15.5％的水分。此外，玉米蒲式耳在爱荷华州由法律定义为按重量计56磅，玉米产量的一个有用换算系数是：100蒲式耳/英亩等于6.272公吨/公顷。产量的其他测量在本领域中是普遍的。在本发明的某些实施例中，产量可在胁迫和/或非胁迫条件下增加。

[0079] 术语“载体”或“构建体”包括指用于转染宿主细胞并且可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸的转录。“载体”被定义为除了其他之外还包括：在双股或单股的线型或环型中的任何质粒、黏粒、噬菌体或土壤杆菌二元载体，它们可能是或可能不是可自我传送的或可活动的，并且它们可以通过整合到该细胞的基因组中或存在于染色体外来转化一种原核或真核生物的宿主(例如，具有一个复制起点的自主的复制质粒)。特别包括的是穿梭载体，穿梭载体一词是指一种DNA运载体，该DNA运载体自然地或经设计能够在两个不同的宿主有机体中复制，这些宿主有机体可以是选自：放线菌以及相关的物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。

[0080] 如在此使用的术语“转化”是指将核酸片段转移到宿主细胞的基因组中，导致基因上稳定的遗传。在一些具体的实施例中，引入植物、植物部分和/或植物细胞中是经由细菌介导的转化、粒子轰击转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米粒子介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、晶须介导的核酸递送、微量注射、超声波处理法、浸润法、聚乙二醇介导的转化、原生质体转化或导致向植物、植物部分和/或其细胞引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或其组合进行的。

[0081] 用于转化植物的程序在本领域中是熟知且常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括经由以下各项的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由来自农杆菌属的细菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸须晶介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗入、PEG介导的核酸吸收、以及使得核酸引入到植物细胞中的任何其他电学、化学、物理(机械)和/或生物学机制，包括其任何组合。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人，(“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants[将外源DNA引入植物中的程序]”在Plant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术]的方法中，Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑(CRC Press,Inc.[CRC出版有限公司]，波卡拉顿，1993)，第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(2002，Cell.Mol.Biol.Lett.[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。

[0082] 如此，在一些具体实施例中，向植物、植物部分和/或植物细胞中的引入是通过细菌介导的转化、粒子轰击转化、钙-磷酸盐介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、须介导的核酸递送、微注射、声处理、浸润、聚乙烯二醇介导的转化、以及其他的致使核酸引入该植物、植物部分和/或其细胞的电的、化学的、物理的和/或生物的机制，或其组合。

[0083] 农杆菌介导的转化是用于转化植物的常用方法，因为它的高转化效率以及因为它与许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体转移至适当的农杆菌菌株，这可能取决于由宿主农杆菌菌株在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补体(Uknes等人，1993，Plant Cell[植物细胞]5:159-169)。将该重组二元载体转移至农杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌，一种辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶农杆菌菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移至农杆菌中( 和Willmitzer，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:9877)。

[0084] 通过重组农杆菌进行的植物转化通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域熟知的方法。典型地在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。

[0085] 另一种用于转化植物、植物部分以及植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物学活性的粒子。参见，例如，美国专利号4,945,050；5,036,006以及5,100,792。通常，这种方法涉及在有效于穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用包含感兴趣的核酸的载体包被这些粒子而将该载体引入该细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被该载体围绕以使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物活性粒子(例如，干燥的酵母细胞、干燥的细菌或噬菌体，各自含有一个或多个力图导入的核酸)推入植物组织中。

[0086] 因此，在本发明的具体实施例中，植物细胞可以通过本领域内已知的任何方法或如在此描述地进行转化并且可以使用多种已知技术中的任一种来从这些经转化的细胞再生出完整的植物。从植物细胞、植物组织培养物和/或培养的原生质体的植物再生描述在例如Evans等人(Handbook of Plant Cell Cultures[植物细胞培养手册]，第1卷，MacMilan Publishing Co.[麦克米伦出版公司]纽约(1983))；和Vasil I.R.(编辑)(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants[植物的细胞培养和体细胞遗传学]，Acad.Press[学术出版社]，奥兰多，第I卷(1984)和第II卷(1986))中。选择转化的转基因植物、植物细胞和/或植物组织培养物的方法在本领域中是常规的，并且可以用于在此提供的本发明的方法中。

