ＡＨＣＹ 발현 또는 활성 저해제를 포함하는 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물 {Pharmaceutical composition for inhibiting proliferation and metastasis of breast cancer containing AHCY expression or activity inhibitor}

본 발명은 S-아데노실호모시스테인 하이드롤레이즈 (S-adenosylhomocysteine hydrolase; AHCY) 발현 또는 활성 저해제를 포함하는 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

S-아데노실호모시스테인 하이드롤레이즈 (S-adenosylhomocysteine hydrolase; AHCY)는 S-아데노실 메타이오닌 (S-Adenosyl methionine; SAM) 사이클에서 결정적인 효소이다. 이 사이클은 S-아데노실 메타이오닌의 제조, 확장 및 재생 반응들을 말한다. AHCY는 S-아데노실호모시스테인 (SAH)을 아데노신과 S-아데노실 메타이오닌 생성에 필요한 호모시스테인으로 전환한다. 따라서, AHCY는 트랜스메틸레이션 (transmethylation)을 강력하게 저해한다 ³ . 유전자 발현을 조정하여 다양한 생리적 상태에서 메틸화의 조절은 매우 중요한 생화학적 메카니즘이다 ^{4 -6} . 예를 들어 AHCY가 감소할 때 메틸기 전이 반응 (transmethylation reactions)의 생화학적 효과는 알코올에 의해 간암이 될 수 있는 간질환에 영향을 미칠 수 있다 ^{7 ,8} . 이와 반대로, AHCY 저해제인 DZNep에 의해 AHCY가 저해되었을 때 유방암 세포주에서는 항암효과가 유도된다 ⁹ . 그렇지만 어떻게 AHCY의 조절이 유방암에서 항암 효과를 발휘하는지 그 메카니즘은 분명하게 밝혀지지 않았다.

유방암은 전세계 여성에게서 가장 빈번하게 진단되는 암 중 하나이며 ¹⁰ , 유전체 기술에서 가장 잘 알려진 인간의 종양 중 하나이다 ¹¹ . 미국 국립 암 연구소에 따르면 유방암은 다섯 진행단계로 나눌 수 있다. 진행 단계는 양성 상피 비정형세포 (benign epithelial atypia)부터 비정형 유관 증식증 (atypical ductal hyperplasia; ADH) 또는 유방상피내암종 (lobular carcinoma in situ; LCIS)까지로 정리할 수 있다. DCIS (ductal carcinoma in situ)는 최종적으로 종양의 늦은 단계에서 침윤능을 갖는 IDC (invasive ductal carcinoma)가 될 수 있다 ^{1 2 ,13} . 침윤성 유방암의 후기 단계는 크기 및 다른 기관, 특히 림프절로의 이동 능력과 같은 다양한 관점에 따라 Ⅰ기부터 Ⅳ기까지로 분류된다. 유방암 관련 사망의 대부분의 큰 원인은 다른 부위로의 전이 때문인 것으로 알려져 있다 ¹⁴ . 전이는 암 진행의 후기 단계로 생각된다.

MAPK (Mitogen-activated protein kinase) 경로는 MAP3K, MEK 및 ERK로 이루어져 있다 ^{15 ,16} . ERK1/2은 다양한 기질을 포함함으로써 전사, 번역, 세포 주기 및 세포 생존을 조절한다 ^{17 -19} . MEK-ERK 활성화에 의해 수용체 타이로신 카이네이즈와 상호작용한 BRaf (MAP3K)는 약 31%의 암 기저성 삼중 음성 유방암 (basal triple negative breast cancer)으로 유도되지만, BRaf 돌연변이의 활성화는 유방암에서 거의 일어나지 않는다 ^{20 ,21} . BRaf-MEK-ERK 경로는 보통 암 기저성 유방암에서 유도된다 ^{21 ,22} . 에스트로겐 활성화는 에스트로겐 수용체 (ER)-양성 유방암에서 MEK/ERK 신호전달을 촉진하는 것으로 보인다 ²³ . ERK1/2은 세포주기 단백질로 알려진 사이클린 D1 카이네이즈 활성을 촉진함으로써 유선 줄기세포 및 전구체 세포 (progenitor cell)의 자가-재생 (self-renewal)을 조절한다 ²⁴ . ERK1/2은 또한 예컨대 침윤 및 전이와 같은 많은 암세포의 기능을 조절한다 ²⁵ . 유방암 조직에서 ERK1/2의 높은 활성화는 유방암 환자의 빈약한 예후와 관련이 있다고 알려져 있다 ²⁶ .

