用于检测细菌孢子的快速方法
阅读：367发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于检测细菌孢子的快速方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了通过测量二 磷酸 腺苷(ATP)的经时产生，用于检测细菌孢子的存在的方法。通过将单磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)转换为ATP来检测孢子。，下面是用于检测细菌孢子的快速方法专利的具体信息内容。
1.一种检测并且区分样品中的细菌孢子与营养细胞及其它微生物的方法，所述方法包括：
制备待测试细菌孢子的存在的样品；
测量三磷酸腺苷(ATP)的初始数量；
富集所述样品；
从所述样品中提取单磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)；
用酶将AMP和ADP转换为ATP；以及
测量ATP的最终数量，其中从初始ATP测量到转换的ATP测量的ATP浓度中的增加指示孢子的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过将所述样品在约80℃下加热约5至60分钟或在约100℃下加热约5至30分钟来分离孢子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述制备包括：
收集含有未知数量的孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的样品；和
如果是固体，则使所述样品崩解。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品从硬表面、液体或纸产品中收集。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述硬表面选自以下：食物和饮料加工设备、管道、罐、蒸发器、喷嘴、乳品加工设备、牛奶罐、运奶车、挤奶设备、台面、烹饪表面、浴室表面例如水槽和马桶把手、电灯开关面板、门把手、呼叫按钮、电话手柄、遥控器、台式机、患者护栏、抓杆、外科器械、包括管道、柜子、流浆箱、损纸塔、回收装置刀片和成型线的造纸厂内的设备。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述液体选自以下：工艺水、进水、冷却塔水、经处理和未经处理的废水、纸配料(薄坯和厚坯)、白水、吸水箱水、托盘水、水果和蔬菜水槽水、蛋白质加工水、水培水或海鲜养殖用水以及农业用水。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述纸产品选自：用于食物接触和非食物接触等级的纸产品，例如成品纸产品和成品纸板产品；用于外科或医疗用途的盖布；无菌包装容器；
塑料食物和饮料容器；食物罐头；铝或PET饮料容器；袋或薄膜或气调包装。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述富集包括通过离心、玻璃珠、魔力珠或过滤来增加所述样品中的微生物浓度。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述提取包括用溶剂、酸或热处理所述样品。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述提取还包括用去污剂或表面活性剂处理所述样品。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述孢子使用65℃或更高的温度提取1至10分钟。
12.根据权利要求1-3和8-10中任一项所述的方法，其中所述转换包括：
用丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸处理所述样品，以将ADP转换为ATP；