[0087] 在将核酸插入细胞中的情形下的术语“引入”意指“转染”、“转化”或“转导”并且包括指将核酸结合到真核或原核细胞中，其中核酸可结合到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

[0088] 如在此所使用的，“稳定转化”或“被稳定地转化的”意为将核酸引入到细胞中并且整合到该细胞的基因组中。按照这样，所整合的核酸能够被其子代遗传，更具体地，被多个连续世代的子代遗传。如在此所使用的，“基因组”还包括核基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸到例如叶绿体基因组的整合。如在此所使用的，稳定转化也可以是指以染色体外方式(例如，作为微型染色体)维持的转基因。

[0089] 细胞的稳定转化可以通过例如细胞的基因组DNA与核酸序列(这些核酸序列与引入生物体(例如，植物)中的转基因的核苷酸序列特异性杂交)的DNA印迹杂交测定来检测。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的RNA印迹杂交测定来检测，这些核酸序列与引入到植物或其他生物体中的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域内熟知的其他扩增反应来进行检测，这些反应采用与转基因的一个或多个靶标序列杂交的特异性引物序列，从而导致该转基因序列的扩增，这种扩增可以根据标准方法进行检测。转化还可以通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案进行检测。

[0090] “转化和再生过程”是指将转基因稳定地引入植物细胞并从转基因植物细胞再生植物的过程。如在此所使用的，转化和再生包括选择过程，通过该过程转基因包括选择性标记，并且转化的细胞已经并入并表达转基因，使得转化的细胞将在选择剂存在下存活并发育繁盛。“再生”是指从植物细胞、一组植物细胞、或植物片(如来自原生质体、愈伤组织、或组织部分的)长成整个植物。

[0091] “选择性标记”或“选择性标记基因”是指一种基因，该基因在一种植物细胞中的表达给予该细胞一种选择优势。“正向选择”是指转化的细胞，该转化的细胞获得其以前不能使用或不能有效使用的底物代谢能力，典型地通过转化并表达正向选择性标记基因。因此，这种转化的细胞从非转化组织的群中生长出来。正向选择可以是来自植物生长调节剂的无活性形式的许多类型，然后通过转移的酶转化为活性形式来转化碳水化合物来源，这些碳水化合物来源不被非转化细胞(例如甘露糖)有效利用，其然后在转化后可得到酶，例如磷酸甘露糖异构酶，使其能够被代谢。与转化的细胞相比，不转化的细胞生长缓慢或根本不生长。与非转化细胞生长能力相比，其他类型的选择可能是由于用选择性标记基因的细胞转化，该选择性标记基因获得在阴性选择试剂(例如抗生素或除草剂)存在下生长的能力。转化细胞所具有的选择优势还可以是由于在所谓“阴性选择”中失去以前具有的基因。在这种情况下，所添加的化合物只对未失去亲本细胞(通常是转基因)中存在的特异性基因(阴性选择标记基因)的细胞具有毒性。