마우스에서 유선 발달은 주로 출산 후에 일어나고 사춘기 시기 3-4주 무렵에 시작되는 조직화된 과정이며, 에스트로겐, 프로게스테론 및 성장 호르몬과 같은 호르몬에 의해 촉진된다 ²⁷ . 이 호르몬들은 유선 연장 (duct extension)에 의하여 기질 지방 패드 (stromal fat pad)에 침투하는 구조인 종말구 (terminal end bud; TEB) 형성을 유도한다 ^{2 8} . 성인이 되면 유선은 점차 임신, 수유 및 퇴축 (involution)의 재구성 단계를 거친다. 상피 세포와 기질 (stroma) 간의 상호작용은 종말구, 유선 연장 및 곁가지 (side branching)를 형성한다 ²⁹ . 종말구는 지방 패드의 끝에 도달한 후 퇴화하며 분지관 나무 (branched ductal tree)는 임신시기까지 휴면상태로 남아있다 ³⁰ . 이러한 일련의 발달과정의 장애는 유선의 증식, 세포자기사멸 및 극성에 문제를 일으킬 수 있고, 최종적으로는 유방암 발생에 영향을 미칠 수 있다 ³⁰ .

본 발명은 좀 더 효과적인 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 S-아데노실호모시스테인 하이드롤레이즈 (adenosylhomocysteine hydrolase; AHCY) 발현 또는 활성 저해제를 포함하는 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 AHCY 발현 저해제가 AHCY 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, shRNA (short hairpin RNA) 및 siRNA (short interfering RNA)로 구성된 군 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 AHCY를 타겟으로 하는 siRNA를 제조하는 것은 용이하다.

또한, 본 발명은 상기 AHCY 활성 저해제가 AHCY 단백질에 결합하는 항 AHCY 항체임을 특징으로 하는 유방암 증식 및 전이 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 AHCY 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 조성물은 상기 AHCY 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임상 투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, AHCY에 대한 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 안티센스 뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다(Hogrefe, 1999). 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본(backbone) 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 본 발명 분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 부분의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

또한, AHCY에 대한 억제제는 상기 유전자의 siRNA(Small Interfering RNA)일 수 있다. siRNA의 염기서열은 AHCY 유전자(mRNA)의 염기서열 중 연속된 19~23개의 연속된 염기서열일 수 있다.

siRNA는 세포 배양 및 생체 내에서 오래 지속되는 효과, 생체 내에서 세포를 트랜스펙션시키는 능력 및 혈청 내 분해에 대한 저항력의 측면에서 생체 내에서 특정한 유전자의 발현의 저해에 대해 매우 강한 약물이 되는 잠재력을 지닌다(Bertrand et al., 2002). siRNA의 전달 및 siRNA를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 미국 출원 제2004/106567 및 2004/0086884는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터를 제공하고 있다.

siRNA는 상대적으로 낮은 농도로도 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 얻을 수 있는 효과와 동등하거나 높은 효과를 얻을 수 있기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 대안으로 제시되고 있다(Thompson, 2002). siRNA의 이용은 질병의 동물 모델에 있어서 유전자 발현을 저해하는 데 대중성을 나타내고 있다. 당업자는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120 참조). 또한 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예컨대, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 그의 결합)을 잘 이해하고 있다.

