一种多功能融合酶XABT基因及构建方法和应用
阅读：684发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种多功能融合酶XABT基因及构建方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种多功能融合酶XABT基因及构建方法和应用，该多功能融合酶XABT基因，可以同时表达表达木聚糖酶、 植酸酶 、葡聚糖酶和 纤维 素酶，并具有高效的酶活，该多功能融合酶强化了葡聚糖酶活性，对含葡聚糖较高的 大麦 、燕麦、黑麦、小麦及其麸皮类日粮具有更强的消化能 力 。亦可以用于制备节粮环保转基因经济动物，消除 饲料 中主要 抗营养因子 ，达到提高饲料消化率，减少污染排放的目的。，下面是一种多功能融合酶XABT基因及构建方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种多功能融合酶XABT基因，其特征在于，所述的XABT基因包括木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶基因。
2.根据权利要求1所述的多功能融合酶XABT基因，其特征在于，所述的XABT基因由木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-葡聚糖酶基因-A3'-纤维素酶基因组成。
3.根据权利要求2所述的多功能融合酶XABT基因，其特征在于，所述的A3的基因序列如SEQ ID No:5所示。
4.根据权利要求2所述的多功能融合酶XABT基因，其特征在于，所述的A3'基因序列如SEQ ID No:6所示。
5.根据权利要求2-4任一项所述的多功能融合酶XABT基因，其特征在于，所述的XABT基因序列如SEQ ID No:11所示。
6.一种多功能融合酶XABT基因构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：
目的基因的筛选；
A3序列的设计和合成；
将木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶基因通过连接肽进行连接；
构建木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶多功能融合酶XABT基因。
7.根据权利要求6所述的多功能融合酶XABT基因构建方法，其特征在于，所述的木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶基因连接结构为木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-葡聚糖酶基因-A3'-纤维素酶基因。
8.根据权利要求7所述的多功能融合酶XABT基因构建方法，其特征在于，所述的A3序列为SEQ ID No:5所示，所述的A3'序列为SEQ ID No:6所示。
9.根据权利要求7所述的多功能融合酶XABT基因构建方法，其特征在于，所述的木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-葡聚糖酶基因-A3'-纤维素酶基因序列如SEQ ID No:
11所示。
10.一种多功能融合酶XABT基因的应用，其特征在于，所述的多功能融合酶XABT基因用于制备节粮环保转基因动物。
一种多功能融合酶XABT基因及构建方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 饲料中含有大量的纤维素、半纤维素(阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖等)、果胶等非淀粉多糖(NSP)抗营养因子，是影响饲料氮和能量利用的主要抗营养因子。植酸是植物磷的主要存在形式，猪自身缺乏植酸酶，无法消化利用其中磷，造成植物源磷的浪费和环境污染。
[0003] 尽管饲料工业中非淀粉多酶和植酸酶的应用已经初见成效，但是其在实际生产应用中依然存在一系列问题。酶制剂行业主要依靠微生物发酵生产工业用酶，产酶微生物种类繁多，单条生产线往往只用于一种高产菌株的生产，生产多种NSP酶就需要动用多条生产线，造成酶制剂生产成本增加；另外，由于动物胃肠道复杂的生理环境和饲料加工过程的特殊工艺需求，目前绝大多数开发饲料用酶性质不稳定，饲料酶制剂的活力及稳定性在制粒、加工、膨化和储存等过程中易受各种因素影响，而造成酶活性丧失，从而影响酶制剂的实际使用效果。此外，饲料酶制剂的添加成本高。