[0092] 选择性标记的实例包括但不限于，提供对以下抗生素抗性或耐受性的基因，如卡那霉素(Dekeyser等人，1989，Plant Phys[植物生理学]90:217-23)、壮观霉素(Svab和Maliga，1993，Plant Mol Biol[植物分子生物学]14:197-205)、链霉素(Maliga等人，1988，Mol Gen Genet[分子基因遗传]214:456-459)、潮霉素B(Waldron等人，1985，Plant Mol Biol[植物分子生物学]5:103-108)、博来霉素(Hille等人，1986，Plant Mol Biol[植物分子生物学]7:171-176)、磺胺剂(sulphonamides)(Guerineau等人，1990，Plant Mol Biol[植物分子生物学]15:127-136)、链丝菌素(Jelenska等人，2000，Plant Cell Rep[植物细胞报告]19:298-303)、或氯霉素(De Block等人，1984，EMBO J 3:1681-1689)。其他可选择标记包括提供对除草剂抗性或耐受性的基因，如赋予除草剂(包括磺胺尿素类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、和嘧啶基硫代苯酸盐类(thiobenzoates))耐受性的乙酰乳酸合酶(ALS)的S4和/或Hra突变；5-烯醇-丙酮-莽草酸-3-磷酸-合酶(EPSPS)基因，包括但不限于描述在美国专利号4,940,935、5,188,642、5,633,435、6,566,587、7,674,598中的那些(连同全部相关的应用)和草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)，其赋予对草甘膦的耐受性(Castle等人，2004，Science[科学]304:1151-1154，和美国专利申请公开号20070004912、20050246798、和20050060767)；BAR，其赋予对草铵膦的耐受性(参见例如美国专利号5,561,236)；芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxy alkanoate dioxygenase)或AAD-1、AAD-12、或AAD-13，其赋予对
2,4-D的耐受性；如假单胞菌HPPD的基因，其赋予对HPPD耐受性；卟啉酮氧化酶(PPO)突变体和变体，其赋予对过氧化除草剂的抗性，这些除草剂包括氟磺胺草醚、三氟醚芬酸钠、氟氟芬、乳糖、氟乙酸甲酯、安非他酮、氟马嗪、氟氯氰菊酯、氟酮唑酮-乙基、磺基腙；以及赋予对麦草畏耐受性的基因，如麦草畏单加氧酶(Herman等人，2005，J Biol Chem[生物化学杂志]
280:24759-24767和美国专利号7,812,224，以及相关的申请和专利)。可选择性标记的其他实例可以在Sundar和Sakthivel(2008，J Plant Physiology[植物生理学杂志]165:1698-
1716)中发现，通过引用结合在此。

[0093] 其他选择系统包括使用药物、代谢物类似物、代谢中间体和酶用于转基因植物的正向选择或有条件的正向选择。实例包括但不限于编码其中甘露糖是选择剂的磷酸甘露糖异构酶(PMI)的基因，或编码其中D-木糖是选择试剂的木糖异构酶的基因(Haldrup等人，1998，Plant Mol Biol[植物分子生物学]37:287-96)。最后，其他选择系统可以使用无激素培养基作为选择剂。一个非限制性实例玉米同源盒基因kn1，其异位表达导致转化效率3倍增加(Luo等人，2006，Plant Cell Rep[植物细胞报告]25:403-409)。各种选择性标记和编码他们的基因的实例披露在Miki和McHugh(J Biotechnol[生物技术杂志]，2004,107:193-
232；通过引用结合)中。

[0094] 在本发明的一些实施例，该选择性标记可以是植物衍生的。可以是植物衍生的选择性标记的实例包括但不限于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化植物中芳香族氨基酸生物合成常见的莽草酸通路中的重要步骤。除草剂草甘膦抑制EPSPS，因此杀死植物。可以通过引入修饰的EPSPS转基因产生转基因草甘膦耐受植物，该植物不由草甘膦影响(例如美国专利6,040,497；通过引用结合)。在草甘膦的存在下可以被用作选择性标记的修饰的植物EPSPS的其他实例包括水稻EPSPS的P106L突变(Zhou等人，2006，Plant Physiol[植物生理学]140:184-195)和在蟋蟀草EPSPS中的P106S突变(Baerson等人，2002，Plant Physiol[植物生理学]129:1265-1275)。不是植物来源的并可以被赋予草甘膦耐受性EPSPS的其他来源包括但不限于来自鼠伤寒沙门氏菌的EPSPS P101S突变(Comai等人，1985，Nature[自然]317:741-744)以及来自农杆菌属菌株的CP4的EPSPS的突变的版本(Funke等人，2006，PNAS 103:13010-13015)。尽管植物EPSPS基因是细胞核，但是成熟酶位于叶绿体(Mousdale和Coggins，1985，Planta[植物]163:241-249)。EPSPS合成为含有转运肽的前蛋白，随后该前体随后转运至叶绿体基质中并进行蛋白质水解以产生成熟酶(della-Cioppa等人，1986，PNAS 83:6873-6877)。因此，为了产生对草甘膦具有耐受性的转基因植物，可以引入正确地易位至叶绿体的EPSPS的适当的突变形式。
然后此类转基因植物具有天然的、基因组的EPSPS基因，连同突变的EPSPS转基因。然后草甘膦可以被用作在转化和再生过程中的选择剂，由此仅用突变的EPSPS转基因成功地转化的的那些植物或植物组织存活。