用肌激酶处理所述样品，以将ATP和AMP转换为ADP；以及
用丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸处理所述样品，以将ADP转换为ATP。
13.根据权利要求1-3和8-11中任一项所述的方法，其中所述腺嘌呤核苷酸在约10分钟至24小时内由丙酮酸激酶、肌激酶和磷酸烯醇丙酮酸转换为ATP。
14.根据权利要求1-3和8-12中任一项所述的方法，其中所述测量包括：
向所述样品中添加萤光素酶和萤光素；以及
以相对光单位(RLU)测量光发射。
15.根据权利要求1-3和8-12中任一项所述的方法，其中所述测量包括通过HPLC测量ATP水平。
16.根据权利要求1-3和8-15中任一项所述的方法，其还包括基于孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的存在或不存在，来选择抗微生物处理。
17.根据权利要求16所述的方法，其中当检测到孢子时所述抗微生物处理选自二氧化氯、臭氧、戊二醛、次氯酸钠、过酸、UV、极热、辐射。
18.根据权利要求16所述的方法，其中当仅检测到营养细胞时，所述抗微生物处理选自：异噻唑啉；戊二醛；二溴次氮基丙酰胺；氨基甲酸酯；季铵化合物；次氯酸钠；二氧化氯；
过氧乙酸；臭氧；氯胺；溴代氨基磺酸盐；溴-氯-二甲基乙内酰脲；二氯二甲基乙内酰脲；一氯胺、与铵盐和稳定剂组合使用的次氯酸钠，所述稳定剂包括二甲基乙内酰脲氨基酸、氰脲酸、琥珀酰亚胺、脲；及其组合。
19.根据权利要求16所述的方法，其还包括对所述硬表面、液体或纸产品施加所述抗微生物处理。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中能够在样品收集的2至8小时内确定所述样品中的孢子浓度。
用于检测细菌孢子的快速方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请作为PCT国际专利申请于2017年7月12日提交，并且涉及与此同时提交的国际申请“A METHOD FOR THE RAPID DETECTION OF BACTERIAL SPORES IN AN INDUSTRIAL PROCESS”序列号(代理人案卷号163.3176WO01)中公开的主题，所述国际申请的主题以引用的方式并入本专利申请中。
背景技术
[0003] 内生孢子是由厚壁菌门(Firmicute)中的特定细菌物种产生的休眠，坚韧，非生殖结构。当处于营养状态的细菌细胞暴露于应激或缺乏营养时，产生内生孢子或孢子。内生孢子具有非常低的代谢率，且因此无法通过通常用于快速检测营养细菌细胞的方法进行检测。进一步地，孢子极难杀死，因为它们被设计为在恶劣条件下生存，所述恶劣条件例如UV、热、消毒剂、干燥和饥饿。在暴露于有利的条件和营养素后，孢子发芽以产生营养细胞。
[0004] 产生孢子的细菌是成问题的，因为它们引起人和动物中的疾病，食物和饮料中的腐败，并且促进生物膜的永存化。特别关注的产生孢子的细菌菌株是芽孢杆菌属(Bacillus)和梭菌属(Clostridium)中的那些。两者均为革兰氏阳性杆状细菌，其包括对人有害的物种。炭疽杆菌(B.anthracis)产生炭疽毒素，并且蜡状芽孢杆菌(B.cereus)引起食物中毒。肉毒杆菌(C.botulinum)引起肉毒杆菌中毒(也称为肉毒杆菌毒素)，艰难梭菌(C.difficile)引起腹泻，产气荚膜梭菌(C.perfringens)引起食物中毒，且破伤风杆菌(C.tetani)引起破伤风。芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌可以在食物包装纸板产品中引起问题。蜡状芽孢杆菌是最成问题的细菌之一，因为它已被鉴定为对用于净化环境表面的杀菌化学品具有渐增的抗性。