유방암 증식 및 전이 억제를 위해 사용되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.

상기 AHCY 유전자의 저해제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다. 따라서 종래 당해 기술 분야에서 상기 유전자의 저해제로 알려진 화합물 또한 이용 가능하다.

본 발명은 또한 AHCY 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 유방암 증식 및 억제용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유전자를 억제하면 그에 따른 단백질의 발현이 억제되어 유방암 증식이 억제되는 것이므로, 상기 유전자의 단백질을 저해하면 유방암 증식을 억제할 수 있다. AHCY 단백질 억제제로는 PCT 국제공개공보 WO/2010/027935에 개시되어 있는 화합물 등을 들 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 단백질에 대한 억제제의 유방암 증식 및 전이 억제 용도를 제공한다.

상기 단백질에 대한 억제제는 본 발명의 유전자로부터 발현된 AHCY 단백질에 대한 항체일 수 있다. 상기 단백질에 대한 단일클론 항체는 당업계에 통상적인 단일클론 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 단일클론 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클론 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

본 발명의 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 억제제가 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 구성될 수 있다.

또한 본 발명의 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물은 하나 또는 그 이상의 유방암 증식 또는 전이 억제용 조성물과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물은 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 가용화제 등이 있다.

또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 유방암 증식 및 전이 억제용 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 흉골 내, 경피, 비측 내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 유방암 증식 및 전이를 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 화합물일 경우 0.1ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 단백질에 대한 단일클론 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 AHCY 유전자는 알려진 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열일 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 좀더 명확해진다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 방사선 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법 등과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명에 따르면 AHCY를 침묵화하면 유방암 세포의 증식과 전이가 억제되었다. 따라서, AHCY의 발현 또는 활성에 대한 저해제를 이용하면 유방암의 증식 및 전이를 억제하는 용도로 이용할 수 있다.

도 1은 다양한 인간 유방암 세포주에서 AHCY 발현 수준을 나타낸다. 도 1a는 인간 유방암 세포주에서 정량적 RT-PCR로 확인한 AHCY mRNA 발현정도이다. 도 1b는 웨스턴 블랏으로 분석한 인간 유방암 세포주의 AHCY 단백질 발현정도이다.
도 2는 인간 유방암 세포의 증식에 대한 AHCY 침묵화의 효과를 나타낸다. 도 2a는 MCF7-ADR/shCon 및 MCF7-ADR/shAhcy 세포의 세포 증식율을 4일 동안 세포증식제인 10% WST-1으로 염색하여 탐지한 결과이다. 도 2b는 증식 분석에 사용한 세포들에서 AHCY 발현 수준을 정량적 RT-PCR과 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 3은 MCF7-ADR 세포에서 AHCY가 세포주기 단백질의 발현을 조절함을 나타낸다. 세포주기 단백질들의 발현 수준은 MCF7-ADR/shCon 및 MCF7-ADR/shAhcy 세포에서 웨스턴 블랏으로 탐지하였다.
도 4는 AHCY 발현이 인간 유방암 세포의 침윤능력과 전이능력을 억제함을 나타낸다. 도 4a는 MCF7-ADR 세포의 트랜스웰 침윤능력 분석이 AHCY 풀 또는 대조군 렌티바이러스에 의해 진행된 결과이다. 상대적 세포 침윤의 정량은 10% 아세트산에 의해 탐지되었다. 도 4b는 상처 치료 분석법에 의해 MCF7-ADR 세포에서 세포 이동에 대한 AHCY의 효과를 분석한 결과이다. 상처는 플레이트에 세포가 꽉 찼을 때 팁으로 긁어 만들었고 현미경으로 24시간 후 및 48시간 후에 관찰하였다.
도 5는 AHCY +/- 마우스에서 유선관 종말구 (mammary ductal terminal end buds)의 수가 감소함을 나타낸다. 도 5a는 야생형 및 AHCY +/- 유선을 6주령 및 8주령일 때 온조직 표본 (Whole-mount) 칼마인 (carmine) 염색한 결과를 4배로 확대 촬영한 것이다. 도 5b는 6주와 8주 때에 종말구 (Terminal end bud; TEB)을 정량한 것이다. 값은 각 군 다섯 마리의 마우스에서 종관의 수를 평균한 것이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

