一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用
阅读：8发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，包括如下步骤：S1：甲基化识别 抗体 筛选；S2：第n级亲和素配置；S3：中间介质；S4： 信号 检测介质；S5： 荧光 编码 磁珠 选用；S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述捕获基因与待检基因互补 配对 ；S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；S8：分离所述第一偶联物，形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；S9：洗涤第二偶联物用于检测信号值，确定样本中是否存在目标核酸或其数量，本发明可同时检测多种基因的甲基化状态，特异性高，操作简单，结果时间短，结果简单。，下面是一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用专利的具体信息内容。
1.一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，
S1：甲基化识别抗体筛选；
S2：第n级亲和素，其中n为5-10的正整数；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链或标记有生物素的小分子量蛋白质；所述的中间介质一端与第n级亲和素结合，而另一端与第n+1级亲和素结合，其中n为5-10的正整数；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，而且信号检测介质中的亲和素与第n级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量。
2.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，所述的荧光编码磁珠为两种颜色按不同比例混合形成的带有不同荧光编码的磁珠。
3.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：
步骤1：将含有甲基化位点的双链寡核苷酸与固定于固相载体上的根序列接触并结合；
步骤2：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述双链寡核苷酸接触并结合，从而形成稳定的捕获序列-抗体的复合物，随后去除过量的抗体；
步骤3：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤4：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；
步骤5：重复步骤3-4共n-1次，从而获得第n级生物素-亲和素的复合物；
步骤6：将标记有亲和素的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤7：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠。
4.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，所述中间介质为10-
100bp单链核苷酸。
5.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，中间介质为分子量30-
60KD的蛋白质。
6.根据权利要求1甲基化基因免PCR扩增分析方法，其特征在于，荧光蛋白包括PE、AFP或者其组合。
7.一种如权利要求1-6任意一项甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用。
8.根据权利要求7所述甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用，其特征在于，应用于恶性肿瘤早期检测领域。
9.根据权利要求8所述甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用，其特征在于，恶性肿瘤为胰腺癌。
10.根据权利要求9所述甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用，其特征在于，甲基化识别抗体具体对应：let-7a-5p（m6A）、miR-17-5p（m6A）、lncRNA KCNK15-AS1（m6A）、CDID（m5C）、SPARC（m5C）。
一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因检测技术领域，更具体地说，它涉及一种甲基化基因免PCR扩增分析方法及其在基因检测领域的应用。
背景技术
[0002] 甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和沉默，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化、RNA甲基化和组蛋白甲基化，甲基化修饰类型又包括m6A、m5C、m1A等。
[0003] DNA甲基化能沉默某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。RNA甲基化调控作用同样受到广泛的重视，通过多种RNA甲基化修饰状态的定量测定也发现RNA甲基化对各种疾病的病发有影响，不同位点的甲基化水平以及多位点的甲基化水平波动会最终与患病存在一定的关系。
[0004] 目前，在胰腺癌治疗领域，大部分晚期治疗都无法像其他癌症一样取得预期疗效，作为一种侵袭性极高的恶性肿瘤，胰腺癌的早期发现率仅为5％-7％，后期化疗耐药性显著，5年生存率只有5％，依据现有的治疗手段，虽然前期发现并不能让患者完全康复，但是能够极大的延长患者的存活时间，通过保守治疗能够将当前的总体存活时间从6个月延长至2-3年，同时也为后续医疗人员攻克这一医学难题做好时间上的准备。
[0005] 早期进行检测，遗传异常以及基因表观遗传学的改变具有重要的作用。同遗传学异常一样，表观遗传的改变也是一种可反映肿瘤发生早期的分子机制。DNA甲基化作为表观遗传学的一种重要调控方式，在控制基因的表达、维持基因组稳定性、细胞分化和胚胎发育中起着重要的作用；RNA甲基化则主要包括后转录过程对真核基因表达的调控。因此，检测肿瘤细胞中这2种甲基化的异常成为早期诊断肿瘤的重要手段。但是目前诊断领域仍然缺少对特定疾病通过甲基化状态来预判身体状态的方案，目前所有的相关资料均只是提及某些基因位点甲基化会对肿瘤病发有影响，缺乏实际应用的实例。