[0005] 蜡状芽孢杆菌经常被诊断为胃肠道病症的原因，并且已被提议为数次食源性疾病暴发的原因。由于蜡状芽孢杆菌的快速孢子形成能力，因此它很容易在环境中存活。这种细菌可以直接和间接污染食物。蜡状芽孢杆菌可以直接经由粪便和土壤污染生乳，并且可以在牛的肠通道和巴氏灭菌过程中存活。间接污染可以来自液体和食物包装中蜡状芽孢杆菌孢子的存在。与食物直接接触的材料中存在的孢子可以引起孢子迁移到食物内，导致腐败。
[0006] 鉴于这些细菌由人摄入的负面影响，政府机构已制定了旨在减少孢子存在的标准或指南。当前的孢子检测方法需要48小时来完成。测试细菌孢子的最常见方法是平板技术。这种两天延迟对于许多行业是不切实际的。在产品测试的情况下，两天延迟需要隔离大量产品，直到测试结果完成。这例如在造纸或纸板工业中是一个问题。
[0007] 同样地，当测试食物和饮料加工设备时，设备仅定期取下用于清洁，并且实际上，不能保持离线两天。医院在等待测试结果时不能将病房空两天，所述测试结果设计为在已感染有艰难梭菌的患者已出院后，鉴定病房中的表面上的孢子存在。而且，将一定数量的食物或水保持被隔离是不切实际的，尤其是在等待时食物可能腐败的地方或者水或流体不断变化的地方(例如，冷却塔水、饮料、牛奶加工过程中的牛奶)。
[0008] 孢子形成细菌可以对液体包装纸板产品质量和机器生产具有负面影响。在生产过程中液体包装纸板产品的孢子污染的不充分诊断可以导致经济损失。
[0009] 本公开内容正是针对这一背景而制备。发明内容
[0010] 一般而言，本公开内容涉及快速检测且区分细菌孢子与营养细胞的方法。
[0011] 在一个方面，本发明描述了检测且区分样品中的细菌孢子与营养细胞及其它微生物的方法。该方法开始于制备待测试细菌孢子的存在的样品。将样品富集且测量ATP的初始数量。从样品中提取单磷酸腺苷(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)，并且酶将AMP和ADP转换为ATP。测量ATP的最终数量，其中从初始ATP测量到转换的ATP测量的ATP浓度中的增加指示样品中孢子的存在。
[0012] 在一些方面，检测且区分样品中的细菌孢子与营养细胞及其它微生物的方法开始于制备待测试细菌孢子的存在的样品。将样品富集且测量ATP的初始数量。从样品中提取AMP和ADP，并且酶将AMP和ADP转换为ATP。测量ATP的最终数量，其中从初始ATP测量到转换的ATP测量的ATP浓度中的增加指示样品中孢子的存在。该方法可以包括另外的步骤。在一些实施例中，通过收集含有未知数量的孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的样品来制备样品。如果样品是固体，则使其崩解。可以从硬表面、液体或纸产品中收集样品。硬表面可以是食物和饮料加工设备、管道、罐、蒸发器、喷嘴、乳品加工设备、牛奶罐、运奶车、挤奶设备、台面、烹饪表面、浴室表面例如水槽和马桶把手、电灯开关面板、门把手、呼叫按钮、电话手柄、遥控器、台式机、患者护栏、抓杆、外科器械、包括管道、柜子、流浆箱、损纸塔、回收装置(saveall)刀片和成型线的造纸厂内的设备。液体可以是工艺水、进水、冷却塔水、经处理和未经处理的废水、纸配料(薄坯和厚坯)、白水、吸水箱水、托盘水、水果和蔬菜水槽水、蛋白质加工水、水培水或海鲜养殖用水以及农业用水。而且，纸产品可以是用于食物接触和非食物接触等级的纸产品，例如成品纸产品和成品纸板产品；用于外科或医疗用途的盖布；无菌包装容器；塑料食物和饮料容器；食物罐头；铝或PET饮料容器；袋或薄膜或气调包装。通过将样品在80℃下加热约5-60分钟、约10-30分钟或约15-20分钟，从样品中分离孢子；或可替代地，将样品在100℃下加热约5-30分钟、约10-30分钟或约15-20分钟。用溶剂、酸、热(例如65℃或更高温度1-10分钟)、去污剂或表面活性剂，从样品中提取AMP和ADP。