[0004] 利用转基因育种技术培育在猪体内表达自身缺乏的消化酶的动物新品种是解决饲料抗营养问题的新途径。2001年加拿大科学家Golovan等(2001)首次利用将大肠杆菌耐酸性植酸酶appA基因整合到猪体内，提高饲料磷的消化率，粪磷排放量显著降低75％。2013年本课题同样利用猪腮腺分泌蛋白上游调控区域成功制备得到转纤维素酶基因小鼠(Huang et al.,2013)和转甘露聚糖酶基因小鼠(李紫聪等，2013)，2018年zhang等用2A多肽将木聚糖酶-葡聚糖酶-植酸酶融合后导入猪基因猪，提高猪生产性能，减少磷氮排放。在公开号为CN106086068A专利中亦公开了利用2A连接肽，实现了果胶酶-木聚糖酶-植酸酶-纤维素酶融合表达，但表达效率不高。然而这些现有技术，存在如下问题，转单基因，表达量高，但表达酶种类少，消除个别饲料营养因子对动物性能改善水平有限，经济价值不大。2A介导的转多基因依然存在共表达效率不高，多基因融合酶的首尾基因表达不一致，且基因排列顺序困难的问题。
[0005] 多基因重组融合蛋白的构建需要两个因素：组成蛋白和连接肽。组成蛋白是根据所需融合蛋白产物的功能来进行选择的，在大多数情况下是相对简单的。而选择合适的连接肽却较困难，且在融合蛋白的设计过程中容易被忽略。若功能域不用连接肽直接进行融合会导致一些不良结果，如融合蛋白的错误折叠，产量低或者活性受损等。因此，连接肽的理性设计和选择对于融合蛋白的构建十分重要。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种多功能融合酶XABT基因及构建方法和应用，该多功能融合酶XABT基因，可以同时表达表达木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶和纤维素酶，并具有高效的酶活，该多功能融合酶强化了葡聚糖酶活性，对含葡聚糖较高的大麦、燕麦、黑麦、小麦及其麸皮类日粮具有更强的消化能力。亦可以用于制备节粮环保转基因经济动物，消除饲料中主要抗营养因子，达到提高饲料消化率，减少污染排放的目的。
[0007] 根据本公开的一个方面，提供了一种多功能融合酶XABT基因，该XABT基因可以高效表达木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶，若将其用于转基因动物和酶发酵工业生产，能显著提高基因转移和酶的生产效率，具有重要的经济价值。
[0008] 在某些实施方式中，XABT基因由木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-葡聚糖酶基因-A3'-纤维素酶基因组成。由于在2个以上蛋白共表达时，单纯使用柔性肽、刚性肽或2A都很难实现所有基因共表达，本发明通过组合应用A3和2A，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低的问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到多基因高效共表达的效果。同时，与单纯2A连接肽相比，本发明利用A3和furin P2A构建XABT显著提高四种酶不同PH条件下的活性，消除2A多肽对上游基因的影响，也避免部分蛋白空间结构抑制2A反应活性的问题，同时还避开对不同蛋白顺序优化繁琐试验过程，酶表达量比2A更高。刚性肽只能用于两种融合酶的构建，本发明将2A和A3巧妙结合，即保留A3优势，又增强融合酶的多基因共表达能力。在融合酶第二和第三号基因连接处采用自剪切效率最高的P2A，同时在其N端添加furin酶识别基序RVKR，RVKR可在细胞器高尔基体高效剪切，仅残留4个氨基酸残基，该设计与一般2A序列，具有更高的剪切效率，对表达产物影响最小。由此，通过本公开设计获得的XABT基因序列，可以高效表达木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶活性，解决了四种基因共表达的难题，更为以后将其用于转基因动物和酶发酵工业生产来提高基因转移和酶的生产效率提供了基础。同时，在公开号为CN106086068A专利中公开的，采用2A连接两个基因序列时，两个基因的连接顺序都会影响基因的表达及功能的发挥，而且两个基因的酶活都不及单基因的酶活高；在多基因连接时，若只采用2A连接肽，这种位置效应会更加明显，对于每个基因酶活的影响会更加突出。但是本公开采用A3和2A连接态组合使用构建的上述多功能酶基因，可以克服位置效应，每个基因表达的酶活与单基因相当。
[0009] 在某些实施方式中，A3的基因序列如SEQ ID No:5所示。
[0010] 在某些实施方式中，A3'基因序列如SEQ ID No:6所示。