发明内容
[0006] 针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，其相对于常规的基因甲基化检测本发明可同时检测多种基因的甲基化状态，特异性高，操作简单，可较短时间出结果，结果简单明了，不需要大量专业知识。此外，本发明还可以根据偶联的抗体不同，可检测多种类型的甲基化位点的优点。
[0007] 为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种甲基化基因免PCR扩增分析方法：S1：甲基化识别抗体筛选；
S2：第n级亲和素，其中n为5-10的正整数；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链或标记有生物素的小分子量蛋白质；所述的中间介质一端与第n级亲和素结合，而另一端与第n+1级亲和素结合，其中n为5-10的正整数；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，而且信号检测介质中的亲和素与第n级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与所述的携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量。
S2：第n级亲和素，其中n为5-10的正整数；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链或标记有生物素的小分子量蛋白质；所述的中间介质一端与第n级亲和素结合，而另一端与第n+1级亲和素结合，其中n为5-10的正整数；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，而且信号检测介质中的亲和素与第n级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与所述的携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量。
[0008] 通过上述技术方案，解决了传统检测工艺步骤繁琐，工作量大，耗时长，需提取、富集、转化，PCR检测或测序等步骤的问题，同时本申请相较于高通量测序的操作繁琐，需要构建高通量测序文库，结果分析复杂现状也有明显改善；同时在灵敏度与通量上比ELISA甲基化定量检测试剂盒更高，具有比较好的商业前景，方便医生用于需要甲基化检测的各种场合。
[0009] 较佳的，所述的荧光编码磁珠为两种颜色按不同比例混合形成的带有不同荧光编码的磁珠。
[0010] 较佳的，带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：步骤1：将含有甲基化位点的双链寡核苷酸与固定于固相载体上的根序列接触并结合；
步骤2：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述双链寡核苷酸接触并结合，从而形成稳定的捕获序列-抗体的复合物，随后去除过量的抗体；
步骤3：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤4：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；
步骤5：重复步骤3-4共n-1次，从而获得第n级生物素-亲和素的复合物；
步骤6：将标记有亲和素的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤7：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠。
步骤2：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述双链寡核苷酸接触并结合，从而形成稳定的捕获序列-抗体的复合物，随后去除过量的抗体；
步骤3：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤4：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；
步骤5：重复步骤3-4共n-1次，从而获得第n级生物素-亲和素的复合物；
步骤6：将标记有亲和素的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤7：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠。
[0011] 较佳的，所述中间介质的长度为10-100bp。
[0012] 较佳的，中间介质的分子量为30-60KD。
[0013] 较佳的，荧光蛋白包括PE、AFP或者其组合。
[0014] 本发明的目的二：一种甲基化基因免PCR扩增分析方法在基因检测领域的应用。
[0015] 较佳的，应用于恶性肿瘤早期检测领域。
[0016] 较佳的，恶性肿瘤为胰腺癌。
[0017] 较佳的，甲基化识别抗体具体对应：let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNA KCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)。
[0018] 通过采用上述技术方案，采用该种方法对多个特定基因进行甲基化状态检测能够得出更加科学的使用数据，能够便于医生针对特定的胰腺或者其他特定病症作出更加科学的诊断，减少实验步骤、缩短实验时间，对RNA、DNA甲基化是否影响肿瘤发生这一问题上是不存在争议的，但是目前很多研发机构仍然没有解决这一过程的逆向诊断，通过特定位点的甲基化水平来提前检出病症，这也是本申请中的另一亮点所在；同时本申请发掘、筛选出能够合理表征胰腺癌发病情况的影响因素，同时采用阈值设定的方式来最终确定胰腺癌发病的底线，从而大幅度增加胰腺癌早期检测的准确度。
具体实施方式
[0019] 以下结合和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0020] 带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备制备例1：以生物素化的单链核苷酸为中间介质
甲基化抗体对应组合选用：let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；
亲和素：选用链亲和素；
荧光蛋白：AFP荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
甲基化抗体对应组合选用：let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；