세포 배양과 트랜스펙션

MCF7-ADR, MDA-MB-435s, MDA-MB-468, T47D는 10% 우태혈청 (Fetal bovine serum, qualified, Canada origin, Gibco)과 고농도 포도당을 포함한 DMEM 배지 (Welgene, Republic of Korea)에서 5% CO ₂ , 습한 조건으로 37 ℃에서 배양하였다. MCF7-ADR 세포는 10% FBS-DMEM과 함께 6-웰 배양 플레이트에 2ⅹ10 ⁵ cells/well 농도로 시드하여 하루 동안 배양하였다. 세포가 약 50%로 성장하였을 때 대조군 (MOI 1:5, Santa Cruz, sc-108080)과 AHCY shRNA 렌티바이러스 입자 (lentiviral particles) (MOI 1:5, Santa Cruz, sc-62972-V)는 10 ㎍/㎖의 폴리브렌 (polybrene; Santa Cruz, sc-134220)을 포함하는 10% FBS-DMEM으로 세포에 감염시켰다. 12시간 후 세포는 폴리브렌 없는 배지에서 24시간 동안 배양하였고, 그 후 10 ㎍/㎖의 푸로마이신 (puromycin; Santa Cruz, sc-108071)에 의해 shRNA를 발현하는 안정된 클론을 선택하여 2 ㎍/㎖의 푸로마이신을 포함하는 10% FBS-DMEM에서 배양하였다. MDA-MB-468 세포는 60 ㎜ 배양접시에 5ⅹ10 ⁵ 농도로 준비하고, FuGENE 트랜스펙션제 (Promega)를 이용하여 5 ㎍의 pCMV-AHCY로 안정적으로 트랜스펙션시켰다.

실시간 정량적 PCR

NucleoSpin® RNA/Protein kit (Macherey-Nagel)를 이용하여 제조자의 지시대로 유방암 세포주로부터 RNA를 분리하였다. cDNA (5 ㎍)는 M-MLV 역전사효소 (Promega, M170A), RNasin® 리보뉴클레이즈 저해제 (Promega, N211A), 100 nM oligo-dT, 2.5 mM dNTP 혼합물을 이용하여 RNA를 역전사하여 제조하였다. 0.1 ㎍의 cDNA는 Rotor-Gene (Corbett research, RG-3000A) 내에서 HiFast SYBR Lo-Rox (Genepole, Q100240)와 프라이머를 이용하여 실시간 정량적 PCR을 수행하는데 이용하였다. 프라이머는 다음과 같다: AHCY (정방향: 5'-AGC CCC AGG TGG ACC GCT A-3', 역방향: 5'-TCA CGA AGC TGG GGT GTC CC-3', POSTN (정방향: 5'-TGC CCT GGT TAT ATG AGA ATG G-3', 역방향: 5'-AGA ATA GCG CTG CGT TGT GGT-3', 인간 18s rRNA (정방향: 5'-GTC GGC GTC CCC CAA CTT CTT-3', 역방향: 5'-CGT GCA GCC CCG GAC ATC TA-3'. 프라이머는 Bioneer (South Korea)에서 제조하였고, 인간 18s rRNA 는 표준화에 이용하였다.