[0011] 在某些实施方式中，XABT基因序列如SEQ ID No:11所示。连接肽最重要的指标是氨基酸链的长度，不同长度的GGGGS连接肽对融合蛋白的表达量和活性有着不同的影响，并不是连接肽越长表达量就越高。融合酶对柔性肽要求比较苛刻，过长或过短的柔性肽都不利于融合酶活性。分子质量大、结构复杂的蛋白需要的折叠空间也就越大，连接肽也应加长，但过长的肽链可能会增加抗原性，同时也易被酶水解断裂。连接肽过短形成空间位阻效应会影响蛋白的正确折叠，也提高了聚体形成的几率。刚性连接肽由于二级结构的稳固，不可伸展弯曲的特性，常用来固定两端功能蛋白间距，保证功能域的完整。由此，设计的刚性连接态A3/A3'与柔性连接态P2A共同作用连接4个基因，实现4个基因的共表达，A3/A3'与P2A连接态序列经过优化设计，使得木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶均可高效表达。另外，由于2A多肽高效的自剪切功能，可较好实现前后两个蛋白的共表达，被誉为蛋白融合表达最可靠的linker。但是，部分酶蛋白融合2A的C端多肽后功能显著受损，后一个蛋白的表达量降低。多基因共表达时，对蛋白组合顺序要求苛刻，需要繁琐验证排列组合，才能实现低水平的共表达(公开号为CN106086068A专利中已表明此现象)，不利于多功能融合酶的构建。2A序列剪切效率与上游多肽基序有关，部分蛋白氨基酸基序会严重影响2A切割活性，导致2A介导前后两个酶因无法完全切割，导致二级结构折叠异常，还有可能被上游基因信号肽迁移到靶向错误的细胞器，无法正确的加工和分泌，导致功能尚失，表达失败。本公开中，采用A3与2A连接态组合使用的方式来构建4种基因融合表达的多功能融合酶，可以克服
2A及A3连接态各自的缺点，使该多功能融合酶可以高效的表达四种酶活，可为获得表达该四种酶的转基因动物做好基础。
2A及A3连接态各自的缺点，使该多功能融合酶可以高效的表达四种酶活，可为获得表达该四种酶的转基因动物做好基础。
[0012] 根据本公开的另一个方面，提供了一种多功能融合酶XABT基因构建方法，该方法包括如下步骤：目的基因的筛选；A3序列的设计和合成；将木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶基因通过连接肽进行连接；构建木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶多功能融合酶XABT基因。
[0013] 在某些实施方式中，木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶基因连接结构为木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-葡聚糖酶基因-A3'-纤维素酶基因。
[0014] 在某些实施方式中，A3序列为SEQ ID No:5所示，A3'序列为SEQ ID No:6所示。
[0015] 在某些实施方式中，木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-葡聚糖酶基因-A3'-纤维素酶基因序列如SEQ ID No:11所示。
[0016] 根据本公开的再一个方面，提供了一种多功能融合酶XABT基因的应用，该多功能融合酶XABT基因用于制备节粮环保转基因动物。该动物可以为转基因猪、转基因牛、转基因羊等。
[0017] 本公开的有益效果：
[0018] 1)本公开设计构建pxynB-A3-APPA-furin-P2A-pBg17A-A3'-TeEGI(XABT)融合酶，具有共表达酸性木聚糖酶，植酸酶，葡聚糖酶和纤维素酶四种酶活性，囊括饲料中消除主要抗营养因子所需要水解酶，对提高饲料转化率具有重要价值。该设计提高了基因表达效率，若将其用于转基因动物和酶发酵工业生产，能显著提高基因转移和酶的生产效率，具有重要的经济价值。
[0019] 2)与单纯2A连接肽相比，本发明利用A3和furin P2A构建XABT显著提高四种酶不同PH条件下的活性，消除2A多肽对上游基因的影响，也避免部分蛋白空间结构抑制2A反应活性的问题，同时还避开对不同蛋白顺序优化繁琐试验过程。酶表达量比2A更高。
[0020] 3)刚性肽只能用于两种融合酶的构建，本发明将2A和A3巧妙结合，即保留A3优势，又增强融合酶的多基因共表达能力。
[0021] 4)本公开在融合酶第二和第三号基因连接处采用自剪切效率最高的P2A，同时在其N端添加furin酶识别基序RVKR，RVKR可在细胞器高尔基体高效剪切，仅残留2个氨基酸残基，该设计与一般2A序列，具有更高的剪切效率，对表达产物影响最小。
[0022] 5)本公开携带XABT由猪CEP112位点高效定点整合载体运载，可高效制备转基因猪，快速获得整合位置一致的转基因家系，培育转基因猪新品种。
[0024] 图1为XABT多功能融合酶多顺反子设计图谱；
[0025] 图2为木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)双顺反子优化组合与表达结果：其中A为木聚糖酶-植酸酶双顺反子优化组合设计示意图，B为xynB的pH范围；C为appA的pH范围；D为xynB的pH稳定性(39.℃，2h)；E为appA的pH稳定性(39.℃，2h)；