通过以下将AMP和ADP转换为ATP：用丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸处理样品，以将ADP转换为ATP，用肌激酶处理样品，以将ATP和AMP转换为ADP，并且用丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸处理样品，以将ADP转换为ATP。腺嘌呤核苷酸在约10分钟至24小时内由丙酮酸激酶、肌激酶和磷酸烯醇丙酮酸转换为ATP。通过向样品中添加萤光素酶和萤光素，并且以相对光单位(RLU)测量光发射，或通过HPLC测量样品中的ATP水平。基于孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的存在或不存在，来选择且施加抗微生物处理。如果存在孢子，则抗微生物处理选自二氧化氯、臭氧、戊二醛、次氯酸钠、过酸、UV、极热和辐射。当仅存在营养细胞时，抗微生物处理选自：异噻唑啉；戊二醛；二溴次氮基丙酰胺；氨基甲酸酯；季铵化合物；次氯酸钠；二氧化氯；过氧乙酸；臭氧；氯胺；溴代氨基磺酸盐；溴-氯-二甲基乙内酰脲；二氯二甲基乙内酰脲；一氯胺、与铵盐和稳定剂组合使用的次氯酸钠，所述稳定剂包括二甲基乙内酰脲氨基酸、氰脲酸、琥珀酰亚胺、脲；及其组合。在一些实施例中，该方法还包括对硬表面、液体或纸产品施加所选择的抗微生物处理。该方法可以在样品收集后的2-8小时内检测到孢子。
[0013] 在一些方面，该方法还包括基于孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的存在或不存在，来选择抗微生物处理。
[0014] 在一些实施例中，通过将样品在约80℃下加热约5至60分钟或在约100℃下加热约5至30分钟，从样品中分离孢子。在一些实施例中，富集样品涉及通过离心、玻璃珠、魔力珠或过滤来增加样品中的微生物浓度。
[0015] 在一些方面，用溶剂、酸、热、去污剂或表面活性剂，从样品中提取AMP和ADP。在其中样品用热进行处理的实施例中，施加65℃或更高的温度1至10分钟。
[0016] 在一些实施例中，通过以下将AMP和ADP转换为ATP：用丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸处理样品，以将ADP转换为ATP，用肌激酶处理样品，以将ATP和AMP转换为ADP，并且用丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸处理样品，以将ADP转换为ATP。在一些方面，腺嘌呤核苷酸在约10分钟至24小时内由丙酮酸激酶、肌激酶和磷酸烯醇丙酮酸转换为ATP。
[0017] 在一些方面，通过向样品中添加萤光素酶和萤光素，并且以相对光单位(RLU)测量光发射，来完成样品中ATP水平的测量。在其它方面，通过HPLC测量ATP水平。
[0018] 在一些方面，该方法还包括基于孢子、营养细胞或孢子和营养细胞两者的存在或不存在，来选择抗微生物处理。在一些实施例中，当检测到孢子时，抗微生物处理选自二氧化氯、臭氧、戊二醛、次氯酸钠、过酸、UV、极热、辐射。在其它实施例中，当仅检测到营养细胞时，抗微生物处理选自：异噻唑啉；戊二醛；二溴次氮基丙酰胺；氨基甲酸酯；季铵化合物；次氯酸钠；二氧化氯；过氧乙酸；臭氧；氯胺；溴代氨基磺酸盐；溴-氯-二甲基乙内酰脲；二氯二甲基乙内酰脲；一氯胺、与铵盐和稳定剂组合使用的次氯酸钠，所述稳定剂包括二甲基乙内酰脲氨基酸、氰脲酸、琥珀酰亚胺、脲；及其组合。在一些实施例中，该方法还包括对硬表面、液体或纸产品施加所选择的抗微生物处理。
[0019] 在一些方面，该方法可以在样品收集的2至8小时内确定样品中的孢子浓度。
具体实施方式
[0020] 本公开内容涉及检测细菌孢子的方法。特别地，实施例涉及快速区分细菌孢子的存在与其它微生物的存在，并且确定孢子污染源的方法。此外，本公开内容区分了孢子形成细菌的营养状态和孢子状态。