[0095] 如此处所用，术语转基因的“事件”是指通过用异源DNA(例如，包括感兴趣的基因的表达盒)转化和再生植物细胞或组织而产生的重组植物。术语“事件”是指包括异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也是指通过该转化体和另一种玉米品系之间进行有性远交(outcross)而产生的子代。即使在重复回交至一个轮回亲本后，来自该转化的亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于在该杂交子代的同样的染色体位置。该术语“事件”也是指来自包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的侧接基因组序列的原始转化体的DNA，将期待其转移到因包含插入的DNA的一个亲本株系(例如原始转化体和由自体授精产生的子代)与不含该插入的DNA的一个亲本株系的一个有性杂交而接收了包含所关注的转基因的插入的DNA的一个子代中。通常，植物组织的转化产生多个事件，每个上述事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组中的不同位置中。基于转基因或其他期望的特征的表达，选择特定的事件。

[0096] 本领域的技术人员将认识到本发明的转基因基因型能通过育种而基因渗入至包含不同转基因或非转基因基因型的其他植物系中。例如，可以将包含本发明的转基因基因型的一个玉米近交系与包含抗鳞翅目的MIR162事件的转基因基因型的一个玉米近交系进行杂交，这是本领域已知的，从而产生了包括本发明的转基因基因型和该MIR162转基因基因型两者的玉米种子。将进一步认识到可以用本发明的转基因的基因型进行其他组合，并因此此实例不应被视为是限制性的。

[0097] 使用本领域公认的育种技术，可以将本发明的转基因基因型从最初转化的植物(如从玉米植物)基因渗入至杂交系或杂种。植物育种的目标是将不同的所希望的性状结合在一个单一品种或杂交种中。对于大田作物而言，这些性状可能包括对昆虫和疾病的抵抗性、对除草剂的耐受性、对热和旱的耐受性、减少农作物成熟的时间、更高的产量，以及更好的农艺学质量。随着许多农作物的机械收获，植物特征(例如发芽和植物丛建立、生长速率、成熟，以及植物和耳穗的高度)的均一性是很重要的。

[0098] 虽然存在携带PAT基因(如Bt11，美国专利号6,114,608和6,403,865)或ZmEPSPS基因(如GA21，美国专利号6,040,497)的商业事件，但是在植物基因组中在三个基因座上引入两个基因的能力将提供显著的优势。目前，创造包含PAT和ZmEPSPS转基因的商业上有用的转基因植物需要多个育种步骤和显著大量的筛选以鉴定正确种质中的正确基因型。这些育种和筛选步骤对于需要引入这两种性状的各种种质是必需的。此外，对于许多农学上重要的作物，这两个性状需要作为数十种种质品种的杂种来维持。最后，如不希望的性状或基因重组的遗传连锁的因素可以使来自两个不同基因座的两种性状进入单个种质品种的引入复杂化。因此，产生携带多种除草剂耐受性性状的核酸分子是有利的，并且可以在转基因植物的基因组中的单个基因座处引入。