[0026] 图3葡聚糖酶(bg17A)-纤维素酶(TeEGⅠ)双顺反子优化组合与表达结果：A为bg17A-TeEGⅠ双顺反子优化组合设计示意图，B为葡聚糖酶的pH范围，C为纤维素酶的pH范围，D为葡聚糖酶的pH稳定性，E为appA纤维素酶的pH稳定性，F和G为Q-PCR定量结果，H为与单基因比较，拓宽pH范围结果；
[0027] 图4多顺反子XABT在pK15细胞中表达检测结果；
[0028] 图5Cep112-npsp-XABT质粒图谱和质粒构建电泳图。
具体实施方式
[0029] 一、目的基因的筛选
[0030] 分别将来源于黑曲霉的木聚糖酶基因xynB(Guo et al.,2013)，来源于大肠杆菌的植酸酶基因appA，来源于Bisporasp.MEY-1葡聚糖酶基因bg17A(Luo et al.,2010)，来源于蟋蟀的纤维素酶基因TeEGⅠ(Kim et al.,2008)，经SignalP 4.1Server预测信号肽后，分别去掉其自身的信号肽，然后根据猪密码子偏好进行优化，并将猪或牛来源的腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)信号肽(signal peptide，sp)序列分别添加到密码子优化后的候选基因的氨基酸序列的N端，如pigPSP-SP-xynB,pigPSP-SP-appA,pigPSP-SP-teEGⅠ,pigPSP-SP-bg17A分别简写为pSPxyn,pSPappA,pSPTeEG,pSPbg17A，密码子优化后的成熟肽基因分别命名为pxyn(基因序列如SEQ ID No:1所示),pappA(基因序列如SEQ ID No:2所示),pbgA(基因序列如SEQ ID No:3所示),pTEGI(基因序列如SEQ ID No:4所示)。
[0031] 二、构建木聚糖酶-植酸酶-葡聚糖酶-纤维素酶多顺反子基因序列
[0032] 利用A3刚性肽，分别将木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)，葡聚糖酶(bg17A)-纤维素酶(TeEGⅠ)连接构建双功能融合酶，去掉A3上游基因终止密码子，同时去掉C端下游基因信号肽。
[0033] 经优化突变后的A3序列如下：
[0034] A3(SEQ ID No:5)：GAGGCTGCCGCCAAAGAAGCTGCCGCCAAGGAGGCTGCCGCCAAG[0035] A3'(SEQ ID No:6)：GAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAG[0036] 经优化后A3连接的双功能酶基因序列为xynB-A3-APPA与bg17A-A3'-TeEGI。将上述融合设计多功能酶顺反子经猪密码子优化，去除稀有密码子，选择猪细胞使用频率较高的密码子。
[0037] 并分别将多顺反子内A3重复序列和猪腮腺蛋白信号肽再次优化，以减少重复序列对多顺反子结构稳定性的影响，优化后的序列进行人工合成。优化后的pxynB-A3-APPA基因序列如SEQ ID No:7所示，氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；优化后的pbg17A-A3'-TeEGI基因序列如SEQ ID No:9所示，氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。
[0038] 利用Furin酶识别基因序列和高效自剪切P2A序列，将pxynB-A3-APPA与pbg17A-A3'-TeEGI，连接构建多功能顺反子pxynB-A3-APPA-furin-P2A-pbg17A-A3'-TeEGI(XABT)(序列如SEQ ID No:11所示，基因结构图谱如图1所示)克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体多克隆位点BamHI/EcoRI上。
[0039] 利用P2A分别将木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)，葡聚糖酶(bg17A)-纤维素酶(TeEGⅠ)，连接构建双功能酶pxynB-p2A-pappA、pbg17A-p2A-pTeEGⅠ，克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上多克隆位点,作为对照组。
[0040] 三、木聚糖酶-植酸酶-葡聚糖酶-纤维素酶真核表达载体构建
[0041] 将优化后的多功能酶顺反子XABT插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点BamHI/EcoRI上，经酶切和测序鉴定，多功能酶顺反子XABT真核表达载体pCD-XABT构建成功。