[0022] 如本文使用的，术语“细菌孢子”或“内生孢子”指由某些细菌物种，例如芽孢杆菌和梭菌物种产生的结构。孢子致使细菌在恶劣条件下保持休眠，所述恶劣条件例如极端温度、干旱和化学处理。
[0023] 如本文使用的，术语“最终使用腐败事件”指当微生物已生长足以腐败产品的时间。
[0024] 如本文使用的，术语“发芽”指来自休眠细菌孢子的营养细胞的生长。当孢子暴露于对于营养细胞生长的有利条件下时，发生发芽。
[0025] 如本文使用的，术语“营养细菌细胞”指活跃生长且分裂的细菌细胞。
[0026] 如本文使用的，术语“杀生物剂”指预期通过化学或生物手段破坏或中和任何有害生物的化学物质或微生物。杀生物剂可以包括防腐剂、杀虫剂、消毒剂和农药，其用于控制对人或动物健康有害或者对天然产品或制造产品造成损害的生物。杀生物剂是可以预防微生物污染或由微生物造成的变质的抗微生物剂或化学组合物。
[0027] 如本文使用的，术语“杀孢子剂”指用于杀死或中和细菌孢子的任何物质。如本公开内容中使用的，术语“杀孢子剂”指具有在60℃下在10秒内，引起蜡状芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的孢子群体中大于90％的减少(1-log级减少)的能力的物理或化学试剂或过程。优选地，本公开内容的杀孢子组合物提供了在60℃下在10秒内，此类群体中大于99％的减少(2-log级减少)，更优选大于99.99％的减少(4-log级减少)，且最优选大于99.999％的减少(5-log级减少)。
[0028] 术语“隔离”指被病原体污染或感染的生物或物体的分开和分离。
[0029] 如本文使用的，术语“快速检测”指在小于48小时内检测细菌和细菌孢子的方法。优选地，“快速检测”指在小于12小时内检测细菌。最优选地，“快速检测”指在小于4小时内检测细菌。
[0030] 如本文使用的，术语“工艺水”是与技术设备和生产工艺结合使用的水。工艺水不视为可饮用的，且用于促进制造工艺。
[0032] 如本文使用的，术语“微生物”指其为单细胞或多细胞的微观生物。这些生物可以包括细菌、病毒、真菌和藻类。
[0033] 如本文使用的，术语“生物发光”指通过活生物的光产生和发射。萤光素酶催化萤光素的氧化，产生光。
[0034] 如本文使用的，术语“高效液相色谱”(HPLC)指用于分开、鉴定且定量混合物中的每种组分的分析化学技术。
[0035] 如本文使用的，术语“阳离子”指带正电的离子。
[0036] 如本文使用的，术语“休眠”指具有正常生理功能中止一段时间的生物。
[0037] 如本文使用的，术语“菌落形成单位”(CFU)指样品中的活细菌或真菌细胞数目的估计量。活细胞能够在受控条件下繁殖。CFU对于液体作为CFU/mL或对于固体作为CFU/g的量度提供。
[0038] 如本文使用的，术语“相对光单位”(RLU)指如通过发光计测量的光量。
[0039] 如本文使用的，术语“发芽条件”指有利于细菌孢子(内生孢子)的活化、发芽和长出的条件。
[0040] 检测细菌和细菌孢子的存在在许多行业中很重要。当涉及人类健康时，指南规定了可以存在的最大细菌量。例如，“乳品商标准(Dairymen’s Standard)”提供了关于待用于乳制品中的每克纸或纸板可能存在的细菌的菌落形成单位(CFU)数目的要求。从待测试的纸或纸板上切下样品，并且置于密封的信封中。然后将样品切成小方块，并且放入无菌搅拌器中。将无菌磷酸盐稀释水加入搅拌器中切碎的纸样品中，以帮助样品崩解。崩解后立即将样品转移到一个或多个培养皿内。将融化的琼脂倒在培养皿中的样品上，且允许固化。在固化后，使平板在36℃下温育48小时。在温育后，用菌落计数器检查板中CFU的存在和数目。
[0041] 行业指南将与乳制品一起使用的纸或纸板产品上存在的菌落形成单位(CFU)数目限制为小于250个/克。一些最终用户可能需要或多或少的严格遵从(<100->1000CFU/g)。为了遵从乳制品、食物和医疗保健行业的孢子指南，重要的是，当细菌处于其最易受影响的营养状态时，检测且适当地处理能够形成孢子的细菌。