웨스턴 블랏

NucleoSpin® RNA/Protein kit (Macherey-Nagel)를 이용하여 제조자의 지시대로 유방암 세포주로부터 단백질을 분리하였다. BCA (Bicinchoninic acid) 용액 (Sigma, B9643)과 황산구리 용액 (Copper(Ⅱ) sulfate solution; Sigma, C2284)을 이용하여 동량의 단백질을 분석하였다. 단백질은 SDS-PAGE (10% 분해용 젤, 5% 축적용 젤; H ₂ O, 30% 아크릴아마이드 (Bio-Rad, #161-0156), 1.5 M pH 8.8 Tris, 10% SDS, 10% 암모늄 퍼설페이트, TEMED (Sigma, T9281)) 상에서 분리하여 클리어 블랏 멤브레인 (Atto, AE-6667-P)으로 옮겼다. 단백질은 항-AHCY 항체 (Abcam, ab134966), 항-phospho-Akt 항체 (Cell signaling, #4060), 항-Akt 항체 (Cell signaling, #4691), 항-phospho-Erk1/2 항체 (Cell signaling, #4377), 항-Erk1/2 항체 (Cell signaling, #9102), 항-cyclinD1 항체 (Cell signaling, #2978), 항-CDK6 항체 (Cell signaling, #3136), 항-p21 waf1/cip1 항체 (Cell signaling, #2946), 항-p53 항체 (Cell signaling, #2527) 및 항-세포골격 액틴 (anti-cytoskeletal actin) 항체 (Bethyl, A300-291A)를 이용하여 탐침하였다. 사용된 이차 항체는 염소 항-토끼 IgG, pAb (HRP conjugate, Enzo, ADI-SAB-300-J), 염소 항-마우스 IgG, pAb (HRP conjugate, Enzo, ADI-SAB-100), 항-바이오틴 HRP가 연결된 항체 (Cell signaling, #7075)였다. 화학발광은 LAS3000 (Fujifilm)을 이용하여 탐지하였다.

세포증식 분석

세포는 12-웰 배양 플레이트에서 10% FBS-DMEM과 함께 1x10 ⁴ cells/well 농도로 시드하였다. 시드한 다음 다섯 시간 후, 100 ㎕/well로 세포증식제인 WST-1 (Roche, 644807001)을 가하고, 어두운 조건에서 한 시간 동안 배양하였다. 각 웰의 100 ㎕의 스프를 96-웰 배양 플레이트로 옮기고 ELISA (Bio-tek instruments, PowerwaveX340)를 이용하여 450 ㎚에서 탐지하였다. 배지는 1% FBS-DMEM으로 바꾸어 주었고 100 ㎍/well WST-1으로 한 시간 동안 처리하고 96-웰 플레이트로 옮겨 1일부터 4일까지 매일 같은 시간에 흡광도를 측정하였다. 세 번의 독립적인 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.

상처 치료 분석법

60 ㎜ 접시에서 10% FBS-DMEM과 함께 세포를 1ⅹ10 ⁵ cells/㎖가 되도록 놓고 습한 조건에서 37 ℃로 24시간 동안 배양하였다. 이후 24시간 동안 배지는 1% FBS-DMEM으로 교체하였다. 플레이트 접시가 세포로 가득 차면 접시 중앙선상의 세포는 10 ㎕ 피펫 팁으로 긁어 제거하였다. 배양 0시간, 24시간 및 48 시간 후 플레이트 접시는 현미경을 이용하여 40배율로 촬영하였다.

트랜스웰 침윤 분석법

세포 침윤은 Biocoat Matrigel Invasion Chamber (BD Biosciences, 354480)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 실험하였다. 24-웰 침윤 챔버는 500 ㎕의 따뜻한 무혈청 DMEM을 두 시간 동안 상측, 하측 챔버에 가하여 재수화시켰다. 상측 챔버의 DMEM은 1% FBS-DMEM 내의 5ⅹ10 ⁴ cells/ml 500 ㎕로 교체되었고, 하측 챔버의 DMEM 또한 화학유인물질로서 5 ㎍/㎖ 피브로넥틴 (Sigma, F2006)을 함유한 10% FBS-DMEM 750 ㎕로 교체되었다. 플레이트는 5% CO ₂ 조건에서 37 ℃로 24시간 동안 배양하였다. 비침윤성 세포들은 면봉으로 상측 챔버에서 제거하였다. 마트리젤 막을 통하여 침윤한 세포들은 100% 메탄올로 고정시키고 크리스탈 바이올렛 (Sigma, C0775)으로 염색하였다. 상측 챔버는 물로 세척한 후 비침윤성 세포와 남아 있는 염색용액들은 면봉으로 제거하였다. 침윤한 세포들은 현미경으로 40배 배율로 촬영하였다. ELISA (Bio-tek instruments, PowerwaveX340)를 이용하여 침윤 세포를 정량하기 위하여 상측 챔버에 10% 아세트산을 가하였다.