[0042] 四、木聚糖酶-植酸酶-葡聚糖酶-纤维素酶多功能酶的体外表达与功能验证[0043] 将pCD-XABT真核表达载体按照转染试剂盒LipofectamineTM LTX+PLUSTM Reagent(invitrogen)说明书瞬时转染猪肾pK15细胞系，48-72h，收集细胞上清液作为粗酶液测定酶活，检测其酶活力及其pH耐受力。酶活测定方法和定义参考纤维素酶《NYT/912-2004》、葡聚糖酶《NYT/911-2004》、木聚糖酶《GBT/23874-2009》、植酸酶《GBT/18634-2009》。
[0044] 1、木聚糖酶(xynB)和植酸酶(appA)融合酶表达分析
[0045] 将木聚糖酶(xynB)和植酸酶(appA)分别用furin-P2A和A3融合，并在猪pK15细胞表达，结果显示，融合后A3连接的融合酶成功表达木聚糖酶和植酸酶双功能酶，且其表达木聚糖酶和植酸酶在pH2.0-pH6.5均具有较高的生物学活性，其中pxynB-A3-appA的木聚糖酶活性，在pH2.0-5.0高于pxynB-p2A-pappA，在pH5.0后略低于后者，但pxynB-A3-appA表达的木聚糖酶对pH2.0-pH7.0耐受能力明显高于pxynB-p2A-pappA。pxynB-A3-appA表达的植酸酶在不同pH缓冲液中活性和耐受性均显著优于pxynB-p2A-pappA，结果如图2所示。
[0046] 2、葡聚糖酶(bg17A)-纤维素酶(TeEGⅠ)融合酶表达分析
[0047] 本研究还尝试将高效β-1,3-1,4-葡聚糖酶bg17A与纤维素酶TeEGⅠ融合表达，结果显示，pbg17A-A3'-TeEGⅠ双顺反子表达的葡聚糖酶和纤维素酶在不同pH缓冲液中活性和耐受性均优于pbg17A-p2A-pTeEGⅠ，pbg17A-A3'-TeEGⅠ表现出较高的葡聚糖酶活性，同时pH范围增宽，其纤维素酶在不同pH缓冲液中活性和走势与TeEGⅠ基本一致。Q-PCR数据显示pbg17A-p2A-pTeEGⅠ和pbg17A-A3'-TeEGⅠmRNA水平差异不大，推测pbg17A-p2A-pTeEGⅠ之间空间结构影响了2A的剪切，最终影响了双功能酶活。在不同pH范围，与单基因比较，融合酶pbg17A-A3'-TeEGⅠ双顺反子明显拓宽了葡聚糖酶pH范围，该融合酶不但适合胃中酸性环境，对小肠中弱酸和中性环境也有较强适应性，结果如图3所示。
[0048] 3、多顺反子XABT在pK15细胞中表达检测
[0049] 分别用电转和脂质体化学转染方法，将多顺反子XABT真核表达载体pCD-XABT导入PK15细胞，于48h后收集细胞上清培养液，测定其表达情况，结果显示，多顺反子XABT均成功表达出葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶和纤维素酶，结果如图4所示。
[0050] 五、定点整合到CEP112位点转木聚糖酶-植酸酶-葡聚糖酶-纤维素酶(XABT)基因表达载体构建
[0051] 首先将XABT多顺反子替换前期研究载体CEP112-LA340RA3219(来源于第“201711477805.5”号“一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法”，公开号“108285906A”专利)中的BEXA顺反子，构建了新载体Cep112-mPSP-XABT，在其基础上，用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XABT，然后用表1中inf-npsp引物扩增npsp上游调控区，并替换现有序列，npsp(-11.5kb～-5.7kb)在原mpsp(-11.1kb～-5.7kb)基础上延长了调控区序列395bp，构建Cep112-npsp-XABT载体(序列如SEQ ID No:12所示)，经酶切验证，切割条带大小与预期相符，经过测序验证，确定成功获得一个能在猪唾液腺中特异表达XABT四种功能酶的转基因载体，质粒图谱及电泳结果如图5所示。
[0052]
[0053]
[0054] 获得的Cep112-npsp-XABT载体为猪CEP112位点高效定点整合载体运载，可高效制备转基因猪，快速获得整合位置一致的转基因家系，为后续快速培育遗传背景一致的转基因猪新品种做好基础。
[0055] 六、转木聚糖酶-植酸酶-葡聚糖酶-纤维素酶(XABT)基因猪的获得
[0057] 对获得的转XABT基因猪进行基因及测序水平的鉴定，采集阳性猪的唾液，进行检测，发现转XABT基因猪均可高效的表达葡聚糖酶，木聚糖酶，植酸酶和纤维素酶，且酶的活性与转单基因猪酶的活性相当。且获得的多功能融合酶XABT基因表达的葡聚糖酶对哺乳动物胃肠道环境适应性更强。
[0058] 以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。
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