[0042] 孢子由许多保护层组成，所述保护层使得其对氧化和化学攻击有抵抗力。与营养细胞相比，需要更高的杀生物剂剂量来杀灭孢子。将杀生物剂施加于活跃营养细胞始终更有效。孢子控制程序必须足够有效，以攻击处于营养状态的细胞并且预防孢子形成。剂量必须足够高，以在营养细胞发育成孢子前杀死它们。
[0043] 三磷酸腺苷(ATP)测量已用于检测各种行业中的微生物。ATP由细胞用作能源，并且是代谢活性的指标。ATP可以在营养细菌中进行测量，但细菌孢子含有很少的ATP或不含ATP。
[0045] 在利用生物发光的方法中，来自萤火虫的萤光素酶和萤光素在氧的存在下与具有阳离子(例如镁)的样品混合。如果存在ATP，它将在产生光的氧化反应中，引起萤光素酶(底物)和萤光素(催化剂)之间的反应。用发光计检测光发射，并且以相对光单位(RLU)报告。产生的光量与存在的微生物的代谢活性成比例，但并不指示存在的生物的量。萤光素酶/萤光素反应是本领域众所周知的，并且存在关于必需试剂的商业来源及其使用方案。例如，几种萤光素酶/萤光素试剂连同萤光素酶可在来自例如Promega Corp.(Madison,WI)和Luminultra(Fredericton,New Brunswick)的商业试剂盒中获得。商购可得的萤光素酶包括萤火虫萤光素酶(萤火虫(Photinus pyralis)，“Ppy萤光素酶”)。纯化的甲虫萤光素也从Promega商购可得。
[0046] 如上文提及的，尽管营养细菌细胞产生大量ATP，但孢子产生非常少的ATP。营养细胞中约80％的腺嘌呤核苷酸(AN)为ATP，而在孢子中，这一数字为1％或更少。然而，孢子含有大量的腺嘌呤核苷酸(AN)，如AMP和ADP。AMP和ADP不能用发光技术进行检测，但AMP和ADP可以从细菌孢子中提取。某些酶的添加将AMP和ADP转换成ATP。然后可以用发光技术来定量ATP。这些ATP测量可以用于估计样品内的孢子计数。令人惊讶地，这种方法可以在短至一小时内定量样品中存在的孢子数目。
[0047] 为了在工业工艺中实施用于快速检测细菌孢子的这种方法，必须首先制备待测试细菌孢子的存在的样品。样品可以从可能被细菌孢子污染的任何来源中收集。样品可以被细菌孢子、营养细菌细胞、无一或两者污染。样品可以取自硬表面，浆料，原料纤维，食物或饮料产品，液体或包装或纸板产品样品。
[0048] 具有硬表面的设施的非限制性例子包括食物和饮料厂、乳品厂、农场和乳品店、酿酒厂、乙醇厂、全方位服务和快速服务餐厅、杂货店、仓储式商店和零售商店、商业或办公场所、酒店、汽车旅馆、医院、造纸厂、工业制造厂包括汽车厂、冷却塔、水处理厂、炼油厂、油田和气田和管道、以及钻井平台。硬表面的实例包括食物和饮料加工设备，包括管道、罐、蒸发器、喷嘴等等；乳品加工设备、牛奶罐、运奶车、挤奶设备、台面、烹饪表面、浴室表面例如水槽和马桶把手、电灯开关面板、门把手、呼叫按钮、电话手柄、遥控器、台式机、患者护栏、抓杆、外科器械、包括管道、柜子、流浆箱、损纸塔、回收装置刀片、成型线等等的造纸厂内的设备。
[0049] 硬表面上的样品可以使用无菌拭子或可以用于从硬表面收集微生物的其它无菌装置获取，所述其它无菌装置例如：医用胶带、棉布、纤维素布等等。如果表面是干的，则可以用拭子施加溶剂，以溶解可能存在的任何细菌残留物，并且将残留物悬浮于溶剂中用于测试。溶剂的实例可以包括但不限于：无菌水、无菌磷酸盐缓冲液、无菌Tris EDTA(TE)缓冲液、稀释去污剂溶液例如TWEEN等等。
[0050] 液体的非限制性例子包括工艺水、进水、冷却塔水、经处理和未经处理的废水、纸配料(薄坯和厚坯)、白水、吸水箱水、托盘水、水果和蔬菜水槽水、蛋白质(例如家禽、猪肉、红肉、海鲜)加工水、水培水或海鲜养殖用水、农业用水。可以将液体样品从潜在污染源等分到无菌容器内。