亲和素：选用链亲和素；
荧光蛋白：AFP荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
[0021] 带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：步骤1：甲基转移酶处理核酸，形成含甲基化位点的捕获探针甲基转移酶可对未甲基化或半甲基化的双联DNA中5’-CpG-3’位置的所有胞嘧啶核苷酸进行甲基化，在其碱基一侧的C5位置发生发应。具体操作步骤如下：
1)合成捕获探针：
第一条探针：5’生物素-ATTAGGTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGTTCTGCAGGATGC-
3’；
第二条探针:5’生物素-GCATCCTGCAGAACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCAACCTAAT；
2)将捕获探针用纯水溶解，浓度为1mM；
3)双链DNA形成：分别取2.2μl杂交探针和6.6μl 1.5x杂交缓冲液中，95℃，5s；65℃，
30min；
4)甲基化位点形成：室温配制反应体系
表1捕获探针甲基化反应体系
试剂名称 用量
10XM.SssIBuffer 2μl
50XSAM 0.4μl
双链探针 10μl
M.SssI 1μl
Nuclease-freewater To20μl
5)混匀后放入热循环仪，37℃，15min；65℃，20min；
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上
根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’，根序列与磁珠偶联，偶联步骤如下：
1)将EDC从-20℃冰箱取出后回温到室温；
2)将根序列用纯水溶解，浓度为1mM；
3)用振荡器振荡磁微球混悬液，并放到超声仪中(～70Hz)超声处理1min，使其混合均匀；
4)取5.0x106个磁微球至EP管，8000g离心1min，弃上清；
5)加入50μl0.1M MES，pH4.5，涡旋振荡20s；
6)取2μl根序列加入磁微球悬液中混合均匀；
7)配制新鲜的10mg/ml EDC溶液，取2.5μl加入上述磁微球悬液中混合均匀；
8)室温避光孵育30min；
9)加入1.0ml 0.02％Tween-20，均匀混合后8000g离心1min，弃上清；
10)取1.0ml 0.1％SDS重悬，8000g离心1min，弃上清；
11)加入100μl TE，pH8.0重悬，2～8℃避光保存；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物，具体步骤如下：
1)20μl双链DNA与100μl含根序列的磁微球混合；
2)加入10μl链霉亲和素溶液，混合后室温放置30min；
3)放到磁分离架上2min，弃去上清液；
4)加1ml TE buffer重悬磁微球；
5)放到磁分离架上2min，弃去上清液；
6)加入30μl PBS缓冲液重悬，备用；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体采用如下步骤获得：
1)取1mg抗体于超滤管中，并加入1ml标记缓冲液，12000g离心10min；
2)加入13.3μl生物素溶液和1ml标记缓冲液标记缓冲液至上述超滤管，使终体积为
0.5ml，轻轻吹打混匀，37℃避光孵育30min；
3)12000g离心10min；
4)加0.2ml标记物保存液至超滤管中，轻轻吹打，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，
6000g离心10min；
5)收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述捕获探针接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物，其中中间介质的序列具体为：5’生物素-(T12)-生物素-3’；具体操作步骤为：
1)将核酸中间介质用TE buffer溶解，浓度为10μM；
2)取20μl生物素标记好的抗体，加到上述磁珠复合物中，37℃避光孵育40min；
3)放到磁分离架上1min，弃上清；
步骤8：重复步骤6-7共4次，从而获得第5级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠。
1)合成捕获探针：
第一条探针：5’生物素-ATTAGGTTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGTTCTGCAGGATGC-
3’；
第二条探针:5’生物素-GCATCCTGCAGAACGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCAACCTAAT；
2)将捕获探针用纯水溶解，浓度为1mM；
3)双链DNA形成：分别取2.2μl杂交探针和6.6μl 1.5x杂交缓冲液中，95℃，5s；65℃，
30min；
4)甲基化位点形成：室温配制反应体系
表1捕获探针甲基化反应体系
试剂名称 用量
10XM.SssIBuffer 2μl
50XSAM 0.4μl
双链探针 10μl
M.SssI 1μl
Nuclease-freewater To20μl
5)混匀后放入热循环仪，37℃，15min；65℃，20min；
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上
根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’，根序列与磁珠偶联，偶联步骤如下：
1)将EDC从-20℃冰箱取出后回温到室温；
2)将根序列用纯水溶解，浓度为1mM；
3)用振荡器振荡磁微球混悬液，并放到超声仪中(～70Hz)超声处理1min，使其混合均匀；
4)取5.0x106个磁微球至EP管，8000g离心1min，弃上清；
5)加入50μl0.1M MES，pH4.5，涡旋振荡20s；
6)取2μl根序列加入磁微球悬液中混合均匀；
7)配制新鲜的10mg/ml EDC溶液，取2.5μl加入上述磁微球悬液中混合均匀；
8)室温避光孵育30min；
9)加入1.0ml 0.02％Tween-20，均匀混合后8000g离心1min，弃上清；
10)取1.0ml 0.1％SDS重悬，8000g离心1min，弃上清；
11)加入100μl TE，pH8.0重悬，2～8℃避光保存；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物，具体步骤如下：