유선 온조직 표본 분석 ( Whole - mount analysis of mammary glands )

6주령 및 8주령 마우스 서혜부 유선을 제거하여 슬라이드 글라스에 올려놓았다. 시료를 Carnoy의 고정용액 (60% 에탄올, 30% 클로로포름 및 10% 차가운 아세트산)으로 상온에서 24시간 고정시키고 70% 에탄올과 증류수로 각각 세 번씩 세척하였다. 이 시료들을 칼마인 알럼 (Carmine Alum) (Stemcell, 07070)으로 24시간 동안 4 ℃로 염색하고 농도가 다른 에탄올로 각각 세 번씩 세척하였다 (70%부터 95% 및 100%까지). 이 시료들은 자일렌으로 깨끗하게 한 다음 Permount ^® 용액 (Fisher scientific, SP15-100)과 함께 슬라이드 글라스와 커버 글라스 사이에 올려놓았다.

통계 분석

모든 인 비트로 실험은 최소 세 번 이상 반복하였고, 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계학적 유의성은 P < 0.05 수준에서 Student's t tests를 이용하여 분석하였다. 인 비보 (마우스 모델을 이용한) 연구는 각 군마다 다섯 마리의 마우스를 두어 수행하였다.

결과 1: 유방암 세포에서 AHCY 의 발현

인간 유방암 세포주에서 AHCY의 발현을 스크리닝하기 위하여 본 발명자들은 실시간 qPCR과 웨스턴 블랏으로 AHCY의 발현을 연구하였다. AHCY는 MCF7-ADR 및 MDA-MB-435s 세포에서 많이 발현되는 반면, MDA-MB-468 및 T47D 세포에서는 발현 수준이 낮았다 (도 1). AHCY가 발현되는 MCF7-ADR을 AHCY sh RNA (small hairpin RNA) 렌티바이러스 입자로 감염시켜 AHCY (MCF7-ADR/shAhcy) 발현을 침묵시켰다. AHCY 발현 수준은 RNA와 단백질에서 모두 MCF7-ADR/shAhcy 세포에서 하향 조절되었다 (도 1). AHCY 음성 세포인 T47D 세포는 AHCY 과발현을 위하여 pCMV-AHCY 벡터에 트랜스펙션시켰다. AHCY 과발현 세포는 G418 (T47D/Ahcy)을 이용하여 선택하였다. AHCY 발현은 T47D/Con보다는 T47D/Ahcy 세포에서 더 높았다 (도 1).

결과 2: 세포 증식에 대한 AHCY 의 효과

세포 생존율에 미치는 AHCY의 영향을 알아보기 위하여 세포증식제인 WST-1을 AHCY를 침묵시킨 세포주에 처리하여 세포 생존율을 시험하였다. 그 결과, MCF7-ADR/shCon 세포와 비교하여 이틀째부터 MCF7-ADR/shAhcy 세포에서 세포 생존율이 저하되었다 (도 2a). AHCY 침묵화가 세포 증식을 얼마나 저해하는지를 정확히 평가하기 위하여 AHCY shRNA 렌티-바이러스로 감염된 MCF7-ADR 세포를 이용하여 BrdU 분석을 진행하였다. 그 결과는 5% FBS-DMEM에서 유방암 세포의 증식은 AHCY를 가했을 때 약 50% 감소하였고 (도 2b), 이는 도 2a와 일치하였다.