[0052] 包装和产品的非限制性例子包括：用于食物接触和非食物接触等级的纸产品，例如成品纸产品和成品纸板产品；用于外科或医疗用途的盖布；无菌包装容器；塑料食物和饮料容器(例如酸奶容器、牛奶容器、熟食容器)；食物罐头(例如汤罐头)；铝或PET饮料容器；袋或薄膜或气调包装。产品可以在它们离开制造设施之前，例如在造纸厂，或在使用点，例如在食物或饮料厂进行测试。纸产品样品可以根据乳品商标准(TAPPI测试方法T449纸和纸板细菌学检验(TAPPI Test Method T449 Bacteriological Examination of Paper and Paperboard)、或ISO8784纸浆和纸板微生物学检验(ISO8784 Pulp and Board Microbiological Examination))中所述的程序进行测试。
[0053] 测量样品的初始ATP水平，并且记录为“ATP原始”。ATP测量通过发光方法进行。如上所述，样品可以与萤光素酶和萤光素连同阳离子、氧和tris缓冲液或类似缓冲液组合。通过反应产生的光以相对光单位(RLU)进行测量。可以用发光计进行测量。可替代地，可以通过HPLC进行ATP测量。
[0054] 将样品加热以破坏营养细胞。在一些实施例中，将样品在80℃下加热约5至60分钟，优选约10至30分钟，且更优选约15至20分钟。在其它实施例中，将样品在100℃下加热约5至30分钟，优选约10至30分钟，且更优选约15至20分钟。ATP水平作为存活的孢子形成细菌进行测量，并且记录为“ATP加热”。
[0055] 通过离心、玻璃珠、魔力珠和过滤技术中的一种或多种来富集样品中的孢子。在一些实施例中，通过使孢子样品经受约60°至65℃的温度约1至30分钟，优选1至20分钟，且最优选5至15分钟来提取孢子。
[0057] 然后将提取的样品用丙酮酸激酶(PK)、肌激酶(MK)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)进行处理，以将ADP和AMP转换为ATP。这种转换在10分钟至24小时内发生。优选地，转换在15分钟至2小时内发生。最优选地，转换在15分钟内发生。下述化学方程式概括了转换过程：
[0058]
[0059]
[0060]
[0061] 在转换完成后，进行样品的另一次ATP测量。孢子形成细菌的ATP水平记录为“ATP转换”。”
[0062] 对“ATP原始”和“ATP加热”的测量之间的显著差异指示营养细胞被破坏。与“ATP加热”相比，“ATP转换”的水平通常增加。ATP水平增加的幅度指示孢子形成细菌的存在。如果只有营养细胞，则通过与“ATP加热”测量的比较，“ATP转换”测量并不显著增加。
[0063] 一旦已确定孢子存在于样品中，就选择抗微生物处理。如果检测到孢子，则处理可以选自下述：氧化性杀生物剂二氧化氯，臭氧，戊二醛，次氯酸钠，一氯胺，过酸及其混合物；非氧化性杀生物剂包括但不限于醇，异噻唑啉，二溴次氮基丙酰胺(DBNPA)，季铵化合物，溴硝丙二醇(BNPD)，双三氯甲基砜，亚甲基双硫氰酸酯，1-(3-氯丙烯基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷，四(羟甲基)硫酸鏻(THPS)，(噻唑基)苯并咪唑及其组合。为了达到杀菌功效，杀生物剂的浓度应该高于用作杀生物的处理剂量；通常在液体中为0.1ppm至5000ppm，或者对于表面、固体或浆料处理，0.001％至0.5％。
[0064] 也可以使用非化学处理，如极热和UV辐射。当它们处于其营养状态时，靶向孢子形成细菌扩展了有效杀生物剂的列表，以包括DBNPA、异噻唑啉、季胺等等。一旦已选择了适当的处理，当未检测到孢子时，就将它施加于其中孢子形成细菌以营养状态存在的工艺的部分。这可以包括在其中已检测到污染的生产点的硬表面，食物或饮料产品，液体，包装或纸产品。