[0099] 在不同的表达盒的上下文中，生产不同的构建体来决定PAT和ZmEPSPS基因的功效。令人惊讶的是，赋予极好的除草剂耐受性的一种载体(18857)对植物生长或转基因植物的生育力没有任何消极影响。来自载体18857的转基因是SEQ ID NO:1。此转基因包含两个表达盒。

[0100] 技术人员将认识到，在核酸分子(如SEQ ID NO:1)插入细胞的过程中，插入的分子的5’和/或3’可以是缺失的或重新排列的。此类缺失或重排可能不影响插入的分子的功能，并且这些相对较小的变化导致可被认为与起始分子基本相同的插入分子。技术人员还将认识到，在插入事件期间，核酸分子(如包含SEQ ID NO:1的一个)可能经历全部或部分重排或重复，使得插入的分子是起始核酸分子的全部或部分重排或重复。技术人员将认识到，此插入的分子仍然可以具有与起始分子相同的特征和/或性状，使得转化的细胞或所得转化的植物仍然是所希望的。

[0101] 技术人员将认识到，用于商业用途的转基因，例如包含SEQ ID NO:1的核酸分子，可能需要对核酸序列的相对较小的修饰以符合政府法规标准。此类修饰将不会影响分子的作用。技术人员将认识到修饰的核酸分子将与起始分子基本上相同。

[0102] 因此，本发明涵盖与SEQ ID NO:1基本上一致的核酸分子，其中将SEQ ID NO:1的某些核苷酸删除、取代或重排，导致突变的SEQ ID NO:1，并且其中突变的SEQ ID NO:1与起始分子的功能性相同。本发明还提供了包含核酸序列、由核酸序列组成或基本上由核酸序列组成的核酸分子、嵌合核酸分子、和/或重组核酸构建体或载体，该核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性、至少95％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性、或100％一致性。本发明还提供了与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性、至少95％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性、或100％一致性的分离的核酸分子。本发明还提供了包含SEQ ID NO:1、由SEQ ID NO:1组成或基本上由SEQ ID NO:1组成的核酸分子、嵌合核酸分子、和/或重组核酸构建体或载体。本发明还提供了包含核酸序列、由核酸序列组成或基本上由核酸序列组成的核酸分子、嵌合核酸分子、和/或重组核酸构建体或载体，该核酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％一致性、至少95％一致性、至少97％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性、或100％一致性。

[0103] 在一个实施例中，此嵌合核酸分子可以包含另外的表达盒、转录或翻译调节元件、或者原核生物的复制起点。在另一个实施例中，该嵌合核酸分子可以是重组核酸构建体，如二元载体或适合在原核生物中表达的载体。该重组核酸构建体可以适于在植物中瞬时或稳定表达。在另一个实施例中，本发明涵盖SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1基本上一致的作为分离的核酸分子或作为较大的核酸分子的部分的核酸分子。

[0104] 本发明还提供了如在此描述的本发明的核酸分子的用途，其中所述核酸分子在细胞中的表达赋予除草剂耐受性。

[0105] 本发明还提供了转基因宿主细胞，该转基因宿主细胞包含如在此描述的本发明的核酸分子。以上描述的转基因宿主细胞可以是细菌细胞或植物细胞。该转基因细菌细胞可以是大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌；蜡样芽孢杆菌、土壤杆菌属或假单胞菌属细胞。该转基因植物细胞可以在转基因植物、植物部分、植物组织、或植物细胞培养物内发现。该转基因植物可以是单子叶植物或双子叶植物。该转基因植物可以选自下组，该组包含以下各项：玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、燕麦、草皮草、牧场草、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甘蔗、甜菜、烟草、大麦和油菜籽油菜。

[0106] 本发明还提供了转基因植物的任一代的子代，其中所述转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子。出于繁殖的目的，本发明还提供了来自转基因植物的转基因种子、插条，并提供来自所述转基因植物的转基因繁殖体。

[0107] 本发明还提供了产生除草剂耐受性转基因植物的方法，该方法包括将如在此描述的本发明的核酸分子引入植物中从而产生转基因植物，其中该核酸分子能够表达除草剂耐受性基因。在优选的实施例中，该转基因植物以控制杂草的量表达除草剂耐受性基因。

