技术领域
[0001] 本
发明涉及抗小儿腹泻的牛初乳制品，特别是抗轮状病毒的牛初乳制品。
背景技术
[0002] A组轮状病毒（ARV）主要侵袭婴幼儿，是致婴幼儿病毒性肠炎的主要病原体，据世界卫生组织（WHO）报道全世界每年约有100多万儿童死于轮状病毒腹泻，是发展中国家婴幼儿腹泻死亡的首位原因，1999年底至2000年初，在我国北京、深圳等地方曾大面积爆发婴幼儿轮状病毒性腹泻。
[0003] 免疫乳是指给
哺乳动物（主要是牛、山羊等）选择性地接种一些能够引起人或动物
疾病的细菌、病毒或其他一些外来
抗原（Antigen），刺激
机体发生免疫应答以分泌特异性的
抗体（Antibody）进入乳中，这种含有特异性抗体的乳即为免疫乳。免疫乳的外观与普通初乳的外观无异，但在功能上则发生了重大变化，对目标抗原（致病
微生物或毒素）的中和效价显著提高。免疫乳中的抗体（即免疫球蛋白）能够参与机体的黏膜免疫反应，特异性地中和或消除相应的抗原（细菌或病毒），防止病原性肠道感染及相关疾病的发生。
[0004] 目前对A组轮状病毒（ARV）
治疗上均不够理想，目前大多采用支持疗法，主动免疫效果不理想。近年来，有些学者曾以抗-ARV 鸡卵黄免疫球蛋白（简称anti-ARV IgY）灌喂小鼠，小鼠获得了被动免疫保护，但尚未用于人类。
发明内容
[0005] 本发明目的在于利用A组轮状病毒（ARV）处理制成抗原，分别免疫健康妊娠乳牛，然后用生物技术处理牛乳，可以获得抗小儿腹泻的牛初乳制品。
[0006] 抗小儿腹泻的牛初乳制品，该技术方案是通过下列步骤实现的：A组轮状病毒（ARV）抗原的制备，A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫，免疫乳的收集，免疫乳制成乳制品。
[0007] 其中A组轮状病毒（ARV）抗原的制备有以下步骤：
[0008] （1） MA104细胞的培养
[0009] MA104细胞是一种常用的生物制品，具体见《 中华实验和临床病毒学杂志 》1998年 12卷 3期记载的“MA104细胞牛轮状病毒受体的提纯及鉴定”。天津医科大学可以提供MA104细胞。
[0010] 从液氮罐中取出一瓶保存的MA104细胞,37℃速融,在无菌室接种到培养瓶中，放于37℃的CO2
培养箱培养；
[0011] 培养液的配制：MEM粉（GIBCO）9.0-10.0g溶入850mL五蒸
水中；将2% L-谷
氨酰胺，0.15mol丙
酮酸钠，双抗（10000单位的青霉和12500单位的
链霉素）母液分别按1%加入850mL MEM溶液中；定容至1000mL，抽滤除菌，分装，-20℃冻存。
[0012] 上海源叶生物科技有限公司是专业从事生物化学及分子生物学
试剂的开发商，可以提供MEM粉（GIBCO）。
[0013] （2）轮状病毒的培养
[0014] 取1mL 购自中国科学院北京病毒研究所的人-Wa株轮状病毒毒种加入胰蛋白酶至终浓度为10μg/mL，在37℃条件下作用30min；将已经贴壁生长的MA-104细胞培养瓶用D-Hanks液洗一遍,以除去未贴壁细胞；加入150??L作用后的病毒于培养瓶中,均匀分布于瓶底,37℃,平放,作用1小时；加入维持液（98mL MEM细胞培养液+2mL标准
小牛血清）10mL至细胞病变。
[0015] D-Hanks液是常用洗液，其配方是公知的，也是由商家可以提供的，例如可以由研域(上海)化学试剂有限公司提供。
[0016] （3）轮状病毒全菌抗原制备
[0017] 抗原与弗氏佐剂等体积混合，乳化，制成油包水
疫苗。
[0018] A组轮状病毒抗原的免疫具体操作为：在颈部肌肉注射或乳房周围的皮下注射；第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂代替完全佐剂进行免疫，抗原15mL与弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂10mL混合，乳化，制成油包水疫苗，共25mL/头/次；
[0019] 第一次免疫 分娩前12周 25mL/头/次
[0020] 第二次免疫 分娩前10周 25mL/头/次
[0021] 第三次免疫 分娩前8周 25mL/头/次