또한 본 발명자들은 실시간 qPCR 및 웨스턴 블랏으로 세포 생존율 및 증식율 분석에 사용된 안정한 세포주들이 잘 기능하는지를 확인하였다. AHCY mRNA 발현은 MCF7-ADR/shCon 세포와 비교하여 MCF7-ADR/shAhcy 세포에서 약 60% 저해되었다 (도 2b). 이 결과에 따르면, AHCY 침묵화는 유방암 세포에서 세포 생존율과 증식율 저하를 유도한다.

결과 3: AHCY 는 ERK 신호전달 경로에 의하여 세포주기를 조절한다.

AHCY 침묵화의 세포증식 저해 효과의 메카니즘을 확인하기 위하여 본 발명자들은 AHCY 억제된 안정한 세포주에서 사이클린D1 (CyclinD1), 사이클린E (CyclinE), CDK6, CDK2, p21 및 p53과 같은 세포주기 조절단백질들의 발현을 시험하였다. 세포주기의 G ₀ /G ₁ 단계에 관련된 사이클린D1과 CDK6는 MCF7-ADR/shAhcy 세포에서 감소하였다. 반면, G ₁ /S 단계를 조절하는 사이클린E와 CDK2는 MCF7-ADR/shAhcy 세포에서 변하지 않았다 (도 3a). 이 결과는 AHCY 침묵화가 G ₁ /S 단계가 아닌 G ₀ /G ₁ 단계를 저해함으로써 세포주기 저해를 유도함을 말해준다. 본 발명자들은 또한 사이클린D1 및 CDK6의 저해제인 p21의 발현 수준을 확인하였다. MCF7-ADR 세포에서 AHCY가 억제되었을 때 p21은 증가하였으나 p53은 변화가 없었다 (도 3a). 이 데이타들은 AHCY 침묵화가 유도한 p21 증대가 p53과는 독립적임을 암시한다.

결과 4: 유방암 세포 침윤과 전이에 미치는 AHCY 침묵 또는 과발현의 효과

종래의 연구에서 AHCY의 간접적 저해제인 아데노신 다이알데하이드 *adenosine dialdehyde; AdOx)가 유방암 세포에서 침윤과 전이를 억제한다고 보고된바 있다 ³¹ . AHCY가 유방암 세포에서 침윤과 전이를 조절하는 능력이 있음을 확인하기 위하여 본 발명자들은 AHCY 안정된 세포주를 이용하여 트랜스웰 분석법 및 상처 치유 분석법으로 침윤능과 전이능을 시험하였다. 도 4a와 같이, MCF7-ADR/shAHCY 세포의 침윤능은 억제되었다. 유사하게, MCF7-ADR 세포에서는 AHCY 발현 정도가 낮을 때 상처가 생긴지 24시간 후부터 세포의 전이능 또한 감소하였다 (도 4b).

결과 5: 6주령 및 8주령 AHCY +/- 마우스에서 유선의 성장이 저해된다.

상기 인 비트로 (세포실험) 데이타가 인 비보 (동물실험) 데이타와 일치하는지를 확인하기 위하여 본 발명자들은 온조직 표본 (Whole-mount) 유선 염색으로 AHCY 야생형 (+/+)과 비교하여 AHCY 헤테로 (+/-) 마우스의 유선을 관찰하고 표현형을 분석하였다. 유선의 성장과 가지 형성을 위해서는 유선의 종말구 (Terminal end buds; TEBs)가 필요하다 ^{32 ,33} . AHCY +/- 마우스에서 종말구의 수는 6주 및 8주령 야생형 마우스의 종말구보다 훨씬 많았다 (도 5). 이 결과는 AHCY가 불충분한 마우스의 유선 증식이 느리게 진행됨을 말해주며, 이것은 인 비트로 데이타와 일치하였다.