1)20μl双链DNA与100μl含根序列的磁微球混合；
2)加入10μl链霉亲和素溶液，混合后室温放置30min；
3)放到磁分离架上2min，弃去上清液；
4)加1ml TE buffer重悬磁微球；
5)放到磁分离架上2min，弃去上清液；
6)加入30μl PBS缓冲液重悬，备用；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体采用如下步骤获得：
1)取1mg抗体于超滤管中，并加入1ml标记缓冲液，12000g离心10min；
2)加入13.3μl生物素溶液和1ml标记缓冲液标记缓冲液至上述超滤管，使终体积为
0.5ml，轻轻吹打混匀，37℃避光孵育30min；
3)12000g离心10min；
4)加0.2ml标记物保存液至超滤管中，轻轻吹打，将滤芯倒转放置于另一个离心管中，
6000g离心10min；
5)收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述捕获探针接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物，其中中间介质的序列具体为：5’生物素-(T12)-生物素-3’；具体操作步骤为：
1)将核酸中间介质用TE buffer溶解，浓度为10μM；
2)取20μl生物素标记好的抗体，加到上述磁珠复合物中，37℃避光孵育40min；
3)放到磁分离架上1min，弃上清；
步骤8：重复步骤6-7共4次，从而获得第5级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠。
[0022] 制备例2：以生物素化的单链核苷酸为中间介质甲基化抗体对应组合选用：let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；
亲和素：卵白亲和素；
荧光蛋白：PE荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
亲和素：卵白亲和素；
荧光蛋白：PE荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
[0023] 带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：步骤1：甲基转移酶处理核酸，形成含甲基化位点的捕获探针；
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上，根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体获得；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述根序列接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；其中中间介质的序列具体为：5’生物素-(T20)-生物素-3’；
步骤8：重复步骤6-7共9次，从而获得第10级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠；
其余于制备例1相同。
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上，根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体获得；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述根序列接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；其中中间介质的序列具体为：5’生物素-(T20)-生物素-3’；
步骤8：重复步骤6-7共9次，从而获得第10级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠；
其余于制备例1相同。
[0024] 制备例3：以生物素化的小分子量蛋白质为中间介质甲基化抗体对应组合选用：let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；
亲和素：选用链亲和素；
荧光蛋白：AFP荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
亲和素：选用链亲和素；
荧光蛋白：AFP荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
[0025] 带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：步骤1：甲基转移酶处理核酸，形成含甲基化位点的捕获探针；
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上，根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体获得；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述根序列接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；其中中间介质的氨基酸序列具体为：
步骤8：重复步骤6-7共4次，从而获得第5级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠；
其余于制备例1相同。
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上，根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体获得；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述根序列接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；其中中间介质的氨基酸序列具体为：
步骤8：重复步骤6-7共4次，从而获得第5级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠；
其余于制备例1相同。
[0026] 制备例4：以生物素化的小分子量蛋白质为中间介质甲基化抗体对应组合选用：let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；
亲和素：卵白亲和素；
荧光蛋白：PE荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
亲和素：卵白亲和素；
荧光蛋白：PE荧光蛋白；