[0022] 第四次免疫 分娩前7周 25mL/头/次
[0023] 第五次免疫 分娩前6周 25mL/头/次
[0024] 第六次免疫 分娩前5周 25mL/头/次
[0025] 其中免疫乳的收集时间为在母牛分娩后的72小时以内，每隔8 小时收集一次初乳，以后每天收集一次，共收集7天,-20℃储存。
[0026] 其中免疫乳制成牛初乳制品有如下步骤：
[0027] （1）过滤和冷却
[0028] 将牛初乳直经过滤袋
净化原料初乳，经冷排处理进入
储奶罐备用，储奶罐
温度应保持在4-5℃，在储奶罐中初乳存放时间不可超过48小时。
[0029] （2）标准化
[0030] 为了保证产品
质量的相对稳定，有必要调整不同批次间的免疫球蛋白含量以及效价，以使在加工前原料初乳中免疫球蛋白的含量大于10mg/mL，使得抗轮状病毒牛初乳效价大于1：10000。
[0031] （3）预热升温
[0032] 采用热
水循环式板式
热交换器将储奶罐中的原料初乳的温度升至45℃。
[0034] 采用碟片式离心机离心脱脂，要求脱脂乳的含脂率控制在0.1％以下。
[0035] （5）预热升温，低温巴氏灭菌
[0036] 采用板式热交换器将脱脂初乳升温至65℃后，输入保温缸，在62℃保持40min，进行低温巴式灭菌。
[0038] 采用外压式中空
纤维超率浓缩设备进行循环式超率浓缩,浓缩时物料温度保持在50-55℃之间，待物料浓度达到20-23%左右，停止浓缩；
[0040] 采用尼鲁公司的低温喷雾干燥设备，最大限度地保持初乳中免疫球蛋白的活性；低温喷雾干燥过程的参数如下：进
风温度160℃；
流化床温度60℃；出料温度62℃；流化床温度60℃；旋风分离器出口温70℃；塔内
负压0.5mmH2O；旋风分离器压差50mmH2O；流化床压差45mmH2O。
[0041] （8）获得牛初乳制品
[0042] 最后将经过低温喷雾干燥的牛初乳根据生产需要制成各种牛初乳制品。
[0043] 本发明涉及的弗氏完全佐剂为12g羊毛脂与20mL液体石
蜡油混合，每克佐剂含1mg经过100℃，30min灭活的卡介苗，弗氏不完全佐剂不含卡介苗，其余与弗氏完全佐剂相同。
[0044] 本发明提供的抗小儿腹泻的牛初乳制品是由经过轮状病毒免疫的母牛所产的牛初乳制得的，具有很强的特异性，对防治小儿腹泻有很好的效果，且还有
副作用小，不易产生耐药株等优点，制备方法也较简便，易于产业化。
[0046] 实施例1：抗小儿腹泻的牛初乳是通过下列步骤实现的：A组轮状病毒（ARV）抗原的制备，A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫，免疫乳的收集。
[0047] 其中A组轮状病毒（ARV）抗原的制备有以下步骤：
[0048] （1） MA104细胞的培养
[0049] 从液氮罐中取出一瓶保存的MA104细胞,37℃速融,在无菌室接种到培养瓶中，放于37℃的CO2培养箱培养；
[0050] 培养液的配制：MEM粉（GIBCO）9.5g溶入850mL五蒸水中；将2% L-谷氨酰胺，0.15mol
丙酮酸钠，双抗（10000单位的青霉和12500单位的链霉素）母液分别按1%加入
850mL MEM溶液中；定容至1000mL，抽滤除菌，分装，-20℃冻存。
[0051] （2）轮状病毒的培养
[0052] 取1mL人-Wa株轮状病毒毒种加入胰蛋白酶至终浓度为10μg/mL，在37℃条件下作用30min；将已经贴壁生长的MA-104细胞培养瓶用D-Hanks液洗一遍,以除去未贴壁细胞；加入150??L作用后的病毒于培养瓶中,均匀分布于瓶底,37℃,平放,作用1小时；加入维持液（98mL MEM细胞培养液+2mL标准小牛血清）10mL至细胞病变。
[0053] （3）轮状病毒全菌抗原制备
[0054] 抗原与弗氏佐剂等体积混合，乳化，制成油包水疫苗。
[0055] A组轮状病毒抗原的免疫具体操作为：在颈部肌肉注射或乳房周围的皮下注射；第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂代替完全佐剂进行免疫，抗原15mL与弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂10mL混合，乳化，制成油包水疫苗，共25mL/头/次；