[0108] 本发明还提供了用于产生除草剂耐受性植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供如在此描述的本发明的核酸分子；(b)将步骤(a)的核酸分子引入植物、组织培养物、或植物细胞中以获得具有除草剂耐受性的转化的植物、转化的组织培养物、或转化的细胞；以及(c)使所述转化的植物生长、或者从转化的组织培养物或转化的植物细胞中再生转化的植物，由此产生除草剂耐受性植物。本发明还提供了用于从以上描述的转基因植物中产生转基因种子的方法，其中将该植物在适当的条件下培养或生长以产生转基因子代种子。

[0109] 本发明还提供了用于产生除草剂耐受性可育转基因植物的任一代的子代的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得除草剂耐受性可育转基因植物，该转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子；(b)从所述转基因植物收集转基因种子；(c)种植收集的转基因种子；以及(d)从所述种子生长子代转基因植物，其中所述子代相比于非转化的植物具有增强的除草剂耐受性。

[0110] 本发明还提供了用于产生具有除草剂耐受性的植物的方法，该方法包括以下步骤：将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本植物是转基因植物，该转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子。产生包含如在此描述的本发明的核酸分子的转基因植物的第一代子代植物。本发明还提供了用于产生具有除草剂耐受性的植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本植物是转基因植物，该转基因植物包含如在此描述的本发明的核酸分子；(b)选择具有除草剂耐受性的第一代子代植物；(c)使第一代子代植物自交，从而产生多株第二代子代植物；以及(d)从第二代子代植物中选择具有除草剂耐受性的植物，其中该第二代子代植物包含如在此描述的本发明的核酸分子。

[0111] 实例

[0112] 实例1：合成构建体

[0113] 用转录增强子、启动子、翻译增强子和终止子的不同组合以及这些遗传元件的变体构建了五个二元载体构建体，驱动编码ZmEPSPS和PAT的基因的表达。已知所有使用的启动子都是强组成型启动子，预期转录和翻译增强子的添加将导致具有极好的表达水平和除草剂耐受性的转基因植物。表1显示了产生的五个构建体，并列出了每个感兴趣的基因(GOI)的遗传元件。表2描述了表1中命名的每种遗传元件。

[0114] 表1：二元构建体的组成

[0115]

[0116] 表2：遗传元件的描述

[0117]

[0118]

[0119]

[0120] 实例2：转化效率

[0121] 使用五个二元载体构建体中的每一个来产生玉米转基因事件。事件由农杆菌介导的专有玉米系转化产生。基本上如在Negrotto等人(2000，Plant Cell Reports[植物细胞报告]19:798-803)中描述，对未成熟胚进行了转化。使用此方法，将转化质粒的左边界区和右边界区内部的遗传元件高效地转移并整合到植物细胞的基因组中，而不转移在这些边界区外部的遗传元件。

[0122] 在该转化过程中使用PAT基因作为可选择的标记(Negrotto等人，2000)。将产生胚胎发生的愈伤组织的胚胎转移到一系列含有双卡双磷作为选择剂的细胞培养物选择培养基中培养10-11周。该选择培养基含有200mg/ml的特美汀和/或10ml/l PPM(植物防腐剂混合物)，以确保从转化组织中清除农杆菌。将再生植物转移到温室用于进一步繁殖。

[0123] 表3显示了每种构建体的转化效率。转化频率被计算为对于具有给定数量的用于转化的未成熟胚的给定构建体的转基因事件的百分比。例如，如果最初转化了100个未成熟的玉米胚，并且最终确定5个事件含有全部或部分T-DNA，转化频率将为5％。

[0124] 表3：转化效率

[0125]