其他原料：SAPE；粒径为5.6μm表面羧基化的磁微球；EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；0.1M MES buffer pH4.5；0.02％Tween-20；TE buffer pH8.0；PBS buffer pH7.4；0.1％SDS；CpG Methyltransferase(甲基转移酶)。
[0027] 带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物制备方法，包括步骤：步骤1：甲基转移酶处理核酸，形成含甲基化位点的捕获探针；
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上，根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体获得；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述根序列接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；其中中间介质的序列具体为：
步骤8：重复步骤6-7共9次，从而获得第10级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠；
其余于制备例1相同。
实施例
步骤2：将第一寡核苷酸用作根序列固定于固相载体上，根序列具体为：5’NH2-(C12)-GAACGATCGGATTAGGTTGC-生物素3’；
步骤3：将带有甲基化位点的捕获探针与所述磁微球-根序列复合物接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物；
步骤4：生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体获得；
步骤5：将生物素标记的特异性识别甲基化位点的抗体与所述根序列接触并结合，从而形成稳定的磁微球-根序列-捕获探针复合物-抗体的复合物；
步骤6：将亲和素与上述抗体上的生物素接触并结合，随后去除过量的、未结合的亲和素；
步骤7：将生物素标记的中间介质与上述的亲和素接触并结合，随后去除过量的、未结合的中间介质，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；其中中间介质的序列具体为：
步骤8：重复步骤6-7共9次，从而获得第10级生物素-亲和素的复合物；
步骤9：将标记有亲和素标记的检测介质与上述复合物中的生物素结合，随后去除过量的、未结合的信号检测介质；
步骤10：将含有固相载体的缓冲液的温度升高，或调节其离子强度或酸碱度，使携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物脱离磁珠；
其余于制备例1相同。
实施例
[0028] 实施例1、一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，包括如下步骤：S1：采用制备例1中的甲基化抗体组合；
S2：选用制备例1中的第5级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述中间介质的长度12bp；所述的中间介质一端与来自制备例1中的第5级亲和素结合，而另一端与第6级的亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例1中的，而且信号检测介质中的亲和素与第5级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性，捕获探针具体如下：
let-7a-5p(m6A)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTTCCCTCTCCTC-3’
miR-17-5p(m6A)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTCCTGCCTGTGCCTTTG-3’
lncRNAKCNK15-AS1(m6A)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCATACATTTGGCTCCCATGGCTATTCAGGGT-3’
CD1D(m5C)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTTCAGTCGTTGCTCCAGCTGTGCGTCTG-3’
SPARC(m5C)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTTCCGATGTAGTCCAGGTGGAGCTTGTGG-3’
S7：将待测样品也即包括组织细胞提取的基因组、total RNA、细胞培养上清液、血浆、血清样本与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量。
S2：选用制备例1中的第5级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述中间介质的长度12bp；所述的中间介质一端与来自制备例1中的第5级亲和素结合，而另一端与第6级的亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例1中的，而且信号检测介质中的亲和素与第5级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性，捕获探针具体如下：
let-7a-5p(m6A)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTTCCCTCTCCTC-3’
miR-17-5p(m6A)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTCCTGCCTGTGCCTTTG-3’
lncRNAKCNK15-AS1(m6A)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCATACATTTGGCTCCCATGGCTATTCAGGGT-3’
CD1D(m5C)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTTCAGTCGTTGCTCCAGCTGTGCGTCTG-3’
SPARC(m5C)：
5’-GCAACCTAATCCGATCGTTCCTTCCGATGTAGTCCAGGTGGAGCTTGTGG-3’
S7：将待测样品也即包括组织细胞提取的基因组、total RNA、细胞培养上清液、血浆、血清样本与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量。