[0056] 第一次免疫 分娩前12周 25mL/头/次
[0057] 第二次免疫 分娩前10周 25mL/头/次
[0058] 第三次免疫 分娩前8周 25mL/头/次
[0059] 第四次免疫 分娩前7周 25mL/头/次
[0060] 第五次免疫 分娩前6周 25mL/头/次
[0061] 第六次免疫 分娩前5周 25mL/头/次
[0062] 其中免疫乳的收集时间为在母牛分娩后的72小时以内，每隔8 小时收集一次初乳，以后每天收集一次，共收集7天,-20℃储存。
[0063] 实施例2：抗小儿腹泻的牛初乳是通过下列步骤实现的：A组轮状病毒（ARV）抗原的制备，A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫，免疫乳的收集。
[0064] 其中A组轮状病毒（ARV）抗原的制备有以下步骤：
[0065] （1） MA104细胞的培养
[0066] 从液氮罐中取出一瓶保存的MA104细胞,37℃速融,在无菌室接种到培养瓶中，放于37℃的CO2培养箱培养；
[0067] 培养液的配制：MEM粉（GIBCO）9.0g溶入850mL五蒸水中；将2% L-谷氨酰胺，0.15mol丙酮酸钠，双抗（10000单位的青霉和12500单位的链霉素）母液分别按1%加入
850mL MEM溶液中；定容至1000mL，抽滤除菌，分装，-20℃冻存。
[0068] 其中A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫具体操作为：在颈部肌肉注射；第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂代替完全佐剂进行免疫，抗原10mL与弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂10mL混合，乳化，制成油包水疫苗，共20mL/头/次。
[0069] 其余同实施例1。
[0070] 实施例3：抗小儿腹泻的牛初乳是通过下列步骤实现的：A组轮状病毒（ARV）抗原的制备，A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫，免疫乳的收集。
[0071] 其中A组轮状病毒（ARV）抗原的制备有以下步骤：
[0072] （2） MA104细胞的培养
[0073] 从液氮罐中取出一瓶保存的MA104细胞,37℃速融,在无菌室接种到培养瓶中，放于37℃的CO2培养箱培养；
[0074] 培养液的配制：MEM粉（GIBCO）10.0g溶入850mL五蒸水中；将2% L-谷氨酰胺，0.15mol丙酮酸钠，双抗（10000单位的青霉和12500单位的链霉素）母液分别按1%加入
850mL MEM溶液中；定容至1000mL，抽滤除菌，分装，-20℃冻存。
[0075] 其中A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫具体操作为：在乳房周围的皮下注射；第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂代替完全佐剂进行免疫，抗原10mL与弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂10mL混合，乳化，制成油包水疫苗，共20mL/头/次。
[0076] 其余同实施例1。
[0077] 实施例4：将实施例1-3中的任何一项所获得的牛初乳制成牛初乳制品有如下步骤：
[0078] （1）过滤和冷却
[0079] 将牛初乳直经过滤袋净化原料初乳，经冷排处理进入储奶罐备用，储奶罐温度应保持在4-5℃，在储奶罐中初乳存放时间不可超过48小时。
[0080] （2）标准化
[0081] 为了保证产品质量的相对稳定，有必要调整不同批次间的免疫球蛋白含量以及效价，以使在加工前原料初乳中免疫球蛋白的含量大于10mg/mL，使得抗轮状病毒牛初乳效价大于1：10000。
[0082] （3）预热升温
[0083] 采用热水循环式板式热交换器将储奶罐中的原料初乳的温度升至45℃。
[0084] （4）脱脂