[0065] 由于该方法花费不长于8个小时来完成，因此可以快速消除细菌污染，以预防下游孢子形成。另外，可以在设备脱机用于清洁时完成处理，或无需隔离产品用于多次轮班，并且可以更迅速地纠正生产问题。在处理施加后，应该进行随后的测试循环，以确保孢子的消除已发生。在生产中的正确场所与正确的化学品一起发挥作用的能力导致成本和时间节省。
[0066] 为了更完全地理解本公开内容，给出下述实例以示出一些实施例。这些实施例和实验应理解为说明性的而不是限制性的。除非有相反说明，否则所有份都按重量计。
[0067] 实例
[0068] 实例1：将AMP和ADP转换为ATP以检测细菌孢子
[0069] 枯草芽孢杆菌用作测试孢子形成细菌菌株。枯草芽孢杆菌培养物在具有TSB琼脂的板上在36±2℃下培养24小时。刮取板，并且将培养物悬浮于无菌水中，转移到扁瓶(bottle flat)，并且在32±2℃下温育24小时。然后将样品以5000rpm离心5分钟。去除团块上方的过量流体，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤团块，并且再次离心。将团块重悬浮于磷酸盐缓冲液中至50ml体积，并且记录为“原始”。通过将收获的样品在80℃下的水浴中浸泡15分钟来制备孢子悬浮液，并且记录为“孢子悬浮液”。在用提取试剂处理之前，将样品在60℃下处理10分钟。将制备的孢子样品分为两部分。第一部分未稀释，而第二部分稀释10倍。测量了总需氧菌数(TABC)和ATP，并且在表1中列出。
[0070] 表1：在转换前制备的内生孢子的ATP和TABC水平
[0071]
[0072] 第2样品稀释为第1样品的10倍。
[0073] 然后通过不同的方法提取孢子样品，所述方法包括正丙醇、离心和超声。测量了ATP，并且列于表2中。在提取程序后，ATP水平并未增加。
[0074] 表2：用不同提取方法处理的样品的ATP水平
[0075]
[0076] 在提取后，用丙酮酸激酶(PK)、肌激酶(MK)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)处理样品，以将ADP和AMP转换为ATP。通过发光方法测量ATP。测量了ATP的水平，并且列于表3中。在用离心和正丙醇提取的样品中，ATP水平在转换后显著增加。
[0077] 表3：转换后的ATP水平
[0078]
[0079] 当制备孢子悬浮液时，样品中的ATP读数以1298RLU测量，而孢子计数为1.6×105cfu/ml。因此，ATP的读数与孢子形成细菌的存在并不相关联。结果指示，在用正丙醇提取并将AN转换为ATP后，ATP读数显著增加。28194和9918RLU的ATP读数分别对应于孢子板计数2.5×105cfu/ml和2×104cfu/ml。
[0080] 实例2：用ATP转换方法的孢子检测
[0081] 如实例1中所述制备枯草芽孢杆菌孢子悬浮液，除了以下之外：在32±2℃下温育24小时后，将培养物放入冰箱内9天，然后在80℃下加热20分钟，以制备生成更长时间的孢子悬浮液。如实例1中所述，在提取程序前，孢子悬浮液未在60℃下进行处理。
[0082] 表4：制备的内生孢子的ATP和TABC
[0083]
[0084] 然后提取孢子悬浮液并且通过酶转换。TABC和ATP水平的结果列于表5中。与无提取处理过程相比，通过TCA和正丙醇提取显著增加了ATP水平。
[0085] 表5：在转换后，样品中的ATP测试结果
[0086]
[0087] 如实例2中所述制备不同负载量的孢子悬浮液，在提取和转换后，与无处理的孢子悬浮液中的655RLU相比，ATP水平增加至17894RLU。
[0088] 表6：在转换后，样品中的ATP测试结果
[0089]
[0090] 总之，本方法可以通过经由富集、提取和转换过程，使休眠孢子中可读的低水平的ATP达到可以通过与板计数相关联的显著水平，来快速鉴定孢子形成细菌。
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