[0029] 实验步骤：1、根序列与磁微球偶联
1)将EDC从-20℃冰箱取出后回温到室温；
2)将根序列用纯水溶解，浓度为1mM；
3)用振荡器振荡磁微球混悬液，并放到超声仪中(70Hz)超声处理1min，使其混合均匀；
4)取5.0x106个磁微球至EP管，8000g离心1min，弃上清；
5)加入50μl 0.1M MES，pH4.5，涡旋振荡20s；
6)取2μl根序列加入磁微球悬液中混合均匀；
7)配制新鲜的10mg/ml EDC溶液，取2.5μl加入上述磁微球悬液中混合均匀；
8)室温避光孵育30min；
9)加入1.0ml 0.02％Tween-20，均匀混合后8000g离心1min，弃上清；
10)取1.0ml 0.1％SDS重悬，8000g离心1min，弃上清；
11)加入100μl TE，pH8.0重悬，2～8℃避光保存。
1)将EDC从-20℃冰箱取出后回温到室温；
2)将根序列用纯水溶解，浓度为1mM；
3)用振荡器振荡磁微球混悬液，并放到超声仪中(70Hz)超声处理1min，使其混合均匀；
4)取5.0x106个磁微球至EP管，8000g离心1min，弃上清；
5)加入50μl 0.1M MES，pH4.5，涡旋振荡20s；
6)取2μl根序列加入磁微球悬液中混合均匀；
7)配制新鲜的10mg/ml EDC溶液，取2.5μl加入上述磁微球悬液中混合均匀；
8)室温避光孵育30min；
9)加入1.0ml 0.02％Tween-20，均匀混合后8000g离心1min，弃上清；
10)取1.0ml 0.1％SDS重悬，8000g离心1min，弃上清；
11)加入100μl TE，pH8.0重悬，2～8℃避光保存。
[0030] 2、捕获探针与磁微球-根序列复合物结合1)配制杂交缓冲液：1.5M TMAC，0.05％酰肌氨酸，50mM Tris，4mM EDTA；
2)将捕获探针用TE buffer溶解，浓度为1mM；
3)分别取2500颗上述磁微球到5支EP管中，放到磁分离器上2-3min，去上清；
4)加入75μl杂交缓冲液，涡旋振荡重悬磁微球；
5)分别加入相应的1μl，100μM捕获探针，充分混匀后50～70℃孵育30min；
6)放到磁分离器上2-3min，弃上清；
7)加入200μlTEbuffer振荡重悬磁微球,放到磁分离器上2-3min，弃上清；
8)加入30μlTEbuffer重悬，备用；
3、样本中目的基因捕获
1)配制杂交缓冲液：1.5M TMAC，0.05％酰肌氨酸，50mM Tris，4mM EDTA。
2)将捕获探针用TE buffer溶解，浓度为1mM；
3)分别取2500颗上述磁微球到5支EP管中，放到磁分离器上2-3min，去上清；
4)加入75μl杂交缓冲液，涡旋振荡重悬磁微球；
5)分别加入相应的1μl，100μM捕获探针，充分混匀后50～70℃孵育30min；
6)放到磁分离器上2-3min，弃上清；
7)加入200μlTEbuffer振荡重悬磁微球,放到磁分离器上2-3min，弃上清；
8)加入30μlTEbuffer重悬，备用；
3、样本中目的基因捕获
1)配制杂交缓冲液：1.5M TMAC，0.05％酰肌氨酸，50mM Tris，4mM EDTA。
[0031] 2)将5种制备好的磁珠混合，放到磁分离器上2-3min，弃上清；3)加入25μl杂交缓冲液重悬；
4)加入1ml标记缓冲液的检测模板，同时设置空白对照组。加入模板量依据检测样本类型而定，必要时可先进行富集处理，振荡混匀；
5)放入热循环仪，95℃，90s；37℃，30min；
6)放到磁分离器上2-3min，弃上清；
7)加入75μl杂交缓冲液重悬，放到磁分离器上2-3min，弃上清；
8)重复步骤7)；
9)加入25μlTEbuffer重悬，2～8℃保存，备用；
4、Luminex 200荧光检测
5、在luminex多功能流式点阵仪上读数，读数设置可参考如下：Event为100perbead；
Min Events为20per bead；Sample size为100μl；Flow rate为Fast；GATE设置为默认；具体上机操作参阅仪器使用说明书。
4)加入1ml标记缓冲液的检测模板，同时设置空白对照组。加入模板量依据检测样本类型而定，必要时可先进行富集处理，振荡混匀；
5)放入热循环仪，95℃，90s；37℃，30min；
6)放到磁分离器上2-3min，弃上清；
7)加入75μl杂交缓冲液重悬，放到磁分离器上2-3min，弃上清；
8)重复步骤7)；
9)加入25μlTEbuffer重悬，2～8℃保存，备用；
4、Luminex 200荧光检测
5、在luminex多功能流式点阵仪上读数，读数设置可参考如下：Event为100perbead；
Min Events为20per bead；Sample size为100μl；Flow rate为Fast；GATE设置为默认；具体上机操作参阅仪器使用说明书。
[0032] 实施例2、一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，包括如下步骤：S1：采用制备例2中的甲基化抗体组合；
S2：采用制备例2中的第10级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述中间介质的长度为20bp；所述的中间介质一端与来自制备例2中的第10级亲和素结合，而另一端与第11级亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例2中的，而且信号检测介质中的亲和素与第10级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量；
其余与实施例1相同。
S2：采用制备例2中的第10级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述中间介质的长度为20bp；所述的中间介质一端与来自制备例2中的第10级亲和素结合，而另一端与第11级亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例2中的，而且信号检测介质中的亲和素与第10级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量；
其余与实施例1相同。
[0033] 实施例3、一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，包括如下步骤：S1：采用制备例3中的甲基化抗体组合；