[0126] 令人惊讶的是，一个构建体(17869)具有非常低的转化效率，基于二进制构建体的组成，既不预测也不预期。

[0127] 实例3：通过定量夹心ELISA测定基因表达

[0128] 通过免疫测定法，具体地通过定量夹心ELISA检测PAT或检测EPSPS来确定EPSPS和PAT基因表达。将蛋白质提取物样品从取样到96孔块中的两个1/4英尺玉米叶冲击片进行制备，然后将其浸泡，澄清并在ELISA稀释液(含有1％BSA、0.05％吐温-20的PBS)中稀释。

[0129] 对于用于检测EPSPS的定量ELISA夹心剂，使用产生一种针对水稻EPSPS蛋白的多克隆抗体，并产生一种针对大豆EPSPS蛋白的单克隆抗体。在ELISA稀释液中制备标准品(纯化的mEPSPS蛋白质的160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml和0ng/ml)。使用与碱性磷酸酶(Jackson ImmunoResearch公司，西格罗夫，宾夕法尼亚州)和底物对硝基苯磷酸酯(Surmodics)共轭连接的驴抗鼠用于检测和定量。使用酶标仪(BioTek Powerwave XS2，Winooski，VT)在405nm下测量吸光度。标准曲线使用四参数曲线拟合来绘制浓度比对吸光度。

[0130] 表4：EPSPS表达数据的总结

[0131]

[0132] 令人吃惊的是，具有来自构建体18472和18943的转基因的植物中ZmEPSPS蛋白的表达一直较低，而来自构建体18857的转基因植物中ZmEPSPS蛋白的表达更高。

[0133] 对于PAT，该测定采用针对PAT蛋白产生的兔和山羊多克隆抗体，以及针对PAT蛋白进行亲和纯化(IAP)。在ELISA稀释液中制备标准品(纯化的PAT蛋白质的32ng/ml、16ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml和0ng/ml)。使用与碱性磷酸酶和底物对硝基苯磷酸酯(Surmodics)共轭连接的驴抗山羊用于检测和定量。使用酶标仪(BioTek Powerwave XS2，Winooski，VT)在405nm下测量吸光度。标准曲线使用四参数曲线拟合来绘制浓度比对吸光度。

[0134] 表5：PAT表达数据的总结

[0135]

[0136] 令人吃惊的是，具有来自构建体18943和19119的转基因的植物中PAT蛋白的表达一直较低，而来自构建体18472或17869的转基因植物中PAT蛋白的表达更高。

[0137] 实例4：田间实验功效

[0138] 测试了草甘膦的田间功效。使用每个构建体的转基因事件来评估田间功效。下表显示了使用草甘膦的田间功效试验的结果。对于该试验，在事件中对草甘膦的植物毒性进行评分，并确定了关于雄性不育的问题。为了通过测试，事件对草甘膦的耐受性必须与商业玉米事件GA21相当，并且没有雄性生育力的问题。

[0139] 表6：草甘膦田间实验功效

[0140]

[0141] **来自19119的事件没有测试雄性生育力的问题，因为与来自18857的事件相比，它们具有更高的植物毒性。

[0142] 来自构建体18857的事件具有通过田间功效测试的最事件。这与通过ELISA检测到的高水平的ZmEPSPS蛋白表达一致(表4)。然而，令人惊讶的是，尽管如表4所示具有良好的ZmEPSPS蛋白表达，但是来自构建体19119的事件没有通过田间功效试验。这表明ZmEPSPS蛋白表达结果不能预测该领域的表现。

[0143] 表6清楚地显示，二元载体构建体18857产生最转基因事件，其可以通过田间功效试验，对于除草剂耐受并对雄性生育力没有问题。这个结果是意想不到的，不可预知的。

[0144] 在本说明书中提到的所有公开物和专利申请对于本发明所涉及的领域的普通技术人员的技术水平而言是指示性的。所有这些公开物和专利申请均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。

[0145] 尽管已经为了清楚理解的目的通过解释和实例详细地描述了以上发明，明显的是在以上实施例列表以及所附权利要求的范围内可以实践某些改变和变更。

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