S2：采用制备例3中的第5级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述中间介质的分子量为41.7KD；所述的中间介质一端与来自制备例3中的第5级亲和素结合，而另一端与第6级的亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例3中的，而且信号检测介质中的亲和素与第5级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量；
其余与实施例1相同。
S2：采用制备例3中的第5级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述中间介质的分子量为41.7KD；所述的中间介质一端与来自制备例3中的第5级亲和素结合，而另一端与第6级的亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例3中的，而且信号检测介质中的亲和素与第5级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量；
其余与实施例1相同。
[0034] 实施例4、一种甲基化基因免PCR扩增分析方法，包括如下步骤：S1：采用制备例4中的甲基化抗体组合；
S2：采用制备例4中的第10级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的小分子量蛋白质，所述中间介质的分子量为30.8KD；所述的中间介质一端与来自制备例3中的第10级亲和素结合，而另一端与第11级的亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例3中的，而且信号检测介质中的生物素与第10级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量；
其余与实施例1相同。
S2：采用制备例4中的第10级亲和素；
S3：中间介质，所述的中间介质是两端标记有生物素的小分子量蛋白质，所述中间介质的分子量为30.8KD；所述的中间介质一端与来自制备例3中的第10级亲和素结合，而另一端与第11级的亲和素结合；
S4：信号检测介质，所述的信号检测介质是标记有亲和素的荧光蛋白，荧光蛋白采用制备例3中的，而且信号检测介质中的生物素与第10级中间介质生物素结合，获得携带甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物；
S5：荧光编码磁珠选用；
S6：靶基因特异性捕获探针与荧光编码磁珠偶联，形成含捕获探针的固相载体混合物，所述的捕获基因与需检查的基因互补配对，具有特异性；
S7：将待测样品与携带特异性捕获探针的磁珠混合，其中所述的待测样品是含有核酸的溶液，从而形成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸的第一偶联物；
S8：分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液中加入所述的含甲基化位点识别特异性抗体的生物素-亲和素的复合物，从而形成成荧光编码磁珠-捕获探针-目标核酸-检测复合物的第二偶联物；
S9：洗涤第二偶联物，用luminex 200检测信号值，从而确定在样本中是否存在目标核酸或其数量；
其余与实施例1相同。
[0035] 应用例1：应用于胰腺癌早期检测领域检测实验内容
选取2018年1月～2019年12月所寻找的志愿者60例，其中具体为胰腺癌患者(30例)以及正常人(30例)作为主要研究对象。其中，志愿者主要包括男28例，女32例，年龄介于48～
75岁，平均年龄为59.5岁；志愿者在诊断过程中均符合胰腺癌的诊断标准。
选取2018年1月～2019年12月所寻找的志愿者60例，其中具体为胰腺癌患者(30例)以及正常人(30例)作为主要研究对象。其中，志愿者主要包括男28例，女32例，年龄介于48～
75岁，平均年龄为59.5岁；志愿者在诊断过程中均符合胰腺癌的诊断标准。
[0036] 在患者空腹状态下，进行4mL静脉血液的提取，在室温环境下静置30min，离心提取血清，并在-20℃温度条件下进行储存备用，采用相关分析仪作为测定仪器。对胰腺癌患者(30例)以及正常人(30例)进行检测，检测项目为以下基因片段甲基化状态和甲基化类型let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)，值得注意的是，检测过程采用通过实施例获得的产品，并需严格按照试剂相关说明和操作标准而开展。
[0037] 实验结果检测let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；按试剂盒使用说明书操作，获取这5种荧光信号，结果见下表：
表2：胰腺癌患者与正常人血清检测荧光信号值
表3不同组别部分价值数据
从表2、3中可以发现，不同位点甲基化程度在胰腺癌患者中的比例确实与正常人有区别，但是通过单一检测指标或多项检测指标的平均数对潜在患者进行诊治意味着会遗漏掉大量的潜在患者，导致早期诊断失去意义；同时虽然正常人在基因片段甲基化程度的平均值上明显低于胰腺癌患者，但是从表2中可以明显发现，平均值低并不意味着所有正常人都低，而是被一些数据拉高后的最终结果，因此实际诊断过程中并不具有参考价值，这也就是为什么很多文献中都给出了某某基因片段甲基化会对胰腺癌有影响，但是实际无法给出其中存在的必然联系，因为从单一某个基因甲基化程度来评判，很容易出现误诊情况，因为在正常人中同样具有单一数值过高的情况；而本申请通过发掘、筛选和匹配，最终通过五项检测值的总值设定为阈值的方式来提高了不同基因片段甲基化程度与胰腺癌患者的关联度。
实现了通过甲基化程度对胰腺癌进行早期诊断的可操作。
表2：胰腺癌患者与正常人血清检测荧光信号值
表3不同组别部分价值数据
从表2、3中可以发现，不同位点甲基化程度在胰腺癌患者中的比例确实与正常人有区别，但是通过单一检测指标或多项检测指标的平均数对潜在患者进行诊治意味着会遗漏掉大量的潜在患者，导致早期诊断失去意义；同时虽然正常人在基因片段甲基化程度的平均值上明显低于胰腺癌患者，但是从表2中可以明显发现，平均值低并不意味着所有正常人都低，而是被一些数据拉高后的最终结果，因此实际诊断过程中并不具有参考价值，这也就是为什么很多文献中都给出了某某基因片段甲基化会对胰腺癌有影响，但是实际无法给出其中存在的必然联系，因为从单一某个基因甲基化程度来评判，很容易出现误诊情况，因为在正常人中同样具有单一数值过高的情况；而本申请通过发掘、筛选和匹配，最终通过五项检测值的总值设定为阈值的方式来提高了不同基因片段甲基化程度与胰腺癌患者的关联度。
实现了通过甲基化程度对胰腺癌进行早期诊断的可操作。
[0038] 应用例2：胰腺癌早期检测特异性对比检测实验内容
选取2018年1月～2019年12月所寻找的志愿者40例，其中具体为肺癌患者(20例)以及胰腺癌患者(20例)作为主要研究对象。志愿者在诊断过程中均符合肺癌、胰腺癌的诊断标准。
选取2018年1月～2019年12月所寻找的志愿者40例，其中具体为肺癌患者(20例)以及胰腺癌患者(20例)作为主要研究对象。志愿者在诊断过程中均符合肺癌、胰腺癌的诊断标准。
[0039] 在患者空腹状态下，进行4mL静脉血液的提取，在恒定的室内温度环境下静置30min，离心提取血清，并在-20℃温度条件下进行储存备用，采用相关分析仪作为测定仪器。对肺癌患者(20例)、胰腺癌患者(20例)进行检测，检测项目为以下基因片段甲基化状态和甲基化类型let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)，值得注意的是，检测过程采用通过实施例获得的产品，并需严格按照试剂相关说明和操作标准而开展。
[0040] 实验结果检测let-7a-5p(m6A)、miR-17-5p(m6A)、lncRNAKCNK15-AS1(m6A)、CDID(m5C)、SPARC(m5C)；按试剂盒使用说明书操作，获取这5种荧光信号，结果见下表：
表4胰腺癌患者血清检测荧光信号值
let-7a-5p miR-17-5p lncRNAKCNK15-AS1 CDID SPARC 合计
胰腺癌组1 3760 2084 3526 2341 4024 15735
胰腺癌组2 2648 2107 4329 4804 3215 17103
胰腺癌组3 1805 4392 3987 2097 2879 15160
胰腺癌组4 2065 3981 2084 3581 3669 15380
胰腺癌组5 3651 3958 2684 3651 3841 17785
胰腺癌组6 3214 3527 3841 2147 2589 15318
胰腺癌组7 3651 4014 2698 3084 3698 17145
胰腺癌组8 3214 3568 3025 3894 3201 16902
胰腺癌组9 3914 3189 2891 3569 2891 16454
胰腺癌组10 3069 2281 3639 3998 2359 15346
胰腺癌组11 3339 2635 3379 3269 3694 16316
胰腺癌组12 3639 3798 3587 3109 3058 17191
胰腺癌组13 2306 3690 3012 3215 3398 15621
胰腺癌组14 3242 3221 3698 3537 3906 17604
胰腺癌组15 3431 3841 3532 2651 3510 16965
胰腺癌组16 3069 2281 3639 3998 2359 15346
胰腺癌组17 3172 2426 3639 3738 2695 15670
胰腺癌组18 3339 2635 3379 3269 3694 16316
胰腺癌组19 3631 3438 3324 3312 2962 16667
胰腺癌组20 2391 3521 3012 3415 3528 15867
表5肺癌患者血清检测荧光信号值
从表4、5中可以发现，虽然不同位点甲基化水平在肺癌患者要比正常人高，但仍然明显低于胰腺癌患者。同时，胰腺癌患者的平均五种参数3127、3229、3345、3334、3258，而肺癌对照组中有大量的局部或者单项数值在胰癌单个检测项目的平均值以上，这也就是一直困扰很多研究者的难题，部分基因片段的甲基化在概率学上确实可能对胰腺癌的产生有影响，但是针对单个指标，并不会因为这个指标超过某个值就一定出现胰腺癌，也不会因为这个值低就一定不会出现胰腺癌，单一指标在评定过程中会出现极大的误差，导致虽然这些基因片段甲基化可能会对患者获得胰腺癌确实有影响，但是目前困扰的是无法数据化，无法形成合理的，准确度高的检测方案，而本申请从众多的已经被证实有影响的、或者可能有影响的基因片段进行合理的组合，发现了通过阈值设定的检测机制，最终实现了胰腺癌前期检测的稳定。
表4胰腺癌患者血清检测荧光信号值
let-7a-5p miR-17-5p lncRNAKCNK15-AS1 CDID SPARC 合计
胰腺癌组1 3760 2084 3526 2341 4024 15735
胰腺癌组2 2648 2107 4329 4804 3215 17103
胰腺癌组3 1805 4392 3987 2097 2879 15160
胰腺癌组4 2065 3981 2084 3581 3669 15380
胰腺癌组5 3651 3958 2684 3651 3841 17785
胰腺癌组6 3214 3527 3841 2147 2589 15318
胰腺癌组7 3651 4014 2698 3084 3698 17145
胰腺癌组8 3214 3568 3025 3894 3201 16902
胰腺癌组9 3914 3189 2891 3569 2891 16454
胰腺癌组10 3069 2281 3639 3998 2359 15346
胰腺癌组11 3339 2635 3379 3269 3694 16316
胰腺癌组12 3639 3798 3587 3109 3058 17191
胰腺癌组13 2306 3690 3012 3215 3398 15621
胰腺癌组14 3242 3221 3698 3537 3906 17604
胰腺癌组15 3431 3841 3532 2651 3510 16965
胰腺癌组16 3069 2281 3639 3998 2359 15346
胰腺癌组17 3172 2426 3639 3738 2695 15670
胰腺癌组18 3339 2635 3379 3269 3694 16316
胰腺癌组19 3631 3438 3324 3312 2962 16667
胰腺癌组20 2391 3521 3012 3415 3528 15867
表5肺癌患者血清检测荧光信号值
从表4、5中可以发现，虽然不同位点甲基化水平在肺癌患者要比正常人高，但仍然明显低于胰腺癌患者。同时，胰腺癌患者的平均五种参数3127、3229、3345、3334、3258，而肺癌对照组中有大量的局部或者单项数值在胰癌单个检测项目的平均值以上，这也就是一直困扰很多研究者的难题，部分基因片段的甲基化在概率学上确实可能对胰腺癌的产生有影响，但是针对单个指标，并不会因为这个指标超过某个值就一定出现胰腺癌，也不会因为这个值低就一定不会出现胰腺癌，单一指标在评定过程中会出现极大的误差，导致虽然这些基因片段甲基化可能会对患者获得胰腺癌确实有影响，但是目前困扰的是无法数据化，无法形成合理的，准确度高的检测方案，而本申请从众多的已经被证实有影响的、或者可能有影响的基因片段进行合理的组合，发现了通过阈值设定的检测机制，最终实现了胰腺癌前期检测的稳定。
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